CN119020179A - 一株内生真菌md9f、菌剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株内生真菌MD9F、菌剂及其应用，属于微生物技术领域。本发明提供的内生真菌（Mycoleptodiscus sp.）菌株MD9F，分离自药用植物浙麦冬叶片，经鉴定为Mycoleptodiscus sp.，已于2024年8月7日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 3.28116。本发明提供的内生真菌MD9F是经多次的活性筛选和分离纯化所得，具有显著的氯霉素降解能力，其丰富了氯霉素降解菌的种质资源库，为氯霉素类抗生素环境污染提供了有效的治理途径。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一株内生真菌MD9F、菌剂及其应用。
背景技术
氯霉素是一种具有旋光活性的酰胺醇类广谱抗生素，被广泛用于治疗多种细菌和真菌引起的感染。然而，氯霉素污染会引起环境和健康问题，亟待开发低成本、环境友好型的氯霉素处理方法。近年来，虽偶有具备氯霉素降解能力的微生物报道，如红球菌（Rhodococcus sp. ）CAP2、柔武氏菌（Raoultella sp. ）db-1及鞘氨醇菌（Sphingobiumsp.） WTD-1等，但其多为细菌来源，真菌尤其是植物内生真菌来源的氯霉素降解菌株鲜有报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一株内生真菌MD9F、菌剂及其应用，本发明的内生真菌MD9F能够高效降解氯霉素。
本发明提供了一株内生真菌（Mycoleptodiscus sp.）MD9F，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 3.28116。
本发明还提供了上述方案所述内生真菌MD9F的孢子。
本发明还提供了一种菌剂，包含上述方案所述的内生真菌MD9F或者所述的孢子。
本发明还提供了一种氯霉素类抗生素的降解剂，包含上述方案所述的内生真菌MD9F、所述的孢子或者所述的菌剂。
优选的，还包括用于培养内生真菌MD9F的物料。
优选的，所述用于培养内生真菌MD9F的物料包括PDA培养基。
本发明还提供了上述方案所述的内生真菌MD9F、所述的孢子、所述的菌剂或者所述的降解剂在降解氯霉素类抗生素的应用。
本发明还提供了一种降解氯霉素类抗生素的方法，包括以下步骤：将上述方案所述降解剂接种或施用于含有氯霉素类抗生素的待降解物料，进行降解。
优选的，所述待降解物料中氯霉素类抗生素的质量浓度为≤50 μg/mL。
优选的，所述降解于避光条件下进行；所述降解的温度包括30℃。
本发明提供了一株内生真菌（Mycoleptodiscus sp.）MD9F，分离自药用植物浙麦冬叶片，经鉴定为Mycoleptodiscus sp.，已于2024年8月7日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 3.28116。本发明提供的内生真菌MD9F是经多次的活性筛选和分离纯化所得，具有显著的氯霉素降解能力，其丰富了氯霉素降解菌的种质资源库，为氯霉素类抗生素环境污染提供了有效的治理途径。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中内生真菌MD9F的菌落表型；
图2为本发明实施例1中基于ITS构建的内生真菌MD9F系统发育树；
图3为本发明实施例2中内生菌株MD9F对氯霉素的降解作用结果图；其中，A为空白对照，表示未接种菌株于高量氯霉素浓度的PDA固体培养基处理，MD9F表示已接种菌株MD9F于高量氯霉素浓度的PDA固体培养基处理；数字2表示氯霉素降解产物；数字1表示氯霉素；B表示基于HPLC检测菌株MD9F降解氯霉素的相对效率，由MD9F培养不同时间段发酵液粗提物中检测到存留氯霉素紫外信号强度与对应空白对照培养基粗提物中存留氯霉素紫外信号强度相比较计算获得；
图4为本发明实施例2中氯霉素降解产物2的高分辨质谱与核磁图谱；其中，A为高分辨质谱图；B为核磁图谱（氢谱）。
生物保藏说明：内生真菌（Mycoleptodiscus sp.）MD9F，已于2024年8月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No. 3.28116。
具体实施方式
本发明提供了一株内生真菌（Mycoleptodiscus sp.）MD9F，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 3.28116。
本发明的内生真菌MD9F分离自药用植物浙麦冬叶片，具体为2~3年生浙麦冬新鲜叶片。本发明的内生真菌MD9F经多次的活性筛选和分离纯化所得，经鉴定为Mycoleptodiscus sp.。
本发明的内生真菌MD9F具有圆形菌落，白色毛绒状菌丝，质地均匀紧密，生长势快等特征。
本发明的内生真菌MD9F对氯霉素具备优秀的耐受性且具有显著的氯霉素降解能力，可高效降解氯霉素。
在本发明中，所述内生真菌MD9F的分离过程包括以下步骤：
将表面灭菌后的浙麦冬叶片切成1 cm小段，接种于含氯霉素浓度为10 μg/mL的PDA固体培养基表面；挑取新菌落外围菌丝并接种于含氯霉素浓度为20 μg/mL的PDA固体培养基表面进行初次纯化；再次分离初次纯化后菌丝，接种于含氯霉素浓度为50 μg/mL的PDA固体培养基表面进行二次纯化，直至获得单一纯净菌株。在本发明中，所述表面灭菌后的浙麦冬叶片是将浙麦冬新鲜叶片经流水冲洗，并在超净工作台内采用三步消毒法对叶片进行表面消毒得到。
在接种于含氯霉素浓度为10 μg/mL的PDA固体培养基表面之后，本发明优选的还包括根据长出菌落的形态、颜色、质地、长势等将不同菌株分离至新的含有轻量氯霉素浓度（10 μg/mL）PDA固体培养基。
在本发明具体实施过程中，所述初次纯化的时间为3d；所述二次纯化的时间为7d。
在本发明具体实施过程中，获得单一纯净菌株后，利用ITS检测完成菌株分子鉴定，得到浙麦冬高效生物降解氯霉素内生真菌Mycoleptodiscus sp. MD9F。
在本发明中，所述PDA固体培养基包括以下浓度的组分: 马铃薯浸粉6.0 g/L，葡萄糖20 g/L和琼脂粉20 g/L，所述PDA固体培养基的pH为5.4~5.8，优选为5.6。
本发明还提供了上述方案所述内生真菌MD9F的孢子。
本发明还提供了一种菌剂，包含上述方案所述的内生真菌MD9F或者所述的孢子。
在本发明中，所述菌剂中，内生真菌MD9F的孢子浓度优选为106~107 CFU/mL。
在本发明中，所述菌剂优选的采用以下方法制备得到：将所述内生真菌MD9F接种于PDA固体培养基，进行活化培养至产孢，用甘油水溶液缓慢多次冲洗培养基表面菌株，重悬孢子，得到孢子生物菌液；将孢子生物菌液接种PDB液体培养基，进行种子培养，获得种子液；所述甘油水溶液中甘油的体积浓度为10%。
在本发明中，所述活化培养的温度为30℃；所述活化培养优选的于恒温生物培养箱中进行；所述活化培养优选的于避光条件下进行；所述活化培养为静置培养；所述活化培养的时间优选为5~7 d。
在本发明中，所述种子培养的时间优选为2 d。
在本发明中，所述PDB液体培养基优选的包括以下浓度的组分:马铃薯浸粉6.0 g/L和葡萄糖20 g/L，所述PDB液体培养基的pH为5.4~5.8，优选为5.6。
本发明还提供了一种氯霉素类抗生素的降解剂，包含上述方案所述的内生真菌MD9F、所述的孢子或者所述的菌剂。
在本发明中，所述降解剂优选的还包括用于培养内生真菌MD9F的物料；所述用于培养内生真菌MD9F的物料优选的包括PDA培养基。
本发明还提供了上述方案所述的内生真菌MD9F、所述的孢子、所述的菌剂或者所述的降解剂在降解氯霉素类抗生素中的应用。
本发明还提供了一种降解氯霉素类抗生素的方法，包括以下步骤：将上述方案所述降解剂接种或施用于含有氯霉素类抗生素的待降解物料，进行降解。
在本发明中，所述待降解物料中氯霉素类抗生素的质量浓度优选为≤50 μg/mL，更优选为50 μg/mL。
在本发明中，所述氯霉素类抗生素包括氯霉素和甲砜霉素；所述的内生真菌MD9F对氯霉素的降解作用，表现为将其结构中的氯乙酰基团降解为乙酰基团。同理，MD9F可降解同样含有氯乙酰官能团的甲砜霉素。
在本发明中，所述降解优选的于避光条件下进行，防止氯霉素在长时间可见光下会产生部分降解；所述降解的温度优选的包括30℃。
在本发明中，所述内生真菌MD9F能够对氯霉素进行脱氯降解，产物为N-[（1R,2R）-2-hydroxy-1-（hydroxymethyl）-2-（4-nitrophenyl）ethyl]acetamide。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一株内生真菌MD9F、菌剂及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1：浙麦冬中高效降解氯霉素内生真菌MD9F的分离与鉴定。
1.浙麦冬中高效降解氯霉素内生真菌的分离、纯化与保存。
采集适宜的2~3年生新鲜浙麦冬叶片，流水冲洗至表面干净，使用灭菌滤纸轻轻拭干叶片表面水分。
超净工作台内，采用三步消毒法处理浙麦冬叶片。首先将清洗后的麦冬叶片浸洗于体积浓度为75%的乙醇水溶液中1 min，无菌水冲洗4次。随后，用次氯酸钠的质量浓度为1%的次氯酸钠溶液再浸泡叶片5 min，无菌水再次清洗4次。最后，再次用体积浓度为75%的乙醇水溶液处理1 min，无菌水清洗4次后，利用灭菌滤纸拭干叶表水分。随后使用无菌剪刀将已表面灭菌的麦冬叶片切割成1.0 cm长小片段，使用无菌镊子将小片段均匀接种（彼此之间保有充分空间）在含有轻量氯霉素浓度（10 μg/mL）PDA固体培养基表面，生物培养箱28℃恒温避光静置培养数天。所用PDA固体培养基需高压灭菌（121 ℃，20 min），并在凝固前加入过滤灭菌的氯霉素。
待内生菌长出后，及时根据各菌落形态、颜色、质地、长势等因素，使用无菌接种环从菌落边缘挑取微量菌丝接种至新的含中量浓度氯霉素的（20 μg/mL）PDA固体培养基表面，28 ℃恒温培养箱避光静置培养数天。观察初次纯化菌株生长状态，重复之前的操作继续挑取菌落外围菌丝接种至新的高量氯霉素浓度（50 μg/mL）PDA培养基表面培养7 d。连续纯化两次后，获得菌落状态一致，颜色一致，质地均匀稳定且长势快的单一菌株，命名MD9F。
最后，使用1 mL灭菌水，缓慢冲洗混悬培养基表面菌株，收集菌株孢子液，等体积混合甘油体积浓度为50%的甘油水溶液（已灭菌）得到孢子混合液，孢子混合液经液氮快速冷却，置于-80 ℃冰箱内长期保存。
2.内生真菌MD9F的鉴定。
（1） 形态鉴定：该菌株如图1所示，真菌在含高量氯霉素浓度的PDA固体培养上依然可以快速正常生长，菌落为规则圆形，表面菌丝呈白色绒毛状，均匀向外扩展，质地紧密，生长稳定。
（2） ITS菌种鉴定：①活化保存的MD9F菌株，划线接种于不含氯霉素的PDA固体培养基表面培养5 d，而后取1 mL无菌水溶解混悬菌落表面，获得孢子悬浮液。
②将孢子悬浮液接种于50 mL PDB液体培养基，于28℃恒温摇床（200 rpm/min）避光培养2 d后离心收集菌体。
③将收集菌体转移至2 mL离心管，液氮迅速冷冻后，充分研磨至匀浆。加入1 mLCTAB缓冲液（含0.5% β-巯基乙醇），颠倒震荡混匀0.5 min，60 ℃水浴处理1 h.
④水浴结束后，于12000 rpm，离心5 min，收集上清于新的2 mL离心管。加入等体积三氯甲烷颠倒混匀，于12000 rpm，离心3 min，移液器小心吸取上清液200 μL至新的2 mL离心管。等体积加入预冷异丙醇轻轻颠倒混匀，快速置于-20 ℃环境下沉淀2 h。
⑤沉淀完毕后，于12000 rpm离心5 min，弃上清，吸取70%酒精500 μL加入离心管。上下翻转清洗数次，室温静置2 min后，12000 rpm，离心2 min，弃70%酒精液。重复70%酒精清洗步骤1次，得DNA沉淀。
⑥超净工作台内将含有DNA沉淀的离心管风干，加入50 μL温育（60 ℃）灭菌水，室温溶解3 min，即得内生真菌MD9F基因组DNA。
⑦利用真菌ITS测序的通用引物ITS1（5’-3’：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，SEQ IDNO.1）与ITS4（5’-3’：TCCTCCGCTTATTGATATGC，SEQ ID NO.2）对MD9F基因组16S rRNA进行PCR扩增，切胶回收PCR电泳扩增产物，送样至上海生工生物有限公司进行1代Sanger测序，测序结果如SEQ ID NO.3所示，Seq-ITS：
CCTTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACAAGTTGAAACGGTTGCCCTCGCGGTGACCGGTTCTTCAAACCTCTGCGTACCAAACCTTTCAGTTGCCTCCGGCGGCCCTGGGCCGACGCGGCGCGCGACCTCCCCGTTCGCGGGGGGGCCGCTCCTCGCGGCGGACCACCCGCCGGGCGGTCATAAACAAAACCTTTTGTCGAGATGGCATCGTCTAATTTCTTCATAACACAATATGAAATACAACTTTTAACAATGGATCTCTTGGCTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAGTGTGAATTGCAGATTTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCTCTTGGTATTCCTCGAGGCATGCCTGTTCGAGCGTCGTTACGCCCCTCAAGCGCAAGCTTGGTGTTGGGGATCGCCCCTGAGATACGGCGGCGGCCCTTAAATGCATCGGCGGTGCTGGTGTCAGCCCGGAGCGCAGCAGACATGCGGCTTCCAGGCGACCACGCGCCCGCCGGACAACGACCCGACTTTCAAACGTCGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA。
（3） 构建系统发育树：基于ITS测序结果，将Seq-ITS序列与NCBI网站NT数据库Blast获取物种相似度靠前的10个物种的16S rRNA信息，通过MEGA软件构建与内生真菌MD9F相关的系统发育树。如图2所示，系统发育树结果表明内生真菌MD9F其16S rRNA与已登记菌株Mycoleptodiscus sp. MK640614.1具有极高亲缘性，二者ITS序列一致性高达99.6%。因此，综合菌株MD9F形态学与分子生物学鉴定结果，将其种属分类归为Mycoleptodiscus sp. MD9F，并于2024年8月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No. 3.28116。
实施例2：内生真菌MD9F在高效降解氯霉素中的应用。
1. 内生真菌MD9F对氯霉素的降解作用。
（1） 菌株MD9F生物菌液制备：挑取-80℃冰箱保存的MD9F菌株，划线复苏于不含氯霉素的PDA固体培养基进行活化，生物培养箱30℃恒温避光静置7 d产孢，用1 mL 10%甘油多次冲洗菌株表面，即得。
（2） 菌株MD9F种子液制备：吸取1 mL 10%甘油制备的生物菌液，加于50 mL PDB液体培养中，于30 ℃，200 rpm恒温摇床避光培养30 h或至对数生长期，即得。
（3） 用于检测氯霉素残留量的菌株MD9F发酵液提取物样品制备：吸取0.5 mL种子液，均匀涂布接种于3个预先准备的高量氯霉素浓度（初始浓度50 μg/mL）的PDA固体培养基平板表面，并设有含高量氯霉素浓度但不接种菌株的PDA固体培养基平板作为空白对照，生物培养箱30 ℃恒温避光静置培养；分别于接种后1 d、2 d与7 d收集长有菌株MD9F的培养基，并使用手术刀同时将带有菌株的培养基与空白对照培养基分割成1 cm小方块，再借助研磨机将小方块充分匀浆；按照1：2比例加入2倍体积甲醇溶液，混匀超声处理30 min，充分萃取并抽滤收集甲醇萃取液，残留物再次加入甲醇重复萃取过程1次，合并前后甲醇萃取液，利用旋转蒸发仪浓缩后复溶于1 mL甲醇，即得真菌MD9F发酵液提取物样品，用于检测氯霉素在不同处理时间段的残留量。
2. 氯霉素降解产物鉴定与降解效率检测。
（1） 于12000 rpm，10 min条件下离心上述甲醇萃取液，取30 μL上清液，小心加入至HPLC样品小瓶内衬管中。
（2） 按照表1所示的条件与洗脱程序执行高效液相色谱HPLC检测不同降解时长下的氯霉素含量。根据氯霉素标准品在HPLC检测中的保留时间与紫外吸收特征，比较内生真菌MD9F待测样品与空白对照样品的HPLC谱图差异（图3中的A），并根据质谱和核磁数据信息确定氯霉素降解产物1的化学结构。
液相色谱柱：C18；孔径：1.7 μm；柱规格：3.0 × 100 mm。
表1 氯霉素降解产物HPLC检测程序
| 时间 （min） | 流动相A （0.5%甲酸，%vol） | 流动相B （乙腈,%/vol） | 流量 （mL/min） |
| 0.00 | 90.0 | 10.0 | 1.0 |
| 5.00 | 80.0 | 20.0 | 1.0 |
| 35.00 | 30.0 | 70.0 | 1.0 |
| 45.00 | 10.0 | 90.0 | 1.0 |
| 46.00 | 0.0 | 100.0 | 1.0 |
| 70.00 | 0.0 | 100.0 | 1.0 |
根据内生真菌MD9F发酵液粗提物样品中存留的氯霉素紫外吸收峰信号强度，与空白对照样品中的氯霉素紫外吸收峰信号强度相比，计算不同时间内氯霉素的相对降解效率。如图3中的B结果所示，氯霉素初始浓度50 μg/mL条件下，内生真菌MD9F接种1 d后氯霉素即有25%相对降解率，接种2 d有47%降解率，而培养7 d时氯霉素的相对降解率约为98.5%。
（3）同时从上述发酵液提取物的HPLC图谱中可观察到新色谱峰（2）的出现（保留时间：约9.2 min），且其含量与培养时间呈正相关。为进一步确证其为氯霉素降解产物，我们从大量发酵产物中对该色谱峰进行了富集，并通过高分辨质谱（HRMS）和核磁（NMR）确定其结构为氯霉素脱氯后产物N-[（1R,2R）-2-hydroxy-1-（hydroxymethyl）-2-（4-nitrophenyl）ethyl]acetamide，参见图4。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一株内生真菌（Mycoleptodiscus sp.）MD9F，其特征在于，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 3.28116。
2.权利要求1所述内生真菌MD9F的孢子。
3.一种菌剂，其特征在于，包含权利要求1所述的内生真菌MD9F或者权利要求2所述的孢子。
4.一种氯霉素类抗生素的降解剂，其特征在于，包含权利要求1所述的内生真菌MD9F、权利要求2所述的孢子或者权利要求3所述的菌剂。
5.根据权利要求4所述的降解剂，其特征在于，还包括用于培养内生真菌MD9F的物料。
6.根据权利要求5所述的降解剂，其特征在于，所述用于培养内生真菌MD9F的物料包括PDA培养基。
7.权利要求1所述的内生真菌MD9F、权利要求2所述的孢子、权利要求3所述的菌剂或者权利要求4~6任意一项所述的降解剂在降解氯霉素类抗生素的应用。
8.一种降解氯霉素类抗生素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求4~6任意一项所述的降解剂接种或施用于含有氯霉素类抗生素的待降解物料，进行降解。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述待降解物料中氯霉素类抗生素的质量浓度为≤50 μg/mL。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述降解于避光条件下进行；所述降解的温度包括30℃。
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