CN119033914A - Reelin蛋白在制备治疗视网膜损伤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种Reelin蛋白在制备治疗视网膜损伤药物中的应用，涉及蛋白药物技术领域，将Reelin蛋白应用于制备治疗视网膜损伤药物，通过改善视网膜损伤后视网膜组织形态异常、视网膜损伤后视网膜视神经细胞死亡、视网膜损伤后视网膜功能障碍和视网膜损伤后视网膜细胞凋亡以调节视网膜缺血再灌注损伤过程。将Reelin蛋白用于制备治疗视网膜损伤药物可以为治疗视网膜缺血再灌注损伤的一种新型药物提供了依据。

Description

Reelin蛋白在制备治疗视网膜损伤药物中的应用

技术领域

本发明涉及蛋白药物技术领域，特别是涉及一种Reelin蛋白在制备治疗视网膜损伤药物中的应用。

背景技术

缺血再灌注(Ischemia-reperfusion，IR)损伤是一类高发病率、高致残率和高死亡率的病理改变，除了会发生在大脑、心脏、肾脏等重要器官引发严重后果，还会参与至多种视网膜疾病中，在视网膜IR损伤的诊疗工作中，以视网膜血流恢复后组织损伤进一步加重为主要表现。在缺乏有效治疗的情况下，视网膜IR损伤会造成神经元逐渐丢失，导致视网膜形态和功能的改变，并最终导致视力丧失。

视网膜IR损伤导致视网膜细胞的氧和营养供应降低，最终引起组织发生氧化应激、炎症、免疫反应和钙超载等进而引起神经元细胞的死亡。神经元的死亡包括细胞凋亡、铁死亡和自噬等，其中细胞凋亡被看作IR损伤后视网膜受损的主要机制之一，且主要经由线粒体介导的内源性细胞凋亡途径完成，因而抑制这一途径中的相关凋亡蛋白的表达将有助于视网膜IR损伤的防治。

在人和小鼠中，Reln基因编码一种细胞外大分子基质糖蛋白—Reelin蛋白，该糖蛋白在哺乳动物中枢神经系统中起重要作用，但Reelin蛋白如何在视网膜IR损伤中的发挥作用，以及是否可以用于治疗视网膜IR损伤均不明确。

因此，本发明提出一种外源性重组蛋白Reelin在制备治疗视网膜缺血再灌注损伤药物中的应用以解决上述问题。

发明内容

本发明提供一种Reelin蛋白在制备治疗视网膜损伤药物中的应用，以解决Reelin蛋白如何在视网膜IR损伤中的发挥作用，以及是否可以用于治疗视网膜IR损伤的问题。

在本发明实施例第一方面提出一种Reelin蛋白在制备治疗视网膜损伤药物中的应用。

在本发明可选地一实施例中，所述Reelin蛋白通过改善视网膜损伤后视网膜组织形态异常以调节视网膜缺血再灌注损伤过程。

在本发明可选地一实施例中，所述Reelin蛋白通过改善视网膜损伤后视网膜视神经细胞死亡以调节视网膜缺血再灌注损伤过程。

在本发明可选地一实施例中，所述Reelin蛋白通过改善视网膜损伤后视网膜功能障碍以调节视网膜缺血再灌注损伤过程。

在本发明可选地一实施例中，所述Reelin蛋白通过改善视网膜损伤后视网膜细胞凋亡以调节视网膜缺血再灌注损伤过程。

在本发明可选地一实施例中，所述Reelin蛋白通过Dab1-Pi3k/Akt途径调节视网膜缺血再灌注损伤过程。

在本发明可选地一实施例中，所述Reelin蛋白通过引起细胞内Dab1蛋白的磷酸化，以激活Pi3k/Akt通路抑制损伤后视网膜细胞凋亡。

在本发明实施例第二方面提供一种用于治疗视网膜损伤的药物，所述药物的活性成分为Reelin蛋白。

在本发明可选地一实施例中，所述药物还包括药学上可接受的载体，所述药学上可接受的载体至少包括生理盐水或PBS。

在本发明可选地一实施例中，所述药物的给药剂量范围为300ng/ul～500ng/ul。

本发明包括以下优点：本发明实施例提供一种Reelin蛋白在制备治疗视网膜损伤药物中的应用，将Reelin蛋白应用于制备治疗视网膜损伤药物，通过改善视网膜损伤后视网膜组织形态异常、视网膜损伤后视网膜视神经细胞死亡、视网膜损伤后视网膜功能障碍和视网膜损伤后视网膜细胞凋亡以调节视网膜缺血再灌注损伤过程。其中，所述Reelin蛋白通过引起细胞内Dab1蛋白的磷酸化，以激活Pi3k/Akt通路抑制损伤后视网膜细胞凋亡。将Reelin蛋白用于制备治疗视网膜损伤药物可以为治疗视网膜缺血再灌注损伤的一种新型药物提供了依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例的描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的一种小鼠视网膜IR损伤模型示意图；

图2是本发明实施例提供的一种视网膜局部Reln基因敲低小鼠模型的效果图；

图3是本发明实施例提供的一种视网膜IR损伤小鼠模型中Reln基因的表达结果图；

图4是本发明实施例提供的一种Reln基因调控视网膜组织损伤修复结果图；

图5是本发明实施例提供的一种视网膜IR损伤后Reln基因通过Dab1-Pi3k/Akt通路促进IR后细胞凋亡的结果图；

图6是本发明实施例提供的一种Reelin蛋白促进视网膜组织损伤修复结果图；

图7是本发明实施例提供的一种视网膜IR损伤后Reelin蛋白通过Dab1-Pi3k/Akt通路抑制细胞凋亡结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

缺血再灌注(Ischemia-reperfusion，IR)损伤是一类高发病率、高致残率和高死亡率的病理改变，其本质是缺血组织在血流再灌注的基础上，由炎症因子、炎症细胞和氧自由基等引起的组织损伤。发生在大脑、心脏、肾脏等重要器官的IR损伤会导致严重后果，包括脑卒中、心肌梗死和急性肾损伤。IR损伤也参与到多种视网膜疾病中，例如视网膜血管阻塞、糖尿病视网膜病变、青光眼和早产儿视网膜病变等。视网膜IR损伤是临床眼科诊疗工作中多发的一类病理损伤过程，以视网膜血流恢复后组织损伤进一步加重为主要表现。由于缺乏有效治疗，视网膜IR损伤会造成神经元逐渐丢失，视网膜形态、功能改变，并最终导致视力丧失。因此，IR损伤的防治一直是眼科学领域的研究热点，探究视网膜IR损伤的机制并研究有效的防治方法将为视网膜IR损伤的防治提供新思路。

视网膜IR损伤导致视网膜细胞氧和营养供应降低，最终引起组织发生氧化应激、炎症、免疫反应和钙超载等进而引起神经元细胞死亡。神经元的死亡可由不同机制触发，包括细胞凋亡、铁死亡和自噬等。其中，细胞凋亡被看作IR损伤后视网膜受损的主要机制之一，且主要经由线粒体介导的内源性细胞凋亡途径完成，因而抑制这一途径中的相关凋亡蛋白的表达将有助于视网膜IR损伤的防治。

在人和小鼠中，Reln基因编码一种细胞外大分子基质糖蛋白—Reelin蛋白，该糖蛋白在哺乳动物中枢神经系统中起重要作用，在胚胎发育期可调节神经元的径向迁移，树突、树突棘的成熟；成年期可维持突触可塑性、调控神经信号传递和突触发生。近期的研究结果显示，Reelin蛋白在内皮细胞和神经元中的信号传导、整合，促进了血管、神经胶质细胞和神经元之间的通信，这种整合对于成熟视网膜血管屏障完整性至关重要。作为中枢神经系统的延伸，Reln基因在视觉系统中的报道目前主要集中在视网膜，Reelin蛋白在成年视网膜中的表达主要位于RGCs(Retinal ganglion cells，视网膜神经节细胞)/RBCs(redblood cell life span，视网膜双极细胞)中。研究表明Reln信号通路与兴奋性和抑制性突触机制的成熟有关，这些突触机制影响着出生后发育过程中视网膜神经网络的发展和微调。相关研究表明，在中枢神经系统中Reelin蛋白能够通过抑制凋亡而促进神经元细胞存活，并在脑缺血再灌注损伤中发挥保护作用。然而，Reln基因以及Reelin蛋白如何在小鼠视网膜IR损伤中的发挥作用，以及相关作用机制的研究仍然是未知的。

因此，本发明提出一种外源性重组蛋白Reelin在制备治疗视网膜缺血再灌注损伤药物中的应用以解决上述问题。

在本发明实施例第一方面提出一种Reelin蛋白在制备治疗视网膜损伤药物中的应用。其中，Reelin蛋白是Reln基因编码的高度保守的细胞外基质糖蛋白，是神经元迁移和突触发生的重要调节因子，Reln信号通路调节视网膜神经节细胞(retinal ganglioncell，RGC)树突靶向投射于中枢神经元。外源性重组蛋白reelin是一种细胞外基质蛋白，可以通过市售途径购买获得。

基于上述第一方面提出的应用，所述Reelin蛋白通过改善视网膜损伤后视网膜组织形态异常以调节视网膜缺血再灌注损伤过程，所述Reelin蛋白通过改善视网膜损伤后视网膜视神经细胞死亡以调节视网膜缺血再灌注损伤过程，所述Reelin蛋白通过改善视网膜损伤后视网膜功能障碍以调节视网膜缺血再灌注损伤过程，所述Reelin蛋白通过改善视网膜损伤后视网膜细胞凋亡以调节视网膜缺血再灌注损伤过程，其中，缺血再灌注损伤是缺血所引的组织损伤是致死性疾病的主要原因，诸如冠动脉硬化导致的心肌梗死、脑卒中等。在缺血性疾病抢救和治疗过程中，对组织造成损伤的主要因素，不是缺血本身，而是恢复血液供应后，过量的自由基攻击这部分重新获得血液供应的组织内的细胞造成的，这种损伤，叫做“组织缺血再灌注损伤”。

基于上述第一方面提出的应用，所述Reelin蛋白通过Dab1-Pi3k/Akt途径调节视网膜缺血再灌注损伤过程，具体为，所述Reelin蛋白通过引起细胞内Dab1蛋白的磷酸化，以激活Pi3k/Akt通路抑制损伤后视网膜细胞凋亡。

本发明实施例在第二方面提出一种用于治疗视网膜损伤的药物，所述药物的活性成分为Reelin蛋白，所述药物中还包括生理盐水或PBS等药学上可接受的载体，上述药物可以通过玻璃体腔注射给药，给药的剂量范围为300ng/ul～500ng/ul，该给药剂量是通过实验得到的。

本发明实施例提供一种Reelin蛋白在制备治疗视网膜损伤药物中的应用，将Reelin蛋白应用于制备治疗视网膜损伤药物，通过改善视网膜损伤后视网膜组织形态异常、视网膜损伤后视网膜视神经细胞死亡、视网膜损伤后视网膜功能障碍和视网膜损伤后视网膜细胞凋亡以调节视网膜缺血再灌注损伤过程。其中，所述Reelin蛋白通过引起细胞内Dab1蛋白的磷酸化，以激活Pi3k/Akt通路抑制损伤后视网膜细胞凋亡。将Reelin蛋白用于制备治疗视网膜损伤药物可以为治疗视网膜缺血再灌注损伤的一种新型药物提供了依据。

由于在中枢神经系统中Reelin蛋白能够通过抑制凋亡而促进神经元细胞存活，并在脑缺血再灌注损伤中发挥保护作用。然而，Reln基因如何在小鼠视网膜IR损伤中的发挥作用，以及相关作用机制的研究仍然是未知的，首先本发明构建小鼠模型并验证Reln基因在小鼠视网膜IR损伤中的作用机制。

实施例1：小鼠模型的构建与分组

A：视网膜IR损伤模型的构建

选择小鼠作为视网膜IR损伤模型的构建对象，上述小鼠采用的是6-8周龄，体重16-22g的健康C57BL/6J野生型雄性小鼠(购自北京斯贝福实验动物技术有限公司)。将含有平衡盐溶液的33号针插入前房，以保持眼压(Intraocular pressure，IOP)在110mmHg下60分钟。作为对照的假手术组在不升高眼压的情况下进行。60分钟后，通过小心地拔出针头使IOP恢复正常。为了防止细菌感染，使用妥布霉素眼膏(Alcon，美国)对其进行处理。IR损伤后3d与7天对小鼠进行过量麻醉，并摘除其眼球。

对视网膜铺片进行荧光染色的操作具体为：I/R损伤后7天，如上所述收集眼球，去除眼球后部肌肉及结缔组织等眼球附属组织，置于4％多聚甲醛固定液中进行固定3小时，在体视显微镜下用15°眼科手术穿刺刀在角巩膜缘处做穿刺口，用显微弹簧剪从穿刺口沿角巩膜缘剪开，去除角膜、虹膜、晶状体、玻璃体，将眼杯以视神经为中心，放射状均匀剪开，分为4部分，巩膜面朝上置于载玻片上，剪去视神经及巩膜与视神经移形处，使视网膜与葡萄膜完全脱离，去除巩膜、葡萄膜及视网膜上残留的色素组织，将分离后的视网膜放入0.1％ PBST(洗涤缓冲液)中漂洗后经50％、100％甲醇梯度脱水，山羊血清于室温封闭1小时，加入RBPMS Polyclonal antibody(15187-1-AP，proteintech)后4℃避光孵育24h，0.1％ PBST漂洗后加入二抗Goat anti-Rabbit IgG(H+L)Cross-Adsorbed SecondaryAntibody(A-11011，Thermo Fisher Scientific)室温避光孵育1h，将视网膜平铺在载玻片上，采用含有DAPI的抗荧光淬灭封片剂封片(ab104139；Abcam)。高内涵成像系统下拍摄与分析(Operetta CLS,PerkinElmer,UK)。

对视网膜进行光学相干层析成像的操作如下：

将小鼠固定并麻醉(腹腔注射15mL/kg 1％戊巴比妥钠+20μl 10％速眠新)后置于升降台上，使用复方托吡卡胺滴眼液散瞳，盐酸奥布卡因滴眼液进行眼表麻醉后将医用卡波姆滴眼液凝胶(Dr.Gerhard Mann,Chem.-Pharm.Fabrik GmbH，德国)涂于待测眼角膜上，将眼科超显微成像系统(OPTOPROBE，英国)光源调整聚焦，调整镜头焦点至视网膜对其进行光学相干断层扫描。然后，使用OptoProbe Research Ltd.的软件(2.0版)分析总视网膜厚度(从内界膜到视网膜色素上皮)。在距视盘外200微米到300微米范围内随机选取4点测量并取平均值。

构建的视网膜IR损伤模型参阅图1，图1为本发明实施例提供的一种小鼠视网膜IR损伤模型示意图，图1中A部分为IR损伤前后小鼠模型前房33G针注射代表性图，图1中B部分为眼底照相显示IR损伤视网膜图，可见，IR损伤后小鼠视网膜血管间歇性供血，周围视网膜萎缩，透见脉络膜，图1中C部分为IR损伤前后视网膜铺片代表性荧光染色图，可见RBPMS(RNAbinding protein with multiple splicing，一种可用于各种RGC变性模型中的RGC定量的标记物)阳性RGC分布情况(参见图中橙色标记)，RGC数量明显减少，图1中D部分为IR损伤后OCT(Optical Coherence Tomography，光学相干断层扫描技术)扫描的视网膜图，可见IR损伤后小鼠的视网膜明显变薄(图中Ctrl为对照组)。

B：视网膜局部Reln基因敲低小鼠模型的构建

使用腺相关病毒(AAV-2/9-shRNA-Reln，HANBIO，中国)局部敲低小鼠视网膜Reln基因的表达。上述小鼠采用的是6-8周龄，体重16-22g的健康C57BL/6J野生型雄/雌性小鼠(购自北京斯贝福实验动物技术有限公司)，在造模开始前3周，将装载有特异性靶标的腺相关病毒(AAV)溶液(2μL，1.0×10¹²vg/ml)注射到玻璃体中，够建视网膜局部Reln基因敲低小鼠模型。AAV病毒携带增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP)，Reln基因的siRNA的靶序列为CCAGGATACATGATGCAATTT。

参阅图2，图2为本发明实施例提供的一种视网膜局部Reln基因敲低小鼠模型的效果图，图2中A部分为将AAV通过玻璃体腔3周后的小鼠模型的视网膜感染效果图，可参阅图中绿色的部分即为AAV自带的EGFP，其中，比例尺为40微米。图2中B部分为Reln mRNA的表达结果图，NC为空白对照组，AAV-EGFP为AAV病毒携带增强型绿色荧光蛋白标记组，AAV-Reln为腺相关病毒局部敲低小鼠视网膜Reln基因组，可见，在AAV-Reln组的Reln基因的表达量明显低于NC组和AAV-EGFP组。因此，通过腺相关病毒AAV-2/9-shRNA-Reln可以局部敲低小鼠的Reln基因表达，成功构建视网膜局部Reln基因敲低小鼠模型。

其中，玻璃体腔注射给药的操作具体如下：

将小鼠麻醉后，复方托吡卡胺滴眼液(Santen Pharmaceutical Co.,Ltd，日本)瞳孔扩张5分钟。使用34G的微型注射器(Hamilton，Switzerland)收集准确的2μl外源性重组小鼠Reelin蛋白、PBS、AAV-shReln和AAV-EGFP，然后从颞上象限(距离角膜巩膜边缘约1毫米)缓慢刺入眼球，并且针尖朝向视乳头以避免刺破晶状体。从扩张的瞳孔中可以明显看出，针尖位于玻璃体腔内，将药物缓慢推入，直至将所有药物推入，拔出针尖完成注射给药。

C：实验分组

将实验小鼠分成Reelin蛋白组和Reln基因敲低组2组。其中，Reelin蛋白组的小鼠在造模前24h随机向玻璃体腔注射2ul外源性重组小鼠Reelin蛋白(300ng/μL，R&DSystems,美国)和2ul PBS，将小鼠分为Reelin组和PBS组，并对其进行视网膜IR损伤模型的构建，将造模后的小鼠分为Reelin-IR组和PBS-IR组。Reln基因敲低组的小鼠在造模开始前3周随机向玻璃体腔注射2ul AAV-shReln和AAV-EGFP，将小鼠分为AAV-shReln组和AAV-EGFP组，并对其进行视网膜IR损伤模型的构建，将造模后的小鼠分为AAV-shReln-IR组和AAV-EGFP-IR组。

实施例2：Reln基因在视网膜IR损伤后的表达

采用Reln-CreERT2 mTmG小鼠在他莫昔芬诱导后Reln阳性细胞和其子代细胞均永久表达绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Proteins，EGFP)荧光的特性，研究Reln基因在视网膜稳态及IR损伤后的表达情况，其中，mTmG为全身呈现为红色的基因鼠。通过对该小鼠的眼球样本进行冰冻切片和共聚焦显微镜观察，发现Reln阳性细胞的EGFP信号在视网膜的内颗粒层、内丛状层和神经节细胞层均有表达。

免疫荧光染色的操作如下：小鼠眼球在4％多聚甲醛中固定过夜，分级蔗糖溶液脱水后包埋在OCT包埋剂中放入液氮速冻。经视神经平面的5微米厚的视网膜冷冻切片，用0.3％ Triton X-100(solarbio，中国)溶液透膜，山羊血清封闭1小时后与一抗孵育过夜。一抗为Reelin Polyclonal Antibody(1:500，Thermo，美国)，随后用Alexa Fluor 488缀合的二抗(Thermo Fisher Scientific，MA，USA)室温下孵育2小时。采用含有DAPI的抗荧光淬灭封片剂封片(ab104139；abcam，英国)。使用Olympus VS200虚拟载玻片扫描显微镜(Olympus，日本)拍摄图像。

参阅图3，图3为本发明实施例提供的一种视网膜IR损伤小鼠模型中Reln基因的表达结果图(图中Ctrl和Control均为对照组)，图3中A部分为Reln-CreERT2 mTmG小鼠在视网膜IR损伤后不同时间点表达Reln阳性细胞及其后代结果图，图3中B部分为野生型小鼠视网膜IR损伤后不同时间点Reelin免疫荧光染色的代表性图。图3中C部分和D部分为视网膜内Reln阳性细胞百分比和Reelin免疫荧光强度统计结果图，图3中E部分为视网膜IR损伤后，Reln mRNA表达结果图。可见，视网膜IR损伤后，Reln表达先降低后升高，但仍然低于正常对照组表达水平。比例尺为40微米，数据用均值±标准差表示(n＝6)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

根据IR损伤后不同时间节点Reln-CreERT2 mTmG小鼠冰冻切片荧光图像结果，IR损伤后24h组EGFP荧光信号开始逐渐减弱，这种趋势在IR损伤后7天达到最低点，之后EGFP荧光信号开始逐渐增强直到损伤后28天，但均低于对照组水平(参阅图3中A部分和C部分，P＜0.05)。野生型小鼠的Reelin免疫荧光染色结果与上述结果完全一致(参阅图3中B部分和D部分)。此外，发明人使用qRT-PCR来确定Reln基因在视网膜IR损伤中的mRNA表达，结果显示IR损伤后24h和3天的Reln基因水平显著下降，IR损伤后7天、14天和28天视网膜Reln基因水平逐渐增加，但仍低于对照组水平(参阅图3中E部分，P＜0.05)。上述结果表明Reln基因水平在视网膜IR损伤后短期迅速降低，表明Reln基因可能在IR损伤中参与损伤调控过程并起重要作用。

实施例3：Reln基因调控视网膜组织损伤修复

为了验证Reln基因在IR损伤过程中的调控作用，首先需要构建Reln基因敲低小鼠，但由于Reln基因全突变小鼠(reeler小鼠)，通常在出生后1-2周死亡，且全身组织形态学改变，包括小脑发育不全、大脑皮质层和海马神经元层的结构混乱。因此本实施例选择通过造模前3周玻璃体腔注射AAV成功建立视网膜Reln基因敲低小鼠模型。进行IR损伤造模后7天对视网膜进行HE染色，测量并统计视网膜内层厚度。

具体的操作如下：I/R损伤后7天，如上所述收集眼球立即浸入4％ PFA(Polyfluoroalkoxy，可溶性聚四氟乙烯)过夜，并包埋在石蜡中。用苏木精和伊红(H&E)染色经视神经切面的五微米厚的切片，观察视网膜的结构变化。为了量化视网膜损伤，每只眼球随机选取4点测量距视盘外200微米到300微米范围视网膜内层厚度(内视网膜从内界膜延伸到外层丛状层的内缘)，并对数据进行平均。图像是用光学显微镜(Olympus)拍摄的。

该结果可参阅图4，图4为本实施例提供的一种Reln基因调控视网膜组织损伤修复结果图。图4中A部分为HE染色视网膜组织病理学结果图，图4中B部分为IR损伤收7天视网膜组织变化的代表性OCT图，图4中C部分为IR损伤后7天视网膜铺片代表性荧光染色结果图，图4中D部分为IR损伤后7天用FERG评估视觉功能的代表性振荡电位波形图，图4中E部分为视网膜内层厚度定量图(n＝6)，图4中F部分为视网膜总厚度定量结果图(n＝6)，图4中G部分为RBPMS阳性RGC的数量(n＝4)，图4中H部分为a波和b波振幅定量结果图(n＝6)，比例尺分别为20微米，100微米或1毫米，数据以均值±标准差表示，*P<0.05，***P<0.001。

可见，损伤后小鼠视网膜内层厚度显著变薄，并且Reln基因敲低小鼠损伤后视网膜内层厚度较阴性对照组进一步降低(参阅图4中A部分和E部分，P＜0.05)。同样的，发明人通过OCT对视网膜组织进行活体动态评估，结果显示Reln基因敲低小鼠损伤后的视网膜全层厚度也进一步下降(参阅图4中B部分和F部分，P＜0.05)。小鼠视网膜免疫荧光铺片染色结果显示AAV-shReln-IR组RGC密度较AAV-EGFP-IR组明显降低，全视网膜RGC计数也明显减少(参阅图4中C部分和G部分，P＜0.05)。且未损伤的AAV-shReln组视网膜厚度和RGC数量较AAV-EGFP组稍有降低，但没有统计学差异。之后，发明人通过闪光视网膜电图(Flashelectroretinogram，FERG)对视觉功能进行评估，结果显示与AAV-EGFP-IR组相比，AAV-shReln-IR组小鼠视网膜a波或b波振幅显著降低，此外，未损伤的AAV-shReln组视网膜a波或b波振较AAV-EGFP组也有所降低，且具有统计学差异(参阅图4中D部分和H部分，P＜0.05)。AAV-shReln介导的局部敲低Reln基因加重了IR损伤小鼠的表现，主要体现在小鼠视网膜厚度变薄，RGC细胞数量减少，视网膜功能障碍。由此可见，Reln基因可调控视网膜稳态和损伤修复，敲低视网膜Reln基因后，视网膜IR损伤进一步加重。

实施例4：Reln基因敲低通过Dab1-Pi3k/Akt通路促进细胞凋亡

如实施例2和实施例3所述，Reln基因敲低促进了IR损伤后小鼠视网膜RGC的死亡，为了阐明Reln基因在小鼠视网膜IR损伤中的作用机制，通过TUNEL染色评估了Reln基因局部敲低对细胞凋亡的影响。

具体操作如下：I/R损伤后3天，如上所述收集眼球，使用TUNEL试剂盒(C1090中国江苏Beyotime)对视网膜冷冻切片进行染色。用4％PFA固定细胞30分钟。PBS洗涤20分钟，0.5％ Triton X-100室温透膜5分钟，在样本上滴加TUNEL检测液(TDT酶+荧光标记液)，37℃避光孵育60分钟。采用含有DAPI的抗荧光淬灭封片剂封片。使用Olympus VS200虚拟载玻片扫描显微镜(Olympus)拍摄图像。

该结果参阅图5，图5为本发明实施例提供的一种视网膜IR损伤后Reln基因通过Dab1-Pi3k/Akt通路促进IR后细胞凋亡的结果图，图5中A部分为IR损伤后3天AAV-shReln小鼠视网膜冰冻切片的代表性TUNEL染色图，图5中B部分为TUNEL阳性细胞的定量结果图(n＝6)，图5中C部分为IR损伤后3天Reln局部敲低对视网膜Dab1、p-Dab1、Pi3k、Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3影响的代表性印迹图，图5中D部分为IR损伤后3天Reln局部敲低对视网膜Dab1、p-Dab1、Pi3k、Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3的蛋白水平的定量分析结果图，标尺为40微米，数据以均值±标准差表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

在未IR损伤组的视网膜冰冻切片中基本观察不到TUNEL阳性细胞，但在IR损伤后7天小鼠视网膜中TUNEL阳性细胞明显增多，且Reln基因局部敲低后TUNEL阳性细胞显著增加(参阅图5中A部分和B部分，P＜0.05)，表明Reln基因敲低促进IR损伤后细胞凋亡。为了进一步探究其作用机制，根据单细胞转录组分析结果，对样本进行Western Blot实验。

具体操作如下：I/R损伤后3天，如上所述收集眼球并在手术显微镜下分离出视网膜，用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液(Radio Immunoprecipitation Assay Lysisbuffer，放射免疫沉淀法裂解缓冲液)充分裂解并从裂解的样品中提取视网膜总蛋白。用BCA蛋白检测试剂盒(Promega，Madison，WI，USA)测定蛋白浓度。蛋白样品在10％聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离，然后使用转印半干系统将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。在室温下用5％脱脂牛奶封闭0.5h后，将膜与一抗：anti-phospho-Dab1(ab78200；Abcam),anti-Dab1(ab111684；Abcam),anti-Pi3k(ab302958；Abcam),anti-phospho-Akt(4060S；CellSignaling Technology,Massachusetts,USA),anti-pan-Akt(ab8805；Abcam),anti-Bcl-2(ab182858；Abcam),anti-Bax(ab32503；Abcam),anti-cleaved caspase-3(9661S；CellSignaling Technology),and anti-β-actin(66009-1,Proteintech,Rosemont,IL,USA)。4℃孵育过夜，随后在室温下与HRP缀合的二抗一起孵育2小时。使用ChemiDoc^TMMP成像系统(Bio-Rad)对蛋白质条带进行拍摄。并通过ImageJ软件(https://imagej.nih.gov/ij/)进行分析。

结果发现AAV-shReln-IR组与AAV-EGFP-IR组AKT蛋白表达水平无明显变化，但AAV-shReln-IR组磷酸化相关蛋白p-Akt以及Pi3k表达则显著低于AAV-EGFP-IR组，并且细胞凋亡相关蛋白Caspase-3表达和Bax/Bcl2比值明显高于AAV-EGFP-IR组(参阅图5中C部分和D部分，P＜0.05)。此外，AAV-shReln-IR组与AAV-EGFP-IR组Dab1蛋白表达水平无明显变化，但AAV-shReln-IR组的p-Dab1蛋白表达显著低于AAV-EGFP-IR组。由此可见，Reln基因的敲低导致视网膜IR损伤后Dab1蛋白的磷酸化降低，并可抑制Pi3k-Akt通路激活从而促进损伤后视网膜细胞凋亡。

从实施例2至实施例4的结果可以看出，Reln基因局部敲低后，小鼠视网膜厚度变薄，RGC细胞数量减少，视网膜功能障碍，导致视网膜IR损伤进一步加重。且Reln基因的敲低导致视网膜IR损伤后Dab1蛋白的磷酸化降低，并可抑制Pi3k-Akt通路激活从而促进损伤后视网膜细胞凋亡。为了进一步确认Reelin蛋白在IR损伤中的潜在治疗作用，对IR损伤小鼠模型进行Reelin蛋白的注射，以探究其对视网膜组织的损伤修复作用。

实施例5：Reelin蛋白促进视网膜组织损伤修复

为了确定Reelin蛋白在IR损伤中的潜在治疗作用，在造模前24h玻璃体腔给予外源性重组Reelin蛋白，并将玻璃体腔注射PBS作为对照组。具体操作参阅实施例1中的操作，此处不再赘述。然后，采用IR损伤后7天的小鼠的视网膜，并对其进行HE染色，测量与统计视网膜内层厚度，该结果参阅图6，图6为本发明实施例提供的一种Reelin蛋白促进视网膜组织损伤修复结果图，图6中A部分为HE染色视网膜组织病理学检查结果图，图6中B部分为视网膜组织的代表性OCT图像显示IR损伤后7天的变化结果图，图6中C部分为IR损伤后7天视网膜铺片表性荧光染色显示RBPMS阳性RGC(橙色)分布结果图，图6中D部分为IR损伤后7天通过FERG评估视觉功能的代表性振荡电位波形结果图，图5中E部分为视网膜内厚度定量结果图(n＝6)，图6中F部分为视网膜总厚度定量结果图(n＝6)，图6中G部分为RBPMS阳性RGC数量(n＝4)，图6中H部分为a波和b波振幅定量结果图(n＝6)，比例尺为20微米，100微米或1毫米，数据以均值±标准差表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

可见，IR损伤组小鼠视网膜内层厚度较未损伤组显著降低，IR损伤7天后小鼠视网膜内层厚度明显减少，并且这种IR诱导的视网膜内层变薄在给予外源性reelin蛋白的小鼠中得到显著改善(参阅图6中A部分和E部分，P＜0.05)。之后，发明人通过OCT对视网膜组织进行活体动态评估，结果显示Reelin蛋白对损伤后的视网膜全层厚度也具有保护作用(参阅图6中B部分和F部分，P＜0.05)。对小鼠视网膜进行免疫荧光铺片染色发现IR损伤后7天小鼠视网膜RGC数量较未损伤组显著减少，Reelin蛋白的补充对损伤后RGC具有显著的保护作用，体现在Reelin-IR组的RGC计数较PBS-IR组明显增加(参阅图6中C部分和G部分，P＜0.05)。此外，通过FERG(flash electroretinogram，闪光视网膜电图，是视网膜神经元受到光刺激时，在角膜端纪录到的一组电位变化，它的波形产生是视网膜多种神经元共同作用的结果)对视觉功能进行评估，结果显示IR损伤后小鼠视网膜a波或b波振幅均显著下降，而与PBS-IR组小鼠相比，Reelin-IR组小鼠视网膜a波或b波振幅均显著增加(参阅图6中D部分和H部分，P＜0.05)。而且未IR损伤的Reelin组相较于PBS组的b波振幅稍有增加，但没有统计学差异。综上所述，适当的Reelin蛋白的补充可促进视网膜组织修复，体现在可减轻IR损伤后视网膜厚度变薄、RGC减少和视网膜功能障碍，因此，Reelin蛋白可作为一个新的损伤修复干预靶点用于视网膜疾病的治疗。

实施例6：Reelin蛋白通过Dab1-Pi3k/Akt通路抑制细胞凋亡

如实施例5所述，Reelin蛋白抑制了IR损伤后小鼠视网膜RGC的死亡，为了阐明Reelin蛋白诱导的神经保护机制，通过TUNEL染色评估了Reelin蛋白对细胞凋亡的影响，该结果参阅图7，图7为本发明实施例提供的一种视网膜IR损伤后Reelin蛋白通过Dab1-Pi3k/Akt通路抑制细胞凋亡结果图，其中，图7中A部分为IR损伤后3天视网膜冰冻切片的代表性TUNEL染色图，图7中B部分为TUNEL阳性细胞的定量(n＝6)，图7中C部分为IR损伤后3天，Reelin蛋白治疗对视网膜Dab1、p-Dab1、Pi3k、Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3影响的代表性印迹图，图7中D部分为IR损伤后3天，Reelin蛋白治疗对视网膜Dab1、p-Dab1、Pi3k、Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3蛋白水平的定量分析结果图，标尺为40微米，数据用均值±标准差表示(n＝3)，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001,****P<0.0001.。

在未损伤组的视网膜冰冻切片中基本没有观察到TUNEL阳性细胞，但在IR损伤后7天小鼠视网膜中TUNEL阳性细胞明显增多，在Reelin-IR组中TUNEL阳性细胞显著减少(参阅图7中A部分和B部分，P＜0.05)，表明Reelin蛋白能有效抑制损伤后的视网膜细胞凋亡。为了进一步探究Reelin蛋白的抗凋亡作用机制，根据单细胞转录组分析结果，对样本进行Western Blot实验，结果发现Reelin-IR组与PBS-IR组AKT蛋白表达水平无明显变化，但Reelin-IR组磷酸化相关蛋白p-Akt以及Pi3K表达则显著高于PBS-IR组，而细胞凋亡相关蛋白Caspase-3表达和BAX/BCL2的比值明显低于PBS-IR组(参阅图7中C部分和D部分，P＜0.05)。此外，Reelin-IR组与PBS-IR组Reln经典信号通路通过中的Dab1蛋白表达水平无明显变化，但Reelin-IR组磷酸化相关蛋白p-Dab1表达显著高于PBS-IR组。由此可见，视网膜IR损伤后Reelin蛋白的补充可以引起Dab1蛋白的磷酸化发挥生物学作用，并且可能通过激活Pi3k-Akt通路抑制损伤后视网膜细胞凋亡。

本发明实施例提供一种Reelin蛋白在制备治疗视网膜损伤药物中的应用，将Reelin蛋白应用于制备治疗视网膜损伤药物，通过改善视网膜损伤后视网膜组织形态异常、视网膜损伤后视网膜视神经细胞死亡、视网膜损伤后视网膜功能障碍和视网膜损伤后视网膜细胞凋亡以调节视网膜缺血再灌注损伤过程。其中，所述Reelin蛋白通过引起Dab1蛋白的磷酸化，以激活Pi3k-Akt通路抑制损伤后视网膜细胞凋亡。将Reelin蛋白用于制备治疗视网膜损伤药物可以为治疗视网膜缺血再灌注损伤的一种新型药物提供了依据。

以上对本发明所提供的一种Reelin蛋白在制备治疗视网膜损伤药物中的应用，进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (10)

1.一种Reelin蛋白在制备治疗视网膜损伤药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Reelin蛋白通过改善视网膜损伤后视网膜组织形态异常以调节视网膜缺血再灌注损伤过程。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Reelin蛋白通过改善视网膜损伤后视网膜视神经细胞死亡以调节视网膜缺血再灌注损伤过程。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Reelin蛋白通过改善视网膜损伤后视网膜功能障碍以调节视网膜缺血再灌注损伤过程。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Reelin蛋白通过改善视网膜损伤后视网膜细胞凋亡以调节视网膜缺血再灌注损伤过程。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Reelin蛋白通过Dab1-Pi3k/Akt途径调节视网膜缺血再灌注损伤过程。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述Reelin蛋白通过引起细胞内Dab1蛋白的磷酸化，以激活Pi3k/Akt通路抑制损伤后视网膜细胞凋亡。

8.一种用于治疗视网膜损伤的药物，其特征在于，所述药物的活性成分为Reelin蛋白。

9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体，所述药学上可接受的载体至少包括生理盐水或PBS。

10.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述药物的给药剂量范围为300ng/ul～500ng/ul。