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CN118984871A - 制备人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞和人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞群的方法 - Google Patents

制备人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞和人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞群的方法 Download PDF

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CN118984871A
CN118984871A CN202380032988.7A CN202380032988A CN118984871A CN 118984871 A CN118984871 A CN 118984871A CN 202380032988 A CN202380032988 A CN 202380032988A CN 118984871 A CN118984871 A CN 118984871A
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CN
China
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cells
pluripotent stem
cell
testosterone
derived
Prior art date
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Application number
CN202380032988.7A
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English (en)
Inventor
青井贵之
佐藤克哉
藤泽正人
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kobe University NUC
Original Assignee
Kobe University NUC
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Publication date
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Abstract

本发明提供了一种制备能够稳定和持续分泌睾酮的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞(睾丸间质样细胞)的方法，以及人多能肝细胞衍生的睾丸间质样细胞。还提供了一种人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞，其能够长期维持睾丸间质样细胞分泌足够量睾酮，并提高了分化诱导的效率。该方法包括以下步骤：在添加了WNT经典途径激活剂、骨形态发生蛋白4(BMP4)和血管内皮生长因子(VEGF)中的一种或多种的培养条件下培养人多能干细胞，并通过控制环磷酸腺苷(cAMP)的添加和去除时间、悬浮培养、贴壁培养等来强制表达NR5A1。

Description

制备人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞和人多能干细胞衍 生的睾丸间质样细胞群的方法
技术领域
本发明涉及制备人多能干细胞衍生的睾丸间质(leydig)样细胞和人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞群的方法。
本申请要求申请号为2022-021533的日本专利的优先权，该申请通过引用并入本文。
背景技术
近年来，与年龄相关的男性性腺功能减退综合征(迟发性性腺功能减退症(LOH)综合征)引起了人们的关注，该综合征是由与年龄相关的男性激素的下降引起的，并引发各种症状。为了解决这个问题，已经进行了睾酮的激素替代疗法。然而，激素替代疗法产生的激素值与生理分泌模式不同，且作用持续时间短，因此需要重复给药，给患者带来沉重负担。一直需要开发一种新的治疗方法，这种方法不需要重复给药，在就医时间、注射相关的工作及疼痛等方面得到了改善，并提高了生活质量(QOL)。
下丘脑产生促性腺激素释放激素(GnRH)。作为对GnRH的产生的应答，垂体前叶产生黄体生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)。据估计，睾丸中的睾丸间质细胞对LH的应答是每天产生5mg至10mg的睾酮。睾酮是由胆固醇通过几种中间化合物合成的，如脱氢表雄酮(DHEA)和雄烯二酮。
有人试图开发使用具有自我复制性和多谱系潜能的多能干细胞诱导分化为各种细胞的方法。在多能干细胞中使用胚胎干细胞(ES细胞)和诱导多能干细胞(iPS细胞)的技术引起了人们的关注。已经进行了各种尝试，通过将作为转录因子的类固醇生成因子-1(SF-1)稳定地引入各种间充质干细胞中，并在培养基中添加环磷酸腺苷(cAMP)，诱导分化为睾丸和肾上腺的类固醇激素产生细胞。SF-1是细胞内转录因子核受体家族的成员，由核受体亚家族5中的A组成员1(NR5A1)基因编码。
已经报道了一种方法，其中将SF-1引入两种类型的人ES细胞(H9株和KhES1株)和一种类型的人iPS细胞系(201B7株)，以诱导分化为类固醇激素产生细胞。在该方法中，通过使用6-溴靛玉红-3′-肟(BIO)和糖原合酶激酶3(GSK-3)抑制剂，诱导每个人ES细胞系和人iPS细胞系分化为中胚层细胞，并用流式细胞术分选所述中胚层细胞。然后将SF-1引入含有pCMFlag-hsNR5A1的质粒的中胚层细胞中，以表达SF-1，从而实现表达。所得细胞在含有8-溴-cAMP(8-Br-cAMP)的培养基中进一步培养，并诱导分化为类固醇激素产生细胞。然而，该报告提及了孕酮和皮质醇的产生，但没有描述睾酮的产生，也没有公开作为睾丸间质细胞选择性标志的标记物(INSL3、17βHSD3、LHCGR等)的表达(非专利文献1)。
另一种公开的方法中，小鼠多能干细胞(ES细胞)被诱导分化为间充质干细胞，然后所述间充质干细胞在SF-1的条件下表达以分化为类固醇激素产生细胞(专利文献1)。然而，该发明没有报告睾酮和皮质醇等激素的产生，也没有示出作为睾丸间质细胞标志的标记物的表达。
一份报告描述了用慢病毒载体将小鼠SF-1引入小鼠ES细胞(OriCellStrainC57BL/6mESC)以产生SF-1+ESC菌株(ESC-SF-1)，然后在含有8-Br-cAMP和毛喉素的培养基中进一步培养，并诱导其分化为睾丸间质祖细胞(PLC)。该描述表明，用8-Br-cAMP和毛喉素处理ESC-SF-1比仅用8-Br-cAMP处理更有效地诱导PLC分化。在该报告中，将由此获得的PLC作为睾丸间质样细胞移植到大鼠体内，然后从血清样本等中测量作为睾丸间质细胞标志的标记物等(非专利文献2)。
一项公开提供了一种方法，其中NR5A1在人多能干细胞中表达，以产生表达INSL3并且还表达选自17βHSD3和LHCGR的至少一种标记物的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞(专利文献2)。此外，另一项公开示出了一种产生表达HSD17B3、INSL3、LHCGR等的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法(非专利文献3)。然而，需要制备能够更稳定地持续分泌睾酮的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞。
引文列表
非专利文献
[NPL 1]Endocrinology,153(9):4336-4345(2012)
[NPL 2]STEM CELLS AND DEVELOPMENT,24(4):459-470(2015)
[NPL 3]Endocrinology,2021,Vol.162,No.12,1-11,https://doi.org/10.1210/endocr/bqab202
专利文献
[PTL 1]JP 2011-15630A
[PTL 2]WO 2018/088240A1(JP 6979702 B2)
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一种制备能够稳定和持续分泌睾酮的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法，以及一种人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞。本发明的另一目的是提供一种人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞，其能够长期维持分泌足够量睾酮的睾丸间质样细胞，并提高分化诱导的效率。
问题解决方案
为了实现上述目的，本发明的发明人进行了认真的研究，并因此发现，通过制备人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法，可以提供能够稳定和持久分泌睾酮的睾丸间质样细胞，所述方法包括在添加细胞因子混合物并强制表达NR5A1的培养条件下培养人多能干细胞的步骤，其中对用于添加或去除cAMP的时间、悬浮培养、贴壁培养等进行了各种方式的设计。因此，发明人实现了本发明。
也就是说，本发明包括以下内容。
1.一种制备人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法，包括在人多能干细胞中强制表达NR5A1的步骤，其中所述方法包括向人多能干细胞的培养系统中添加选自WNT经典途径激活剂、骨形态发生蛋白4(BMP4)和血管内皮生长因子(VEGF)中的一种或多种的步骤。
2.根据上述第1项所述的制备人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法，其中所述方法包括在存在选自WNT经典途径激活剂、BMP4和VEGF中的一种或多种的情况下，在人多能干细胞中强制表达NR5A1，然后悬浮培养2天至10天，随后进行贴壁培养的步骤。
3.根据上述第1项所述的制备人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法，其中所述方法包括在存在选自WNT经典途径激活剂、BMP4和VEGF中的一种或多种的情况下，在人多能干细胞中强制表达NR5A1，然后进行悬浮培养，直到所述人多能干细胞开始形成胚叶体，随后进行贴壁培养的步骤。
4.根据上述第2或3项所述的制备人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法，其中所述贴壁培养步骤包括去除存在的WNT经典途径激活剂、BMP4和VEGF，然后加入cAMP的步骤。
5.根据上述第4项所述的制备人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法，其中所述方法包括在开始用cAMP处理后的第2天至第40天期间从培养系统中去除cAMP的步骤。
6.根据上述第4项所述的制备人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法，其中所述贴壁培养步骤包括去除存在的WNT经典途径激活剂、BMP4和VEGF，然后用毛喉素处理的步骤。
7.根据上述第1项所述的制备人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法，其中所述在存在选自WNT经典途径激活剂、BMP4和VEGF的一种或多种的情况下，人多能干细胞中强制表达NR5A1的步骤在能够形成50个细胞到20000个细胞的一个胚状体的培养装置上进行。
8.根据上述第1项所述的制备人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法，其中所述人多能干细胞中强制表达NR5A1的步骤包括在四环素依赖性基因表达系统中使用Tet-Off(商标名)系统，所述Tet-Off系统在不存在四环素或多西环素的情况下强制表达NR5A1。
9.根据上述第2项或第3项所述的制备人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法，其中所述方法包括在进行悬浮培养和贴壁培养之后进一步进行悬浮培养的步骤。
10.根据上述第1项所述的制备人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法，其中，从所述人多能干细胞到所述人多能干细胞衍生的睾丸间质状细胞的分化诱导效率为80％或更高。
11.一种人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞，其通过上述第1项的方法制备。
12.根据上述第11项所述的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞，其中所述人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞是连续产生睾酮至少60天的睾丸间质样细胞。
13.一种人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞，其是在上述第11项的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞传代至少一次后获得的。
14.一种人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞群，包括上述第11项所述的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞。
15.根据上述第14项所述的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞群，其中所述细胞群包含80％或更多能够产生睾酮的睾丸间质样细胞。
16.根据上述第14或15项所述的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞群，其中所述细胞群进行免疫隔离处理。
17.一种用于治疗与睾酮降低相关疾病的药物组合物，其包括上述第14或15项的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞群作为活性成分。
18.一种用于细胞移植的组合物，其包括生物相容性膜，上述第14或15项的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞群粘附在所述生物相容性膜上。
19.一种用于多能干细胞衍生的内分泌细胞移植的装置，包括用于将多能干细胞衍生的内分泌细胞植入活体的生物相容性膜。
20.根据上述第19项所述的用于多能干细胞衍生的内分泌细胞移植的装置，其中所述多能干细胞衍生的内分泌细胞是能够产生睾酮的人多能干细胞衍生的内分泌细胞。
21.根据上述第20项所述的用于多能干细胞衍生的内分泌细胞移植的装置，其中，能够产生睾酮的人多能干细胞衍生的内分泌细胞是上述第11项所述的人多干细胞衍生的间质样细胞。
A.一种将人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞群移植到活体中的方法。
B.根据上述A项的移植方法，其中将人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞群与细胞群粘附的生物相容性膜一起移植到活体中。
C.根据上述A项所述的移植方法，其中将包括生物相容性膜的用于细胞移植的组合物移植到活体中，所述人多能干细胞衍生的间质样细胞群粘附在所述生物相容性膜上。
D.根据上述A至C项中任一项所述的移植方法，其中所述人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞群是包括通过包括向人多能干细胞的培养系统中添加选自WNT经典途径激活剂、BMP4、和VEGF的一种或多种的步骤的方法产生的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的细胞群。
E.一种治疗与睾酮降低相关的疾病的方法，方法包括施用含有人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞群作为活性成分的药物组合物。
F.一种治疗与睾酮降低相关的疾病的方法，或一种治疗需要睾酮替代的症状的方法，所述方法包括移植用于细胞移植的组合物，所述组合物包括生物相容性膜，其中人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞群附着在所述生物相容性膜上。
G.根据上述F项所述的治疗方法，其中，所述用于细胞移植的组合物为片状细胞移植组合物。
发明的有利效果
根据本发明的制备人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法，可以制备能够更稳定和持久地分泌睾酮的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞。此外，由此产生的睾丸间质样细胞可以皮下移植到小鼠体内。
附图说明
图1是制备本发明的睾丸间质样细胞的方法的示意图(实施例1)。
图2示出了与现有技术方法相比，在制备间质样细胞的过程中检测培养上清液中睾酮浓度的结果。图2A示出了有和没有贴壁培养的比较，图2B示出了添加和不添加细胞因子混合物的比较(实验例1-1)。
图3示出了在制备睾丸间质样细胞的过程中，在培养开始后第17天从培养基中去除8-Br-cAMP，和在培养开始后第17天之后持续存在1mM8-Br-cAMP的情况下，对培养上清液中睾酮浓度和睾酮分泌持续时间的影响的检查结果(实验例1-2)。
图4是分别示出在制备睾丸间质样细胞的过程中，在培养开始后第17天从培养基中去除8-Br-cAMP，和在培养结束后第17天后继续存在1mM 8-Br-cAMP的情况下培养第55天的细胞形态的照片(实验例1-2)。
图5是用于强制表达NR5A1基因的Tet-OffTM系统和Tet-OnTM系统的示意图(实验例1-3)。
图6示出了在制备睾丸间质样细胞的过程中，使用Tet-OffTM系统和Tet-OnTM系统在NR5A1基因的强制表达下检查睾丸间质细胞标记物(17βHSD3、StAR、CYP17A1和CYP11A1)表达的细胞免疫染色图像的照片(实验例1-3)。
图7示出了在制备睾丸间质样细胞的过程中，使用Tet-OffTM系统和Tet-OnTM系统在NR5A1基因的强制表达下检查睾丸间质细胞标记物(17βHSD3)表达的细胞免疫染色图像的照片(实验例1-3)。
图8示出了本发明睾丸间质样细胞培养上清液中的睾酮浓度和传代后的细胞形态(实验例1-4)。
图9示出了本发明睾丸间质样细胞的培养上清液中的睾酮浓度和第二代后的细胞形态(实验例1-4)。
图10示出了本发明的睾丸间质样细胞在冻融后第27天的培养上清液中的睾酮浓度和细胞形态(实验例1-5)。
图11示出了本发明睾丸间质样细胞在免疫隔离处理中的睾酮浓度和细胞形态(实验例1-6)。
图12是本发明的制备睾丸间质样细胞的方法中形成球体(细胞团)的方法的示意图(实施例2)。
图13示出了由本发明的睾丸间质样细胞产生的球体(细胞团)在免疫隔离处理中的睾酮浓度和细胞形态(实施例2)。
图14是在本发明制备睾丸间质样细胞的方法中，制备用于细胞移植的组合物的方法的示意图，所述组合物用于将睾丸间质样细胞移植到小鼠体内。
图15示出了在贴壁培养皿上培养本发明的睾丸间质样细胞，以及从贴壁培养皿中分离睾丸间质状细胞并在用于细胞移植的装置(PET材料的人造膜)上培养细胞2天的细胞形态观察(实施例3)。
图16A是将在用于细胞移植的装置上培养的睾丸间质样细胞与用于细胞移植的装置一起移植到小鼠体内的方法的示意图，图16B示出了移植后1周移植细胞的观察结果。
图17示出了从小鼠中收获用于细胞移植的移植装置并用免疫染色检查作为睾丸间质细胞(LHCGR)选择性指示的标记物的结果。在移植细胞存在的部位观察到标记物的表达。
图18是用于说明制备携带引入的Venus-Akaluc基因的睾丸间质样细胞的方法的示意图，用于检查移植到小鼠体内的睾丸间质样细胞的存活情况(实施例4)。
图19示出了本发明的睾丸间质样细胞在培养开始后第17天和第19天的形态的照片(实施例4)。
图20A是用于说明制备细胞片的方法和用于细胞移植的装置的示意图，所述细胞片包括携带引入的Venus-Akaluc基因的睾丸间质样细胞。图20B示出了培养开始后第40天，在将细胞接种到用于细胞移植的装置上之前的睾丸间质样细胞。图20C示出了培养开始后第41天，在细胞接种在用于细胞移植的装置上后的睾丸间质样细胞(实施例4)。
图21A是用于说明将睾丸间质样细胞移植到小鼠体内的方法的图。图21B示出了移植后第7天用AkaBLI发光对小鼠活体中睾丸间质样细胞存活进行检查的结果的照片(实施例4)。
具体实施方式
本发明涉及一种制备能够稳定和持续分泌睾酮的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法、制备的人多干细胞衍生的睾丸间质样细胞和人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的细胞群。本发明的制备人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法包括强制表达NR5A1的步骤。能够更稳定和持续分泌睾酮的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞可以通过以下方法制备，所述方法包括使人多能干细胞强制表达NR5A1，然后在存在培养系统中形成胚状体(EB)所需的细胞因子混合物的情况下进行悬浮培养，随后进行贴壁培养的步骤。
如本文所使用的，术语“睾丸间质样细胞”是指通过对多能干细胞进行分化诱导处理而获得的细胞，并且该细胞的使用方式与天然存在的“睾丸间质细胞”不同。本发明的“人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞”是指通过对人多能干细胞进行分化诱导处理而获得的细胞，所述细胞能够产生睾酮和/或表达睾丸间质细胞标记物。例如，间质细胞标记物是选自17βHSD3、StAR、CYP17A1和CYP11A1中的至少一种标记物，最优选的标记物是17βHSD3。特别地，被发现能够产生睾酮的细胞也被称为本文所用的“睾酮产生细胞”。
如本文所使用的，“多能干细胞”只需要是一种未分化的细胞，具有“自我繁殖性”和“分化多能性”，前者允许增殖，同时保持未分化状态，后者允许分化为所有三个胚层谱系。其实例包括胚胎干细胞(ES细胞)和诱导多能干细胞(iPS细胞)。本发明的方法包括使用人多能干细胞。人iPS细胞在性质上与人ES细胞非常相似，但据报道，在转录因子网络、表观遗传学和对细胞外因子的应答等方面与小鼠ES细胞不同(STEM CELLS 2010；28:p.419-430；Experimental Medicine 2012；30,No.10:p.1544-1548；和Journal of Clinical andExperimental Medicine 2011；239,No.14:p.1247-1251)。如本文所使用的，人多能干细胞因此被认为与来源于除人以外的动物的多能干细胞不同。
如本文所使用的，术语“ES细胞”通常是指通过将囊胚期胚胎内的细胞聚集(称为内细胞团)转移到体外培养中，并将细胞分离为未分化的干细胞群而得到的多能干细胞。许多人ES细胞株已经建立，并且可从ES Cell International私人有限公司、威斯康星校友研究基金会、国家干细胞库(NSCB)等处获得。
如本文所使用的，术语“iPS细胞”是指通过将某些种类的基因引入体细胞并由此诱导分化细胞的重编程而获得的诱导多能干细胞，而不使用卵子、胚胎或ES细胞，并且具有与ES细胞相似的多能性和增殖潜力(K.Takahashi和S.Yamanaka(2006),Cell,126:663-676；K.Takahashi等人，(2007),Cell,131:861-872；J.Yu等人(2007),Science,318:1917-1920；Nakagawa,M.等人，Nat.Biotechnol.,26:101-106(2008)；和WO 2007/069666A1)。适用的iPS细胞只需要是通过现有的制备方法或未来开发的制备方法制备的人iPS细胞。用于制备iPS细胞的源细胞也没有特别限制。
用于多能干细胞(如ES细胞或iPS细胞)的培养方法或培养的培养基没有特别限制，可以取决于现有的或未来开发的培养基或技术。作为能够保持ES细胞、iPS细胞等的未分化性和多能性的培养基和适合于其分化诱导的培养基，可以使用例如市售的哺乳动物细胞基础培养基，例如DMEM和/或DMEM/F12，其添加有血清或血清替代物(KnockOutTM血清置换：KSR，Thermo Fisher Scientific股份有限公司)和bFGF等；市售灵长类ES细胞培养基；用于灵长类ES细胞增殖的基础培养基hESF-GRO；用于灵长类ES细胞分化诱导的基础培养基hESF-DIF；以及灵长类ES细胞增殖培养基CSTI-7。具体而言，可以使用专利文献2中示例的培养基来进行培养。
在制备本发明的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法中，将NR5A1基因引入人多能干细胞中，形成胚状体(EB)。为了形成EB，细胞因子混合物，特别是选自以下的细胞因子：WNT经典途径激活剂、骨形态发生蛋白4(BMP4)和血管内皮生长因子(VEGF)中的一种或多种被添加到人多能干细胞的培养系统中。WNT经典途径激活是指经典Wnt通路的激活，也称为β-catenin通路的激活，其中β-catenin蛋白调节基因表达。WNT经典途径激活剂具体地是例如糖原合酶激酶3(GSK-3)抑制剂，更具体地，例如CHIR99021。WNT经典途径激活剂的添加浓度没有特别限制，但可以在最高300mM的范围内适当选择，例如，从1mM到300mM，从1mM至100mM，优选从10mM到50mM，更优选20mM。BMP4的添加浓度不受特别限制，可以在最高2000μg/mL的范围内适当选择，例如从10μg/mL到2000μg/mL，从10μg/mL到1000μg/mL，优选从30μg/mL到500μg/mL，更优选100μg/mL。VEGF的添加浓度没有特别限制，但可以在最高2000μg/mL的范围内适当选择，例如，从10μg/mL到2000μg/mL，从10μg/mL到1000μg/mL，优选从30μg/mL到500μg/mL，更优选100μg/mL。
在培养开始后，将人多能干细胞适当地进行悬浮培养10天或8天，更优选6天。EB是在人多能干细胞培养开始后2天至10天，优选6天至10天、更优选6天至8天、最优选6天的悬浮培养过程中形成的。
用于悬浮培养的培养装置只需要是能够进行悬浮培养并允许通过三维培养等形成EB的装置。特别是，能够形成均匀大小的EB的培养装置是合适的。例如，合适的培养装置是微孔孔径为200μm至20mm，优选400μm至1000μm，更优选400μm或800μm的培养装置。具体地，可以使用AggreWellTM400(StemCell Technologies股份有限公司)等。使用这种培养装置可以通过以单细胞悬浮液的形式接种细胞来形成均匀大小的EB。培养装置适于形成约50个细胞至约20000个细胞、优选约50细胞至约5000个细胞、更优选约100细胞至约200个细胞一个EB的培养装置。例如，当AggreWellTM4006孔板用作培养装置时，该板每孔包括7000个腔，并允许在每个腔中形成一个EB。当每个孔包含约1.4×106个细胞时，一个EB由200个细胞形成。
如本文所使用的，“NR5A1基因”可以通过例如GenBank登录号NM_004959(SEQ IDNo:1)进行鉴定。现有的方法或未来开发的任何方法可以用作将NR5A1基因引入人多能干细胞的方法。NR5A1 cDNA可以通过现有的方法引入到含有启动子的适当表达载体中，从而可以在作为宿主的细胞中发挥作用。具体地，可以应用专利文献2中描述的方法。
本发明包括在导入了NR5A1基因的人多能干细胞中强制表达导入基因的步骤。该基因可以通过使用现有或未来开发的任何基因表达系统来表达。基因表达的时间可以通过采用现有的方法或未来开发的任何方法来调节。能够可逆地控制细胞等中的目标基因表达的示例性实验系统是Tet-OnTM/OffTM系统，其提供四环素依赖性基因表达。这种表达系统允许目标基因的表达受加入培养基的抗生素四环素或四环素衍生物多西环素(Dox)的存在或不存在来控制。Tet-OffTM系统采用在大肠杆菌四环素抗性操纵子例如Tet阻遏蛋白(TetR)和Tet操纵子序列(tetO序列)中起作用，并允许TetR在不存在四环素的情况下与tetO序列结合，导致NR5A1的强制表达(见图5A和图5B)。
在本发明的制备人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法中，Tet-OffTM系统和Tet-OnTM系统中的任何一种都可以用于调节NR5A1基因的表达。然而，使用Tet-OffTM系统是合适的，该系统在不存在四环素或多西环素的情况下提供NR5A1的强制表达。通过使用Tet-OffTM系统，在四环素或多西环素的存在下培养预先引入NR5A1基因的人多能干细胞，从而能够防止其分化为人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞。然后，在需要分化为睾丸间质样细胞的时间去除四环素或多西环素，可以持续强制表达NR5A1。此外，在NR5A1的持续强制表达中，去除四环素或多西环素可以避免这些药物引起的不良反应，因此是合适的。所以，可以更有效地调节和促进向人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的分化。
专利文献2的实施例(WO 2018/088240A1)中也描述了Tet-on/off，但专利文献2中的描述基于Tet-OnTM系统，该系统在四环素或多西环素存在下提供NR5A1的强制表达。专利文献2的实施例中的Tet-off系统被描述为在没有四环素或多西环素的情况下没有NR5A1的强制表达，因此与本发明中的Tet-OffTM系统不同。
本发明的制备人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法包括在悬浮培养后对细胞进行贴壁培养的步骤。贴壁培养是指使细胞粘附到培养容器(培养装置)上并在单层状态下培养。培养皿(实验室培养皿)、培养瓶、多孔板等用作培养容器，并且可以使用具有涂覆有例如MatrigelTM(由Becton，Dickinson and Company制造)、胶原蛋白、明胶、层粘连蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖、巢蛋白或其组合的粘附表面的容器进行贴壁培养。在贴壁培养步骤中，可以诱导人中胚层细胞分化为睾丸间质样细胞。在贴壁培养步骤中，适合于去除在悬浮培养步骤中使用的、添加到人多能干细胞的培养体系中的细胞因子混合物(存在于培养系统中的一种或多种细胞因子，选自WNT经典途径激活剂、BMP4和VEGF)。
在贴壁培养步骤中，适合进一步用cAMP进行处理。在用作cAMP时，8-Br-cAMP可以以0.01mM至4mM，优选0.1mM至1mM的浓度添加到培养基中。除了用cAMP处理外，优选进一步用毛喉素进行刺激。毛喉素可以以0.1μM至100μM，优选2μM至100μM，更优选5μM至100μM的浓度添加到培养基中。cAMP适合于在处理开始后的第8天至第40天内适当去除，优选在培养开始后的30天去除，更优选在培养开始后的20天去除，最优选在培养开始后的17天去除。同时，即使在去除cAMP后，也优选在培养基中加入毛喉素。
贴壁培养的持续时间没有特别限制，只要培养可以进行，就可以继续培养。此外，细胞可以在贴壁培养步骤中传代。在细胞传代中，适合用细胞解离酶，如TrypLETM Select、TrypLETM Express或进行处理。此外，还可以用ROCK抑制剂如Y27632进行处理。传代时细胞的接种密度只需要是允许细胞存活的浓度，没有特别限制，例如，从1个细胞/孔到1.0×106个细胞/孔，优选从1000个细胞/孔到1.0×105个细胞/孔，更优选约1.0×104个细胞/孔(9.6cm2)。
此外，可以冷冻保存经历过贴壁培养的细胞。细胞的冷冻保存方法、储存条件等只需要是本领域技术人员进行的方法，没有特别限制，可以应用现有的方法或未来开发的任何方法。例如，需要使用含有冷冻保护剂(如二甲亚砜(DMSO)或甘油)的培养基作为冷冻培养基，也可以使用市售的培养基。例如，可以使用STEM-CELLBANKERTM(Zenogen Pharma)、RecoveryTM细胞冻存液(Thermo Fisher Scientific股份有限公司)或Synth-a-FreezeTM冻存培养基(Thermo Fisher Scientific股份有限公司)作为市售培养基。在细胞冷冻过程中，细胞可以保存在例如-80℃的温度下，也可以保存在较低温度的液氮中。解冻冷冻细胞的方法也只需要是本领域技术人员进行的方法，没有特别限制，可以应用现有的方法或未来开发的任何方法。
本发明制备的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法以80％或更高、优选90％或更高，更优选95％或更高的高分化诱导效率诱导人多能干细胞分化为人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞。本发明还包括通过本发明的方法制备的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞和人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞群。本发明的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞能够连续产生睾酮至少60天，优选120天或更长时间。本发明的睾丸间质样细胞群也是人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞群，其含有80％或更高、优选90％或更高，更优选95％的高比率的能够产生睾酮的睾丸间质样细胞。
通过上述步骤中的贴壁培养制备的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞可以进一步进行悬浮培养。悬浮培养中使用的培养装置只需要是能够进行三维培养的培养装置，没有特别限制，但可以使用在由人多能干细胞形成EB的步骤或在人多能干细胞中强制表达NR5A1的步骤中使用的培育装置。具体地，例如，可以使用微孔的孔径为200μm至20mm，优选为400μm至1000μm，更优选为400或800μm的培养装置。使用这种培养装置的培养能够实现人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的三维培养。
本发明还包括一种药物组合物，其含有通过本发明的方法制备的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞或细胞群作为活性成分。本发明药物组合物的靶点是，例如，与睾酮降低相关的疾病或需要睾酮替代的症状。本发明还包括用于与睾酮降低相关的疾病的治疗剂，其含有通过本发明的方法制备的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞或细胞群作为活性成分。其具体实例包括LOH综合征、克兰费尔特(Klinefelter)综合征、睾丸创伤、继发性性腺功能减退症，以及需要雄性激素替代的生物学上女性人类的病例，如变性人。
含有人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞或细胞群作为活性成分的药物组合物或与睾酮降低相关的疾病的治疗剂，除了包含制备的睾丸间质样细胞外，还可以含有药学上可接受的载体。例如，载体是用于产生睾丸间质样细胞的细胞培养中的培养基。此外，人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞可以进行免疫隔离处理。
本发明还包括用于人多能干细胞衍生的内分泌细胞移植的装置。换句话说，本发明还包括在贴壁培养本发明的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞群之前的装置。如本文所使用的，术语“多能干细胞衍生的内分泌细胞移植装置”是指能够移植多能干细胞衍生的内分泌细胞的装置，该装置允许在装置上进行多能干细胞衍生的内分泌细胞贴壁培养时，有效分泌多能干细胞衍生的内分泌细胞产生的物质，如激素，特别是睾酮。可用于多能干细胞衍生的内分泌细胞移植装置的材料需要具有生物相容性，其作为对活体没有有害影响的特性。生物相容性材料适当地与活体具有亲和力，并且可以是在移植的人多能干细胞衍生的间质样细胞群在活体中建立移植物后被生物吸收的材料。这种材料的例子包括合成聚合物，如聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚-L-乳酸(PLLA)、聚乙醇酸(PGA)、乳酸和乙醇酸的共聚物(PLGA)和聚己内酯(PCL)。可以使用天然聚合物，如胶原蛋白、明胶、糖胺聚糖、几丁质、壳聚糖、透明质酸和多肽。用于多能干细胞衍生的内分泌细胞移植的装置的形状没有特别限制，但是，可以使用例如片状装置，如生物相容性膜。
本发明还包括用于细胞移植的组合物，其包括用于多能干细胞衍生的内分泌细胞移植的装置，本发明的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞群粘附在该装置上。粘附在用于细胞移植的装置上的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞可以进一步进行免疫隔离处理。用于细胞移植的组合物可以通过在用于细胞移植的装置上贴壁培养本发明的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞群来制备。用于细胞移植的组合物的形状只要是允许细胞移植的形状，没有特别限制，可以是例如片状或胶囊状。
如本文所使用的，术语“免疫隔离处理”是指允许水、营养物质或激素通过，但禁止免疫细胞和移植的细胞通过，并抑制在局部环境下移植的细胞的排斥反应，而不阻碍血管生成的处理。现有的方法或未来开发的任何方法都可以用作免疫隔离处理。例如，免疫隔离处理可以通过将细胞包埋在例如藻酸盐凝胶、琼脂糖、各向异性材料、聚砜(PSF)、纳米纤维垫、聚酰亚胺、四氟乙烯/聚四氟乙烯(PTFE)、ePTFE、聚丙烯腈、聚醚砜、丙烯酸树脂、醋酸纤维素、硝酸纤维素、聚酰胺或羟丙基甲基纤维素(HPMC)膜的珠子或胶囊中来进行。这种免疫隔离处理可以避免一些问题，例如与细胞移植相关的免疫排斥反应，或细胞的扩散或侵袭。免疫隔离处理使产生的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞，即使不是来自自己的细胞(不是来自自体细胞)，也能用于治疗需要向生物体持续供应人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞产生的物质(特别是睾酮)的病症。
本发明还包括移植由本发明方法制备的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞群的方法。移植可以通过将细胞群与细胞群粘附的多能干细胞衍生内分泌细胞移植装置一起移植到活体中所需部位的方法来实现，优选皮下移植。本发明的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞群的移植靶点是例如与睾酮降低相关的疾病或需要睾酮替代的症状，如上述药物组合物的靶点的情况。其具体实例包括LOH综合征、Klinefelter综合征、睾丸创伤、继发性性腺功能减退症，以及需要雄性激素替代的生物学上女性人类的病例，如变性人。
本发明还包括治疗与睾酮降低相关的疾病的方法，包括施用含有人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞群作为活性成分的药物组合物，治疗与睾酮下降相关的疾病的方法，包括移植用于细胞移植的组合物，所述用于细胞移植的组合物包括用于多能干细胞衍生的内分泌细胞移植的装置，人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞群体粘附于所述装置，或用于需要睾酮替代的症状的治疗方法。
实施例
参照以下实施例详细描述本发明，以进一步理解本发明，但应理解的是，本发明不限于这些实施例。
(实施例1)制备睾丸间质样细胞的方法
在本实施例中，描述了一种制备睾丸间质样细胞的方法(见图1)。
1.备用细胞
在本实施例中，使用iPS细胞(FFPB3AB4)进行分化诱导处理。
2.NR5A1基因
根据专利文献2的实施例1中描述的方法，克隆鉴定为GenBank登录号NM_004959(SEQ ID No:1)的全长NR5A1基因(cDNA)，构建NR5A1表达载体并转染进iPS细胞(FFPB3AB4)。NR5A1由Tet-OffTM高级诱导表达系统(Tet-OffTM Advanced InducibleExpression System，Clontech)强制表达。
3.诱导分化为睾丸间质样细胞
将通过Tet-OffTM系统具有强制表达的NR5A1基因的人iPS细胞(KW107_121-3-NR5A1_睾丸间质_P12+2(EX564))以每孔1.4×106个细胞接种在AggreWellTM4006孔板中。在培养中，使用含有20mM CHIR99021、100μg/mL BMP4和100μg/mLVEGF作为细胞因子混合物的分化诱导培养基(含有15％KSR(Thermo Fisher Scientific股份有限公司)的DMEM培养基(Invitrogen))进行培养6天。AggreWellTM4006孔板每孔有7000个腔，培养6天后，一个腔中的约200个细胞形成一个EB。
将形成EB的KW107_121-3_NR5A1_睾丸间质_P12+2(EX564)在用于贴壁培养的平板(NuncTM细胞培养板(Cell-Culture Treated Multidishes))中，使用含10％FBS的DMEM培养基(Invitrogen，含有1mM 8-Br-cAMP、10μM Y27632、100μM毛喉素、不含KSR)进一步培养11天，然后在第17天去除8-Br-cAMP。随后，将细胞在含有100μM毛喉素的含10％FBS的DMEM培养基(Invitrogen)中进行贴壁培养。
在以下每个实验例中，对KW107_121-3_NR5A1_睾丸间质_P12+2(EX564)或用Tet-OnTM系统处理的细胞(KW111_3AB4_2S6_NR5A1_睾丸间质)进行了不同的分化诱导处理条件研究，并检查了由此产生的睾丸间质样细胞的性质。
(实验例1-1)贴壁培养和添加细胞因子混合物对睾酮分泌量的影响
在本实施例中，测量了根据实施例1中的制备方法(Tet-OnTM系统)制备的细胞和通过现有技术方法制备的细胞(参见专利文献2的实施例1)(均为KW111_3AB4_2S6_NR5A1_hiPSC衍生的睾丸间质样细胞)在有和没有贴壁培养以及有和没有添加细胞因子混合物的培养上清液中睾酮的量。
1.有或没有贴壁培养
图2A示出了在AggreWellTM4006孔板中经历悬浮培养然后进行贴壁培养的细胞和作为对比例的来源于相关技术方法的细胞(在用三维培养板(PrimeSurfaceTM:MS-9096M和MS-90240)的连续悬浮培养中)的培养上清液中处于峰值(在培养的第16天至第26天)的睾酮浓度。采用电化学发光免疫法(ECLIA)测定睾酮浓度。结果表明，在AggreWellTM400中进行悬浮培养然后切换到贴壁培养的系统提供了显著更高的睾酮浓度。
2.添加或不添加细胞因子
图2B示出了在用三维培养板(PrimeSurfaceTM:MS-9096M和MS-90240)进行连续悬浮培养的第6天加入细胞因子混合物的细胞系统中，以及在第6天不加入细胞因子混合物的连续悬浮培养细胞系统中，培养在第28天培养的上清液中的睾酮浓度。结果表明，添加细胞因子混合物的系统具有显著更高的睾酮浓度和更大量的睾酮分泌。
(实验例1-2)添加8-Br-cAMP对睾酮分泌量的影响
在本实验例中，研究了8-Br-cAMP在制备睾丸间质样细胞过程中的作用。检测培养上清液中的睾酮浓度：一例在培养开始后第6天开始贴壁培养时加入1mM 8-Br-cAMP，并在培养开始后第17天从培养基中去除8-Br-cAMP；以及一例在培养开始后的第17天之后培养基持续含有1mM8-Br-cAMP。通过与实验例1中相同的技术的测量方法测定睾酮浓度。
结果表明，在培养中期去除8-Br-cAMP更有利于维持睾酮分泌(图3)。结果还示出，在培养中期去除8-Br-cAMP更有利于细胞的长期存活(图4)。
(实验例1-3)睾丸间质细胞标记物的表达
在该实验例中，通过细胞免疫染色检测了使用Tet-OffTM系统或Tet-OnTM系统的强制表达NR5A1基因的人iPS细胞中睾丸间质细胞标记物17βHSD3、StAR、CYP17A1和CYP11A1的表达。Tet-OffTM高级可诱导表达系统(Clontech)或Tet-OnTM高级诱导表达系统(Clontech)被用作Tet-OffTTM系统或Tet-OnTM系统(见图5)。
经Tet-OffTM系统处理的细胞：KW107_121-3_NR5A1_睾丸间质_P12+2(EX564)
经Tet-OnTM系统处理的细胞：KW111_3AB4_2S6_NR5A1_睾丸间质
在Tet-OffTM系统中，将通过实施例1的方法制备的睾丸间质样细胞传代四次，并测量第四次传代后第4天的细胞。在Tet-OnTM系统中，开始iPS细胞的分化诱导，并测量第25天的细胞。
结果显示，即使当NR5A1基因用Tet-OffTM系统和Tet-OnTM系统中的任何一种强制表达时，睾丸间质细胞标记物都会表达，但使用Tet-OffTM系统强制表达NR5A1基因的细胞以更高的密度表达睾丸间质细胞标记物17βHSD3、StAR和CYP17A1(图6)。特别地，99.9％或更多的细胞是17βHSD3阳性的(图7)。这表明，通过Tet-OffTM系统的NR5A1基因的长期强制表达表现出了极高的向睾丸间质样细胞分化诱导的效率，并能获得纯度更高的睾丸间质样细胞群。
(实验例1-4)传代后细胞中睾酮的分泌量
在本实验例中，测量传代后细胞的培养上清液中的睾酮浓度。通过与实验例1中相同的技术进行睾酮浓度的测量。
用细胞解离酶(0.5×TrypLE Select)处理通过实施例1的方法(Tet-OffTM系统)培养的细胞(培养开始后第26天)，收获并悬浮在维持培养基(10％FBS+100μM含毛喉素的DMEM培养基(Invitrogen))中以提供细胞悬浮液，然后从1孔传代到5孔中。此时细胞的接种密度约为1×104个细胞/孔(9.6cm2)。在传代后第1天、第9天和第15天测量细胞的培养上清液中的睾酮浓度。传代后第1天睾酮分泌量为11.8ng/mL，第9天为86.6ng/mL，第15天为128ng/mL(图8)。
与第一次传代一样，在第一次传代后进行贴壁培养18天的细胞用细胞解离酶(0.5×TrypLE Select)处理，并悬浮在维持培养基(10％FBS+100μM含毛喉素的DMEM培养基(Invitrogen))中以提供细胞悬浮液，然后从1孔传代到12孔。此时细胞的接种密度约为1×104个细胞/孔(9.6cm2)。在传代后第1天、第9天和第15天测量细胞的培养上清液中的睾酮浓度。传代后第4天睾酮分泌量为14.7ng/mL，第11天为71.9ng/mL，第25天为139ng/mL(图9)。
(实验例1-5)冷冻和解冻后细胞中睾酮的分泌量
在本实验例中，测量了冷冻和解冻后细胞的培养上清液中的睾酮浓度。通过与实验例1中相同的技术进行睾酮浓度的测量。
用细胞解离酶(0.5×TrypLE Select)处理通过实施例1的方法(Tet-OffTM系统)培养的细胞(培养开始后第48天)，将其悬浮在冷冻培养基(STEM-CELLBANKER)中，分配到冷冻保存瓶中，并在液氮中冷冻保存。并按照常规方法将冷冻保存的细胞从液氮储存中取出，解冻，悬浮在维持培养基(10％FBS+100μM含毛喉素的DMEM培养基，Invitrogen)中培养。
在冷冻和解冻后的第27天，测量培养上清液中的睾酮浓度。结果显示睾酮分泌为62.1ng/mL(图10)。
(实验例1-6)经免疫隔离处理的睾丸间质样细胞中睾酮的分泌量
通过实施例1的方法(Tet-OffTM系统)制备的睾丸间质样细胞传代一次，传代后第18天的细胞根据以下方法进行免疫隔离处理。测量含有经过免疫隔离处理的睾丸间质样细胞的培养上清液中的睾酮浓度。通过与实验例1中相同的技术进行睾酮浓度的测量。
(1)将2mL/孔的氯化钙溶液加入NuncTM细胞培养板12孔板中。
(2)传代后第18天，移除贴壁培养中的KW107_121-3_NR5A1_睾丸间质_P12+2(EX564)的维持培养基。
(3)应用400μL/孔0.5×TrypLE select。
(4)将细胞置于37℃含5％CO2的培养箱中，静置2分钟。
(5)从培养箱中取出细胞，移除0.5×TrypLE select。
(6)用1×PBS洗涤细胞。
(7)使用300μL/孔的海藻酸钠溶液。
(8)用移液管悬浮细胞。
(9)用移液管枪头(pipette chip)将200μL的第(8)项的悬浮液倒入第(1)项的孔中。
(10)将悬浮液在常温下放置5分钟，以提供包埋在藻酸盐珠子中的睾丸间质样细胞。
(11)除去珠子以外的溶液。
(12)添加2mL/孔的维持培养基(10％FBS+100μM含毛喉素的DMEM培养基)。
结果显示，进行免疫隔离处理的睾丸间质样细胞分泌28.3ng/mL的睾酮(图11)。
(实施例2)睾丸间质样细胞2的制备
使用iPS细胞(FFPB3AB4)，并采用与实施例1第1至3节所示相同的技术进行培养，在培养的第17天去除8-Br-cAMP后，在含有10％FBS和100μM毛喉素的DMEM培养基(Invitrogen)中进一步对细胞进行维持培养。用细胞解离酶(0.5×TrypLE Select)处理细胞，并在培养开始后第30天收获。通过常规方法用培养基洗涤细胞，然后悬浮在维持培养基(含10％FBS+100μM毛喉素的DMEM培养基)中以提供细胞悬浮液，并在AggreWellTM4006孔板上以每孔2.0×105个细胞进行接种，形成细胞的小球状细胞团(小球体)。作为对比例，在三维培养板(PrimeSurfaceTM:MS-9096M)中以每孔1.25×104个细胞进行接种细胞，形成大的球状细胞团(大球体)(图12)。
通过以下方法对4天内形成的大球体和小球体进行免疫隔离处理，然后培养3天，并测量由此获得的含有睾丸间质样细胞的培养上清液中的睾酮浓度。通过与实验例1中相同的技术进行睾酮浓度的测量。
(1)将2mL/孔的氯化钙溶液加入NuncTM细胞培养板12孔板中。
(2)将相应悬浮培养物中的每个大球体和小球体收集到一个试管中，并移除维持培养基。
(3)分配300μL/孔的海藻酸钠溶液。
(4)用移液管枪头将1000μL的第(3)项悬浮液倒入第(1)项的独立的孔中。
(5)将悬浮液在常温下放置5分钟，以提供包埋在藻酸盐珠子中的睾丸间质样细胞。
(6)移除珠子中包埋的球体以外的溶液。
(7)加入2mL/孔的维持培养基(含10％FBS+100μM毛喉素的DMEM培养基)，然后进行培养。
结果显示，对大球体进行免疫隔离处理的睾丸间质样细胞以9.47ng/mL的浓度提供睾酮分泌，而对小球体进行免疫隔离处理的睾丸间质样细胞以13.5ng/mL的浓度提供睾酮分泌(图13)。上述结果表明，小球体的形成提供了更高的睾酮分泌。
(实施例3)睾丸间质样细胞的移植
本实施例检查了本发明的睾丸间质样细胞是否能够通过使用雌性小鼠移植到小鼠体内。使用iPS细胞(FFPB3AB4)，并采用与实施例1第1至3节所示相同的技术进行培养，在培养的第17天去除8-Br-cAMP后，在含有10％FBS和100μM毛喉素的DMEM培养基(Invitrogen)中进一步对细胞进行维持培养。在培养开始后的第20天，用细胞解离酶(0.5×TrypLE Select)处理细胞，并收获。通过常规方法用培养基洗涤细胞，然后悬浮在维持培养基(含10％FBS+100μM毛喉素的DMEM培养基)中，以提供细胞悬浮液。制备FalconTM细胞培养插入物(FalconTM Cell Culture Inserts)作为用于细胞移植的装置，其包括PET材料的人造膜，将4.5×105个细胞接种在细胞移植装置中并培养2天以提供细胞片(图14)。观察粘附在贴壁培养皿和用于细胞移植的装置上的睾丸间质样细胞的形态(图15)。
将包括用于细胞移植的装置的细胞片皮下移植到免疫功能低下的小鼠(24周龄，雌性)中(图16A)。移植一周后，从小鼠体内取出用于细胞移植的装置，观察移植的睾丸间质样细胞。在移植的细胞片部位观察到小鼠的血管生成，这表明可能建立了促进营养物质输送到移植的睾丸间质样细胞的环境(图16B)。通过用针对指示标记物的抗体(LHCGR)(抗LHR抗体)进行免疫染色来检查移植的睾丸间质样细胞是否表达睾丸间质细胞标记物。在移植的细胞存在的部位，观察到标记物的表达(图17)。
上述内容表明，本发明的睾丸间质样细胞能够移植到小鼠体内，并且不会从用于细胞移植的装置上脱落。
(实施例4)移植的睾丸间质样细胞存活率的检查
本实施例通过使用人工生物发光系统AkaBLI(RIKEN)检查移植到小鼠体内的本发明的睾丸间质样细胞是否在小鼠体内存活。
使用iPS细胞(FFPB3AB4)，并采用与实施例1第1至3节所示相同的技术进行培养，在第17天，用细胞解离酶(0.5×TrypLE Select)处理，收获，并在含有10％FBS、100μM毛喉素和不含8-Br-cAMP的DMEM培养基(Invitrogen)中传代。在传代后第2天(培养开始后第19天)，使用逆转录病毒载体引入Venus-Akaluc基因(RIKEN)(图18)。Akaluc是一种人工酶，当与底物AkaLumine结合时，能够使AkaBLI产生发光。图19示出了培养开始后第17天的睾丸间质样细胞和引入Venus-Akaluc基因之前的细胞(培养开始后的第19天)。
在引入Venus-Akaluc基因后的第21天(培养开始后的第40天)，用细胞解离酶(0.5×TrypLE Select)处理细胞并收获。通过常规方法用培养基洗涤细胞，然后悬浮在维持培养基(含10％FBS+100μM毛喉素的DMEM培养基)中，以提供细胞悬浮液。如实施例3所述，将细胞悬浮液以1.0×105个细胞接种到包括PET材料人造膜的用于细胞移植的装置中，以产生细胞片(图20A)。图20B示出了在引入Venus-Akaluc基因后的第21天的细胞，图20C示出了在用于细胞移植的装置中接种后的第二天的细胞。在每种情况下，使用未转染Venus-Akaluc基因的细胞作为对照。引入Venus-Akaluc基因的细胞表达Venus，即使在用于细胞移植的装置中接种后，在装置上也能检测到Venus的表达(图20B和图20C)。
将包括用于细胞移植的装置的细胞片皮下移植到免疫功能低下的小鼠(11周龄，雌性)中(图21A)。移植后第7天，腹腔注射AkaLumine盐酸盐(AkaLumine hydrochloride)，然后用IVIS成像系统(PerkinElmer)观察AkaBLI的体内发光，以检测Venus的表达。在引入了Akaluc基因的睾丸间质样细胞的细胞片中鉴定出AkaBLI的发光，证明移植的睾丸间质样细胞在小鼠的活体中存活(图21B)。
工业实用性
如上所述，能够稳定和持续分泌睾酮的睾丸间质样细胞可以通过制备人多能干细胞衍生的睾丸间质细胞样细胞的方法来提供，所述方法包括在添加细胞因子混合物以强制表达NR5A1的培养条件下培养人多能干细胞的步骤，其中为添加或去除cAMP的时间、悬浮培养、贴壁培养等进行了各种方式的设计。通过本发明的方法制备的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞能够长期稳定地产生睾酮，并表达17βHSD3、StAR、CYP17A1和CYP11A1中的任何一种。
此外，在强制表达NR5A1的步骤中，可以通过使用Tet-OffTM系统在没有四环素的情况下持续强制表达NR5A1，Tet-OffTM系统采用在大肠杆菌四环素抗性操纵子中起作用的Tet阻遏蛋白(TetR)和Tet操纵子序列(tetO序列)，并允许TetR在没有四环素的情况下与tetO序列结合。这使得能够通过在四环素、多西环素等存在下在分化诱导处理之前保存人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞，并在需要分化诱导时去除四环素、多西环素等，在期望的时间产生睾丸间质样细胞。此外，睾丸间质样细胞可以在不存在四环素或多西环素的情况下产生，因此可以避免这些药物引起的不良作用。
通过本发明的方法制备的睾丸间质样细胞可以传代和冷冻保存。此外，本发明的睾丸间质样细胞可以与本发明的用于细胞移植的组合物，即用于人多能干细胞衍生的内分泌细胞移植的装置一起移植到活体中的所需部位，优选皮下移植，所述装置例如是本发明睾丸间质样细胞粘附的生物相容性膜。此外，免疫隔离处理还提供了作为睾酮产生细胞的功能。本发明的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞可应用于患有与睾酮降低相关的疾病或需要睾酮替代的症状的人。其具体实例包括LOH综合征、Klinefelter综合征、睾丸创伤、继发性性腺功能减退症，以及需要雄性激素替代的生物学上女性人类的病例，如变性人。用于这些情况的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞是有用的，因为经过免疫隔离处理的细胞移植允许水、营养物质或激素通过，但禁止免疫细胞、移植的细胞等通过，从而能够防止与细胞移植相关的排斥反应以及细胞的扩散和侵袭。

Claims (21)

1.一种制备人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法，
包括在人多能干细胞中强制表达NR5A1的步骤，
其中所述方法包括向人多能干细胞的培养系统中添加选自：WNT经典途径激活剂、骨形态发生蛋白4(BMP4)和血管内皮生长因子(VEGF)的一种或多种的步骤。
2.根据权利要求1所述的制备人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法，其中所述方法包括在存在选自WNT经典途径激活剂、BMP4和VEGF中的一种或多种的情况下，在所述人多能干细胞中强制表达NR5A1；然后悬浮培养2天至10天，随后进行贴壁培养的步骤。
3.根据权利要求1所述的制备人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法，其中所述方法包括在存在选自WNT经典途径激活剂、BMP4和VEGF中的一种或多种的情况下，在所述人多能干细胞中强制表达NR5A1；然后进行悬浮培养，直到所述人多能干细胞开始形成胚叶体，随后进行贴壁培养的步骤。
4.根据权利要求2或3所述的制备人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法，其中所述贴壁培养步骤包括去除存在的WNT经典途径激活剂、BMP4和VEGF，然后加入cAMP的步骤。
5.根据权利要求4所述的制备人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法，其中所述方法包括在开始用cAMP处理后的第2天至第40天期间从培养系统中去除cAMP的步骤。
6.根据权利要求4所述的制备人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法，其中所述贴壁培养步骤包括去除存在的WNT经典途径激活剂、BMP4和VEGF，然后用毛喉素处理的步骤。
7.根据权利要求1所述的制备人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法，其中，在存在选自WNT经典途径激活剂、BMP4和VEGF的一种或多种的情况下的一种或多种存在下，人多能干细胞中强制表达NR5A1的步骤在能够形成50个细胞到20000个细胞的一个胚状体的培养装置上进行。
8.根据权利要求1所述的制备人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法，其中人多能干细胞中强制表达NR5A1的步骤包括在四环素依赖性基因表达系统中使用Tet-Off(商标名)系统，所述Tet-Off系统在四环素或多西环素不存在的情况下强制表达NR5A1。
9.根据权利要求2或3所述的制备人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法，其中所述方法包括在进行悬浮培养和贴壁培养后进一步进行悬浮培养的步骤。
10.根据权利要求1所述的制备人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞的方法，其中，从所述人多能干细胞到所述人多能干细胞衍生睾丸间质状细胞的分化诱导效率为80％或更高。
11.一种人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞，其通过权利要求1的方法制备。
12.根据权利要求11所述的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞，其中所述人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞是连续产生睾酮至少60天的睾丸间质样细胞。
13.一种人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞，所述人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞是在权利要求11的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞传代至少一次后获得的。
14.一种人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞群，包括权利要求11所述的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞。
15.根据权利要求14所述的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞群，其中所述人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞群包含80％或更多能够产生睾酮的睾丸间质样细胞。
16.根据权利要求14或15所述的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞群，其中所述人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞群进行免疫隔离处理。
17.一种用于治疗与睾酮降低相关疾病的药物组合物，包含权利要求14或15所述的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞群作为活性成分。
18.一种用于细胞移植的组合物，包含生物相容性膜，所述生物相容性膜上粘附有权利要求14或15所述的人多能干细胞衍生的睾丸间质样细胞群。
19.一种用于多能干细胞衍生的内分泌细胞移植的装置，包括用于将多能干细胞衍生的内分泌细胞植入活体的生物相容性膜。
20.根据权利要求19所述的用于多能干细胞衍生的内分泌细胞移植的装置，其中所述多能干细胞衍生的内分泌细胞是能够产生睾酮的人多能干细胞衍生的内分泌细胞。
21.根据权利要求20所述的用于多能干细胞衍生的内分泌细胞移植的装置，其中，能够产生睾酮的人多能干细胞衍生的内分泌细胞是权利要求11所述的人多干细胞衍生的睾丸间质样细胞。
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