CN118974253A

CN118974253A - Crispr v型系统的治疗应用

Info

Publication number: CN118974253A
Application number: CN202380029750.9A
Authority: CN
Inventors: 保罗·丹尼尔·多诺豪; 史蒂文·B·坎纳; 安东尼奥·穆诺斯-豪威尔; 麦格戴德·拉达尔
Original assignee: Caribou Biosciences Inc
Current assignee: Caribou Biosciences Inc
Priority date: 2022-04-13
Filing date: 2023-04-12
Publication date: 2024-11-15

Abstract

本公开提供了用于治疗用途的方法和组合物，其中所述方法和所述组合物包含具有RNA向导的V型CRISPR系统，所述RNA向导含有核糖核苷酸碱基和至少一个脱氧核糖核苷酸碱基。所述V型CRISPR系统用于在动物的体细胞、诱导多能干细胞(iPSC)和种系或胚胎细胞中进行治疗性基因组编辑以对器官和组织进行异种移植。

Description

CRISPR V型系统的治疗应用

相关申请的交叉引用

本申请要求于2022年4月13日提交的美国临时申请序列号63/330,695以及于2022年4月18日提交的美国临时申请序列号63/332,173的优先权，所有这些美国临时申请均通过引用并入本文。

关于联邦资助研究的声明

不适用。

技术领域

本公开总体上涉及利用用成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)系统，更具体地CRISPR-Cas12系统修饰的细胞的细胞疗法领域。

背景技术

成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关(Cas)蛋白系统存在于许多原核生物的基因组中，并且提供针对病毒的适应性免疫。可以在Makarova等人中找到各种CRISPR-Cas系统在其天然宿主(1类I型；2类II和V型)、RNA靶向(2类VI型)以及DNA和RNA联合靶向(1类III型)方面的最新描述和分类(《自然综述：微生物学(Nat.Rev.Microbiol.)》,2020,18:67-83)。尤其感兴趣的是V型系统，其包含不同的亚型，例如，V-A、V-B、V-C、V-D、V-E、V-F、V-G、V-H、V-I、V-J、V-K和V-U。V-A亚型编码Cas12a蛋白(以前被称为Cpf1)。Cas12a具有与Cas9的相应结构域同源的RuvC样核酸酶结构域但缺少HNH核酸酶结构域。

已经在若干种细菌中发现V型系统，所述细菌包含俭菌超门细菌(Parcubacteriabacterium)GWC2011_GWC2_44_17(PbCpf1)、毛螺菌科细菌(Lachnospiraceae bacterium)MC2017(Lb3 Cpf1)、解蛋白丁酸弧菌(Butyrivibrio proteoclasticus)(BpCpf1)、异域菌门细菌(Peregrinibacteria bacterium)GW2011_GWA_33_10(PeCpf1)、氨基酸球菌(Acidaminococcus sp.)BV3L6(AsCpf1)、猕猴卟啉单胞菌(Porphyromonas macacae)(PmCpf1)、毛螺菌科细菌ND2006(LbCpf1)、狗口腔卟啉单胞菌(Porphyromonascrevioricanis)(PcCpf1)、解糖胨普雷沃氏菌(Prevotella disiens)(PdCpf1)、牛眼莫拉氏菌(Moraxella bovoculi)237(MbCpf1)、史密斯氏菌属(Smithella sp.)SC_K08D17(SsCpf1)、稻田氏钩端螺旋体(Leptospira inadai)(LiCpf1)、毛螺菌科细菌MA2020(Lb2Cpf1)、新凶手弗朗西斯菌(Francisella novicida)U112(FnCpf1)、候选白蚁甲烷支原体(Candidatus methanoplasma termitum)(CMtCpf1)和挑剔真杆菌(Eubacteriumeligens)(EeCpf1)。

CRISPR-Cas系统提供了用于通过缺失、插入、突变或取代特定核酸序列进行定点基因组编辑的强大工具。改变可能是基因特异性的或位置特异性的。基因组编辑可以使用定点核酸酶(如Cas蛋白和其同源多核苷酸)来切割靶核酸，由此产生用于改变的位点。在某些情况下，切割可以在靶DNA序列中引入双链断裂(DSB)。DSB可以例如通过非同源端接合(NHEJ)、微同源介导的端接合(MMEJ)或同源定向修复(HDR)进行修复。HDR依赖于模板的存在进行修复。在这种基因组编辑的一些实例中，供体多核苷酸或其部分可以插入到断裂中。

发明内容

这种利用V型CRISPR-Cas蛋白(如Cas12a)与CRISPR杂交RNA-DNA向导(chRDNA)组合的基因组编辑方法对于产生可用于治疗应用的经基因修饰的细胞来说尤其有用。

在一些实施例中，本发明是一种治疗以基因的异常表达为特征的疾病或病状的方法，所述方法包括将以下引入到患有疾病或病状的患者的体细胞中：(a)第一核蛋白复合物，所述第一核蛋白复合物包括Cas12a蛋白和第一CRISPR向导分子，所述第一CRISPR向导分子具有能够与第一靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述Cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述Cas12a蛋白能够切割第一靶核酸，其中所述第一CRISPR向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸；以及(b)供体多核苷酸，所述供体多核苷酸包括在患有所述疾病或病状的个体中异常表达的基因靶的编码序列；其中由所述Cas12a蛋白进行的切割引起将所述编码序列插入到所述体细胞的基因组中，并且其中所述引入是通过使所述体细胞与包括所述第一核蛋白复合物和所述供体多核苷酸的脂质纳米颗粒接触进行的，并且其中所述基因靶选自表3。在一些实施例中，在所述CRISPR向导分子中，所述激活区、所述靶向区或两者均包括至少一种脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中，所述方法进一步包括将包括Cas12a蛋白和第二CRISPR向导分子的第二核蛋白复合物引入到所述体细胞中，所述第二CRISPR向导分子具有能够与第二靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述Cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述Cas12a蛋白能够切割第二靶核酸；其中所述编码序列插入在由所述Cas12a蛋白切割的第一靶核酸和所述第二靶核酸中的切割位点之间。在一些实施例中，所述第二CRISPR向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸。

在一些实施例中，所述将所述编码序列插入到所述体细胞的基因组中引起所述基因在所述体细胞中的表达增加。在一些实施例中，所述脂质纳米颗粒包括一种或多种阳离子脂质，其中所述脂质或两种或更多种脂质的组合的pK_a介于6.1与6.7之间。在一些实施例中，所述脂质纳米颗粒包括中性脂质。在一些实施例中，所述脂质纳米颗粒包括固醇。在一些实施例中，所述脂质纳米颗粒包括一种或多种选自由以下组成的组的脂质：DSPC、DPPC、POPC、DOPE、SM、PEG-DMA、PEG-DMG、DOTMA、DOSPA、DOTAP、DMRIE、DC-胆固醇、DOTAP-胆固醇、GAP-DMORIE-DPyPE、GL67A-DOPE-DMPE-PEG、98N12-5、C12-200、DLin-KC2-DMA(KC2)、DLin-MC3-DMA(MC3)、XTC、MD1、7C1、PEG-CerC14和PEG-CerC20。

在一些实施例中，所述引入到体细胞中是离体进行的。在一些实施例中，所述引入到体细胞中是通过全身静脉内施用、施用到门静脉中或通过眼内施用进行的。

在一些实施例中，本发明是一种用于治疗以基因的异常表达为特征的疾病或病状的治疗组合物，所述组合物包括：(a)第一核蛋白复合物，所述第一核蛋白复合物包括Cas12a蛋白和第一CRISPR向导分子，所述第一CRISPR向导分子具有能够与第一靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述Cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述Cas12a蛋白能够切割第一靶核酸，其中所述第一CRISPR向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸；以及(b)供体多核苷酸，所述供体多核苷酸包括在患有所述疾病或病状的个体中异常表达的基因靶的编码序列；其中所述第一核蛋白复合物和所述供体多核苷酸存在于脂质纳米颗粒中，并且其中所述基因靶选自表3。在一些实施例中，在所述CRISPR向导分子中，所述激活区、所述靶向区或两者均包括至少一种脱氧核糖核苷酸。

在一些实施例中，所述组合物进一步包括第二核蛋白复合物，所述第二核蛋白复合物包括Cas12a蛋白和第二CRISPR向导分子，所述第二CRISPR向导分子具有能够与第二靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述Cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述Cas12a蛋白能够切割第二靶核酸。在所述组合物的一些实施例中，所述第二CRISPR向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸。在所述组合物的一些实施例中，所述脂质纳米颗粒包括一种或多种阳离子脂质，其中所述脂质或两种或更多种脂质的组合的pK_a介于6.1与6.7之间。在所述组合物的一些实施例中，所述脂质纳米颗粒包括中性脂质。在所述组合物的一些实施例中，所述脂质纳米颗粒包括固醇。在所述组合物的一些实施例中，所述脂质纳米颗粒包括一种或多种选自由以下组成的组的脂质：DSPC、DPPC、POPC、DOPE、SM、PEG-DMA、PEG-DMG、DOTMA、DOSPA、DOTAP、DMRIE、DC-胆固醇、DOTAP-胆固醇、GAP-DMORIE-DPyPE、GL67A-DOPE-DMPE-PEG、98N12-5、C12-200、DLin-KC2-DMA(KC2)、DLin-MC3-DMA(MC3)、XTC、MD1、7C1、PEG-CerC14和PEG-CerC20。在一些实施例中，所述组合物进一步包括药学上可接受的载剂。

在一些实施例中，本发明是一种用经基因修饰的分化的诱导多能干细胞(iPSC)治疗以基因的异常表达为特征的疾病或病状的方法，所述方法包括：(1)将以下引入到iPSC中：第一核蛋白复合物，所述第一核蛋白复合物包括Cas12a蛋白和第一CRISPR向导分子，所述第一CRISPR向导分子具有能够与第一靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述Cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述Cas12a蛋白能够切割第一靶核酸，其中所述第一CRISPR向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸；其中由所述Cas12a蛋白进行的切割引起选自表4或表5的基因靶的修饰；(2)在患有所述疾病或病状的个体中将所述iPSC分化为受所述疾病或病状影响的细胞类型；以及(3)向受所述疾病或病状影响的患者施用分化的iPSC。在一些实施例中，在所述CRISPR向导分子中，所述激活区、所述靶向区或两者均包括至少一种脱氧核糖核苷酸。

在一些实施例中，所述方法进一步包括将包括Cas12a蛋白和第二CRISPR向导分子的第二核蛋白复合物引入到所述iPSC中，所述第二CRISPR向导分子具有能够与第二靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述Cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述Cas12a蛋白能够切割第二靶核酸；其中所述编码序列插入在由所述Cas12a蛋白切割的第一靶核酸和所述第二靶核酸中的切割位点之间。在所述方法的一些实施例中，所述第二CRISPR向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中，所述方法进一步包括将供体多核苷酸引入到所述iPSC中，所述供体多核苷酸包括选自表4的基因靶的编码序列。在所述方法的一些实施例中，所述用所述Cas12a蛋白进行的切割引起将所述编码序列插入到所述iPSC的基因组中。在所述方法的一些实施例中，所述将所述编码序列插入到所述iPSC的基因组中引起所述基因在所述iPSC中的表达增加。在所述方法的一些实施例中，所述用所述Cas12a蛋白进行的切割引起所述iPSC的基因组中表5中列出的基因靶的编码序列的破坏。在所述方法的一些实施例中，所述iPSC的基因组中的所述破坏引起所述基因在所述iPSC中的表达减少。在所述方法的一些实施例中，所述iPSC是通过对体细胞进行重新编程产生的。在所述方法的一些实施例中，所述重新编程是通过诱导一个或多个基因在所述体细胞中的表达进行的。在所述方法的一些实施例中，所述重新编程是通过诱导基因表达进行的，是通过将mRNA引入到所述体细胞中进行的。在所述重新编程的一些实施例中，所述一个或多个基因选自Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、NANOG、Sox1、Sox3、Sox15、Sox18、Klf1、Klf2、Klf5、NR5A2、c-Myc、l-Myc、n-Myc、Rem2、Tert、LIN28和Wnt。在所述重新编程的一些实施例中，所述一个或多个基因由Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的组合组成。在所述重新编程的一些实施例中，所述一个或多个基因由Oct4、Sox2和NANOG的组合组成。在所述方法的一些实施例中，所述重新编程进一步包括使所述iPSC与以下中的一者或多者接触：MEK抑制剂、DNA甲基转移酶抑制剂、组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂、丙戊酸、5'-氮杂胞苷、地塞米松(dexamethasone)、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、维生素C和曲古抑菌素(TSA)、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA(例如，MK0683、伏立诺他(vorinostat))和其它异羟肟酸)、BML-210、Depudecin(例如，(-)-Depudecin)、HC毒素、Nullscript(4-(1,3-二氧代-1H,3H-苯并[de]异喹啉-2-基)-N-羟基丁酰胺)、苯基丁酸盐(例如，苯丁酸钠)和丙戊酸((VP A)和其它短链脂肪酸)、斯克瑞泰(Scriptaid)、苏拉明钠(Suramin Sodium)、曲古抑菌素A(TSA)、APHA化合物8、制蚜菌素(Apicidin)、丁酸钠、新戊酰氧基甲基丁酸盐(Pivanex，AN-9)、曲普欣B(Trapoxin B)、Chlamydocin、缩酚酸肽(也被称为FR901228或FK228)、苯甲酰胺(例如，CI-994(例如，N-乙酰基地那林(N-acetyl dinaline))和MS-27-275)、MGCD0103、NVP-LAQ-824、CBHA(间羧基肉桂酸双异羟肟酸)、JNJ16241199、吐巴辛(Tubacin)、A-161906、proxamide、oxamflatin、3-C1-UCHA(例如，6-(3-氯苯基脲基)己异羟肟酸)、AOE(2-氨基-8-氧代-9,10-环氧癸酸)、CHAP31和CHAP50。在所述方法的一些实施例中，所述iPSC分化为神经元。在所述方法的一些实施例中，通过在存在以下中的一者或多者的情况下温育所述iPSC来将所述iPSC分化为神经元：GSK-3抑制剂、TGF-β受体或TGF-β抑制剂、ALK抑制剂、多索吗啡(dorsomorphin)、化合物E、FGF、EGF、全反式视黄酸、音猬蛋白(Sonic Hedgehog protein)、嘌莫啡胺(purmorphamine)、SAG二盐酸盐、CNTF和GDNF。在所述方法的一些实施例中，所述将iPSC分化为神经元是通过在分化过程之后测量Sox1、Pax6、巢蛋白(Nestin)、HB9、MAP2、神经丝、Tuj1和Olig2中的一者或多者的表达来评估的。在所述方法的一些实施例中，所述将iPSC分化为神经元是通过在分化过程之后测量所述细胞的电活动来评估的。

在所述方法的一些实施例中，其中所述iPSC分化为肌细胞。在所述方法的一些实施例中，通过在存在GSK-3抑制剂和Wnt依赖性磷酸化阻断剂中的一者或多者的情况下温育所述iPSC来将所述iPSC分化为肌细胞。在所述方法的一些实施例中，所述将iPSC分化为肌细胞是通过在分化过程之后测量TBX5、TNNT2、MYH6和MYL7中的一者或多者的表达来评估的。

在一些实施例中，本发明是一种用经基因修饰的分化的诱导多能干细胞(iPSC)治疗以基因的异常表达为特征的疾病或病状的组合物，所述组合物包括iPSC，所述iPSC包括：第一核蛋白复合物，所述第一核蛋白复合物包括Cas12a蛋白和第一CRISPR向导分子，所述第一CRISPR向导分子具有能够与第一靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述Cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述Cas12a蛋白能够切割第一靶核酸，其中所述第一CRISPR向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸；其中由所述Cas12a蛋白进行的切割引起选自表4或表5的基因靶的修饰；并且所述iPSC能够在患有所述疾病或病状的个体中分化为受所述疾病或病状影响的细胞类型。在所述组合物的一些实施例中，CRISPR向导分子，所述激活区、所述靶向区或两者均包括至少一种脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中，所述组合物进一步包括将包括Cas12a蛋白和第二CRISPR向导分子的第二核蛋白复合物引入到所述iPSC中，所述第二CRISPR向导分子具有能够与第二靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述Cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述Cas12a蛋白能够切割第二靶核酸；其中所述编码序列插入在由所述Cas12a蛋白切割的第一靶核酸和所述第二靶核酸中的切割位点之间。在所述组合物的一些实施例中，所述第二CRISPR向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中，所述组合物进一步包括供体多核苷酸，所述供体多核苷酸包括选自表4的基因靶的编码序列。在所述组合物的一些实施例中，所述用所述Cas12a蛋白进行的切割引起将所述编码序列插入到所述iPSC的基因组中。在所述组合物的一些实施例中，所述将所述编码序列插入到所述iPSC的基因组中引起所述基因在所述iPSC中的表达增加。在所述组合物的一些实施例中，所述用所述Cas12a蛋白进行的切割引起所述iPSC的基因组中表5中列出的基因靶的编码序列的破坏。在所述组合物的一些实施例中，所述iPSC的基因组中的所述破坏引起所述基因在所述iPSC中的表达减少。在所述组合物的一些实施例中，所述iPSC是通过对体细胞进行重新编程产生的。在所述组合物的一些实施例中，所述重新编程是通过诱导一个或多个基因在所述体细胞中的表达进行的。在所述组合物的一些实施例中，所述重新编程是通过诱导基因表达进行的，是通过将mRNA引入到所述体细胞中进行的。在所述组合物的一些实施例中，所述一个或多个基因选自Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、NANOG、Sox1、Sox3、Sox15、Sox18、Klf1、Klf2、Klf5、NR5A2、c-Myc、l-Myc、n-Myc、Rem2、Tert、LIN28和Wnt。在所述组合物的一些实施例中，所述一个或多个基因由Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的组合组成。在所述组合物的一些实施例中，所述一个或多个基因由Oct4、Sox2和NANOG的组合组成。在所述组合物的一些实施例中，其中所述重新编程进一步包括使所述iPSC与以下中的一者或多者接触：MEK抑制剂、DNA甲基转移酶抑制剂、组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂、丙戊酸、5'-氮杂胞苷、地塞米松、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、维生素C和曲古抑菌素(TSA)、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA(例如，MK0683、伏立诺他)和其它异羟肟酸)、BML-210、Depudecin(例如，(-)-Depudecin)、HC毒素、Nullscript(4-(1,3-二氧代-1H,3H-苯并[de]异喹啉-2-基)-N-羟基丁酰胺)、苯基丁酸盐(例如，苯丁酸钠)和丙戊酸((VP A)和其它短链脂肪酸)、斯克瑞泰、苏拉明钠、曲古抑菌素A(TSA)、APHA化合物8、制蚜菌素、丁酸钠、新戊酰氧基甲基丁酸盐(Pivanex，AN-9)、曲普欣B(Trapoxin B)、Chlamydocin、缩酚酸肽(也被称为FR901228或FK228)、苯甲酰胺(例如，CI-994(例如，N-乙酰基地那林(N-acetyldinaline))和MS-27-275)、MGCD0103、NVP-LAQ-824、CBHA(间羧基肉桂酸双异羟肟酸)、JNJ16241199、吐巴辛、A-161906、proxamide、oxamflatin、3-C1-UCHA(例如，6-(3-氯苯基脲基)己异羟肟酸)、AOE(2-氨基-8-氧代-9,10-环氧癸酸)、CHAP31和CHAP50。

在所述组合物的一些实施例中，所述iPSC分化为神经元。在所述组合物的一些实施例中，通过在存在以下中的一者或多者的情况下温育所述iPSC来将所述iPSC分化为神经元：GSK-3抑制剂、TGF-β受体或TGF-β抑制剂、ALK抑制剂、多索吗啡、化合物E、FGF、EGF、全反式视黄酸、音猬蛋白、嘌莫啡胺、SAG二盐酸盐、CNTF和GDNF。在所述组合物的一些实施例中，所述将iPSC分化为神经元是通过在分化过程之后测量Sox1、Pax6、巢蛋白、HB9、MAP2、神经丝、Tuj1和Olig2中的一者或多者的表达来评估的。在所述组合物的一些实施例中，所述将iPSC分化为神经元是通过在分化过程之后测量所述细胞的电活动来评估的。

在所述组合物的一些实施例中，所述iPSC分化为肌细胞。在所述组合物的一些实施例中，通过在存在GSK-3抑制剂和Wnt依赖性磷酸化阻断剂中的一者或多者的情况下温育所述iPSC来将所述iPSC分化为肌细胞。在所述组合物的一些实施例中，所述将iPSC分化为肌细胞是通过在分化过程之后测量TBX5、TNNT2、MYH6和MYL7中的一者或多者的表达来评估的。

在一些实施例中，所述组合物进一步包括药学上可接受的载剂。

在一些实施例中，本发明是一种制备用于治疗以基因的异常表达为特征的疾病或病状的经基因修饰的分化的诱导多能干细胞(iPSC)的方法，所述方法包括：(1)将以下引入到iPSC中：第一核蛋白复合物，所述第一核蛋白复合物包括Cas12a蛋白和第一CRISPR向导分子，所述第一CRISPR向导分子具有能够与第一靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述Cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述Cas12a蛋白能够切割第一靶核酸，其中所述第一CRISPR向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸；其中由所述Cas12a蛋白进行的切割引起选自表4或表5的基因靶的修饰；(2)在患有所述疾病或病状的个体中将所述iPSC分化为受所述疾病或病状影响的细胞类型；以及(3)向受所述疾病或病状影响的患者施用分化的iPSC。在所述方法的一些实施例中，所述CRISPR向导分子，所述激活区、所述靶向区或两者均包括至少一种脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中，所述方法进一步包括将包括Cas12a蛋白和第二CRISPR向导分子的第二核蛋白复合物引入到所述iPSC中，所述第二CRISPR向导分子具有能够与第二靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述Cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述Cas12a蛋白能够切割第二靶核酸；其中所述编码序列插入在由所述Cas12a蛋白切割的第一靶核酸和所述第二靶核酸中的切割位点之间。在所述方法的一些实施例中，所述第二CRISPR向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中，方法进一步包括将供体多核苷酸引入到所述iPSC中，所述供体多核苷酸包括选自表4的基因靶的编码序列。在所述方法的一些实施例中，所述用所述Cas12a蛋白进行的切割引起将所述编码序列插入到所述iPSC的基因组中。在所述方法的一些实施例中，所述将所述编码序列插入到所述iPSC的基因组中引起所述基因在所述iPSC中的表达增加。在所述方法的一些实施例中，所述用所述Cas12a蛋白进行的切割引起所述iPSC的基因组中表5中列出的基因靶的编码序列的破坏。在所述方法的一些实施例中，所述iPSC的基因组中的所述破坏引起所述基因在所述iPSC中的表达减少。在所述方法的一些实施例中，所述iPSC是通过对体细胞进行重新编程产生的。在所述方法的一些实施例中，所述重新编程是通过诱导一个或多个基因在所述体细胞中的表达进行的。在所述方法的一些实施例中，所述重新编程是通过诱导基因表达进行的，是通过将mRNA引入到所述体细胞中进行的。在所述重新编程的一些实施例中，所述一个或多个基因选自Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、NANOG、Sox1、Sox3、Sox15、Sox18、Klf1、Klf2、Klf5、NR5A2、c-Myc、l-Myc、n-Myc、Rem2、Tert、LIN28和Wnt。在所述重新编程的一些实施例中，所述一个或多个基因由Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的组合组成。在所述重新编程的一些实施例中，所述一个或多个基因由Oct4、Sox2和NANOG的组合组成。在所述方法的一些实施例中，所述重新编程进一步包括使所述iPSC与以下中的一者或多者接触：MEK抑制剂、DNA甲基转移酶抑制剂、组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂、丙戊酸、5'-氮杂胞苷、地塞米松、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、维生素C和曲古抑菌素(TSA)、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA(例如，MK0683、伏立诺他)和其它异羟肟酸)、BML-210、Depudecin(例如，(-)-Depudecin)、HC毒素、Nullscript(4-(1,3-二氧代-1H,3H-苯并[de]异喹啉-2-基)-N-羟基丁酰胺)、苯基丁酸盐(例如，苯丁酸钠)和丙戊酸((VP A)和其它短链脂肪酸)、斯克瑞泰、苏拉明钠、曲古抑菌素A(TSA)、APHA化合物8、制蚜菌素、丁酸钠、新戊酰氧基甲基丁酸盐(Pivanex，AN-9)、曲普欣B、Chlamydocin、缩酚酸肽(也被称为FR901228或FK228)、苯甲酰胺(例如，CI-994(例如，N-乙酰基地那林)和MS-27-275)、MGCD0103、NVP-LAQ-824、CBHA(间羧基肉桂酸双异羟肟酸)、JNJ16241199、吐巴辛(Tubacin)、A-161906、proxamide、oxamflatin、3-C1-UCHA(例如，6-(3-氯苯基脲基)己异羟肟酸)、AOE(2-氨基-8-氧代-9,10-环氧癸酸)、CHAP31和CHAP50。

在所述方法的一些实施例中，所述iPSC分化为神经元。在所述方法的一些实施例中，通过在存在以下中的一者或多者的情况下温育所述iPSC来将所述iPSC分化为神经元：GSK-3抑制剂、TGF-β受体或TGF-β抑制剂、ALK抑制剂、多索吗啡、化合物E、FGF、EGF、全反式视黄酸、音猬蛋白、嘌莫啡胺、SAG二盐酸盐、CNTF和GDNF。在所述方法的一些实施例中，所述将iPSC分化为神经元是通过在分化过程之后测量Sox1、Pax6、巢蛋白、HB9、MAP2、神经丝、Tuj1和Olig2中的一者或多者的表达来评估的。在所述方法的一些实施例中，所述将iPSC分化为神经元是通过在分化过程之后测量所述细胞的电活动来评估的。

在一些实施例中，本发明是一种制备用于异种移植的转基因动物的方法，所述方法包括：(1)将以下引入到动物的细胞中：第一核蛋白复合物，所述第一核蛋白复合物包括Cas12a蛋白和第一CRISPR向导分子，所述第一CRISPR向导分子具有能够与第一靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述Cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述Cas12a蛋白能够切割第一靶核酸，其中所述第一CRISPR向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸；其中由所述Cas12a蛋白进行的切割引起选自表6的基因靶的修饰；(2)将所述细胞引入到寄养雌性动物体内。在所述方法的一些实施例中，动物的细胞是卵母细胞、卵子或受精卵。在所述方法的一些实施例中，所述动物的细胞是体细胞，并且所述方法进一步包括在步骤(1)之后，将所述细胞的核转移到去核卵子或受精卵中。在所述方法的一些实施例中，所述动物是猪。在所述方法的一些实施例中，在所述CRISPR向导分子中，所述激活区、所述靶向区或两者均包括至少一种脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中，所述方法进一步包括将包括Cas12a蛋白和第二CRISPR向导分子的第二核蛋白复合物引入到所述iPSC中，所述第二CRISPR向导分子具有能够与第二靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述Cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述Cas12a蛋白能够切割第二靶核酸；其中所述编码序列插入在由所述Cas12a蛋白切割的第一靶核酸和所述第二靶核酸中的切割位点之间。在所述方法的一些实施例中，所述第二CRISPR向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中，所述方法进一步包括将供体多核苷酸引入到所述细胞中，所述供体多核苷酸包括选自以下的基因靶的编码序列：A20、HO-1、FAT-1、TNF-α受体、CD39、水蛭素、TFPI、EPCR、TBM、CD46、DAF(CD55)、CD59、CR1、CTLA4、CD47、I类HLA中的一个或多个I类HLA。在所述方法的一些实施例中，所述用所述Cas12a蛋白进行的切割引起将所述编码序列插入到所述细胞的基因组中。在所述方法的一些实施例中，所述将所述编码序列插入到所述细胞的基因组中引起所述基因在所述细胞中的表达增加。在所述方法的一些实施例中，所述用所述Cas12a蛋白进行的切割引起所述细胞的基因组中选自以下的基因靶的编码序列的破坏：GGTA1、b4GalNT2、CMAH、GT(α(1,3)-半乳糖基转移酶)、GHR、I类SLA中的一个或多个I类SLA。在所述方法的一些实施例中，所述细胞的基因组中的所述破坏引起所述基因在所述细胞中的表达减少。

在一些实施例中，本发明是一种用于制备用于异种移植的转基因动物的组合物，所述组合物包括动物细胞，所述动物细胞包括：第一核蛋白复合物，所述第一核蛋白复合物包括Cas12a蛋白和第一CRISPR向导分子，所述第一CRISPR向导分子具有能够与第一靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述Cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述Cas12a蛋白能够切割第一靶核酸，其中所述第一CRISPR向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸；其中由所述Cas12a蛋白进行的切割引起选自表6的基因靶的修饰。在所述组合物的一些实施例中，动物的细胞是卵母细胞、卵子或受精卵。在所述组合物的一些实施例中，所述动物的细胞是由将体细胞的核转移到去核卵子或受精卵中而产生的卵子或受精卵。在所述组合物的一些实施例中，所述动物是猪。在所述组合物的一些实施例中，所述CRISPR向导分子，所述激活区、所述靶向区或两者均包括至少一种脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中，所述组合物进一步包括将包括Cas12a蛋白和第二CRISPR向导分子的第二核蛋白复合物引入到所述iPSC中，所述第二CRISPR向导分子具有能够与第二靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述Cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述Cas12a蛋白能够切割第二靶核酸；其中所述编码序列插入在由所述Cas12a蛋白切割的第一靶核酸和所述第二靶核酸中的切割位点之间。在所述组合物的一些实施例中，所述第二CRISPR向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中，所述组合物进一步包括供体多核苷酸，所述供体多核苷酸包括选自以下的基因靶的编码序列：A20、HO-1、FAT-1、TNF-α受体、CD39、水蛭素、TFPI、EPCR、TBM、CD46、DAF(CD55)、CD59、CR1、CTLA4、CD47、I类HLA中的一个或多个I类HLA。在所述组合物的一些实施例中，所述用所述Cas12a蛋白进行的切割引起将所述编码序列插入到所述细胞的基因组中。在所述组合物的一些实施例中，所述将所述编码序列插入到所述细胞的基因组中引起所述基因在所述细胞中的表达增加。在所述组合物的一些实施例中，所述用所述Cas12a蛋白进行的切割引起所述细胞的基因组中选自以下的基因靶的编码序列的破坏：GGTA1、b4GalNT2、CMAH、GT(α(1,3)-半乳糖基转移酶)、GHR、I类SLA中的一个或多个I类SLA。在所述组合物的一些实施例中，所述细胞的基因组中的所述破坏引起所述基因在所述细胞中的表达减少。

附图说明

在所附权利要求书中对本公开的特征进行了具体阐述。通过参考阐述了说明性实施例的以下详细说明，将获得对本公开的特征和优点的更好理解，在所述实施例中利用了本公开的原理和附图。附图不是按比例渲染的，也不是按比例绘制的。指示标记的位置是近似的。

图1A、图1B和图1C展示了V型CRISPR-Cas12a向导RNA的实例。

图2展示了靶多核苷酸的Cas12a chRDNA向导/核蛋白复合物切割。

图3A-图3I展示了用于Cas12 chRDNA向导的各种典型和非典型核苷酸。

图4展示了靶多核苷酸的Cas12a chRDNA向导/核蛋白复合物切割。

图5展示了Cas12a crRNA向导。

图6展示了包括激活区中的DNA碱基和靶结合序列的Cas12a chRDNA向导。

图7展示了包括激活区中的DNA碱基和经化学修饰的核酸以及靶结合序列的Cas12a chRDNA向导。

图8展示了Cas12 chRDNA向导/核蛋白复合物的形成和靶多核苷酸的结合。

图9示出由Cas12 chRDNA向导/核蛋白复合物在靶多核苷酸中产生的插入或缺失(indel)。

图10展示了由Cas12 chRDNA向导/核蛋白复合物在靶多核苷酸中进行的供体多核苷酸序列的插入。

图11展示了由Cas12 chRDNA向导/核蛋白复合物对靶多核苷酸的切刻。

图12展示了用两个Cas12 chRDNA向导/核蛋白复合物对靶多核苷酸进行的串联切刻以及供体多核苷酸序列在靶多核苷酸中的插入。

具体实施方式

定义

以下定义帮助理解本公开。

如本文所使用的术语“向导”和“向导多核苷酸”是指与Cas蛋白形成核蛋白复合物的一个或多个多核苷酸，其中所述核蛋白复合物优先与多核苷酸中的核酸靶序列结合(相对于不包括核酸靶序列的多核苷酸)。此类向导可以包括核糖核苷酸碱基(例如，RNA)、脱氧核糖核苷酸碱基(例如，DNA)、核糖核苷酸碱基和脱氧核糖核苷酸碱基的组合(例如，RNA/DNA)、核苷酸类似物、经修饰的核苷酸等，以及合成的、天然存在的和非天然存在的经修饰的主链残基或键。已知许多此类向导，如但不限于单向导RNA(包含微型和截短的单向导RNA)、crRNA、双向导RNA，包含但不限于crRNA/tracrRNA分子等，其使用取决于特定Cas蛋白。例如，“V型CRISPR-Cas12相关向导”是与同源Cas12蛋白特异性缔合以形成核蛋白复合物的向导。

如本文所使用的，“CRISPR多核苷酸”是包括向导分子的一部分的多核苷酸序列。在一些实施例中，CRISPR多核苷酸包含靶向区和/或激活区。

关于向导分子，如本文所使用的“间隔子”、“间隔子序列”、“间隔子元件”或“靶向区”是指可以与靶核酸序列特异性杂交的多核苷酸序列。靶向区通过互补碱基对(即，成对碱基)之间的氢键合与靶核酸序列相互作用。靶向区与所选核酸靶序列结合。在一些实施例中，靶序列是细胞的基因组内的序列，无论是在体外、离体(如在CAR-T细胞的产生中)还是在体内(如其中直接向受试者施用组合物的情况)。靶向区确定Cas12蛋白的位点特异性结合和溶核切割的位置。靶向区的功能性长度的可变性是本领域已知的。

关于向导分子，术语“激活区”是指多核苷酸的能够与Cas12多肽(如Cas12a多肽)缔合或结合的一部分。

如本文所使用的，术语“碱基类似物”、“非典型碱基”和“经化学修饰的碱基”是指与DNA或RNA中存在的典型嘌呤或嘧啶碱基具有结构相似性的化合物。如与天然存在于DNA或RNA中的嘌呤或嘧啶碱基相比，碱基类似物可以含有经修饰的糖和/或经修饰的核碱基。在一些实施例中，碱基类似物是肌苷或脱氧肌苷，如2'-脱氧肌苷。在其它实施例中，碱基类似物是2'-脱氧核苷、2'-核糖核苷、2'-脱氧核糖核苷酸或2'-核糖核苷酸，其中核碱基包含经修饰的碱基(例如，黄嘌呤、尿苷、oxanine(oxanosine)、7-甲基鸟苷、二氢尿苷、5-甲基胞苷、C3间隔子、5-甲基dC、5-羟基丁基-2'-脱氧尿苷、5-硝基吲哚、5-甲基异脱氧胞嘧啶、异脱氧鸟苷、脱氧尿苷、异脱氧胞苷、其它0-1嘌呤类似物、N-6-羟氨基嘌呤、水粉蕈素、7-脱氮次黄嘌呤、其它7-脱氮嘌呤和2-甲基嘌呤)。在一些实施例中，碱基类似物可以选自由以下组成的组：7-脱氮-2'-脱氧肌苷、2'-氮杂-2'-脱氧肌苷、PNA-肌苷、吗啉代-肌苷、LNA-肌苷、亚磷酰胺-肌苷、2'-O-甲氧基乙基-肌苷和2'-OMe-肌苷。术语“碱基类似物”还包含例如，2'-脱氧核糖核苷、2'-核糖核苷、2'-脱氧核糖核苷酸或2'-核糖核苷酸，其中核碱基是经取代的次黄嘌呤。例如，经取代的次黄嘌呤可以被卤素(如氟或氯)取代。在一些实施例中，碱基类似物可以是氟肌苷或氯肌苷，如2-氯肌苷、6-氯肌苷、8-氯肌苷、2-氟肌苷、6-氟肌苷或8-氟肌苷。在其它实施例中，碱基类似物是脱氧尿苷。在其它实施例中，碱基类似物是核酸模拟物(例如，人工核酸和异种核酸(XNA))。

如本文所使用的，术语“CRISPR杂交RNA/DNA向导”(chRDNA)是指包括靶向区的多核苷酸向导分子，其中多核苷酸包括RNA和被设计成多核苷酸的DNA。

如本文所使用的，术语“Cas12-chRDNA向导核蛋白复合物”是指与Cas12蛋白复合形成核蛋白复合物的chRDNA向导分子，其中所述核蛋白复合物能够与和存在于chRDNA向导分子中的核酸靶结合序列互补的核酸靶序列定点结合。

“接头元件核苷酸序列”、“接头核苷酸序列”和“接头多核苷酸”在本文中可互换使用并且是指与第一核酸序列共价连接的一个或多个核苷酸的序列(5'-接头核苷酸序列-第一核酸序列-3')。在一些实施例中，接头核苷酸序列连接两个单独的核酸序列以形成单个多核苷酸(例如，5'-第一核酸序列-接头核苷酸序列-第二核酸序列-3')。

如本文所使用的，术语“同源”通常是指能够形成核蛋白复合物的Cas12蛋白(例如，Cas12a)和一个或多个V型CRISPR-Cas12相关向导(例如，Cas12 chRDNA向导)，所述核蛋白复合物能够与和存在于一个或多个向导之一中的核酸靶结合序列互补的核酸靶序列定点结合。

术语“工程化的”、“基因工程化的”、“经基因修饰的”、“重组的”、“经修饰的”、“非天然存在的”和“非天然的”指示人类对生物体或细胞的基因组的有意操纵。这些术语涵盖基因组修饰方法，包含如本文所定义的基因组编辑，以及改变基因表达或失活的技术、酶工程、定向进化、基于知识的设计、随机诱变方法、基因改组、密码子优化等。用于基因工程的方法是本领域已知的。

如本文所使用的，如果Cas12向导/核蛋白复合物在多核苷酸内的核酸靶序列处与多核苷酸结合或切割多核苷酸，则称Cas12蛋白“靶向”多核苷酸。

如本文所使用的“原间隔子邻近基序”或“PAM”是指包括Cas12蛋白结合识别序列的双链核酸序列，其中Cas12蛋白的氨基酸直接与识别序列相互作用(例如，Cas12a蛋白与PAM 5'-TTTN-3'或PAM 5'-TTTV-3'相互作用)。PAM序列位于非靶链上并且可以是靶补体序列的5'或3'(例如，在CRISPR-Cas12a系统中，PAM 5'-TTTN-3'或PAM 5'-TTTV-3'序列位于非靶标链上并且是靶补体序列的5')。

“靶”、“靶序列”、“核酸靶序列”、“靶核酸序列”和“在靶序列”在本文中可互换使用，指的是与Cas12多核苷酸的核酸靶结合序列(例如，靶向区)完全或部分互补的核酸序列。通常，核酸靶结合序列被选择为与Cas12核蛋白复合物的结合所针对的核酸靶序列100％互补；然而，为了减弱与核酸靶序列的结合，可以使用较低百分比的互补性。

“供体多核苷酸”、“供体寡核苷酸”、“供体模板”、“非病毒供体”和“非病毒模板”在本文中可互换使用并且可以是双链多核苷酸(例如，DNA)、单链多核苷酸(例如，DNA或RNA)或其组合。供体多核苷酸可以包括侧接插入序列的同源臂(例如，DNA中的DSB)。每侧上的同源臂的长度可以变化，以确保在所使用的条件下达到期望的杂交水平。

如本文所使用的，“同源定向修复”(HDR)是指在细胞中，例如在DNA中的DSB的修复期间发生的DNA修复。HDR需要核苷酸序列同源，并且使用供体多核苷酸修复其中发生DSB的序列(例如，在靶DNA序列内)。例如，供体多核苷酸可以用于修复靶DNA序列中的断裂，其中修复引起基因信息(例如，多核苷酸序列)在DNA断裂的位点处或附近从供体多核苷酸转移。因此，可以在靶DNA序列处插入或复制新的基因信息(例如多核苷酸序列)。

如本文所使用的，“同源非依赖性靶整合”(HITI)是指在细胞中，例如在DNA中的DSB的修复期间发生的DNA修复。与HDR不同，HITI不需要核苷酸序列同源，并且使用供体多核苷酸修复其中发生DSB的序列(例如，在靶DNA序列内)。HITI引起基因信息从例如供体多核苷酸转移至靶DNA序列。因此，可以在靶DNA序列处插入或复制新的基因信息(例如多核苷酸序列)。

“基因组区”是宿主细胞的基因组中的染色体的区段，存在于核酸靶序列位点的任一侧上，或者可替代地也包含核酸靶序列位点的一部分。供体多核苷酸的同源臂具有足够的同源性以与对应的基因组区进行同源重组。

如本文所使用的，“非同源端接合”(NHEJ)是指通过将断裂的一个末端与断裂的另一个末端直接连接来修复DNA中的DSB，而不需要供体多核苷酸。NHEJ是可用于细胞的在不使用修复模板的情况下修复DNA的DNA修复途径。在不存在供体多核苷酸的情况下，NHEJ通常会引起核苷酸在DSB的位点处随机插入或缺失。

“微同源介导的端接合”(MMEJ)是用于修复DNA中的DSB的途径。MMEJ涉及侧接DSB的缺失和接合之前断裂位点内部的微同源序列的比对。MMEJ是经基因定义的并且需要例如CtIP、聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP1)、DNA聚合酶θ(Polθ)、DNA连接酶1(Lig 1)或DNA连接酶3(Lig 3)的活性。另外的基因组分是本领域已知的。参见例如，Sfeir等人(《生化科学趋势(Trends in Biochemical Sciences)》,2015,40:701-714)。

如本文所使用的，“DNA修复”涵盖了细胞机制修复细胞中含有的DNA分子的损伤的任何过程。经修复的损坏可能包含单链断裂或双链断裂(DSB)。存在至少三种用于修复DSB的机制：HDR、NHEJ和MMEJ。“DNA修复”在本文中也用于指由人类操纵引起的DNA修复，其中靶基因座例如通过插入、缺失或取代(所有这些都表示基因组编辑的形式)核苷酸而被修饰。

如本文所使用的，术语“调节序列”、“调节元件”和“控制元件”是可互换的，并且是指位于要表达的多核苷酸靶的上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非翻译序列)的多核苷酸序列。例如，调节序列影响转录的时间、转录的量或水平、RNA加工或稳定性和/或相关结构性核苷酸序列的翻译。调节序列可以包含激活剂结合序列、增强子、内含子、聚腺苷酸化识别序列、启动子、转录起始位点、阻遏子结合序列、茎环结构、翻译起始序列、内部核糖体进入位点(IRES)、翻译前导序列、转录终止序列(例如，聚腺苷酸化信号和poly-U序列)、翻译终止序列、引物结合位点等。

如本文所使用的，术语“可操作地连接”是指多核苷酸序列或氨基酸序列相互之间存在功能关系。例如，如果调节序列(例如，启动子或增强子)调节或有助于调节多核苷酸的转录，则所述调节序列与编码基因产物的多核苷酸“可操作地连接”。可操作地连接的调节元件通常与编码序列相邻。然而，如果与启动子分离至多若干千碱基或更多，则增强子可以发挥作用。因此，一些调节元件可以与多核苷酸序列可操作地连接，但不与多核苷酸序列相邻。类似地，翻译调节元件有助于调节来自多核苷酸的蛋白质表达。

如本文所使用的，术语“调节”是指功能的数量、程度或量的变化。例如，如本文所公开的，Cas12-向导/核蛋白复合物可以通过与在启动子处或附近的核酸靶序列结合来调节启动子序列的活性。取决于结合之后发生的作用，Cas12向导/核蛋白复合物可以诱导、增强、遏制或抑制与启动子序列可操作地连接的基因的转录。因此，基因表达的“调节”包含基因激活和基因阻遏两者。

“过继细胞”是指可以或已经经基因修饰用于细胞疗法治疗的细胞。

“干细胞”是指具有自我更新能力的细胞，即，在保持未分化状态的同时经历许多细胞分裂周期的能力。干细胞可以是全能的、多能的、专能的、寡能的或单能的。干细胞是胚胎干细胞、胎儿干细胞、羊膜干细胞、成体干细胞或诱导多能干细胞。

“诱导多能干细胞”(iPSC)是指由非多能干细胞(通常是体细胞)人工衍生的一种类型的多能干细胞。可以在分化之前或之后用Cas12 chRDNA向导/核蛋白复合物对多能干细胞进行编辑。可以在分化之前或之后通过将外源性基因或序列引入到基因组(如编码CAR的序列)中对iPSC进行进一步修饰。

“造血干细胞”是指能够分化为造血谱系细胞的未分化的细胞，如淋巴细胞。

“淋巴细胞”是指作为脊椎动物免疫系统的一部分的白细胞(leukocyte/whiteblood cell)。术语“淋巴细胞”还涵盖产生淋巴细胞的造血干细胞。淋巴细胞包含：用于细胞介导的细胞毒性适应性免疫的T细胞，如CD4+和/或CD8+细胞毒性T细胞；α/βT细胞和γ/δT细胞；调节性T细胞，如Treg细胞；在细胞介导的细胞毒性先天免疫中起作用的自然杀伤(NK)细胞；以及B细胞，用于体液、抗体驱动的适应性免疫；NK/T细胞；细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)；以及抗原呈递细胞(APC)，如树突状细胞。淋巴细胞可以是哺乳动物细胞，如人类细胞。

肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)也涵盖在如本文所使用的术语“淋巴细胞”中。TIL是已经渗透到肿瘤内部和周围环境(“肿瘤微环境”)的免疫细胞。术语“淋巴细胞”还涵盖经基因修饰的T细胞和NK细胞(CAR-T细胞和CAR-NK细胞)。

术语“受试者”、“个体”或“患者”在本文中可互换使用，并且是指人类和其它灵长类动物以及其它哺乳动物、农场动物、家畜和实验室动物。在一些实施例中，细胞源自受试者(例如，淋巴细胞、干细胞、祖细胞或组织特异性细胞)。在一些实施例中，受试者是非人类受试者。

术语组合物或药剂(如本文所提供的基因工程化过继细胞)的“有效量”或“治疗有效量”是指组合物或药剂的用于提供期望应答的足够量。优选地，有效量将防止、避免或消除一种或多种有害副作用。此类应答将取决于所讨论的特定疾病。例如，在使用过继细胞疗法治疗癌症的患者中，期望应答可以包含预防、避免或消除以下中的一者或多者：治疗或预防移植物抗宿主病(GvHD)、宿主抗移植物排斥、细胞因子释放综合征(CRS)、细胞因子风暴以及施用的经基因修饰的细胞的致癌转化的减少。需要的精确治疗量将因受试者而异，具体取决于受试者的物种、年龄和一般状况、治疗的病状的严重程度以及所使用的特定经修饰的淋巴细胞、施用方式等。任何个体情况下的适宜“有效量”可以由本领域普通技术人员使用常规实验确定。

“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”特定疾病(如癌症病状或GvHD)包含：预防疾病，例如，预防疾病的发展或使疾病在可能易患所述疾病但尚未出现或显示所述疾病的症状的受试者中以较低的强度发生；抑制疾病，例如，减慢发展速度、阻止发展或扭转疾病状态；和/或缓解疾病的症状，例如，减少受试者经历的症状的数量。

本公开依赖于本领域普通技术人员，因为它涉及免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组多核苷酸的常规技术，例如，如以下标准出版物所教导的：Sambrook,Joseph.《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:aLaboratory Manual)》.冷泉港,纽约州,冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press),2001；E.A.Greenfield(《抗体：实验室手册(Antibodies:ALaboratory Manual)》,2014,第二版,冷泉港实验室出版社,ISBN 978-1-936113-81-1)；R.I.Freshney(《动物细胞培养：基本技术和专门应用手册(Culture of animal cells:AManual of Basic Technique and Specialized Applications)》,2016,第7版,威利-布莱克威尔出版社(Wiley-Blackwell),ISBN 978-1118873656)；J.M.Walker(《分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)》(系列),胡马纳出版社(Humana Press),ISSN 1064-3745)；Green等人(《分子克隆：实验室手册》,2012,第四版,冷泉港实验室出版社,ISBN978-1605500560)。

CRISPR V型系统

成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)和相关的CRISPR相关蛋白(Cas蛋白)构成CRISPR-Cas系统。CRISPR-Cas系统的分类已经经历了多次迭代。Makarova等人(《自然综述：微生物学》,2020,18:67-83)提出了一种分类系统，所述系统考虑了对CRISPR-Cas系统的个体类型和亚型具有特异性的特征cas基因。所述分类还考虑了多个共享Cas蛋白之间的序列相似性、最保守Cas蛋白的系统发生、基因组织和CRISPR阵列的结构。此方法提供了一种分类方案，其将CRISPR-Cas系统分为两个不同的类别：1类和2类。

在2类V型系统中，crRNA和靶结合涉及Cas12，靶核酸切割也是如此。例如，Cas12a的RuvC样核酸酶结构域以交错配置切割靶核酸的两条链，从而产生5'突出端，这与由Cas9切割产生的钝端形成对比。这些5'突出端可以通过同源重组方法促进DNA的插入。

与V型crRNA和靶结合和切割缔合的其它蛋白质包含Cas12b(以前为C2c1)和Cas12c(以前为C2c3)。Cas12b和Cas12c蛋白在长度上与CRISPR 2类II型Cas9和CRISPR 2类V型Cas12a蛋白类似，范围为大约1,100个氨基酸至大约1,500个氨基酸。C2c1和C2c3蛋白也含有RuvC样核酸酶结构域，并且具有类似于Cas12a的结构。C2c1蛋白与Cas9蛋白在需要crRNA和tracrRNA进行靶结合和切割方面类似，但其最佳切割温度为50℃。C2c1蛋白靶向富含AT的PAM，其类似于Cas12a，位于靶序列的5'处。参见例如，Shmakov等人(《分子细胞(Molecular Cell)》,2015,60(3):385-397)。

CRISPR V型亚型包含Cas12蛋白，并且显示出广泛的序列和大小多样性；然而，Cas12亚型与由IS605样转座子编码的TnpB核酸酶共享共同的进化起源。由于Cas12蛋白的低序列相似性以及可能通过多个独立的重组事件进化，将Cas12蛋白分类为其相应的亚型引起了多种命名惯例。表1显示了V型Cas12蛋白的分类和名称，以及它们的大致大小、向导要求、优选靶多核苷酸和代表性来源生物体。

Cas12同源物可以使用本领域技术人员已知的序列相似性搜索方法进行鉴定。通常，Cas12蛋白能够与同源Cas12向导相互作用以形成能够与靶核酸序列结合的Cas12向导/核蛋白复合物。在本公开的一些实施例中，Cas12蛋白或其同源物是Cas12a蛋白或其同源物。

Cas12a蛋白包含但不限于来自以下的Cas12a：俭菌超门细菌GWC2011_GWC2_44_17(PbCpf1)、毛螺菌科细菌MC2017(Lb3 Cpf1)、解蛋白丁酸弧菌(BpCpf1)、异域菌门细菌GW2011_GWA_33_10(PeCpf1)、氨基酸球菌BV3L6(AsCpf1)、猕猴卟啉单胞菌(PmCpf1)、毛螺菌科细菌ND2006(LbCpf1)、狗口腔卟啉单胞菌(PcCpf1)、解糖胨普雷沃氏菌(PdCpf1)、牛眼莫拉氏菌237(MbCpf1)、史密斯氏菌属SC_K08D17(SsCpf1)、稻田氏钩端螺旋体(LiCpf1)、毛螺菌科细菌MA2020(Lb2Cpf1)、新凶手弗朗西斯菌U112(FnCpf1)、候选白蚁甲烷支原体(CMtCpf1)和挑剔真杆菌(EeCpf1)。

在V型系统中，核酸靶序列结合通常涉及Cas12蛋白和crRNA，就像核酸靶序列切割一样。在V型系统中，Cas12蛋白的RuvC样核酸酶结构域以顺序方式切割核酸靶序列的两条链(参见Swarts等人(《分子细胞(Mol.Cell)》,2017,66:221-233))，从而产生5'突出端，这与由Cas9蛋白切割产生的钝端形成鲜明对比。

V型系统的Cas12蛋白切割活性可以独立于tracrRNA(例如，V-A型)；并且一些V型系统仅需要具有形成内部双链体的茎环结构的单个crRNA。Cas12蛋白通过识别茎环和与茎环相邻的序列，最显著的是与核酸靶序列杂交的位于间隔子序列的5'处的核苷酸，以序列特异性和结构特异性方式与crRNA结合。这种茎环结构的长度通常在15至22个核苷酸的范围内。破坏这种茎环双链体的取代消除了切割活性，而不破坏茎环双链体的其它取代不会消除切割活性。某些V型系统需要crRNA与tracrRNA之间的杂交，如V-F1、V-G、V-C、V-E(CasX)、V-K和V-B型。参见例如，Yan等人(《科学(Science)》,2019,363(6422):88-91)。

Cas12向导

能够与同源Cas12蛋白(如Cas12a蛋白)形成核蛋白复合物的CRISPR Cas12chRDNA向导已经在于2021年10月18日提交的国际专利申请序列号PCT/US21/55394用于CRISPR V型系统的含DNA的多核苷酸和向导和其制备和使用方法(DNA-containingpolynucleotides and guides for CRISPR Type V systems and methods of makingand using the same)中描述。其中描述的复合物能够靶向与间隔子序列互补的序列。

图1A展示了包括以下的氨基酸球菌BV3l6 Cas12a向导分子的实例：激活区(图1A，101)，其包括茎环双链体(图1A，102)；以及间隔子序列(图1A，103)，其包括靶结合序列(图1A，104)。图1B展示了包括以下的替代性Cas12a向导分子：激活区(图1B，105)，其包括茎环双链体(图1B，106)；以及间隔子序列(图1B，107)，其包括靶结合序列(图1B，108)和3'延伸(图1B，109)。3'延伸(图1B，109)可以通过接头序列与间隔子序列(图1B，107)连接。图1C展示了包括以下的替代性Cas12a向导分子：激活区(图1C，110)，其包括茎环双链体(图1C，111)；以及接头核苷酸(图1C，114)和5'延伸(图1C，115)；以及间隔子序列(图1C，112)，其包括靶结合序列(图1C，113)。

在本公开的Cas12 chRDNA向导分子中，靶向区以及或者单独地激活区可以包括DNA、RNA或DNA和RNA的混合物。在某些实施例中，靶向和激活区还可以包括其它碱基类似物、经修饰的核苷酸、无碱基位点等，以及合成的、天然存在的和非天然存在的经修饰的主链残基或键或其组合。

在一些实施例中，激活区的长度为10-25个碱基，包含任选的无碱基位点。

在一些实施例中，靶向区的长度为10-30个碱基，包含任选的无碱基位点。

图2展示了与包括靶结合序列(图2，205)的同源Cas12a chRDNA向导分子(图2，204)结合的Cas12a蛋白(图2，206)。Cas12a chRDNA向导/核蛋白复合物解开包括靶序列的靶多核苷酸，并且Cas12 chRDNA向导分子的靶结合序列(图2，205)通过氢键(图2，由多核苷酸之间的竖直线指示)与靶序列(图2，207)连接。在图2中，靶多核苷酸包括包含靶序列(图2，207)的靶链(图2，201)以及包括PAM序列(图2，203)的非靶链(图2，202)。PAM序列(图2，203)通常发生在非靶链(图2，202)上的靶序列(图2，207)的上游(即，在5'方向上)。Cas12achRDNA向导分子的靶结合序列(图2，205)与靶序列(图2，207)之间的氢键的形成引起靶链(图2，201)和非靶链(图2，202)的交错切割(图2，208)。

图3A-图3I展示了用于本公开的Cas12 chRDNA向导分子的各种典型和非典型核苷酸。表2显示了图3A-图3I中使用的一系列指示标记。

图4展示了与包括靶结合序列(图4，405)的同源Cas12a chRDNA向导分子(图4，404)结合的Cas12a蛋白(图4，406)，其中靶结合序列(图4，405)包括非RNA核苷酸(图4，409)，如图3B-图3I中显示的典型和非典型核苷酸。Cas12a chRDNA向导/核蛋白复合物解开包括靶序列的靶多核苷酸，并且Cas12 chRDNA向导分子的靶结合序列(图4，405)通过氢键(图4，由多核苷酸之间的竖直线指示)与靶序列(图4，407)连接。在图4中，靶多核苷酸包括包含靶序列(图4，407)的靶链(图4，401)以及包括PAM序列(图4，403)的非靶链(图4，402)。PAM序列(图4，403)通常发生在非靶链(图4，402)上的靶序列(图4，407)的上游(即，在5'方向上)。chRDNA向导分子的靶结合序列(图4，405)与靶序列(图4，407)之间的氢键的形成引起靶链(图4，401)和非靶链(图4，402)的交错切割(图4，408)。

图5展示了包括以下的氨基酸球菌(菌株BV3L6)Cas12a crRNA向导分子的实例：激活区(图5，501)，其包括茎环双链体(图5，502)；以及间隔子(图5，503)，其包括靶结合序列(图5，504)。激活区(图5，501)和间隔子(图5，503)中的每个核苷酸定位从向导分子的5'端处开始标记，其中激活区和靶结合区各自包括RNA。

图6展示了包括以下的氨基酸球菌(菌株BV3L6)Cas12a chRDNA向导分子的实例：激活区(图6，601)，其包括茎环双链体(图6，602)；以及间隔子(图6，603)，其包括靶结合序列(图6，604)。间隔子(图6，603)中的激活区(图6，601)中的每个核苷酸定位从向导分子的5'端处开始标记，其中激活区包括RNA(白色填充)和DNA(灰色填充)的混合物，并且靶结合序列包括RNA(白色填充)和DNA(灰色填充)的混合物。

图7展示了包括以下的氨基酸球菌(菌株BV3L6)Cas12a chRDNA向导分子的实例：激活区(图7，701)，其包括茎环双链体(图7，702)；以及间隔子(图7，703)，其包括靶结合序列(图7，704)。激活区(图7，701)和间隔子(图7，703)中的每个核苷酸定位从向导分子的5'端处开始标记，其中激活区包括RNA(白色填充)和DNA(灰色填充)的混合物。Cas12a chRDNA向导分子进一步包括其它非典型核苷酸，如经化学修饰的糖核苷酸(图7，705)、无碱基核糖核苷酸(图7，706)、具有经化学修饰的主链的脱氧核糖核苷酸(图7，707)、具有经化学修饰的主链的核糖核苷酸(图7，708)以及无碱基脱氧核糖核苷酸(图7，709)。

图8展示了Cas12 chRDNA向导/核蛋白复合物的形成，其中Cas12蛋白(图8，801)与Cas12 chRDNA向导分子(图8，802)结合以形成Cas12 chRDNA向导/核蛋白质复合物(图8，803)。Cas12 chRDNA向导/核蛋白复合物(图8，803)与靶多核苷酸(图8，804)结合，其中靶多核苷酸包含与Cas12 chRDNA向导分子的靶结合序列互补的靶序列，并且Cas12 chRDNA向导分子的靶结合序列与靶序列(图8，805)之间形成氢键。

图9展示了由Cas12 chRDNA向导/核蛋白复合物在靶多核苷酸中产生插入或缺失(indel)，其中与Cas12 chRDNA向导分子(图9，902)复合的Cas12蛋白(图9，901)与包括PAM(图9，904)的靶多核苷酸(图9，903)结合，并且靶多核苷酸被Cas12 chRDNA向导/核蛋白复合物切割(图9，905)。靶向发生之后，Cas12 chRDNA向导/核蛋白复合物从靶多核苷酸解离(图9，906)，其中靶多核苷酸相对于PAM(图9，904)包括上游(即，在5'方向上)链(图9，907)和下游(即，在3'方向上)链(图9，908)。细胞DNA修复机制通过靶多核苷酸中的切割位点周围的序列的插入或缺失(图9，910)来修复靶多核苷酸。上游链(图9，911)和下游链(图9，912)重新接合，并且经编辑的靶多核苷酸(图9，914)在切割位点处包括插入或缺失(图9，913)，其中经编辑的靶多核苷酸相对于未经编辑的靶多核苷酸具有不同的序列。在一些实施例中，由Cas12chRDNA向导/核蛋白复合物在靶多核苷酸中产生的插入或缺失(indel)发生在细胞内。

图10展示了供体多核苷酸序列并入到靶多核苷酸中，其中与Cas12 chRDNA向导分子(图10，1002)复合的Cas12蛋白(图10，1001)与包括PAM(图10，1004)的靶多核苷酸(图10，1003)结合，并且靶多核苷酸由Cas12 chRDNA向导/核蛋白复合物切割(图10，1005)。靶向发生之后，Cas12 chRDNA向导/核蛋白复合物从靶多核苷酸解离(图10，1006)，其中靶多核苷酸相对于PAM(图10，1004)包括上游(即，在5'方向上)链(图10，1007)和下游(即，在3'方向上)链(图10，1008)，并且其中提供了供体多核苷酸(图10，1009)。细胞DNA修复机制使用供体多核苷酸(图10，1011)修复靶多核苷酸(图10，1010)。所得经编辑的靶多核苷酸(图10，1010)在靶位点处包括供体序列(图10，1011)。在一些实施例中，供体多核苷酸序列并入到靶多核苷酸中发生在细胞内。

图11展示了靶多核苷酸的切刻，其中与包括靶结合序列中的DNA碱基(图11，1106)的Cas12 chRDNA向导分子(图11，1102)复合的Cas12蛋白(图11，1101)与包括PAM(图11，1104)的靶多核苷酸(图11，1103)结合，并且靶多核苷酸仅在靶多核苷酸的一条链中由Cas12 chRDNA向导/核蛋白复合物切刻(图11，1105)。

图12展示了使用两个切口Cas12 chRDNA向导/核蛋白复合物在靶多核苷酸中产生交错双链断裂，其中第一Cas12 chRDNA向导/核蛋白复合物与靶多核苷酸的上游(即，在5'方向上)靶序列(图12，1201)结合，从而在靶多核苷酸中产生第一切口(图12，1202)，并且第二Cas12 chRDNA向导/核蛋白复合物与靶多核苷酸的下游(即，在3'方向上)靶序列(图12，1203)结合，从而在靶多核苷酸中产生第二切口(图12，1204)。在发生串联切刻之后，切割后的靶多核苷酸包括具有5'突出端的上游(即，在5'方向上)链(图12，1205)和下游(即，在3'方向上)链(图12，1206)。提供供体多核苷酸，并且细胞DNA修复机制使用供体多核苷酸(图12，1208)修复靶多核苷酸(图12，1207)。所得经编辑的靶多核苷酸(图12，1209)在串联切刻位点处包括供体序列(图12，1210)。在一些实施例中，使用两个切口Cas12chRDNA向导/核蛋白复合物在靶多核苷酸中产生交错的DSB发生在细胞内。

可以设计用于将特定Cas12 chRDNA向导分子设计成哪些脱氧核糖核苷酸的方法以及任选地另外的修饰(如碱基类似物、经修饰的核苷酸、无碱基位点、经修饰的骨架残基或键或其组合)，如在例如序列号PCT/US21/55394中所描述。简而言之，为了设计Cas12向导，首先鉴定要靶向的基因的基因组序列。所选基因要靶向的确切的区将取决于具体应用。例如，为了激活或阻遏靶基因，Cas12可以靶向驱动基因的表达的启动子或5'组成型表达的外显子，以减少由于替代性剪接而从mRNA中去除靶向区的可能性。可以靶向N末端部分中的其它外显子，因为这里的移码突变将产生非功能性蛋白质产物。还可以靶向编码必需蛋白质结构域的外显子。对于使用HDR进行基因编辑，靶序列应靠近期望编辑的位置。在这种情况下，鉴定出期望进行编辑的位置并且在附近选择靶序列。

在一些实施例中，Cas12 chRDNA向导可以被设计为在Cas12蛋白的切割位点之外结合，使得可以从Cas12核蛋白复合物中释放靶核酸。在一些实施例中，可以将Cas12chRDNA向导设计为在Cas12蛋白的切割位点内部结合。在这种情况下，靶核酸可以将与Cas12核蛋白复合物结合。

在Cas12 chRDNA向导分子的一些实施例中，靶向区、激活区或两者都含有脱氧核糖核苷酸或经修饰的核苷酸。在一些实施例中，Cas12a chRDNA向导包括一个或多个，例如23个或更少的脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中，chRDNA的靶向区中的所有脱氧核糖核苷酸与靶序列形成典型碱基对。在一些实施例中，chRDNA的靶向区中的脱氧核糖核苷酸中的至少一个脱氧核糖核苷酸不与靶序列形成典型碱基对，或与靶序列形成非典型碱基对。

Cas12蛋白

本公开的Cas12蛋白包含但不限于源自V型CRISPR-Cas系统的Cas12野生型蛋白、经修饰的Cas12蛋白、Cas12蛋白的变体、Cas12直系同源物和其组合。在一些实施例中，Cas12蛋白是野生型Cas12a蛋白、经修饰的Cas12a蛋白、Cas12a蛋白的变体、Cas12a直系同源物或其组合。。

Cas12蛋白通常由六个结构域组成，分别对应于REC1、REC2、PAM相互作用(PI)、核酸酶(Nuc)、楔形(WED)和RuvC结构域。参见例如，Yamano等人(《细胞(Cell)》,2016,165(4):949-962)。WED结构域和RuvC结构域可以具有被来自其它结构域的序列中断的三分序列架构。例如，氨基酸球菌Cas12a WED结构域序列被REC1、REC2和PI结构域序列中断。另外地，Cas12蛋白的某些亚型包含邻近RuvC结构域序列或在其之间发生的桥螺旋结构域。

为了产生经修饰的Cas12蛋白，可以对Cas12蛋白的区进行修饰以调节Cas12蛋白的活性。例如，可以对氨基酸球菌(菌株BV3L6)Cas12a蛋白的与PI结构域(598-718)和WED结构域(526-597和719-883)的残基相对应的区进行修饰，以改变PAM特异性。参见例如，Tóth等人(《核酸研究(Nucleic Acid Research)》,2020,48(7):3722-3733)。The region inthe Acidaminococcus spp.(strain BV3L6)可以对与REC1(24-319)和REC2(320-526)结构域的残基相对应的Cas12a蛋白进行修饰，以改变靶接合和切割动力学。REC1(226-304)和REC2(368-435)结构域的区直接与靶结合序列和靶序列的PAM远端相互作用，并且可以被工程化以修改靶序列切割的效率。可以对Nuc结构域(1066-1261)和RuvC结构域(940-956、957-1065和1261-1307)的区进行修饰，以改变靶序列的靶链、非靶链或靶链和非靶链的切割效率。对这些区进行工程化可以包括引入突变、使用来自其它Cas12直系同源物的对应区替换、缺失、插入等。

经修饰的Cas12蛋白可以与Cas12 chRDNA向导分子组合使用，以改变Cas12蛋白的活性或特异性。在一些情况下，当与Cas12 chRDNA向导分子复合时，可以对Cas12蛋白进行修饰以提供增强的活性或特异性，其中Cas12修饰发生在REC1、REC2、RuvC、WED和/或Nuc结构域中。在一些情况下，当与Cas12 chRDNA向导分子复合时，可以对Cas12蛋白进行修饰以提供增强的活性或特异性，其中Cas12a修饰发生在226-304、368-435、940-956、978-1158、1159-1180和1181-1298区中(基于氨基酸球菌Cas12a序列编号)。

在一些实施例中，Cas12蛋白是作为核酸酶缺陷变体的nCas12蛋白，也被称为“切口Cas12”或“Cas12切口酶”。此类分子缺少核酸内切酶活性的一部分，并且因此只能切刻靶核酸的一条链。参见例如，Jinek等人(《科学》,2012,337:816-821)。例如，这可以通过将突变引入到RuvC核酸酶结构域中来实现。此类修饰的非限制性实例可以包含新凶手弗朗西斯菌(F.novicida)Cas12a蛋白的RuvC核酸酶结构域的D917A、E1006A和D1225A。应当理解，本领域技术人员也可以进行其它催化残基的突变以降低RuvC核酸酶结构域的活性。所得nCas12蛋白不能切割双链DNA，但保留了与向导分子复合、与靶DNA序列结合以及仅切刻靶DNA的一条链的能力。靶向特异性由与PAM序列结合的Cas12蛋白以及向导分子的与基因组基因座互补的碱基配对确定。在本公开的一些实施例中，nCas12蛋白是nCas12a蛋白。

在一些实施例中，Cas12蛋白是作为核酸酶失活变体的dCas12蛋白，也被称为“催化失活Cas12蛋白”、“酶促失活Cas12”、“催化死亡Cas12”或“死亡Cas12”。此类分子缺少核酸内切酶活性，并且因此可以用于以RNA引导的方式调节基因。参见例如，Jinek等人(《科学》,2012,337:816-821)。本领域技术人员可以进行催化残基的突变以消除RuvC结构域的活性。所得dCas12蛋白不能切割双链DNA，但保留了与向导分子复合以及与靶DNA序列结合的能力。靶向特异性由与PAM序列结合的Cas12蛋白以及向导分子的与基因组基因座互补的碱基配对确定。在本公开的一些实施例中，dCas12蛋白是dCas12a蛋白。

某些Cas12蛋白亚型缺乏核酸酶活性，这是由于RuvC样核酸酶结构域失活，或者是由于部分或全部RuvC样核酸酶结构域缺失。相反，一种此类亚型，V-K型和相关蛋白Cas12k，与Tn7样转座因子tnsB、tnsC、tniQ相关。参见例如，Strecker等人(《科学》,2019,364(6448):48-53)。Cas12k保留了与向导分子复合以及与靶DNA序列结合的能力，并且相关Tn7样蛋白促进了RNA引导的DNA序列的转座。在本公开的一些实施例中，Cas12 chRDNA向导/核蛋白复合物是Cas12k chRDNA向导/核蛋白复合物。

其它氨基酸改变可能包含糖基化形式的氨基酸、与其它分子的聚集缀合物以及与无关化学部分(例如，聚乙二醇化分子)的共价缀合物。可以通过将功能与在氨基酸链中或在N末端或C末端残基处发现的基团连接来制备共价变体。在一些情况下，突变的定点多肽还可以包含等位基因变体和物种变体。

在某些实施例中，Cas12蛋白可以是融合或嵌合蛋白，其包含来自Cas12蛋白的第一结构域和来自不同蛋白质(如Csy4蛋白)的第二结构域。对Cas12蛋白的融合修饰可以赋予经修饰的Cas12蛋白另外的活性。此类活性可以包含修饰与核酸靶序列相关的多肽(例如，组蛋白)的核酸酶活性、甲基转移酶活性、去甲基酶活性、DNA修复活性、DNA损伤活性、脱氨基活性、歧化酶活性、烷基化活性、脱嘌呤活性、氧化活性、嘧啶二聚体形成活性、整合酶活性、转座酶活性、重组酶活性、聚合酶活性、连接酶活性、解旋酶活性、光解酶活性、糖苷酶活性、乙酰基转移酶活性、脱乙酰基酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、泛素连接酶活性、逆转录酶活性、去泛素化活性、腺苷酸化活性、脱腺苷酸化活性、SUMO化活性、去SUMO化活性、核糖基化活性、脱核糖基化活性和/或肉豆蔻酰化活性或脱肉豆蔻酰化活性。

在某些实施例中，Cas12蛋白可以包含一个或多个NLS序列(例如，附加到Cas12蛋白序列和/或插入其中)。NLS序列可以定位在例如N末端、C末端处或Cas12蛋白(如Cas12a蛋白)的内部，包含其组合(例如，一个或多个NLS位于N末端处并且一个或多个NLS位于C末端处)。NLS序列可以源自SV40大T抗原、核质蛋白、53BP1、VACM-1/CUL5、CXCR4、VP1、ING4、IER5、ERK5、UL79、EWS、Hrp1、cMyc(1)、cMyc(2)、小鼠c-able IV、Matα2和MINIYO。

NLS序列可以直接或通过接头多肽(例如，与Cas12蛋白、与另一个NLS序列或与和Cas12蛋白连接的融合肽序列)共价连接。接头序列的长度可以根据特定Cas12蛋白的结构特性(例如，末端的溶剂可及性、末端处是否存在其它关键功能肽序列等)进行优化，以确保NLS序列可用于同源重要蛋白质结合和运输。

在一些实施例中，接头序列包含至少一个甘氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸残基。在一些实施例中，接头序列包含至少一个甘氨酸残基和至少一个丝氨酸残基。在一些实施例中，接头序列包含多个甘氨酸残基和至少一个丝氨酸残基。在一些实施例中，接头序列由GS序列组成或包括GS序列。

使用Cas12-chRDNA向导核蛋白复合物对细胞进行基因组编辑

通过本领域普通技术人员已知的多种方法，可以在体外、离体或体内将本公开的Cas12 chRDNA向导分子、Cas12蛋白和Cas12-chRDNA向导核蛋白复合物递送至细胞。用于将这些组分引入到细胞中的非限制性方法包含病毒载体递送、声孔效应、细胞挤压、电穿孔、核转染、脂质转染、粒子枪技术、微弹轰击或化学品(例如，细胞穿透肽)。

在一些实施例中，电穿孔可以用于将本公开的Cas12 chRDNA向导分子递送至细胞。电穿孔也可以用于递送本公开的Cas12 chRDNA向导/核蛋白复合物。在这些方法中，chRDNA向导分子或Cas12 chRDNA向导/核蛋白复合物在电穿孔缓冲液中与靶细胞混合以形成悬浮液。然后，此悬浮液在优化的电压下经受电脉冲，这在细胞膜的磷脂双层中产生临时孔，允许带电分子(如核酸和蛋白质)穿过孔并且进入细胞中。用于进行电穿孔的试剂和设备是市售的。

在一些实施例中，通过将组分包装到隔室中来实现Cas12 chRDNA向导、Cas12蛋白和Cas12-chRDNA向导核蛋白复合物的递送。包括这些组分的隔室可以在体内施用(例如，在活生物体的细胞中，条件是，在一些实施例中，所述生物体是非人类生物体)。在一些实施例中，隔室是如病毒(慢病毒、腺病毒)或脂质体等生物隔室。在一些实施例中，隔室是选自以下的非生物隔室：纳米球、脂质体、量子点、纳米颗粒、微粒、纳米胶囊、囊泡、聚乙二醇颗粒、水凝胶和胶束。

在一些实施例中，隔室是脂质纳米颗粒(LNP)。

当可以将Cas12 chRDNA向导分子引入到具有Cas12蛋白的细胞中，由此形成Cas12-chRDNA向导核蛋白复合物时，Cas12-chRDNA向导核蛋白复合物可以用于切割靶核酸或与其结合。核蛋白复合物可以与包括PAM的靶核酸杂交。核蛋白复合物包括具有与核酸靶序列互补的靶向区的Cas12 chRDNA向导。任选地，第二Cas12-chRDNA向导核蛋白复合物包括具有与第二核酸靶互补的第二靶向区的Cas12 chRDNA向导，也被引入到细胞中。

与核酸靶序列结合的步骤可以在体外(例如，在生化反应或培养的细胞中)、体内(例如，在活生物体或患者的细胞中)或离体(例如，从受试者或患者取出的细胞用于返回给所述受试者或患者)进行。

在一另外的实施例中，还可以使用Cas12蛋白-chRDNA向导核蛋白复合物将供体多核苷酸引入到细胞中，以促进所述供体多核苷酸的至少一部分并入所述细胞的基因组DNA中。通常，通过将供体多核苷酸与产生双链断裂的Cas12蛋白(例如，Cas12a)结合来使供体多核苷酸非常接近定点靶核酸断裂。这种接近性增强了供体多核苷酸到双链断裂的位点中的插入(例如，同源重组)。

治疗组合物、应用和方法

本公开的Cas12 chRDNA向导分子和Cas12-chRDNA向导核蛋白复合物可以用于产生用于治疗目的的经修饰的细胞。如序列号PCT/US21/55394中所公开的，经修饰的细胞可以用于过继细胞疗法，如过继免疫疗法。

可以通过本领域熟知的技术将淋巴细胞从受试者(如人类受试者)中分离出来，例如从血液或从实体瘤(如在TIL的情况下)中分离，或从淋巴器官(如胸腺、骨髓、淋巴结和粘膜相关淋巴组织)中分离。分离后，可以例如通过测量T细胞应答频率的ELISPOT测定在特异性、频率和功能方面对淋巴细胞进行表征。可以任选地使用本领域熟知的技术激活经分离的淋巴细胞，以促进增殖和分化为专门的效应淋巴细胞。

在一些实施例中，可以使用本公开的Cas12-chRDNA向导核蛋白复合物例如通过插入编码嵌合抗原受体(CAR)的基因来修饰经分离的淋巴细胞。在一些实施例中，Cas12-chRDNA向导核蛋白复合物用于使内源性T细胞受体(例如，TRAC基因)失活。所得淋巴细胞形成CAR-T细胞或CAR-NK细胞，用于过继免疫疗法。

另外地，Cas12-chRDNA核蛋白复合物可以用于保护过继细胞在宿主中的存活。在一些实施例中，保护性修饰包括使免疫检查点蛋白(如由PDCD1基因编码的PD-1蛋白)失活。其它可以失活的免疫检查点蛋白包含细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4，也被称为CD152)、LAG3(也被称为CD223)、Tim3(也被称为HAVCR2)、BTLA(也被称为CD272)、BY55(也被称为CD160)、TIGIT(也被称为IVSTM3)、LAIR1(也被称为CD305)、SIGLEC10、2B4(也被称为CD244)、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、CD96、CRTAM、SIGLEC7、SIGLEC9、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、TGFBRII、TGFRBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2和GUCY1B3。在一些实施例中，使用Cas12-chRDNA向导核蛋白复合物使一个或多个免疫检查点分子失活。

在一些实施例中，保护性修饰包括使存在于有核细胞上的MHC I类分子的组分β-2微球蛋白(B2M)失活。在一些实施例中，保护性修饰包括将HLA-E基因插入到失活的B2M基因座中。

在一些实施例中，本发明是一种通过施用用包括本公开的chRDNA的V型CRISPR系统修饰的细胞来治疗或缓解疾病或病状的方法。表3列出了所述疾病或病状以及要用包括chRDNA的V型CRISPR系统靶向的基因。

表3：疾病和病状以及V型CRISPR-chRDNA技术靶向的基因

表4：iPSC技术

疾病或病状	基因靶
		心脏纤维化	FAP(成纤维细胞激活蛋白α)
脊髓小脑性共济失调1型	ATXN1
		脊髓性肌萎缩(SMA)	SMN1

表5：用于心血管和神经系统疾病的细胞疗法

疾病或病状	经基因修饰的细胞
		心力衰竭	HLA^-CIITA^-心肌细胞
梗阻性肥厚型心肌病(oHCM)	HLA^-CIITA^-心肌肌球蛋白^-心肌细胞
		肌萎缩性侧索硬化症(ALS)	HLA^-CIITA^-运动神经元
脊髓损伤	HLA^-CIITA^-神经元
		脊髓性肌萎缩(SMA)	HLA^-CIITA^-神经元
脊髓损伤	HLA^-CIITA^-神经元

表6：异种移植

在一些实施例中，包括chRDNA的V型CRISPR系统产生基因组修饰，引起经修饰的细胞中的表3中列出的一个或多个基因的表达或消除。在一些实施例中，基因的异常表达导致表3中列出的疾病或病状，并且由基因组修饰引起的基因的消除或表达减轻了所述疾病或病状。

在一些实施例中，外源性核酸插入到细胞的基因组中。根据本公开(参见图10和图12)，提供了一种包括一个或多个外源性基因的拷贝的供体多核苷酸。所述外源性基因包括在基因的启动子、在靶细胞中具有活性的另一个启动子或组成型启动子的控制下编码蛋白质的序列。外源性基因选自表3中提供的列表。

在一些实施例中，在心力衰竭、脊髓损伤、SMA和ALS的情况下，包括chRDNA的V型CRISPR系统会产生消除导致移植物排斥的基因表达的基因组修饰。这种基因组修饰使得能够植入外源性神经元(在脊髓损伤、SMA或ALS的情况下)或外源性心肌细胞(在心力衰竭的情况下)，而受体的免疫系统不会排斥所述外源性神经元或心肌细胞。在一些实施例中，本发明是一种治疗中枢神经系统(CNS)的疾病或病状的方法，所述方法包括由V型CRISPR系统实现的基因修饰，所述系统包括引起HLA^-/CIITA^-神经元(包含运动神经元)的形成的chRDNA。在一些实施例中，本发明是一种治疗心力衰竭的方法，所述方法包括由V型CRISPR系统实现的基因修饰，所述系统包括引起HLA^-/CIITA^-心肌细胞的形成的chRDNA。在一些实施例中，包括chRDNA的V型CRISPR系统使选自HLA-A、HLA-A2、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G的MHC I类基因中的一者或多者失活，并且进一步使II类反式激活因子(CIITA)基因失活。

脂质纳米颗粒(LNP)

在一些实施例中，包括chRDNA的V型CRISPR系统的组分被包封在有时被称为脂质纳米颗粒(LNP)的微观脂滴内。LNP的实例描述于例如Sharma等人(2014),用于治疗目的的蛋白质和基因的下一代递送系统：为何以及如何？(Next generation delivery systemfor proteins and genes of therapeutic purpose:why and how？)《国际生物医学研究(Biomed Res Int)》.2014:327950中，并且进一步描述于美国专利申请公开第US20190136231号，用于CRISPR/Cas组分的脂质纳米颗粒制剂(Lipid nanoparticleformulations for CRISPR/Cas components)；第US20160317676号，用于核酸递送的方法和组合物(Methods and compositions for delivery of nucleic acids)；第US20190022247号，用于递送核酸的脂质和脂质纳米颗粒组合物(Lipids and lipidnanoparticle compositions for delivery of nucleic acids)；以及第US20210251898号，用于mRNA疫苗的脂质纳米颗粒(Lipid nanoparticles for mRNA vaccines)中。

在一些实施例中，本文所使用的LNP的直径介于约100nm与约1μm之间，优选地<100nm。在一些实施例中，LNP包含一种或多种阳离子脂质。可以选择阳离子脂质，使得当组合时，组合的pK_a的测量值不小于6.1并且不大于6.7，例如，介于6.2至6.6之间；或介于6.3与6.5之间。阳离子脂质可以具有头基、一个或多个疏水性尾以及介于所述头基与所述一个或多个尾之间的接头。所述头基可以包含作为带正电荷的位点的胺。所述胺可以是伯胺、仲胺、叔胺或季胺。所述一个或多个疏水性尾可以包含可以相同或不同的两个疏水链。尾可以是脂肪链、脂肪酸链或其它疏水链。所述接头可以包含例如甘油酯接头、无环甘油酯类似物接头或环状接头。所述接头可以包含官能团，如醚、酯、磷酸酯、膦酸酯、硫代磷酸酯、磺酸酯、二硫化物、缩醛、缩酮、亚胺、腙或肟。阳离子脂质包含一个或多个携带正电荷的胺基。优选的阳离子脂质是可电离的，使得其可以根据pH以带正电荷或中性的形式存在。阳离子脂质的电离会影响脂质纳米颗粒(LNP)的表面电荷，并且可能影响血浆蛋白吸收、血液清除、组织分布以及与细胞膜融合的能力。

在一些实施例中，LNP进一步包括中性脂质。所述中性脂质可以选自DSPC、DPPC、POPC、DOPE或SM。能够减少聚集的脂质可以是PEG脂质。在一些实施例中，脂质颗粒进一步括包含固醇。在一些实施例中，颗粒中的所有阳离子脂质的摩尔比为约20％至约60％；中性脂质可以以约5％至约25％的摩尔比存在；固醇可以以约25％至约55％的摩尔比存在；并且PEG脂质可以是PEG-DMA、PEG-DMG或其组合，并且可以以约0.5％至约15％的摩尔比存在。

用于产生LNP的脂质的其它实例包含DOTMA、DOSPA、DOTAP、DMRIE、DC-胆固醇、DOTAP-胆固醇、GAP-DMORIE-DPyPE和GL67A-DOPE-DMPE-聚乙二醇(PEG)。阳离子脂质的实例包含98N12-5、C12-200、DLin-KC2-DMA(KC2)、DLin-MC3-DMA(MC3)、XTC、MD1和7C1。经PEG修饰的脂质的其它实例包含PEG-CerC14和PEG-CerC20。

在一些实施例中，LNP进一步包括能够减少聚集(例如，LNP的聚集)的脂质。

在一些实施例中，LNP的表面进一步用聚合物或脂质(例如，壳聚糖、阳离子聚合物或阳离子脂质)修饰，或与靶向分子(对细胞表面受体或细胞表面受体的天然配体具有特异性的抗体)偶联，以将纳米颗粒引导至适当的细胞类型，并且增加细胞摄取的可能性，如例如Jian等人,(2012)用于眼部基因递送的阳离子核壳脂质纳米颗粒(Cationic core shellliponanoparticles for ocular gene delivery),《生物材料(Biomaterials)》33(30):7621-30中所描述。

LNP的递送

在一些实施例中，本发明包括将包括本文所描述的chRDNA的V型CRISPR系统递送至患者的细胞和组织。在一些实施例中，所述递送是通过本文所描述的脂质纳米颗粒(LNP)进行的。递送可以在体外、离体或体内完成到患者的细胞中。在一些实施例中，向患者全身施用(即，静脉内施用到体循环中)包括包含chRDNA的V型CRISPR系统的LNP。在一些实施例中，靶核酸在特定器官中表达(或异常表达)，并且将包括包含chRDNA的V型CRISPR系统的LNP施用于此器官。在一些实施例中，使包括包含chRDNA的V型CRISPR系统的LNP离体接触患者的细胞，并且将经处理的细胞施用于患者。

在一些实施例中，靶核酸在肝脏中表达(或异常表达)。在此类实施例中，全身施用包括包含chRDNA的V型CRISPR系统的LNP或将其施用到肝循环(例如，门静脉或另一条肝血管或肝脏结合血管)中。

在一些实施例中，靶核酸在肝脏中并且更具体地在肝细胞中表达(或异常表达)。在此类实施例中，使用包括包含chRDNA的V型CRISPR系统的LNP对患者自己的(自体)肝细胞或供体(同种异体)肝细胞进行离体处理，并且将经处理的肝细胞全身施用于患者或施用到肝循环(例如，患者的门静脉或另一条肝血管或肝脏结合血管)中。

在一些实施例中，靶核酸在肝脏的肝窦内皮细胞或全身的造血细胞中表达(或异常表达)(例如，因子VIII基因，其缺乏是A型血友病的原因)。在此类实施例中，用于体内或离体施用包括chRDNA的V型CRISPR系统的靶细胞包含肝窦内皮细胞、分化为肝窦内皮细胞的祖细胞、造血内皮细胞或分化为造血内皮细胞的祖细胞。

在一些实施例中，靶核酸在眼镜的细胞中表达(或异常表达)。在一些实施例中，将包括包含chRDNA的V型CRISPR系统的LNP递送到眼睛中(眼内递送)。在一些实施例中，所述递送是玻璃体内的。在一些实施例中，所述递送直接针对视网膜以到达视网膜色素上皮。

在一些实施例中，施用与药学上可接受的载剂组合。

诱导多能干细胞(iPSC)

在一些实施例中，本发明包括一种基于离体细胞的疗法的方法，所述方法包括使用包括chRDNA的V型CRISPR系统编辑诱导多能干细胞(iPSC)的基因组；将经编辑的iPSC分化为期望谱系的细胞，并且将经分化的细胞植入患者体内。

在一些实施例中，iPSC是患者来源的(自体的)。在一些实施例中，从受试者或患者获得体细胞，将其重新编程为诱导多能干细胞(iPSC)，使用如本文所描述的包括chRDNA的V型CRISPR系统编辑基因组，重新分化为期望细胞类型的细胞，并且施用于同一受试者或患者。

在一些实施例中，iPSC是供体来源的或细胞系来源的。在一些实施例中，iPSC的分化是通过施用某些刺激体外或离体人工诱导的。

将细胞重新编程为iPSC

在一些实施例中，将经分化的细胞重新编程为iPSC是通过施用外部药剂体外或离体人工诱导的。在一些实施例中，将经分化的细胞重新编程为iPSC包括逆转一种或多种可遗传的核酸修饰模式，如甲基化。在一些实施例中，将经分化的细胞重新编程为iPSC是通过在经分化的细胞中表达某些基因来实现的。在一些实施例中，使用质粒或病毒表达载体将基因引入到细胞中。在一些实施例中，基因作为能够在细胞内被翻译的mRNA引入。在一些实施例中，诱导重新编程的基因是Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc中的一者或多者，如Takahashi等人,(2006)限定因子诱导来自小鼠胚胎和成体成纤维细胞培养物的多能干细胞(Inductionof pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast culturesby defined factors),《细胞》126(4):663-76中所描述。在一些实施例中，诱导重新编程的基因是Oct4、Sox2和NANOG中的一者或多者或全部三者，如Budniatzky等人,(2014)简明综述：心血管再生医学的重新编程策略：从诱导多能干细胞到直接重新编程(Concisereview:reprogramming strategies for cardiovascular regenerative medicine:frominduced pluripotent stem cells to direct reprogramming),《干细胞转化医学(Stem Cells Transl Med)》.3(4):448-57以及其中引用的参考文献中所描述。在一些实施例中，诱导重新编程的基因是以下中的一者或多者：Sox1、Sox3、Sox15、Sox18、Klf1、Klf2、Klf5、NR5A2、c-Myc、l-Myc、n-Myc、Rem2、Tert和LIN28或Wnt。在一些实施例中，通过引入以下中的一者或多者来增强将体细胞重新编程为iPSC：MEK抑制剂、DNA甲基转移酶抑制剂、组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂、丙戊酸、5'-氮杂胞苷、地塞米松、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、维生素C和曲古抑菌素(TSA)、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA(例如，MK0683、伏立诺他)和其它异羟肟酸)、BML-210、Depudecin(例如，(-)-Depudecin)、HC毒素、Nullscript(4-(1,3-二氧代-1H,3H-苯并[de]异喹啉-2-基)-N-羟基丁酰胺)、苯基丁酸盐(例如，苯丁酸钠)和丙戊酸((VP A)和其它短链脂肪酸)、斯克瑞泰、苏拉明钠、曲古抑菌素A(TSA)、APHA化合物8、制蚜菌素、丁酸钠、新戊酰氧基甲基丁酸盐(Pivanex，AN-9)、曲普欣B、Chlamydocin、缩酚酸肽(也被称为FR901228或FK228)、苯甲酰胺(例如，CI-994(例如，N-乙酰基地那林)和MS-27-275)、MGCD0103、NVP-LAQ-824、CBHA(间羧基肉桂酸双异羟肟酸)、JNJ16241199、吐巴辛(Tubacin)、A-161906、proxamide、oxamflatin、3-C1-UCHA(例如，6-(3-氯苯基脲基)己异羟肟酸)、AOE(2-氨基-8-氧代-9,10-环氧癸酸)、CHAP31和CHAP50。

在一些实施例中，通过检测或测量与iPSC相关的标志物的表达来评估经分化的细胞重新编程为iPSC。在一些实施例中，通过检测或测量选自以下的一个或多个基因的表达来评估重新编程：SSEA3、SSEA4、CD9、Nanog、Fbx15、Ecat1、Esg1、Eras、Gdf3、Fgf4、Cripto、Dax1、Zpf296、Slc2a3、Rex1、Utf1和Nat1。在一些实施例中，通过检测或测量Sox1、Pax6、巢蛋白、HB9、MAP2、神经丝、Tuj1和Olig2的组合的表达来评估重新编程为运动神经元。在一些实施例中，通过Southern印迹或PCR(包含逆转录PCR(RT-PCR)、实时PCR(rtPCR)和数字液滴PCR(ddPCR))或核酸测序检测所讨论的mRNA来评估或测量表达。在一些实施例中，通过选自蛋白质印迹、流式细胞术、免疫化学和免疫细胞化学的免疫方法检测所讨论的蛋白质来确认表达。

修饰iPSC

在一些实施例中，本发明包括对iPSC进行基因修饰以实现基因的表达的方法，其中基因的异常表达与患者的疾病或病状有关。然后将经基因修饰的iPSC分化成以患者体内的基因的异常表达为特征的细胞类型，并且将将分化的细胞施用于患者以缓解所述疾病或病状的症状。

在一些实施例中，在用包括chRDNA的V型CRISPR系统进行核转染之前，将iPSC在含有一种或多种补充剂的合适培养基(例如，mTeSR-plus培养基(马萨诸塞州剑桥市的干细胞技术公司(STEMCELL Technologies,Cambridge,Mass.)))中培养。在一些实施例中，在核转染之前，用accutase(马萨诸塞州剑桥市的干细胞技术公司)分散细胞。在一些实施例中，对细胞进行计数，以在核转染孔中达到期望数量的细胞。在一些实施例中，4x 10³-2x 10⁴个细胞存在于96孔板的孔中。添加Cas12a向导/核蛋白复合物，并且根据制造商的建议进行核转染。在一些实施例中，使用Nucleocuvette^TM板和Nucleofector^TM仪器(新泽西州艾伦代尔的龙沙公司(Lonza,Allendale,NJ))。

分化iPSC

在一些实施例中，所述方法包括使用根据本发明的方法的包括chRDNA的V型CRISPR系统对经基因修饰的iPSC进行分化的步骤。在一些实施例中，iPSC被分化为中枢神经系统(CNS)的细胞(如神经元，包含运动神经元)、视网膜细胞或神经胶质细胞、心血管系统的细胞(如内皮细胞或心肌细胞)。在一些实施例中，iPSC被分化为肝细胞或间充质干细胞。在一些实施例中，iPSC被分化为眼镜(非神经)细胞，如角膜细胞、巩膜细胞或脉络膜细胞。

在一些实施例中，iPSC被分化为神经元。在一些实施例中，所述方法包含制备汇合的iPSC的新鲜培养物以及在将iPSC的汇合培养物置于神经诱导培养基中之前将其解离的步骤，所述神经诱导培养基包括以下中的一者或多者：血清替代物、非必需氨基酸、谷氨酰胺或谷氨酰胺替代物、维生素、GSK-3抑制剂、TGF-β受体或TGF-β抑制剂、ALK抑制剂、多索吗啡和化合物E。在一些实施例中，进行一次或多次培养基交换。在一些实施例中，后续培养基包括生长因子，如FGF和EGF。在一些实施例中，对于运动神经元的分化和生成，后续培养基是MN诱导培养基和神经基础培养基。在一些实施例中，培养基进一步补充有以下中的一者或多者：全反式视黄酸、音猬蛋白、嘌莫啡胺、SAG二盐酸盐、CNTF和GDNF。在一些实施例中，为了评估分化为神经元，通过荧光显微法对细胞进行评估。在一些实施例中，将细胞固定在甲醛或多聚甲醛中，例如用Triton-X和/或吐温-20渗透，并且用能够与Sox1、Pax6、巢蛋白、HB9、MAP2、神经丝、Tuj1和Olig2中的一者或多者特异性结合的初级抗体染色。为了进一步评估分化为运动神经元，例如通过使用俄勒冈绿488BAPTA-2钙指示剂进行成像来评估钙活性。在一些实施例中，例如，使用MultiClamp 700B微电极放大器(加利福尼亚州圣何塞的分子装置公司(Molecular Devices,San Jose,Cal.))测量细胞的电活性。

在一些实施例中，iPSC被分化为肌细胞，如心肌细胞。在一些实施例中，iPSC新鲜生长以实现60％-70％的培养物汇合度，并且用GSK-3抑制剂和Wnt依赖性磷酸化阻断剂中的一者或多者处理，并且在含有胰岛素的培养基中温育。在一些实施例中，通过测量心肌细胞特异性标志物(例如，TBX5、TNNT2、MYH6和MYL7)的基因表达以及任选地多能性标志物(NANOG、POUF5F1)的表达减少来评估细胞。

异种移植

在一些实施例中，本发明是一种通过使用包括chRDNA的V型CRISPR系统修饰动物的基因组以消除产生免疫不相容性的一个或多个基因的表达和/或引入在非人供体与人类受体之间建立免疫相容性的一种或多种基因或降低被人类免疫系统排斥的可能性来制备用于异种移植的转基因非人哺乳动物的方法。

在一些实施例中，所述转基因非人哺乳动物是猪，并且所述方法包括将包括chRDNA的V型CRISPR系统递送到猪卵母细胞、卵子或受精卵中，随后将经基因修饰的卵母细胞、卵子或受精卵转移到寄养雌性中。

在一些实施例中，所述转基因非人哺乳动物是猪，并且所述方法包括将包括chRDNA的V型CRISPR系统递送到猪体细胞中，并且进一步包括将所述体细胞的核转移到去核卵子或受精卵中，随后将所得卵子或受精卵转移到寄养雌性中。

在一些实施例中，基因组修饰是引起外源性蛋白的产生的基因的功能性拷贝的插入。在一些实施例中，外源性蛋白具有细胞保护性质、抗凝血性质、补体抑制剂性质或免疫抑制性质。在一些实施例中，外源性基因是人基因。在一些实施例中，外源性蛋白具有细胞保护性质，并且基因选自A20、HO-1、FAT-1和TNF-α受体。在一些实施例中，外源性蛋白具有抗凝血性质，并且基因选自CD39、水蛭素、TFPI、EPCR和TBM。在一些实施例中，外源性蛋白具有补体抑制剂性质，并且基因选自CD46、DAF(CD55)、CD59和CR1。在一些实施例中，外源性蛋白具有免疫抑制性质，并且基因选自CTLA4和CD47。

在一些实施例中，基因组修饰是导致内源性蛋白的表达减少或消除的内源性基因的破坏。在一些实施例中，被破坏的内源性基因是猪主要组织相容性复合物(SLA复合物)的一部分，并且选自SLA-1、SLA-2、SLA-3、SLA-6、SLA-7、SLA-8、SLA-9、SLA-11和SLA-12。在一些实施例中，猪I类SLA基因中的一者或多者的破坏伴随着选自HLA-A、HLA-A2、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G的人类I类HLA基因中的一者或多者的插入。

在一些实施例中，被破坏的内源性基因是α(1,3)-半乳糖基转移酶(GT)和单磷酸胞苷-N-乙酰基神经氨酸羟化酶(CMAH)中的一者或两者。减少或消除GT和CMAH的表达通过破坏猪细胞中的表面蛋白的糖基化来降低猪异种移植的免疫原性。GT催化半乳糖-α-1,3-半乳糖残基添加到糖蛋白中。CMAH催化N-乙酰基神经氨酸(Neu5Ac)转化为N-乙醇酰基神经氨酸(Neu5Gc)，其在其它猪酶的参与下形成在猪细胞的表面上发现但在人类细胞中未发现的免疫原性糖蛋白。

实例

实例1.Cas12a-向导核蛋白复合物的克隆、表达、产生和组装

于2021年10月18日提交的国际专利申请第PCT/US2021/055394号中描述了成功制备功能性Cas12a-向导核蛋白复合物的非限制性实例。

简而言之，氨基酸球菌(菌株BV3L6)催化活性Cas12a蛋白(AsCas12a)序列可以进行密码子优化，以在大肠杆菌(E.coli)细胞中表达，并且通过接头(例如，甘氨酸-丝氨酸接头)与核定位序列(NLS)缀合。已经验证了Cas12a的若干个NLS序列，包含核质蛋白(NLP)NLS和SV40大T抗原NLS。可以使用标准克隆方法将编码NLS-Cas9的DNA序列克隆到合适的细菌表达载体中。

AsCas12a蛋白可以使用表达载体在大肠杆菌中表达，并且使用亲和色谱法、离子交换和尺寸排阻色谱法纯化，基本上如例如Swarts等人(《分子细胞》,2017,66:221-233)中所描述。

可以通过将靶向区与特定Cas12a向导激活区连接来产生Cas12a向导。靶向区或间隔子优选地包括20-核苷酸靶结合序列。靶结合序列与发生在5'-TTTV或5'-TTTN PAM的下游(在3'方向上)的靶序列互补。Cas12a向导(如crRNAs和chRDNA)可以由商业制造商合成或通过体外转录(例如，T7快速高产RNA合成试剂盒；马萨诸塞州伊普斯威奇的新英格兰生物实验室(New England Biolabs,Ipswich,Mass.))产生。

例如，可以在80pmol Cas12a蛋白:240pmol向导的浓度下形成核蛋白复合物。可以将Cas12a蛋白和向导组分中的每一者(例如，crRNA或chRDNA)调节至期望的总浓度，在95℃下温育2分钟，从热循环仪中取出，并使其平衡至室温。将Cas12a蛋白在结合缓冲液(60mMTRIS-乙酸盐、150mM乙酸钾、30mM乙酸镁，pH 7.9)中稀释至适当浓度，最终体积为1.5μl，并与1μl的向导组分混合，随后在37℃下温育10分钟。

实例2.用于Cas12a切割的平铺靶基因

为了靶向所选基因，位于PAM基序(例如5'-TTTV)下游的所有20-核苷酸序列(在3'方向上)都可以用于靶向。靶选择标准包含但不限于与基因组中的其它区的同源性；G-C含量百分比；熔融温度；以及间隔子内均聚物的存在。

已鉴定的20-核苷酸序列可以在下游(在3'方向上)附加到AsCas12a向导激活区序列上，并且从而可以产生期望的向导。

任选地，向导可以被设计为包含靶向区或激活区中的核糖核苷酸(RNA)中的一种或多种脱氧核糖核苷酸(DNA)。

进一步任选地，向导可以被设计为包含一个或多个经化学修饰的核苷酸。化学修饰可以包含主链修饰、含氮碱基修饰和糖修饰。一个实例是核酸主链的硫代磷酸酯修饰。

实例3.(预测性)使用Cas12a-chRDNA核蛋白复合物转染人诱导多能干细胞。

本实例描述了使用Cas12a向导/核蛋白复合物对iPSC进行核转染。如本文所描述制备Cas12a(AsCas12a)。针对表3中列出的基因的靶序列制备向导。

细胞制备如下。在转染前，在37℃下，以10uM的最终浓度将iPSC在补充有Rho相关含卷曲螺旋的蛋白激酶抑制剂(“ROCKi”，马萨诸塞州伯灵顿市的密理博西格玛公司(MilliporeSigma,Burlington,Mass.))的mTeSR-plus培养基(马萨诸塞州剑桥市的干细胞技术公司)中培养3小时。去除mTeSR-plus/ROCKi培养基，并且用10mL PBS洗涤iPSC，随后添加3mL的accutase(马萨诸塞州剑桥市的干细胞技术公司)，并且将细胞在37℃下温育5-10分钟。然后，将7mL mTeSR-pulse和ROCKi添加到细胞中，并且将细胞混合并计数。然后，将细胞离心，去除培养基，并且将细胞用10mL PBS洗涤，再次离心并去除PBS。将细胞重新悬浮于Nucleofector^TM P4或P3(新泽西州艾伦代尔的龙沙公司)溶液中，密度为每个样品2x 10⁵-10⁶个细胞/ml。然后，将20μl细胞悬浮液添加到每个含有2.5μl Cas12a向导/核蛋白复合物的孔中，并将每个孔的全部体积转移到96孔Nucleocuvette^TM板(新泽西州艾伦代尔的龙沙公司)的孔中。将板装载到Nucleofector^TM 96孔Shuttle上，并且使用CA137Nucleofector^TM程序对细胞进行核转染。核转染后，向每个孔中添加77.5μl补充有IL-2(100单位/mL)的ImmunoCult-XF完全培养基，并将全部体积的经转染的细胞悬浮液转移到含有补充有IL-2(100单位/mL)的100μl预热的ImmunoCult XF完全培养基的96孔细胞培养板上。在下游分析之前，将板转移到组织培养温育箱中，并且在5％ CO₂中在37℃下保持48小时。

实例4.(预测性)经核转染的iPSC分化为运动神经元

此实例描述了经核转染的iPSC分化为运动神经元。简而言之，使用来自Bianchi,F.等人((2018)快速有效分化来自iPSC的功能性运动神经元用于治疗神经损伤(Rapid andefficient differentiation of functional motor neurons from iPSC for neuralinjury),《干细胞研究(Stem Cell Research)》32:126)的方案。核转染之后，使iPSC静置并生长至汇合。使用accutase将汇合的iPSC解离，并铺板在神经诱导培养基(NIM)中以0.5x10⁶个细胞/孔在经MG涂覆的6孔板上，所述NIM由KO-DMEM/F:12和神经基础培养基(NBM)的1:1混合物组成，补充有10％敲除血清替代物(KnockOut Serum Replacement)、1％非必需氨基酸(NEAA)(均来自赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))以及1％GlutaMAX、0.1mML抗坏血酸、3μM CHIR99021(两者均来自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))、2μM SB431542(CellGuidance Systems公司(CellGuidance Systems))、1μM多索吗啡和1μM化合物E(两者均来自干细胞公司(StemCell))。仅在前24小时添加1％RevitaCell(赛默飞世尔科技公司)。每天更换NIM，持续六天，之后用accutase使细胞解离，并将细胞铺板在NPC扩增培养基中，所述NPC扩增培养基由KO-DMEM:F12和NBM的1:1混合物组成，补充有1％ P/S、1％ B27、1％ N2、1％ NEAA、1％GlutaMAX、0.1mML-AA、10ng/mL bFGF和10ng/mL EGF。任选地，在每次传代时保留五分之一的细胞用于标志物分析。

为了进行分化并产生运动神经元，将NPC在MN诱导培养基中培养6天，所述MN诱导培养基由KO-DMEM:F12和神经基础培养基的1:1混合物组成，补充有1％ P/S、1％B27、1％N2、1％非必需氨基酸、1％ GlutaMAX、0.1mML抗坏血酸、10μM全反式视黄酸、100ng/ml重组SHH、1μM嘌莫啡胺(艾博抗公司(Abcam))和1mM SAG二盐酸盐(西格玛奥德里奇公司)。七天后，使用accutase使细胞解离，并将其重新铺板在由1:1KO-DMEM:F12和NBM组成的成熟培养基中，所述成熟培养基补充有1％ P/S、1％B27、1％N2、1％NEAA、1％GlutaMAX、0.1mML-AA、10ng/mL CNTF、10ng/ml BDNF、10ng/mL NT-3和10ng/mL GDNF。

细胞分析

为了评估分化，将细胞固定在含3.75％多聚甲醛的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中，用0.1％ Triton-X、0.1％吐温-20和含2.5％ BSA的PBS封闭和透化。添加针对Sox1、Pax6、巢蛋白、HB9、MAP2、神经丝、Tuj1和Olig2的初级抗体(例如，来自艾博抗公司)。接下来，用经AlexaFluor标记的次级抗体对细胞进行复染。例如使用NucBlue对细胞核进行标记。使用荧光显微镜(例如，倒置荧光显微镜)对细胞进行成像。

为了进一步评估分化为运动神经元，使用俄勒冈绿488BAPTA-2钙指示剂对钙活性进行成像。将细胞在含染料溶液的成像介质(例如，FluoroBrite-DMEM成像介质)中温育30分钟，在PBS中洗涤两次，并且进一步在新鲜的FBDMEM中温育30分钟。使用标准FITC滤光片对细胞进行成像，并及时记录单个分段细胞的荧光强度。为了进一步评估分化为运动神经元，使用MultiClamp 700B微电极放大器(加利福尼亚州圣何塞的分子装置公司)测量细胞的电活性。

实例5.(预测性)经核转染的iPSC分化为心肌细胞。

此实例描述了经核转染的iPSC分化为心肌细胞。简而言之，使用来自Balafkan,N.等人((2020)用于在96孔微孔板中将人诱导多能干细胞分化为功能性心肌细胞的方法(Amethod for differentiating human induced pluripotent stem cells towardfunctional cardiomyocytes in 96-well microplates),《自然(Nature)》10:18498)的方案。核转染之后，使iPSC静置并生长至汇合。使用高级DMEM/F-12和Geltrex(两者均来自赛默飞世尔科技公司)涂覆96孔板中的孔。在铺板之前，将人iPSC集落转化为均匀的细胞悬浮液，并使用Essential 8培养基(赛默飞世尔科技公司)以2.4x 10⁴个细胞/cm²的密度铺板并温育3天，其中每天更换培养基，以实现60％-70％的培养物汇合度。然后，在培养基(例如，RPMI 1640)中用GSK-3抑制剂(例如，CHIR99021)处理细胞。24小时后，将培养基更改为不含GSK-3抑制剂，并将细胞放置48小时(第1天-第2天)。在第3天，使用5μM Wnt依赖性磷酸化阻断剂(例如，IWP2)处理细胞，并温育另外48小时(第3天-第4天)。在第5天，将培养基更改为不含Wnt-P抑制剂，并将细胞放置48小时(第5天-第6天)。在第7天，将培养基更改为含有胰岛素。通过测量心肌细胞特异性标志物(例如，TBX5、TNNT2、MYH6和MYL7)的基因表达、多能性标志物(NANOG、POUF5F1)的表达减少来评估细胞。

实例6.永生化小鼠肝细胞的培养

此实例说明了永生化小鼠肝细胞系H2.35(弗吉尼亚州马纳萨斯的ATCC公司(ATCC；Manassas,VA))的培养。

从液氮储存中取出H2.35细胞，并且将细胞在37℃水浴中解冻3分钟。将细胞稀释到无钙和镁的磷酸盐缓冲盐水(PBS；特拉华州威尔明顿的赛默科技公司(ThermoScientific,Wilmington,DE))中至最终体积为10mL，并且以300g离心5分钟。抽吸PBS，并且将细胞重新悬浮于10mL预热的H2.35培养基中，所述培养基包括杜氏改性伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(DMEM；特拉华州威尔明顿的赛默科技公司)和1g/mL葡萄糖，补充有4％胎牛血清和200nM地塞米松(德国慕尼黑的默克公司/密理博西格玛公司(Merck/Millipore-Sigma,Munich,Germany))。使用3自动化细胞计数器(纽约州格兰德岛的生命科技公司(Life Technologies；Grand Island,NY))对细胞进行计数。然后，将细胞在贴壁平底烧瓶中以10,000个细胞/cm²的密度培养，并在32℃下在10％ CO₂中培养。

当汇合达到60％-70％时，通过抽吸培养基并用足够的PBS洗涤以覆盖烧瓶底部并轻轻来回摇动来对细胞进行常规传代。然后，抽吸PBS，并且将室温(RT)Accutase(特拉华州威尔明顿的赛默科技公司)添加至足够的体积以覆盖烧瓶底部，随后将烧瓶轻轻来回摇动，并在室温下温育3分钟。用手掌轻轻敲击烧瓶五次至十次，使细胞松动，并且将相对于Accutase体积的2.5倍体积的H2.35培养基添加到烧瓶中，并使用血清学移液管混合。将细胞以300g离心5分钟，倾析培养基，并且使用3自动化细胞计数器计数，并且在H2.35培养基中以10,000-20,000个细胞/cm²的密度接种到新的烧瓶中。

实例7.Cas12a向导/核蛋白复合物的克隆、表达、产生和组装

此实例描述了用于克隆、表达和纯化Cas12a向导/核蛋白复合物的方法，以及产生Cas12a向导组分的方法。

A.Cas12蛋白的克隆

对氨基酸球菌(菌株BV3L6)催化活性Cas12a蛋白序列(SEQ ID NO:1)进行密码子优化，以在大肠杆菌细胞中表达。在C末端处，添加甘氨酸-丝氨酸接头和一个核定位序列(NLS)(SEQ ID NO:2)。将编码Cas12a-NLS蛋白(在以下实例中称为AsCas12a和Cas12a蛋白)的寡核苷酸序列提供给商业制造商进行合成。然后，使用标准克隆方法将DNA序列克隆到合适的细菌表达载体中。

B.Cas12a蛋白的表达和纯化

AsCas12a蛋白使用表达载体在大肠杆菌中表达，并且使用亲和色谱法、离子交换和尺寸排阻色谱法纯化，基本上如例如Swarts等人(《分子细胞》,2017,66:221-233)中所描述。

C.Cas12a向导组分的产生

通过将靶向区与特定Cas12a向导激活区连接来产生Cas12a向导。靶向区或间隔子优选地包括20-核苷酸靶结合序列。靶结合序列与发生在5'-TTTV或5'-TTTN PAM的下游(在3'方向上)的靶序列互补。示例性Cas12a向导激活区序列分别是氨基酸球菌、毛螺菌科细菌(L.bacterium)和新凶手弗朗西斯菌Cas12a物种的SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8和SEQ IDNO:10。

将Cas12a向导序列(如crRNA和chRDNA)提供给商业制造商进行合成。

通过在双链(ds)DNA模板序列的5'端处并入T7启动子，可以从dsDNA模板体外转录(例如，T7快速高产RNA合成试剂盒；马萨诸塞州伊普斯威奇的新英格兰生物实验室)产生向导RNA组分(如crRNA)。

D.Cas12a向导/核蛋白复合物的组装

将用C末端核定位序列标记的氨基酸球菌Cas12a(AsCas12a)在大肠杆菌中重组表达，并使用色谱法纯化。除非另有说明，否则核蛋白复合物以80pmol Cas12a蛋白:240pmol向导的浓度形成。在与Cas12a蛋白组装之前，将向导组分(例如，crRNA或chRDNA)中的每一者调节至期望的总浓度(240pmol)，最终体积为1μl，在95℃下温育2分钟，从热循环仪中取出，并使其平衡至室温。将Cas12a蛋白在结合缓冲液(60mM TRIS-乙酸盐、150mM乙酸钾、30mM乙酸镁，pH 7.9)中稀释至适当浓度，最终体积为1.5μl，并与1μl的向导组分混合，随后在37℃下温育10分钟。立即使用Cas12a向导/核蛋白复合物，或在-20℃下冷冻直至需要为止。

实例8.具有Cas12a向导/核蛋白复合物的永生化小鼠肝细胞的电穿孔。

此实例说明了对具有Cas12a向导/核蛋白复合物的永生化小鼠肝细胞系H2.35进行电穿孔以进行基因编辑。

使用Nucleofector^TM 96孔Shuttle系统(新泽西州艾伦代尔的龙沙公司)将实例7的Cas12a向导/核蛋白复合物转染到H2.35中。将Cas12a向导/核蛋白复合物以2.5μl的最终体积分配到96孔板的各个孔中。以类似于实例1中所描述的方法从培养瓶中取出H2.35细胞。在对H2.35进行计数后，根据转染条件，将100,000个细胞重新悬浮于17.5uL的CTS^TMXenon^TM电穿孔缓冲液(特拉华州威尔明顿的赛默科技公司)中，并与2.5uL的Cas12a向导/核蛋白复合物混合，并且转移到96孔Nucleocuvette^TM板(新泽西州艾伦代尔的龙沙公司)的孔中。将板装载到Nucleofector^TM 96孔Shuttle(新泽西州艾伦代尔的龙沙公司)上，并且使用EH-110Nucleofector^TM程序(新泽西州艾伦代尔的龙沙公司)对细胞进行核转染。

核转染后，向每个孔中添加80μl的H2.35培养基，并将全部体积的经转染的细胞悬浮液转移到含有100μl预热的H2.35介质的96孔细胞培养板上。在下游分析之前，将板转移到组织培养温育箱中，并且在10％ CO₂中在32℃下保持72小时。

实例9.使用Cas12a向导/核蛋白复合物对小鼠基因进行平铺

此实例描述了设计和使用Cas12a向导/核蛋白复合物靶向永生化小鼠肝细胞系H2.35中编码小鼠前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/可欣9型(PCSK9)、转甲状腺素蛋白(TTR)和血管生成素样3(ANGPTL3)的基因。

A.设计AsCas12a crRNA向导

选择编码小鼠PCSK9、TTR和ANGPLT3的基因的编码区中位于5'-TTTV PAM基序下游(在3'方向上)的20-核苷酸序列进行靶向(SEQ ID NO:5-94)。靶选择标准包含但不限于与基因组中的其它区的同源性；G-C含量百分比；熔融温度；以及间隔子内均聚物的存在。

将已鉴定的20-核苷酸序列附加到AsCas12a激活区序列(SEQ ID NO:3)的下游(在3'方向上)。

将序列提供给商业制造商进行合成。然后，如实例7所描述的制备单独的Cas12a向导/核蛋白复合物，并且如实例3所描述的转染到原代H2.35细胞中。

B.确定基因组编辑效率

(1)用于深度测序的靶dsDNA序列生成

转染后72小时，使用Cas12a向导/核蛋白复合物和每孔50μL QuickExtract^TM DNA提取溶液(威斯康星州麦迪逊市的Epicenter公司(Epicentre,Madison,WI))从经核转染的H2.35细胞中分离gDNA，随后在37℃下温育10分钟，在65℃下温育30分钟，并且在95℃下温育3分钟以停止反应。将经分离的gDNA用50μL无菌水稀释，并且将样品储存在-20℃下。

使用经分离的gDNA，使用Q5热启动高保真2X主混合物(马萨诸塞州伊普斯威奇的新英格兰生物实验室)以1倍浓度进行第一次PCR，使用设计用于扩增Cas12a靶周围的区的引物，每种引物0.5μM，并且使用3.75μL的gDNA，最终体积为10μL。通过以下步骤进行扩增：在98℃下进行初始循环，持续1分钟；进行35个循环，在98℃下10秒，并且在60℃下20秒，在72℃下30秒；并且在72℃下进行最终延伸，持续2分钟。将PCR反应在水中以1:100稀释。

使用用于条形码编码PCR的一组独特索引引物来促进每个样品的多重测序。使用反应混合物进行条形码编码PCR，所述混合物包括1倍浓度的Q5热启动高保真2X主混合物(马萨诸塞州伊普斯威奇的新英格兰生物实验室)，每种引物0.5μM，以及1μL的1:100稀释的第一次PCR，最终体积为10μL。如下扩增反应混合物：在98℃下持续1分钟；随后进行12个循环，在98℃下10秒，在60℃下20秒，并且在72℃下30秒；并且在72℃下进行最终延伸反应，持续2分钟。

(2)SPRIselect清洁

将PCR反应合并并转移到单个微量离心管中，用于SPRIselect(加利福尼亚州帕萨迪纳市的贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter,Pasadena,CA))基于珠粒的扩增子清洁，以进行测序。

向扩增子中添加0.9倍体积的SPRIselect珠粒，混合，并在室温下温育10分钟。将微量离心管放置在磁性管架上，直到溶液澄清为止。去除上清液并丢弃，用1体积的85％乙醇洗涤残余珠粒，并将珠粒在室温下温育30秒。温育后，抽吸乙醇，并且将珠粒在室温下空气干燥10分钟。从磁性架上取出微量离心管，并且将0.25倍体积的Qiagen EB缓冲液(荷兰芬洛的凯杰公司(Qiagen,Venlo,Netherlands))添加到珠粒中，剧烈混合，并在室温下温育2分钟。将微量离心管放回磁铁上，温育至溶液澄清，并将含有经纯化的扩增子的上清液分配到干净的微量离心管中。使用Nanodrop^TM 2000系统(特拉华州威尔明顿的赛默科技公司)对经纯化的扩增子进行定量，并使用Fragment Analyzer^TM系统(爱荷华州艾姆斯的先进分析技术公司(Advanced Analytical Technologies,Ames,IA))和DNF-910dsDNA试剂盒(爱荷华州艾姆斯的先进分析技术公司)分析文库质量。

(3)深度测序设置

如根据Nanodrop^TM 2000系统值和扩增子的平均大小计算的，将合并的扩增子相对于4nM浓度归一化。在MiSeq测序仪(加利福尼亚州圣地亚哥的因美纳公司(Illumina,SanDiego,CA))上使用MiSeq试剂盒v2(加利福尼亚州圣地亚哥的因美纳公司)对文库进行300个循环的分析，其中有两个151个循环的配对末端运行和两个8个循环的索引读段。

(4)深度测序数据分析

测序数据中产物的身份是基于条形码编码PCR中调整到扩增子上的索引条形码序列确定的。计算脚本用于处理例如执行以下任务的MiSeq数据：

a.使用Bowtie(bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml)软件将读数与小鼠基因组(构建GRCm38/mm10)比对；

b.将比对的读段与预期的野生型基因组基因座序列进行比较，并将未与野生型基因座的任何部分比对的读段丢弃；

c.对匹配野生型序列的读段进行合计；

d.对具有indel(碱基的插入或缺失)的读段按indel类型分类并进行合计；以及

e.将总indel读段除以野生型读段和indel读段取的总和，以得到突变读段的百分比。

通过鉴定由Cas12a向导/核蛋白复合物靶向的区的indel序列，确定所得Cas12a向导/核蛋白复合物的基因组编辑效率。下表7中示出了细胞内编辑实验的结果。

StDev＝标准偏差；nd＝未确定，n＝3

上表7中的数据表明，Cas12a crRNA/核蛋白复合物能够在小鼠H2.35细胞中在靶编辑多个基因。可以使用AsCas12a或其它Cas12a蛋白(如毛螺菌科细菌或新凶手弗朗西斯菌)以类似的方式靶向其它基因，如本文其它地方所描述的基因。

实例10.对Cas12a chRDNA向导分子进行工程化以在激活区序列中具有DNA。

以下实例描述了对AsCas12a chRDNA向导分子进行工程化以在激活区序列中包括DNA碱基。

A.Cas12a chRDNA向导计算机设计

选择AsCas12a向导的20-核苷酸激活区序列(SEQ ID NO:03)用于进行工程化，并且在定位1、3、7、10、12、14、15和19处(沿向导在从5'至3'方向上计数)设计DNA碱基以代替RNA。

从实例9表7所示的靶列表中选择九个靶序列并工程化为在激活区序列中具有DNA碱基，并且将所述靶序列以及Cas12a crRNA对照序列提供给商业制造商进行合成。

B.细胞转染和分析

基本上如实例7所描述的制备用于筛选的单独的Cas12a向导/核蛋白复合物。如实例8所描述的，将核蛋白复合物转染到H2.35细胞中，并且如实例9所描述的，测定所得Cas12a向导/核蛋白复合物的基因组编辑效率。下表8中示出了细胞内编辑实验的结果。

StDev＝标准偏差；n＝3

上表8中呈现的数据表明，在激活区序列中具有DNA的AsCas12a向导能够达到与所有RNA向导相当的在靶编辑率(例如，比较SEQ ID NO:148与SEQ ID NO:149；SEQID NO:153与SEQ ID NO:154；SEQ ID NO:160与SEQ ID NO:161)。可以使用AsCas12a或其它Cas12a蛋白(如毛螺菌科细菌或新凶手弗朗西斯菌)以类似的方式对其它向导，如本文其它地方所描述的向导进行工程化以在激活区序列中具有DNA。

实例11.对Cas12a chRDNA向导分子进行工程化以在向导重复序列中具有DNA。

以下实例描述了对AsCas12a chRDNA向导分子进行工程化以在靶结合序列中包括DNA碱基。

A.Cas12a chRDNA向导计算机设计

在编码小鼠PCSK9(PCSK9-tgt9)、TTR(TTR-tgt5)和ANGPTL3(ANGPLT3-tgt18)的基因中选择一个靶序列用于进行工程化。将每个靶的Cas12a chRDNA向导以及Cas12acrRNA对照序列提供给商业制造商进行合成，所述向导包括靶结合序列中的定位子集处的单独的DNA碱基(SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:95-130)。

B.细胞转染和分析

基本上如实例7所描述的制备用于筛选的单独的Cas12a向导/核蛋白复合物。如实例8所描述的，将核蛋白复合物转染到H2.35细胞中，并且如实例9所描述的，测定所得Cas12a向导/核蛋白复合物的基因组编辑效率。下表9中示出了细胞内编辑实验的结果。

StDev＝标准偏差；n＝3

上表9中的编辑结果表明，在间隔子中包括DNA的Cas12a chRDNA向导分子能够以与crRNA相当的速率跨多个靶进行编辑(比较SEQ ID NO:148与SEQ ID NO:103；SEQ ID NO:152与SEQ ID NO:109；SEQ ID NO:156与SEQ ID NO:130)。将表3中的chRDNA向导设计的编辑率相对于每个靶的crRNA的编辑率归一化，并且用于确定所选靶的靶结合序列内的哪些定位可以工程化为Cas12a向导中的DNA。

实例12.在靶结合序列中具有多个DNA碱基的Cas12a chRDNA向导分子。

此实例描述了在靶结合序列中具有多个DNA碱基的Cas12a chRDNA向导分子的设计和测试。

A.Cas12a chRDNA向导的计算机设计

选择编码人B2M的基因中的三个靶(B2M-tgt12、B2M-tgt1、B2M-内含子-tgt12)、编码人TRAC的基因中的靶(TRAC-tgt12)以及编码人DNA甲基转移酶1的基因中的靶(DNMT1-tgt1)的20-核苷酸序列进行编辑。对于每个靶，将DNA的1至7个核苷酸设计到每个AsCas12a向导的靶结合序列中。针对DNA碱基的定位的设计标准包含但不限于先前的单个定位筛选数据(参见实例10)、先前对耐受DNA的定位的共识、靶结合序列中的单独的DNA碱基之间的距离以及脱靶序列中已知的错配位置。将Cas12a chRDNA向导设计以及在靶结合序列中不具有DNA的对照序列(表10中的“V3'”)提供给商业制造商进行合成。

B.细胞转染和分析

基本上如实例7所描述的制备用于筛选的单独的Cas12a向导/核蛋白复合物。如实例8所描述的，将Cas12a向导/核蛋白复合物转染到初级T细胞中，并且如实例9所描述的，测定所得Cas12a向导/核蛋白复合物的基因组编辑效率。下表10中示出了细胞内编辑实验的结果以及每个Cas12a chRDNA向导的靶结合序列中的DNA碱基的位置。

StDev＝标准偏差；n＝3

上表10中的编辑结果表明，在靶结合序列中包括多个DNA碱基的Cas12a chRDNA向导分子能够以与crRNA相当的速率跨多个靶进行编辑(比较SEQ ID NO:136与SEQ ID NO:131；SEQ ID NO:141与SEQ ID NO:139或SEQ ID NO:147与SEQ ID NO:142)。

虽然已经参考具体实例详细描述了本发明，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，可以在本发明的范围内进行各种修改。因此，本发明的范围不应受到本文所描述的实例的限制，而应受到以下权利要求的限制。

Claims

1.一种治疗以基因的异常表达为特征的疾病或病状的方法，所述方法包括将以下引入到患有疾病或病状的患者的体细胞中：

(a)第一核蛋白复合物，所述第一核蛋白复合物包括Cas12a蛋白和第一CRISPR向导分子，所述第一CRISPR向导分子具有能够与第一靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述Cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述Cas12a蛋白能够切割第一靶核酸，其中所述第一CRISPR向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸；以及

(b)供体多核苷酸，所述供体多核苷酸包括在患有所述疾病或病状的个体中异常表达的基因靶的编码序列；

其中由所述Cas12a蛋白进行的切割引起将所述编码序列插入到所述体细胞的基因组中，并且

其中所述引入是通过使所述体细胞与包括所述第一核蛋白复合物和所述供体多核苷酸的脂质纳米颗粒接触进行的，并且

其中所述基因靶选自表3。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在所述CRISPR向导分子中，所述激活区、所述靶向区或两者均包括至少一种脱氧核糖核苷酸。

3.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括将包括Cas12a蛋白和第二CRISPR向导分子的第二核蛋白复合物引入到所述体细胞中，所述第二CRISPR向导分子具有能够与第二靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述Cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述Cas12a蛋白能够切割第二靶核酸；

其中所述编码序列插入在由所述Cas12a蛋白切割的第一靶核酸和所述第二靶核酸中的切割位点之间。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述第二CRISPR向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述将所述编码序列插入到所述体细胞的基因组中引起所述基因在所述体细胞中的表达增加。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒包括一种或多种阳离子脂质，其中所述脂质或两种或更多种脂质的组合的pK_a介于6.1与6.7之间。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒包括中性脂质。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒包括固醇。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒包括一种或多种选自由以下组成的组的脂质：DSPC、DPPC、POPC、DOPE、SM、PEG-DMA、PEG-DMG、DOTMA、DOSPA、DOTAP、DMRIE、DC-胆固醇、DOTAP-胆固醇、GAP-DMORIE-DPyPE、GL67A-DOPE-DMPE-PEG、98N12-5、C12-200、DLin-KC2-DMA(KC2)、DLin-MC3-DMA(MC3)、XTC、MD1、7C1、PEG-CerC14和PEG-CerC20。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述引入到体细胞中是离体进行的。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述引入到体细胞中是通过全身静脉内施用、施用到门静脉中或通过眼内施用进行的。

12.一种用于治疗以基因的异常表达为特征的疾病或病状的治疗组合物，所述组合物包括：

其中所述第一核蛋白复合物和所述供体多核苷酸存在于脂质纳米颗粒中，并且其中所述基因靶选自表3。

13.根据权利要求12所述的组合物，其中在所述CRISPR向导分子中，所述激活区、所述靶向区或两者均包括至少一种脱氧核糖核苷酸。

14.根据权利要求12所述的组合物，其进一步包括第二核蛋白复合物，所述第二核蛋白复合物包括Cas12a蛋白和第二CRISPR向导分子，所述第二CRISPR向导分子具有能够与第二靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述Cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述Cas12a蛋白能够切割第二靶核酸。

15.根据权利要求12所述的组合物，其中所述第二CRISPR向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸。

16.根据权利要求12所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包括一种或多种阳离子脂质，其中所述脂质或两种或更多种脂质的组合的pK_a介于6.1与6.7之间。

17.根据权利要求12所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包括中性脂质。

18.根据权利要求12所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包括固醇。

19.根据权利要求12所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包括一种或多种选自由以下组成的组的脂质：DSPC、DPPC、POPC、DOPE、SM、PEG-DMA、PEG-DMG、DOTMA、DOSPA、DOTAP、DMRIE、DC-胆固醇、DOTAP-胆固醇、GAP-DMORIE-DPyPE、GL67A-DOPE-DMPE-PEG、98N12-5、C12-200、DLin-KC2-DMA(KC2)、DLin-MC3-DMA(MC3)、XTC、MD1、7C1、PEG-CerC14和PEG-CerC20。

20.根据权利要求12所述的组合物，其进一步包括药学上可接受的载剂。

21.一种用经基因修饰的分化的诱导多能干细胞(iPSC)治疗以基因的异常表达为特征的疾病或病状的方法，所述方法包括

(1)将以下引入到iPSC中：

第一核蛋白复合物，所述第一核蛋白复合物包括Cas12a蛋白和第一CRISPR向导分子，所述第一CRISPR向导分子具有能够与第一靶核酸序列结合的靶向区；以及

能够与所述Cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述Cas12a蛋白能够切割第一靶核酸，其中所述第一CRISPR向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸；

其中由所述Cas12a蛋白进行的切割引起选自表4或表5的基因靶的修饰；

(2)在患有所述疾病或病状的个体中将所述iPSC分化为受所述疾病或病状影响的细胞类型；以及

(3)向受所述疾病或病状影响的患者施用分化的iPSC。

22.根据权利要求21所述的方法，其中在所述CRISPR向导分子中，所述激活区、所述靶向区或两者均包括至少一种脱氧核糖核苷酸。

23.根据权利要求21所述的方法，其进一步包括将包括Cas12a蛋白和第二CRISPR向导分子的第二核蛋白复合物引入到所述iPSC中，所述第二CRISPR向导分子具有能够与第二靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述Cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述Cas12a蛋白能够切割第二靶核酸；

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述第二CRISPR向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸。

25.根据权利要求21所述的方法，其进一步包括将供体多核苷酸引入到所述iPSC中，所述供体多核苷酸包括选自表4的基因靶的编码序列。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述用所述Cas12a蛋白进行的切割引起将所述编码序列插入到所述iPSC的基因组中。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述将所述编码序列插入到所述iPSC的基因组中引起所述基因在所述iPSC中的表达增加。

28.根据权利要求21所述的方法，其中所述用所述Cas12a蛋白进行的切割引起所述iPSC的基因组中表5中列出的基因靶的编码序列的破坏。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述iPSC的基因组中的所述破坏引起所述基因在所述iPSC中的表达减少。

30.根据权利要求21所述的方法，其中所述iPSC是通过对体细胞进行重新编程产生的。

31.根据权利要求26所述的方法，其中所述重新编程是通过诱导一个或多个基因在所述体细胞中的表达进行的。

32.根据权利要求26所述的方法，其中所述重新编程是通过诱导基因表达进行的，是通过将mRNA引入到所述体细胞中进行的。

33.根据权利要求27所述的方法，其中所述一个或多个基因选自Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、NANOG、Sox1、Sox3、Sox15、Sox18、Klf1、Klf2、Klf5、NR5A2、c-Myc、l-Myc、n-Myc、Rem2、Tert、LIN28和Wnt。

34.根据权利要求27所述的方法，其中所述一个或多个基因由Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的组合组成。

35.根据权利要求27所述的方法，其中所述一个或多个基因由Oct4、Sox2和NANOG的组合组成。

36.根据权利要求26所述的方法，其中所述重新编程进一步包括使所述iPSC与以下中的一者或多者接触：MEK抑制剂、DNA甲基转移酶抑制剂、组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂、丙戊酸、5'-氮杂胞苷、地塞米松(dexamethasone)、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、维生素C和曲古抑菌素(TSA)、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA(例如，MK0683、伏立诺他(vorinostat))和其它异羟肟酸)、BML-210、Depudecin(例如，(-)-Depudecin)、HC毒素、Nullscript(4-(1,3-二氧代-1H,3H-苯并[de]异喹啉-2-基)-N-羟基丁酰胺)、苯基丁酸盐(例如，苯丁酸钠)和丙戊酸((VP A)和其它短链脂肪酸)、斯克瑞泰(Scriptaid)、苏拉明钠(Suramin Sodium)、曲古抑菌素A(TSA)、APHA化合物8、制蚜菌素(Apicidin)、丁酸钠、新戊酰氧基甲基丁酸盐(Pivanex，AN-9)、曲普欣B(Trapoxin B)、Chlamydocin、缩酚酸肽(也被称为FR901228或FK228)、苯甲酰胺(例如，CI-994(例如，N-乙酰基地那林(N-acetyl dinaline))和MS-27-275)、MGCD0103、NVP-LAQ-824、CBHA(间羧基肉桂酸双异羟肟酸)、JNJ16241199、吐巴辛(Tubacin)、A-161906、proxamide、oxamflatin、3-C1-UCHA(例如，6-(3-氯苯基脲基)己异羟肟酸)、AOE(2-氨基-8-氧代-9,10-环氧癸酸)、CHAP31和CHAP50。

37.根据权利要求21所述的方法，其中所述iPSC分化为神经元。

38.根据权利要求33所述的方法，其中通过在存在以下中的一者或多者的情况下温育所述iPSC来将所述iPSC分化为神经元：GSK-3抑制剂、TGF-β受体或TGF-β抑制剂、ALK抑制剂、多索吗啡(dorsomorphin)、化合物E、FGF、EGF、全反式视黄酸、音猬蛋白(SonicHedgehog protein)、嘌莫啡胺(purmorphamine)、SAG二盐酸盐、CNTF和GDNF。

39.根据权利要求33所述的方法，其中所述将iPSC分化为神经元是通过在分化过程之后测量Sox1、Pax6、巢蛋白(Nestin)、HB9、MAP2、神经丝、Tuj1和Olig2中的一者或多者的表达来评估的。

40.根据权利要求33所述的方法，其中所述将iPSC分化为神经元是通过在分化过程之后测量所述细胞的电活动来评估的。

41.根据权利要求21所述的方法，其中所述iPSC分化为肌细胞。

42.根据权利要求37所述的方法，其中通过在存在GSK-3抑制剂和Wnt依赖性磷酸化阻断剂中的一者或多者的情况下温育所述iPSC来将所述iPSC分化为肌细胞。

43.根据权利要求37所述的方法，其中所述将iPSC分化为肌细胞是通过在分化过程之后测量TBX5、TNNT2、MYH6和MYL7中的一者或多者的表达来评估的。

44.一种用经基因修饰的分化的诱导多能干细胞(iPSC)治疗以基因的异常表达为特征的疾病或病状的组合物，所述组合物包括iPSC，所述iPSC包括：

其中由所述Cas12a蛋白进行的切割引起选自表4或表5的基因靶的修饰；并且

所述iPSC能够在患有所述疾病或病状的个体中分化为受所述疾病或病状影响的细胞类型。

45.根据权利要求44所述的组合物，其中在所述CRISPR向导分子中，所述激活区、所述靶向区或两者均包括至少一种脱氧核糖核苷酸。

46.根据权利要求44所述的组合物，其进一步包括将包括Cas12a蛋白和第二CRISPR向导分子的第二核蛋白复合物引入到所述iPSC中，所述第二CRISPR向导分子具有能够与第二靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述Cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述Cas12a蛋白能够切割第二靶核酸；

47.根据权利要求45所述的组合物，其中所述第二CRISPR向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸。

48.根据权利要求44所述的组合物，其进一步包括供体多核苷酸，所述供体多核苷酸包括选自表4的基因靶的编码序列。

49.根据权利要求48所述的组合物，其中所述用所述Cas12a蛋白进行的切割引起将所述编码序列插入到所述iPSC的基因组中。

50.根据权利要求49所述的组合物，其中所述将所述编码序列插入到所述iPSC的基因组中引起所述基因在所述iPSC中的表达增加。

51.根据权利要求44所述的组合物，其中所述用所述Cas12a蛋白进行的切割引起所述iPSC的基因组中表5中列出的基因靶的编码序列的破坏。

52.根据权利要求51所述的组合物，其中所述iPSC的基因组中的所述破坏引起所述基因在所述iPSC中的表达减少。

53.根据权利要求44所述的组合物，其中所述iPSC是通过对体细胞进行重新编程产生的。

54.根据权利要求53所述的组合物，其中所述重新编程是通过诱导一个或多个基因在所述体细胞中的表达进行的。

55.根据权利要求54所述的组合物，其中所述重新编程是通过诱导基因表达进行的，是通过将mRNA引入到所述体细胞中进行的。

56.根据权利要求54所述的组合物，其中所述一个或多个基因选自Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、NANOG、Sox1、Sox3、Sox15、Sox18、Klf1、Klf2、Klf5、NR5A2、c-Myc、l-Myc、n-Myc、Rem2、Tert、LIN28和Wnt。

57.根据权利要求54所述的组合物，其中所述一个或多个基因由Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的组合组成。

58.根据权利要求54所述的组合物，其中所述一个或多个基因由Oct4、Sox2和NANOG的组合组成。

59.根据权利要求53所述的组合物，其中所述重新编程进一步包括使所述iPSC与以下中的一者或多者接触：MEK抑制剂、DNA甲基转移酶抑制剂、组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂、丙戊酸、5'-氮杂胞苷、地塞米松、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、维生素C和曲古抑菌素(TSA)、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA(例如，MK0683、伏立诺他)和其它异羟肟酸)、BML-210、Depudecin(例如，(-)-Depudecin)、HC毒素、Nullscript(4-(1,3-二氧代-1H,3H-苯并[de]异喹啉-2-基)-N-羟基丁酰胺)、苯基丁酸盐(例如，苯丁酸钠)和丙戊酸((VP A)和其它短链脂肪酸)、斯克瑞泰、苏拉明钠、曲古抑菌素A(TSA)、APHA化合物8、制蚜菌素、丁酸钠、新戊酰氧基甲基丁酸盐(Pivanex，AN-9)、曲普欣B、Chlamydocin、缩酚酸肽(也被称为FR901228或FK228)、苯甲酰胺(例如，CI-994(例如，N-乙酰基地那林)和MS-27-275)、MGCD0103、NVP-LAQ-824、CBHA(间羧基肉桂酸双异羟肟酸)、JNJ16241199、吐巴辛、A-161906、proxamide、oxamflatin、3-C1-UCHA(例如，6-(3-氯苯基脲基)己异羟肟酸)、AOE(2-氨基-8-氧代-9,10-环氧癸酸)、CHAP31和CHAP50。

60.根据权利要求44所述的组合物，其中所述iPSC分化为神经元。

61.根据权利要求60所述的组合物，其中通过在存在以下中的一者或多者的情况下温育所述iPSC来将所述iPSC分化为神经元：GSK-3抑制剂、TGF-β受体或TGF-β抑制剂、ALK抑制剂、多索吗啡、化合物E、FGF、EGF、全反式视黄酸、音猬蛋白、嘌莫啡胺、SAG二盐酸盐、CNTF和GDNF。

62.根据权利要求60所述的组合物，其中所述将iPSC分化为神经元是通过在分化过程之后测量Sox1、Pax6、巢蛋白、HB9、MAP2、神经丝、Tuj1和Olig2中的一者或多者的表达来评估的。

63.根据权利要求60所述的组合物，其中所述将iPSC分化为神经元是通过在分化过程之后测量所述细胞的电活动来评估的。

64.根据权利要求44所述的组合物，其中所述iPSC分化为肌细胞。

65.根据权利要求64所述的组合物，其中通过在存在GSK-3抑制剂和Wnt依赖性磷酸化阻断剂中的一者或多者的情况下温育所述iPSC来将所述iPSC分化为肌细胞。

66.根据权利要求64所述的组合物，其中所述将iPSC分化为肌细胞是通过在分化过程之后测量TBX5、TNNT2、MYH6和MYL7中的一者或多者的表达来评估的。

67.根据权利要求44所述的组合物，其进一步包括药学上可接受的载剂。

68.一种制备用于治疗以基因的异常表达为特征的疾病或病状的经基因修饰的分化的诱导多能干细胞(iPSC)的方法，所述方法包括

(1)将以下引入到iPSC中：

(3)向受所述疾病或病状影响的患者施用分化的iPSC。

69.根据权利要求68所述的方法，其中在所述CRISPR向导分子中，所述激活区、所述靶向区或两者均包括至少一种脱氧核糖核苷酸。

70.根据权利要求68所述的方法，其进一步包括将包括Cas12a蛋白和第二CRISPR向导分子的第二核蛋白复合物引入到所述iPSC中，所述第二CRISPR向导分子具有能够与第二靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述Cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述Cas12a蛋白能够切割第二靶核酸；

71.根据权利要求70所述的方法，其中所述第二CRISPR向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸。

72.根据权利要求68所述的方法，其进一步包括将供体多核苷酸引入到所述iPSC中，所述供体多核苷酸包括选自表4的基因靶的编码序列。

73.根据权利要求72所述的方法，其中所述用所述Cas12a蛋白进行的切割引起将所述编码序列插入到所述iPSC的基因组中。

74.根据权利要求73所述的方法，其中所述将所述编码序列插入到所述iPSC的基因组中引起所述基因在所述iPSC中的表达增加。

75.根据权利要求68所述的方法，其中所述用所述Cas12a蛋白进行的切割引起所述iPSC的基因组中表5中列出的基因靶的编码序列的破坏。

76.根据权利要求75所述的方法，其中所述iPSC的基因组中的所述破坏引起所述基因在所述iPSC中的表达减少。

77.根据权利要求68所述的方法，其中所述iPSC是通过对体细胞进行重新编程产生的。

78.根据权利要求77所述的方法，其中所述重新编程是通过诱导一个或多个基因在所述体细胞中的表达进行的。

79.根据权利要求77所述的方法，其中所述重新编程是通过诱导基因表达进行的，是通过将mRNA引入到所述体细胞中进行的。

80.根据权利要求78所述的方法，其中所述一个或多个基因选自Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、NANOG、Sox1、Sox3、Sox15、Sox18、Klf1、Klf2、Klf5、NR5A2、c-Myc、l-Myc、n-Myc、Rem2、Tert、LIN28和Wnt。

81.根据权利要求78所述的方法，其中所述一个或多个基因由Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的组合组成。

82.根据权利要求78所述的方法，其中所述一个或多个基因由Oct4、Sox2和NANOG的组合组成。

83.根据权利要求77所述的方法，其中所述重新编程进一步包括使所述iPSC与以下中的一者或多者接触：MEK抑制剂、DNA甲基转移酶抑制剂、组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂、丙戊酸、5'-氮杂胞苷、地塞米松、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、维生素C和曲古抑菌素(TSA)、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA(例如，MK0683、伏立诺他)和其它异羟肟酸)、BML-210、Depudecin(例如，(-)-Depudecin)、HC毒素、Nullscript(4-(1,3-二氧代-1H,3H-苯并[de]异喹啉-2-基)-N-羟基丁酰胺)、苯基丁酸盐(例如，苯丁酸钠)和丙戊酸((VP A)和其它短链脂肪酸)、斯克瑞泰、苏拉明钠、曲古抑菌素A(TSA)、APHA化合物8、制蚜菌素、丁酸钠、新戊酰氧基甲基丁酸盐(Pivanex，AN-9)、曲普欣B(Trapoxin B)、Chlamydocin、缩酚酸肽(也被称为FR901228或FK228)、苯甲酰胺(例如，CI-994(例如，N-乙酰基地那林(N-acetyldinaline))和MS-27-275)、MGCD0103、NVP-LAQ-824、CBHA(间羧基肉桂酸双异羟肟酸)、JNJ16241199、吐巴辛、A-161906、proxamide、oxamflatin、3-C1-UCHA(例如，6-(3-氯苯基脲基)己异羟肟酸)、AOE(2-氨基-8-氧代-9,10-环氧癸酸)、CHAP31和CHAP50。

84.根据权利要求68所述的方法，其中所述iPSC分化为神经元。

85.根据权利要求84所述的方法，其中通过在存在以下中的一者或多者的情况下温育所述iPSC来将所述iPSC分化为神经元：GSK-3抑制剂、TGF-β受体或TGF-β抑制剂、ALK抑制剂、多索吗啡、化合物E、FGF、EGF、全反式视黄酸、音猬蛋白、嘌莫啡胺、SAG二盐酸盐、CNTF和GDNF。

86.根据权利要求85所述的方法，其中所述将iPSC分化为神经元是通过在分化过程之后测量Sox1、Pax6、巢蛋白、HB9、MAP2、神经丝、Tuj1和Olig2中的一者或多者的表达来评估的。

87.根据权利要求85所述的方法，其中所述将iPSC分化为神经元是通过在分化过程之后测量所述细胞的电活动来评估的。

88.根据权利要求68所述的方法，其中所述iPSC分化为肌细胞。

89.根据权利要求88所述的方法，其中通过在存在GSK-3抑制剂和Wnt依赖性磷酸化阻断剂中的一者或多者的情况下温育所述iPSC来将所述iPSC分化为肌细胞。

90.根据权利要求88所述的方法，其中所述将iPSC分化为肌细胞是通过在分化过程之后测量TBX5、TNNT2、MYH6和MYL7中的一者或多者的表达来评估的。

91.一种制备用于异种移植的转基因动物的方法，所述方法包括：

(1)将以下引入到动物的细胞中：

其中由所述Cas12a蛋白进行的切割引起选自表6的基因靶的修饰；

(2)将所述细胞引入到寄养雌性动物体内。

92.根据权利要求91所述的方法，其中所述动物的细胞是卵母细胞、卵子或受精卵。

93.根据权利要求91所述的方法，其中所述动物的细胞是体细胞，并且所述方法进一步包括在步骤(1)之后，将所述细胞的核转移到去核卵子或受精卵中。

94.根据权利要求91所述的方法，其中所述动物是猪。

95.根据权利要求91所述的方法，其中在所述CRISPR向导分子中，所述激活区、所述靶向区或两者均包括至少一种脱氧核糖核苷酸。

96.根据权利要求91所述的方法，其进一步包括将包括Cas12a蛋白和第二CRISPR向导分子的第二核蛋白复合物引入到所述iPSC中，所述第二CRISPR向导分子具有能够与第二靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述Cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述Cas12a蛋白能够切割第二靶核酸；

97.根据权利要求96所述的方法，其中所述第二CRISPR向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸。

98.根据权利要求91所述的方法，其进一步包括将供体多核苷酸引入到所述细胞中，所述供体多核苷酸包括选自以下的基因靶的编码序列：A20、HO-1、FAT-1、TNF-α受体、CD39、水蛭素、TFPI、EPCR、TBM、CD46、DAF(CD55)、CD59、CR1、CTLA4、CD47、I类HLA中的一个或多个I类HLA。

99.根据权利要求98所述的方法，其中所述用所述Cas12a蛋白进行的切割引起将所述编码序列插入到所述细胞的基因组中。

100.根据权利要求99所述的方法，其中所述将所述编码序列插入到所述细胞的基因组中引起所述基因在所述细胞中的表达增加。

101.根据权利要求91所述的方法，其中所述用所述Cas12a蛋白进行的切割引起所述细胞的基因组中选自以下的基因靶的编码序列的破坏：GGTA1、b4GalNT2、CMAH、GT(α(1,3)-半乳糖基转移酶)、GHR、I类SLA中的一个或多个I类SLA。

102.根据权利要求101所述的方法，其中所述细胞的基因组中的所述破坏引起所述基因在所述细胞中的表达减少。

103.一种用于制备用于异种移植的转基因动物的组合物，所述组合物包括动物细胞，所述动物细胞包括：

其中由所述Cas12a蛋白进行的切割引起选自表6的基因靶的修饰。

104.根据权利要求103所述的组合物，其中动物的细胞是卵母细胞、卵子或受精卵。

105.根据权利要求103所述的组合物，其中所述动物的细胞是由将体细胞的核转移到去核卵子或受精卵中而产生的卵子或受精卵。

106.根据权利要求103所述的组合物，其中所述动物是猪。

107.根据权利要求103所述的组合物，其中在所述CRISPR向导分子中，所述激活区、所述靶向区或两者均包括至少一种脱氧核糖核苷酸。

108.根据权利要求103所述的组合物，其进一步包括将包括Cas12a蛋白和第二CRISPR向导分子的第二核蛋白复合物引入到所述iPSC中，所述第二CRISPR向导分子具有能够与第二靶核酸序列结合的靶向区；以及能够与所述Cas12a蛋白形成核蛋白复合物的激活区，并且所述Cas12a蛋白能够切割第二靶核酸；

109.根据权利要求108所述的组合物，其中所述第二CRISPR向导分子包括至少一种脱氧核糖核苷酸。

110.根据权利要求103所述的组合物，其进一步包括供体多核苷酸，所述供体多核苷酸包括选自以下的基因靶的编码序列：A20、HO-1、FAT-1、TNF-α受体、CD39、水蛭素、TFPI、EPCR、TBM、CD46、DAF(CD55)、CD59、CR1、CTLA4、CD47、I类HLA中的一个或多个I类HLA。

111.根据权利要求110所述的组合物，其中所述用所述Cas12a蛋白进行的切割引起将所述编码序列插入到所述细胞的基因组中。

112.根据权利要求111所述的组合物，其中所述将所述编码序列插入到所述细胞的基因组中引起所述基因在所述细胞中的表达增加。

113.根据权利要求103所述的组合物，其中所述用所述Cas12a蛋白进行的切割引起所述细胞的基因组中选自以下的基因靶的编码序列的破坏：GGTA1、b4GalNT2、CMAH、GT(α(1,3)-半乳糖基转移酶)、GHR、I类SLA中的一个或多个I类SLA。

114.根据权利要求113所述的组合物，其中所述细胞的基因组中的所述破坏引起所述基因在所述细胞中的表达减少。