[go: up one dir, main page]

CN119040279A - 基于水疱性口炎病毒载体的狂犬病毒疫苗 - Google Patents

基于水疱性口炎病毒载体的狂犬病毒疫苗 Download PDF

Info

Publication number
CN119040279A
CN119040279A CN202411261067.0A CN202411261067A CN119040279A CN 119040279 A CN119040279 A CN 119040279A CN 202411261067 A CN202411261067 A CN 202411261067A CN 119040279 A CN119040279 A CN 119040279A
Authority
CN
China
Prior art keywords
virus
recombinant
rabies
protein
vesicular stomatitis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202411261067.0A
Other languages
English (en)
Inventor
郑爱华
李虹悦
袁菲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Zoology of CAS
Original Assignee
Institute of Zoology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Zoology of CAS filed Critical Institute of Zoology of CAS
Priority to CN202411261067.0A priority Critical patent/CN119040279A/zh
Publication of CN119040279A publication Critical patent/CN119040279A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/70—Invertebrates
    • A01K2227/706—Insects, e.g. Drosophila melanogaster, medfly
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
    • C12N2760/20122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
    • C12N2760/20134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
    • C12N2760/20221—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
    • C12N2760/20234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
    • C12N2760/20241—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/20243—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明公开了基于水疱性口炎病毒载体的狂犬病毒疫苗。具体地公开了重组病毒，该重组病毒为表达狂犬病病毒PM1503毒株G蛋白（SEQ ID No.2）的重组水疱性口炎病毒。本发明在水疱性口炎病毒（VSV）的囊膜蛋白G前插入了狂犬病毒PM1503株的囊膜糖蛋白G，并且恢复了该重组病毒。该重组病毒安全性高，感染巴马猪与小鼠不会造成疫苗载体病毒脱落与传播。且本发明疫苗可高效感染埃及伊蚊，通过蚊子携带递送及口服的方式可诱导机体产生高滴度的中和抗体，保护其免受狂犬病毒的攻击。本发明的重组病毒可以用于狂犬病毒疫苗研发和制备，实现对自然疫源地的野生动物宿主的免疫接种，对野生动物的保护产生重要意义。

Description

基于水疱性口炎病毒载体的狂犬病毒疫苗
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及基于水疱性口炎病毒载体的狂犬病毒疫苗。
背景技术
狂犬病（Rabies）又称恐水症、疯狗病，是由狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）引起的人畜共患中枢神经系统急性传染病，一旦发病，病死率为100%，目前尚无有效的治疗药物和方法。狂犬病病毒主要存在于患病动物的唾液腺和唾液中，通过动物咬伤、抓伤皮肤或舔舐黏膜传染。为犬类等狂犬病病毒野生动物宿主接种疫苗是预防人类狂犬病最具成本效益的方法，因为这可以从源头阻断传播。另外，为野生动物接种疫苗还能减少对暴露后预防的需求。RABV属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病毒属（Lyssavirus），是一种具有包膜的单链负义RNA病毒，它包含有5种结构蛋白：核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、包膜糖蛋白（G）和RNA依赖的RNA聚合酶（L）。狂犬病病毒的糖蛋白G是一种跨膜蛋白，具有三聚体结构，构成了病毒表面的棘突，它是目前发现的唯一可以刺激机体产生中和抗体的狂犬病毒抗原，也是唯一一种存在于所有新型狂犬疫苗中的成分。
传统的狂犬病疫苗是由减毒或灭活的狂犬病病毒组成的，从以巴斯德狂犬病疫苗为起始的神经组织疫苗到禽胚疫苗，再到细胞培养疫苗，狂犬病疫苗不断得到改进和完善，目前Vero细胞系培养的狂犬病病毒疫苗已大量生产，广泛应用于人和动物狂犬病的预防和暴露后接种。传统疫苗中含有与野生毒株相同特征的抗原，可诱导机体产生针对糖蛋白G的病毒中和抗体，同时活化辅助T细胞以及细胞毒性T细胞,从而对致死性的狂犬病毒的致死性攻击具有保护作用。然而，目前所使用的传统狂犬病疫苗生产成本较高，缺乏针对野生动物的疫苗及投放方式考虑，且存在一定的生产和使用风险，并且在一些狂犬病发病率较高的国家，仍需要使用更经济的疫苗产品进行单次免疫以达到预防狂犬病的目的。因此研制更加经济、安全、有效的新型狂犬病疫苗成为越来越多研究者关注的重点。
在各种疫苗形式中，活病毒载体疫苗由于能引起相对最强的免疫反应和最佳的保护效果，现已成为新型疫苗研发的重点，而病毒载体的选择是疫苗成功的关键。水疱性口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus，VSV）是弹状病毒科的代表模式毒种，被广泛用于研究有囊膜RNA病毒入侵细胞、复制和装配等机制的研究。VSV病毒引起的水疱性口炎是接触性传染的良性疾病，主要感染啮齿类动物牛、猪和马，也能感染人类和其它动物。VSV抗体的缺乏和不具明显致病性是VSV作为疫苗和治疗性病毒载体的前提条件。VSV为单股负链不分节段RNA病毒，基因组长约11Kb，结构简单，从3'到5'依次转录出5条mRNA，分别编码5种蛋白：核衣壳蛋白N（nucleocapsid protein）、磷蛋白P（phosphoprotein）、基质蛋白M（matrixprotein）、糖蛋白G（glycoprotein）、大聚合酶L（large protein）。G蛋白是I型整合膜蛋白，在病毒粒子表面以三聚体形式存在，行使与靶细胞受体结合及膜融合的功能。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何预防狂犬病（Rabies）。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了重组病毒，所述重组病毒可为表达狂犬病病毒G蛋白的重组水疱性口炎病毒。
所述重组病毒可为在水疱性口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus，VSV）的囊膜蛋白G（G蛋白）的前面（N端）插入狂犬病病毒G蛋白而得到的重组病毒。
进一步地，所述水疱性口炎病毒的基质蛋白M（M蛋白）可缺失第51位的氨基酸-甲硫氨酸。
所述狂犬病病毒G蛋白可来源于狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）PM1503毒株。
进一步地，所述狂犬病病毒G蛋白的氨基酸序列可如SEQ ID No.2所示。
进一步地，所述重组病毒可含有编码本文中所述狂犬病病毒G蛋白的核酸分子，所述核酸分子可位于水疱性口炎病毒的M蛋白基因和G蛋白基因之间。
进一步地，所述核酸分子的核苷酸序列可如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了制备本文中任一所述重组病毒的方法，所述方法可包括如下步骤：
A1）将编码本文中所述狂犬病病毒G蛋白的核酸分子导入到水疱性口炎病毒载体中，得到表达狂犬病病毒G蛋白的重组水疱性口炎病毒载体；
A2）将所述重组水疱性口炎病毒载体经病毒拯救得到所述重组病毒。
上述方法中，A1）中所述导入可以是将所述核酸分子导入到所述水疱性口炎病毒载体的M蛋白基因和G蛋白基因之间。
A2）中所述病毒拯救的方法可为：将所述重组水疱性口炎病毒载体和辅助质粒共同转染宿主细胞，经培养得到所述重组病毒；所述辅助质粒包括表达水疱性口炎病毒N蛋白的质粒、表达水疱性口炎病毒P蛋白的质粒、表达水疱性口炎病毒L蛋白的质粒、表达水疱性口炎病毒M蛋白的质粒、表达水疱性口炎病毒G蛋白的质粒和表达T7 RNA聚合酶的质粒。
上述方法中，所述宿主细胞可为包装细胞。所述包装细胞用于包装缺乏编码病毒包装所需蛋白质的至少一种基因的病毒载体质粒，其可为病毒包装成为重组病毒提供全面的病毒蛋白，且其本身不能产生任何形式的病毒颗粒。提供病毒包装所缺乏的蛋白质或多肽的任何细胞都可被考虑用作包装细胞。合适的包装细胞是本领域技术人员熟知的，例如ECO细胞、PG13细胞、HEK293细胞、CHO细胞、293T细胞、293细胞、MDCK细胞、NIH3T3细胞、PA317细胞、COS细胞、HeLa细胞、Vero细胞、PsiCRIP细胞等。在本发明的一个或多个实施方案中，所述宿主细胞（包装细胞）为Vero细胞。
上述方法中，所述核酸分子的核苷酸序列可如SEQ ID No.1所示。
上述方法中，所述辅助质粒可为将编码病毒拯救所需蛋白质的核酸分子克隆到表达载体中得到的重组表达载体。所述表达载体不限于特定的载体，本领域技术人员可采用合适的表载体，例如pCDNA3.1(-)、pCDNA3.1(+)、PYES2.0、pBI121和pPIC9K等。只要该表达载体能够表达所述病毒拯救所需蛋白质即可。
所述病毒拯救所需蛋白质包括水疱性口炎病毒N蛋白、水疱性口炎病毒P蛋白、水疱性口炎病毒L蛋白、水疱性口炎病毒M蛋白、水疱性口炎病毒G蛋白和T7 RNA聚合酶。
上述方法中，所述水疱性口炎病毒载体可为rVSV-G ΔM51。
所述载体rVSV-G ΔM51的核苷酸序列的Genebank登录号为：NC_038236.1（11162bp）。
进一步地，本文所述重组水疱性口炎病毒载体还可包括报告基因。
进一步地，可将报告基因导入到所述水疱性口炎病毒载体（如rVSV-G ΔM51）中。
进一步地，所述报告基因可包括但不限于β-葡糖醛酸酶（GUS）基因、荧光素酶（Luciferase）基因、氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因、β-半乳糖苷酶（β-gal）基因、分泌性人胎盘碱性磷酸酶（SEAP）基因、黄色荧光蛋白（YFP）基因和绿色荧光蛋白（GFP）基因。在本发明的一个或多个实施方案中，所述报告基因为GFP基因。
本文中任一所述的重组水疱性口炎病毒载体也在本发明的保护范围内。
本发明还提供了由本文中任一所述的重组病毒或所述重组水疱性口炎病毒载体制备得到的疫苗。
所述疫苗的活性成分可包括本文中任一所述的重组病毒。
所述疫苗可用于预防狂犬病病毒感染或狂犬病；所述疫苗还可用于提供针对狂犬病病毒的免疫应答。
所述疫苗还可包括佐剂（adjuvant）。
术语“佐剂”是指一种可以刺激机体产生针对与其一同接种的抗原更强烈体液和/或细胞免疫应答的物质。本文所述佐剂是本领域技术人员公知的，包括但不限于：植物佐剂（如烷基胺、酚类成分、奎宁、皂角素、倍半萜、蛋白质、多肽、多糖、糖脂、植物血凝素等）、细菌佐剂（如霍乱毒素、大肠埃希菌不耐热毒素、细菌脂多糖等）、铝佐剂及其他无机成分佐剂（如钙佐剂）、细胞因子和核酸佐剂（如单核细胞克隆刺激因子、白细胞因子IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IFN-γ、CpG基序、核酸载体等）、乳剂佐剂（如弗氏佐剂）。
本发明还提供了本文中任一所述的重组病毒或所述重组水疱性口炎病毒载体在制备预防狂犬病病毒感染或狂犬病的产品（如疫苗）中的应用。
本发明还提供了一种制备用于免疫的昆虫的方法，所述方法包括利用本文中任一所述的重组病毒感染昆虫，获得所述用于免疫的昆虫。
所述昆虫可为能传播病毒的昆虫，包括但不限于蚊子、白蛉、黑蝇、吸血蠓‌、苍蝇、‌ ‌跳蚤、‌虱子、‌蟑螂、‌臭虫、‌蚂蚁等。‌
进一步地，所述昆虫可为蚊科昆虫，例如埃及伊蚊、白纹伊蚊。
所述用于免疫的昆虫的制备方法具体可包括采用所述重组病毒和血液的混合物喂养蚊科昆虫。
水疱性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）是一种活病毒疫苗载体，是弹状病毒科的代表模式毒种。其传播媒介包括蚊子，白蛉，黑蝇及吸血蠓等等。通过遗传改造，VSV可以表达外源的抗原蛋白，诱导机体产生针对抗原的特异免疫反应，作为一种疫苗载体应用。
对VSV病毒进行分子遗传学研究需要建立一个体系，把DNA恢复成有感染性的病毒。本发明通过转染编码病毒转录复合物（N，P，M，L，G）和T7聚合酶的质粒，同时转染的还有编码全长病毒反义基因组的T7启动子质粒。收获的细胞上清被证明含有感染性的病毒颗粒。本发明成功的从DNA恢复出有感染性的VSV病毒，使得对VSV进行遗传操作变为可能。带有合适胞质尾的外源病毒功能囊膜蛋白可以有效包装进病毒的囊膜，形成各种携带异源囊膜蛋白的嵌合重组VSV。重组VSV各转录单元之间的非编码区可耐受长达4.5kb外源基因的插入并获得高效表达。作为一种活载体疫苗，VSV具有以下优点：(1)易于培养：VSV在大多数哺乳动物细胞上都可获得很高滴度，容易大量制备。(2)高效性：在VSV-HA感染的小鼠模型中，10个感染性病毒颗粒诱导的免疫应答和105个感染性颗粒引起的免疫应答一样显著。(3)易使用：可通过多种接种途径进行免疫，往往一次接种即可引起强烈的免疫应答反应。(4)能刺激机体产生强烈的细胞免疫反应和体液免疫反应。还能引起较强的粘膜免疫反应：特别适合于通过粘膜感染的呼吸道病原体的疫苗研制。(5)安全性好：由于VSV病毒完全在细胞质中复制，仅从RNA→RNA，不会整合到宿主细胞的DNA中，最终会被宿主免疫系统清除。而且通过反向遗传操作进行基因组突变、修饰，可对VSV病毒进行适当的致弱，使之成为更安全的重组疫苗载体。另外，由于VSV囊膜蛋白同时具有受体识别和膜融合功能，其识别受体广泛存在于各种组织细胞膜表面，使得VSV具极为广泛的组织嗜性。这些特性赋予了VSV作为新型表达载体和活病毒疫苗载体的应用潜力。
本发明中利用病毒载体系统(rVSV)，能够直接在动物体内产生具有天然结构和免疫原性的RABV G蛋白，且能够刺激机体的免疫反应，产生能够抵抗狂犬病毒攻击的特异性抗体。本发明中的病毒载体疫苗用于狂犬病免疫更简单和直接，是相较于其他基因工程疫苗和传统的细胞培养疫苗更廉价和高效的疫苗。本发明中rVSV-RABV G-G ΔM51重组病毒可通过口服方式刺激实验动物产生高水平的特异性中和抗体，百分百保护小鼠免受狂犬病毒攻击。口服免疫途径为野外投放提供了基础。并且该重组病毒可以高效感染埃及伊蚊，通过蚊子携带疫苗递送免疫可以实现对自然疫源地野生动物宿主的免疫。
综上，为了实现对于狂犬病的预防，本发明开发了一种基于水疱性口炎病毒载体的病毒疫苗。本发明在水疱性口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus，VSV）的囊膜蛋白G前插入了狂犬病毒PM1503株的囊膜糖蛋白G，并且恢复了该重组病毒。该重组病毒安全性高，感染巴马猪与小鼠不会造成疫苗载体病毒脱落与传播。且本发明疫苗可高效感染埃及伊蚊，通过蚊子携带递送及口服的方式可诱导机体产生高滴度的中和抗体，保护其免受狂犬病毒的攻击。本发明构建的基于水泡性口炎病毒VSV的重组狂犬病毒，可以用于狂犬病毒疫苗研发和制备，该重组病毒可通过蚊虫媒介携带递送及口服对野生宿主进行狂犬疫苗免疫接种。对自然疫源地的野生动物宿主的免疫接种将对狂犬病毒疫苗的研发及野生动物的保护产生重要意义。
附图说明
图1为表达RABV PM1503毒株G蛋白的重组病毒载体rVSV-RABV G-G ΔM51的结构示意图。
图2为实施例1中重组病毒rVSV-RABV G-G ΔM51的鉴定结果。
图3为实施例2中重组病毒rVSV-RABV G-G ΔM51的安全性检测结果（猪体内病毒脱落检测结果）。
图4为实施2中重组病毒rVSV-RABV G-G ΔM51候选疫苗的传播安全性检测结果（小鼠体内病毒脱落检测结果）。
图5为实施例3中重组病毒rVSV-RABV G-G ΔM51感染埃及伊蚊检测结果（蚊子体内病毒滴度检测结果）。
图6为实施例4中重组病毒rVSV-RABV G-G ΔM51口服途径免疫及保护效果检测结果。
图7为实施例4中重组病毒rVSV-RABV G-G ΔM51通过埃及伊蚊递送途径免疫小鼠检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中GFP基因的GenBank登录号为AHL68672.1。
下述实施例中的表达VSV的N蛋白的质粒为将VSV基因组中的N蛋白编码基因序列，通过BamHI和EcoRI酶切位点克隆入真核表达质粒pCDNA3.1(+)（北京盛元科萌基因生物科技有限公司）后得到的质粒。P蛋白的质粒为将VSV基因组中的P蛋白编码基因序列通过BamHI和EcoRI酶切位点克隆入真核表达质粒pCDNA3.1(+)（北京盛元科萌基因生物科技有限公司）后得到的质粒。M蛋白的质粒为将VSV基因组中的M蛋白编码基因序列，通过BamHI和EcoRI酶切位点克隆入真核表达质粒pCDNA3.1(+)（北京盛元科萌基因生物科技有限公司）后得到的质粒。G蛋白的质粒为将VSV基因组中的G蛋白编码基因序列，通过BamHI和EcoRI酶切位点克隆入真核表达质粒pCDNA3.1(+)（北京盛元科萌基因生物科技有限公司）后得到的质粒。L蛋白的质粒为将VSV基因组中的L蛋白编码基因序列，通过BamHI和EcoRI酶切位点克隆入真核表达质粒pCDNA3.1(+)（北京盛元科萌基因生物科技有限公司）后得到的质粒。表达T7 RNA聚合酶的质粒为将T7RNA聚合酶编码基因序列，通过BamHI和EcoRI酶切位点克隆入真核表达质粒pCDNA3.1(+)（北京盛元科萌基因生物科技有限公司）后得到的质粒。
下述实施例中的巴马猪和埃及伊蚊均为常见物种，可商购获得。
下述实施例中的狂犬病毒CVS-11毒株购自吉林和元生物工程技术创新研究开发有限公司。
下述实施例中水疱性口炎病毒记载于文献“Single dose of a rVSV-basedvaccine elicits complete protection against severe fever withthrombocytopenia syndrome virus. NPJ Vaccines . 2019 Jan 25;4:5 .”中，公众可从中国科学院动物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、重组病毒rVSV-RABV G-G ΔM51的制备
1、重组载体rVSV-RABV G-G ΔM51的制备
为了研制针对于野生动物的狂犬病毒疫苗，本发明将RABV PM1503毒株的糖蛋白G（基因库登录号P15199.2）的编码基因插入到水疱性口炎病毒载体rVSV-G ΔM51中，同时插入表达GFP的报告基因，得到表达RABV PM1503毒株G蛋白的重组病毒载体，结构示意图如图1所示，上述RABV PM1503毒株的糖蛋白G的编码基因是插入到病毒载体rVSV-G ΔM51中的囊膜蛋白G的前面（N端），以及基质蛋白M的后面（C端），构建得到的重组载体命名为rVSV-RABV G-G ΔM51。
其中：RABV PM1503毒株G蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
水疱性口炎病毒载体rVSV-G ΔM51是删除了M片段第51位氨基酸的rVSV- G载体。水疱性口炎病毒载体rVSV-G ΔM51由北京盛元科萌基因生物科技有限公司合成，基因序列为NC_038236.1。
重组载体rVSV-RABV G-G ΔM51的具体构建方法如下：将SEQ ID No.1的序列插入rVSV-G ΔM51载体的酶切位点MluI和NotI之间，同时将GFP基因插入到rVSV-G ΔM51载体的酶切位点BamHI和EcoRI之间，得到重组载体，将其命名为重组载体rVSV-RABV G-G ΔM51。
2、重组病毒rVSV-RABV G-G ΔM51的拯救
将步骤1中制备的重组载体rVSV-RABV G-G ΔM51以及辅助质粒（表达VSV的N蛋白的质粒、表达VSV的P蛋白的质粒、表达VSV的L蛋白的质粒、表达VSV的M蛋白的质粒、表达VSV的G蛋白的质粒、表达T7 RNA聚合酶的质粒）共同转染Vero细胞，制备得到重组病毒rVSV-RABV G-G ΔM51。具体步骤如下：
1）将Vero细胞（来源于ATCC，货号为CCL-81）传代至培养皿中，第二天细胞密度达到70%-80%时，把完全培养基换成含有2%（体积分数）胎牛血清（FBS，Thermo Fisher，货号为10091）的DMEM培养基（Thermo Fisher，货号为SH30243.01B），得到Vero细胞培养体系。
2）完成步骤1）后，将36μL FuGENE 6（Promaga公司，货号为E2692）与Opti-MEM培养基（Thermo Fisher，货号为51985091）室温孵育5分钟，与步骤1中的重组载体rVSV-RABV G-G ΔM51（1.59μg）、表达VSV的N蛋白的质粒（1.286μg）、表达VSV的P蛋白的质粒（639ng）、表达VSV的L蛋白的质粒（159.9ng）、表达VSV的M蛋白的质粒（159.9ng）、表达VSV的G蛋白的质粒（159.9ng）、表达T7 RNA聚合酶的质粒（8.1μg）混匀，室温孵育15分钟，得到孵育后溶液（总体积为600μL）。
3）完成步骤2）后，将步骤2）中孵育后的溶液加入步骤1）中的Vero细胞培养体系中，6小时后换新鲜培养基。转染3天之后收取细胞上清，该上清中含有重组病毒rVSV-RABVG-G ΔM51。用所获得的上清感染新的Vero细胞，实现重组病毒rVSV-RABV G-G ΔM51的扩增。重组病毒rVSV-RABV G-G ΔM51为在水疱性口炎病毒基因组序列中的糖蛋白G的编码基因序前插入狂犬病毒G蛋白的编码基因序列后得到的病毒。
3、重组病毒rVSV-RABV G-G ΔM51的鉴定
将Vero细胞按照1:3的比例传代于10cm细胞培养皿中。第二天细胞长到80%左右密度时加入实施例1制备的重组病毒rVSV-RABV G-G ΔM51，M.O.I.=0.01，感染3个小时后换液成含有2%（体积分数）FBS的DMEM培养基。感染后每隔12小时取样，一直取到感染后120个小时。测定不同感染时间上清液中的病毒滴度。结果如图2所示，重组病毒rVSV-RABV G-GΔM51在感染48-60小时内病毒滴度可达到108FFU/mL。
病毒滴度的检测采用直接荧光方法，具体步骤如下：
将Vero细胞按照每孔1.0万个细胞传代于96孔板中。第二天细胞长到80％-90％左右密度时加入待测病毒上清。对病毒上清进行10倍梯度稀释，即30μl病毒原液与270μl病毒稀释液混匀，以此类推，共稀释6-7个梯度。病毒稀释液为含有2％(体积分数)FBS的DMEM培养基。每个孔中加入100μl病毒液，每个稀释度设3孔重复。将细胞放置于37℃细胞培养箱中，感染2小时后换液为含有20mM NH4Cl和2％(体积分数)FBS的DMEM培养基，将细胞放置于28℃细胞培养箱中。感染24小时后选择96孔板中的荧光数在102左右的孔进行计数，计算方法为：三个孔中的平均荧光数×稀释倍数×10。例如稀释倍数为104的孔中荧光为21个，病毒滴度为 21×104×10＝2.1×106FFU/ml。
实施例2、重组病毒rVSV-RABV G-G ΔM51的安全性检测
1、重组病毒rVSV-RABV G-G ΔM51在巴马猪中的安全性
选择3-5周龄的巴马猪作为实验动物。在第0天，6头巴马猪进行鼻尖皮内注射，剂量为106FFU/头。接种前以及接种后第1-7天每天监测动物体重及体温并记录。接种前以及接种后第1，3，5，7天采集血样约500 ul用于病毒血症的检测，血样装在含有抗凝剂的EP管。接种前以及接种后第1，3，5，7天采集鼻拭子、咽拭子、直肠拭子装在含有RNALater的EP管。接种后第3天取实验组动物3只进行安乐死，解剖取舌，鼻，唇，脑，心，肝、脾、肺，肾、气管用于病毒脱落的检测，样品分装两管，放置在EP管。接种14天时，取剩余3只实验动物约1ml全血，制备血清，-80°C保存。
各时间点的拭子，各组织及血液进行病毒核酸的检测。检测结果如图3所示，接种后实验动物未发生体重下降的情况，拭子及血液样品定量检测结果未发现病毒的脱落，对于安乐死的动物组织检测，仅在一只动物接种第三天的舌组织内检测到低剂量的病毒核酸。实验组动物在接种后14天可检测到较高水平的中和抗体。综上所述，虽然VSV载体重组病毒可在猪体内复制，但该病毒不会引起明显的临床疾病，病毒脱落量很小。
1.1、病毒核酸检测具体步骤如下：
采用qRT-PCR方法使用One Step TB PrimeScriptTMRT-PCR Kit(货号：RR066A，厂家：TaKaRa)试剂盒检测各样本中的病毒载量。引物信息：N-F：CGGAGGATTGACGACTAATGC，N-R：ACCATCCGAGCCATTCGA。反应体系如表1所示。
反应程序设置为反转录反应：42℃ 5min，95℃ 10sec；PCR反应：循环数：40，95℃5sec，60℃ 30sec。
1.2、中和抗体检测具体步骤如下：
将Vero细胞按照每孔1 .0万个细胞传代于96 孔板中。第二天细胞长到80％-90％左右时准备试验。首先将血清按照5倍稀释法进行稀释，例如1:10、1:50、1:250、1:1250。同时把rVSV-GFP-SARS-CoV-2病毒稀释至2×103FFU/ml，使得最终每孔病毒数为100FFU。在空的96孔板中，每孔加入等量的上述已稀释好的病毒液后，按照相应的稀释比例将血清以相同量逐一加入，然后混匀，混匀后血清稀释倍数相应地变为原始稀释数的二倍。室温孵育30min后，取100μl混合液覆盖到Vero细胞层。2小时后更换含20mM NH4Cl的培养基，24小时后在荧光显微镜下读取各孔的GFP阳性细胞数。根据Reed Muench方法计算中和抗体滴度(FRNT50)。计算公式：FRNT50＝【1/10】(小于50％细胞感染数稀释倍数的对数+距离比例×稀释系数的对数)。距离比例＝(50％-小于50％细胞感染数阳性率)/(大于50％细胞感染数阳性率-小于50％细胞感染数阳性率)。稀释系数即为倍比稀释梯度。
2、重组病毒rVSV-RABV G-G ΔM51候选疫苗的传播安全性
为了验证感染高剂量VSV载体重组病毒的动物不易传播给未感染动物，是一种生态安全的疫苗载体，我们利用BALB/c小鼠进行了实验。首先通过肌肉注射途径向两只小鼠每只接种106FFU病毒，将该接种小鼠与三只未接种小鼠共同饲养。设置两组重复，即图4中组1，组2。如图4所示，饲养期间未发现接触对照鼠体重下降，按照实施例2病毒核酸检测方法，血液中未检测到疫苗病毒的脱落。这表明，即使长时间接触后VSV载体重组病毒也无法轻易传播给未接种动物。
实施例3、重组病毒rVSV-RABV G-G ΔM51感染埃及伊蚊检测
将实施例1制备的重组病毒rVSV-RABV G-G ΔM51（108FFU/ml）通过吸血方式接毒5-6日龄的埃及伊蚊。5-6日龄雌蚊在感染病毒之前需要饥饿16-24小时。吸血感染蚊子当天，将600 μl小鼠血液和病毒混合物（50%小鼠血液和50%病毒液）在37℃水浴锅中预热30min。然后将血液和病毒混合物加在喂血器中，喂血器连通37℃循环水浴设备，蚊子可以通过一层非常薄的封口膜刺吸病毒混合液30 min。蚊子吸饱血后放在4℃冰箱冷冻5-10分钟，待冻晕后置于冰上挑取饱血蚊虫，放于28℃恒温光照培养箱中饲养。10天之后取埃及伊蚊研磨检测单只埃及伊蚊体内的病毒滴度，检测方法与实施例1相同。结果如图5所示，单只埃及伊蚊的病毒滴度可达到105.5FFU/mL，唾液腺病毒滴度可达到103.3FFU/mL。
实施例4、重组病毒rVSV-RABV G-G ΔM51的免疫原性及保护效果检测
1、重组病毒rVSV-RABV G-G ΔM51口服途径免疫及保护效果
试验动物：BALB/c小鼠（维通利华实验动物技术有限公司，雌性，8周龄）。
试验方法：将实施例1制备的重组病毒rVSV-RABV G-G ΔM51通过口服途径接种BALB/c小鼠，分为107FFU及106FFU 两个剂量，单次免疫，每组12只小鼠。在接种后28天取血，检测中和抗体滴度。中和抗体滴度检测根据中华人民共和国国家标准《动物狂犬病病毒中和抗体检测技术GB/T34739—2017》进行。并在28天时通过颅内注射的方式进行攻毒50LD50狂犬病毒CVS-11毒株，观察并记录小鼠的存活情况。结果如图6所示，口服方式单次免疫107FFU或106FFU，小鼠的中和抗体滴度均高于WHO定义的狂犬病病毒免疫替代水平（RVNA≥0.5IU），且可以完全保护小鼠免受狂犬病病毒的攻击。
2、重组病毒rVSV-RABV G-G ΔM51通过埃及伊蚊递送途径免疫小鼠
将实施例1制备的重组病毒rVSV-RABV G-G ΔM51通过吸血方式接毒埃及伊蚊。经喂食或叮咬途径免疫小鼠，每组12只小鼠。通过喂食免疫的实验组中，将感染12天之后的埃及伊蚊分为每20只一管研磨，每只小鼠喂食一管研磨液。通过叮咬免疫的实验组中，将感染12天之后的埃及伊蚊分为12笼，每笼20只，每笼叮咬一只BALB/c小鼠，每隔28天叮咬一次，共叮咬2次。在接种后28天取血，检测中和抗体滴度。中和抗体滴度检测根据中华人民共和国国家标准《动物狂犬病病毒中和抗体检测技术GB/T34739—2017》进行。并在28天时通过颅内注射的方式进行攻毒50LD50狂犬病毒CVS-11毒株，观察并记录小鼠的存活情况。结果如图7所示，通过喂食途径免疫的小鼠中和抗体滴度均高于WHO定义的狂犬病病毒免疫替代水平（RVNA≥0.5IU），且可以完全保护小鼠免受狂犬病病毒的攻击，叮咬途径免疫的小鼠攻毒后保护率可达60%。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (10)

1.重组病毒，其特征在于，所述重组病毒为表达狂犬病病毒G蛋白的重组水疱性口炎病毒。
2.根据权利要求1所述的重组病毒，其特征在于，所述狂犬病病毒G蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.根据权利要求1或2所述的重组病毒，其特征在于，所述重组病毒含有编码权利要求1或2中所述狂犬病病毒G蛋白的核酸分子，所述核酸分子位于水疱性口炎病毒的M蛋白基因和G蛋白基因之间。
4.制备权利要求1-3中任一所述重组病毒的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
A1）将编码权利要求1或2中所述狂犬病病毒G蛋白的核酸分子导入到水疱性口炎病毒载体中，得到表达狂犬病病毒G蛋白的重组水疱性口炎病毒载体；
A2）将所述重组水疱性口炎病毒载体经病毒拯救得到所述重组病毒。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，A1）中所述导入是将所述核酸分子导入到所述水疱性口炎病毒载体的M蛋白基因和G蛋白基因之间。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述水疱性口炎病毒载体为rVSV-G ΔM51。
7.权利要求4-6中任一所述的重组水疱性口炎病毒载体。
8.由权利要求1-3中任一所述的重组病毒或权利要求7所述的重组水疱性口炎病毒载体制备得到的疫苗。
9.权利要求1-3中任一所述的重组病毒或权利要求7所述的重组水疱性口炎病毒载体在制备预防狂犬病病毒感染或狂犬病的产品中的应用。
10.一种制备用于免疫的昆虫的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求1-3中任一所述的重组病毒感染昆虫，获得所述用于免疫的昆虫。
CN202411261067.0A 2024-09-10 2024-09-10 基于水疱性口炎病毒载体的狂犬病毒疫苗 Pending CN119040279A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202411261067.0A CN119040279A (zh) 2024-09-10 2024-09-10 基于水疱性口炎病毒载体的狂犬病毒疫苗

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202411261067.0A CN119040279A (zh) 2024-09-10 2024-09-10 基于水疱性口炎病毒载体的狂犬病毒疫苗

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN119040279A true CN119040279A (zh) 2024-11-29

Family

ID=93585122

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202411261067.0A Pending CN119040279A (zh) 2024-09-10 2024-09-10 基于水疱性口炎病毒载体的狂犬病毒疫苗

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN119040279A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101715418B1 (ko) 뉴캐슬 질환 바이러스-벡터를 이용한 조류 백신
CN100447247C (zh) 重组的感染性不分节段的负链rna病毒
CN113186173B (zh) 一种基于减毒流感病毒载体的新型冠状病毒肺炎疫苗
CN104988124B (zh) 基因ⅶ型新城疫病毒标记疫苗株及其应用
JP6956965B2 (ja) サイレント変異を有する組換えｒｓｖ、ワクチン、およびそれに関連する方法
CN108546302B (zh) 一种复合多表位表达盒、其组成的重组病毒及应用
CN102373180B (zh) 表达禽流感病毒血凝素(ha)基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株及其构建方法和应用
CN108715866B (zh) 一种重组病毒载体、疫苗及其制备方法与应用
CN102533674B (zh) 表达禽流感病毒血凝素基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株及其构建方法和应用
TW201701900A (zh) 二價豬流感病毒疫苗
US11730805B2 (en) Paramyxoviridae expression system
CN102533675B (zh) 表达尼帕脑炎病毒F蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株
CN110218706B (zh) 表达h7n9亚型高致病性禽流感病毒ha蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建与应用
CN102559610B (zh) 表达禽流感病毒血凝素基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株及其构建方法和应用
KR102154796B1 (ko) 변이 뉴캣슬병 바이러스 및 상기 바이러스를 이용한 조류 백신
KR102154794B1 (ko) 조류 인플루엔자 바이러스 h9n2의 표면항원을 발현하는 뉴캣슬병 바이러스 발현 시스템 및 이를 이용한 조류 백신
CN104628865B (zh) 一种伪狂犬表位多肽基因工程疫苗
KR20110092316A (ko) 재조합 불활성화 바이러스 벡터 백신
US20220125909A1 (en) Chimeric rsv and hmpv f proteins, immunogenic compositions, and methods of use
CN109439633B (zh) 一种插入h7n9的ha蛋白的新城疫病毒重组疫苗株
CN114807195B (zh) 一种提高狂犬病病毒耐热稳定性和免疫效果的融合基因、重组狂犬病病毒及其应用
CN119040279A (zh) 基于水疱性口炎病毒载体的狂犬病毒疫苗
KR102154795B1 (ko) 조류 인플루엔자 바이러스 h5n6의 표면항원을 발현하는 뉴캣슬병 바이러스 발현 시스템 및 이를 이용한 조류 백신
CN111647610B (zh) 一种互换ha和ns1缺失基因包装信号的h9n2亚型禽流感病毒及其构建方法和应用
CN101376879A (zh) 表达牛干扰素(α、β或γ-干扰素)的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination