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CN118956772A - 产生蜡样芽胞杆菌非溶血性肠毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

产生蜡样芽胞杆菌非溶血性肠毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 Download PDF

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CN118956772A
CN118956772A CN202410857822.5A CN202410857822A CN118956772A CN 118956772 A CN118956772 A CN 118956772A CN 202410857822 A CN202410857822 A CN 202410857822A CN 118956772 A CN118956772 A CN 118956772A
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bacillus cereus
hybridoma cell
kit
antibody
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魏春豪
匡华
徐丽广
孙茂忠
吴晓玲
刘丽强
郝昌龙
宋珊珊
吴爱红
郭玲玲
胥欣欣
瞿爱华
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Jiangnan University
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Abstract

本发明涉及产生蜡样芽胞杆菌非溶血性肠毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。所述产生蜡样芽胞杆菌非溶血性肠毒素NheA单克隆抗体的杂交瘤细胞株的名称为杂交瘤细胞株KET，保藏编号为CGMCC No.45910；或者，所述杂交瘤细胞株的名称为杂交瘤细胞株SFD，保藏编号为CGMCCNo.45911。本发明还提供两种杂交瘤细胞株KET和SFD分别分泌的单克隆抗体KET、SFD，单克隆抗体KET、SFD均为高亲和力、高特异性的鼠源性单克隆抗体，建立的夹心法灵敏度高，成本低，为乳制品中蜡样芽胞杆菌非溶血性肠毒素NheA的检测提供了快速高效的分析手段。

Description

产生蜡样芽胞杆菌非溶血性肠毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞 株及其应用
技术领域
本发明涉及免疫学和体外诊断技术领域，尤其是指产生蜡样芽胞杆菌非溶血性肠毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。
背景技术
蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)是一种革兰阳性菌，能产生芽孢，广泛存在于人类的周围环境中。蜡样芽孢杆菌被认为是一种条件致病菌，可引起眼内炎、败血症等，而其引起的食物中毒最为常见也最为重要。蜡样芽孢杆菌能产生多种毒素，引起腹泻或呕吐。引起腹泻类型的毒素包含单体蛋白细胞毒素K，溶血型肠毒素(HBL)，以及非溶血型肠毒素(Nhe)；Nhe是由3种非溶血型毒素的亚基组成，分别为NheA(41.0kDa)、Nhe B(41.0kDa)、NheC(41.0kDa)。
目前检测蜡样芽胞杆菌或毒素常见的方法有传统的生化培养方法、分子生物学检测方法、免疫学方法检测。其中传统的细菌检测方法是通过其生物学特性进行鉴定，主要包括增菌培养、分离纯化、菌落形态观察、革兰氏染色镜检、生化鉴定和生化分型几个步骤，这些步骤耗时较长、步骤繁琐；常见的分子生物学检测方法有PCR、多重PCR、实时荧光定量PCR、环介导等温扩增技术、重组酶聚合酶扩增技术等；而基于分子生物学方法的检测手段通常需要专业的技术人员或对仪器依赖性较高，不适合现场检测；基于抗原抗体特异性反应在实时现场检测方面具有显著优势，但是检测的准确性和灵敏度对抗体质量要求较高，因此需要制备高特异性和灵敏度的抗体以满足检测需求。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提出产生蜡样芽胞杆菌非溶血性肠毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。具体地说涉及一种产生蜡样芽胞杆菌非溶血性肠毒素NheA单克隆抗体的杂交瘤细胞株、抗体、试剂盒及其应用。
本发明通过以下技术方案实现：
本发明第一个目的是提供产生蜡样芽胞杆菌非溶血性肠毒素Nhe A单克隆抗体的一对杂交瘤细胞株，包括已于2024年04月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.45910；
以及已于2024年04月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.45911。
本发明第二个目的是提供一种蜡样芽胞杆菌非溶血性肠毒素Nhe A单克隆抗体，由所述杂交瘤细胞株分泌产生。
优选地，所述蜡样芽胞杆菌非溶血性肠毒素NheA单克隆抗体由所述的杂交瘤细胞株KET产生，其名称为单克隆抗体KET；和/或，所述蜡样芽胞杆菌非溶血性肠毒素NheA单克隆抗体由所述杂交瘤细胞株SFD产生，其名称为单克隆抗体SFD。
所述单克隆抗体KET和单克隆抗体SFD的抗体亚型均为IgG1。
本发明第三个目的是提供一种组合物，包括所述蜡样芽胞杆菌非溶血性肠毒素NheA单克隆抗体。
本发明第四个目的是提供一种试纸条，包括所述蜡样芽胞杆菌非溶血性肠毒素NheA单克隆抗体或权利要求3所述组合物。
本发明第五个目的是提供一种试剂盒，包括所述蜡样芽胞杆菌非溶血性肠毒素NheA单克隆抗体或所述组合物。
在本发明的一个实施例中，所述试剂盒包括作为标记抗体的单克隆抗体和作为包被抗体的单克隆抗体；
其中，所述作为标记抗体的单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No.45911的杂交瘤细胞株分泌；所述作为包被抗体的单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No.45910的杂交瘤细胞株分泌。
优选地，所述单克隆抗体KET可包被于固相载体上；所述单克隆抗体KET可为带有检测标记的抗体；
所述固相载体可优选自酶标板、微球、硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜或尼龙膜中的至少一种；更优选为酶标板。所述检测标记可优选自胶体金标记、酶标记、生物素标记或荧光素标记中的至少一种；所述酶标记优选自如下任一种：辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、溶菌酶及苹果酸脱氢酶；更优选为辣根过氧化物酶(HRP)。
在本发明的一个实施例中，所述试剂盒选自酶联免疫检测试剂盒、荧光免疫检测试剂盒或化学发光免疫检测试剂盒。
在本发明的一个实施例中，所述试剂盒为双抗体夹心法免疫检测试剂盒。
优选地，所述蜡样芽胞杆菌非溶血性肠毒素NheA的双抗体夹心ELISA检测试剂盒，以所述单克隆抗体KET为包被抗体，以所述单克隆抗体SFD为检测抗体；更优选地，所述检测抗体(单克隆抗体SFD)为辣根过氧化物酶所标记的抗体。酶标板上包被单克隆抗体KET用于特异性捕获蜡样芽胞杆菌非溶血性肠毒素NheA，并以酶标板上酶标抗体SFD-HRP与捕获的霍乱毒素A亚单位结合，底物加入后被HRP酶催化并在450nm产生吸收值，根据P/N值判定结果，其中：若蜡样芽胞杆菌非溶血性肠毒素NheA被包被抗体KET捕获并与酶标抗体SFD-HRP结合，并催化底物在450nm产生吸收值(P/N≥2.1)，判定为阳性；若蜡样芽胞杆菌非溶血性肠毒素NheA浓度过低(P/N＜2.1)被判定为阴性。
具体地，所述双抗体夹心ELISA检测试剂盒还可包括以下组分的至少一种：阴性对照，阳性对照，终止液，显色液，酶联板，包被液，PBS-T缓冲液，PBS；
其中，
所述显色液可选为TMB；
所述终止液可选为10％H2SO4；
所述包被液可选为0.01～0.05M(例如具体可为0.05M)，pH9.6的碳酸盐包被缓冲液。
本发明第六个目的是提供一种蜡样芽胞杆菌非溶血性肠毒素Nhe A的检测方法，所述检测方法包括：利用所述的试剂盒进行检测。
本发明第七个目的是提供所述的杂交瘤细胞株、所述的蜡样芽胞杆菌非溶血性肠毒素NheA单克隆抗体、所述的组合物、所述的试纸条或所述的试剂盒在检测含蜡样芽胞杆菌非溶血性肠毒素NheA的制剂中的应用。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
本发明提供了产生蜡样芽胞杆菌非溶血性肠毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。本发明采用理化性质高度均一、特异性好、可大量制备的单克隆抗体KET、SFD，单克隆抗体KET、SFD均为是高亲和力、高特异性的鼠源性单克隆抗体，建立的夹心法灵敏度高，成本低，为蜡样芽胞杆菌非溶血性肠毒素NheA抗原的检测提供了快速高效的分析手段，为开发快速检测试剂盒奠定基础。
本申请采用双抗体夹心法，用以检测蜡样芽胞杆菌非溶血性肠毒素NheA的蛋白水平。具有以下几方面的优点：
1.无需复杂的样本处理，仅检测乳制品即可，操作简便、检测时间短，成本较低。
2.所制备的抗体在检测乳制品样本时具备特异性；
3.通过乳制品分析获得的生物信息可以对疾病进展进行监测，以动态评价治疗效果；
4.为检测和防治蜡样芽胞杆菌非溶血性肠毒素NheA提供依据。
生物材料保藏：
产生蜡样芽胞杆菌非溶血性肠毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株KET，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期为2024年04月18日，保藏编号为CGMCC No.45910；
产生蜡样芽胞杆菌非溶血性肠毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株SFD已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期为2024年04月18日，保藏编号为CGMCC No.45911。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
图1为本发明中NheA重组蛋白表达纯化后SDS-PAGE鉴定图；
图2为本发明中单克隆抗体KET和SFD纯化后SDS-PAGE鉴定图；
图3为本发明中单克隆抗体KET的效价检测ELISA结果图；
图4为本发明中单克隆抗体SFD的效价检测ELISA结果图；
图5为本发明中双抗体夹心法KET-SFD/HRP的检测标准曲线；
图6为本发明中单克隆抗体对常见的微生物毒素的交叉反应率图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明通过大肠杆菌重组表达NheA蛋白，免疫小鼠，通过细胞融合、HAT选择性培养基培养、亚克隆等步骤，最终得到了对ctxA有较高灵敏度的配对单克隆抗体杂交瘤细胞株KET和SFD。
本发明的实施例与对比例中采用的原料，如果没有特别限定，那么均是现有技术公开的，例如可直接购买获得或者根据现有技术公开的制备方法制得。
具体实施中，
所述杂交瘤细胞株KET、SFD的制备方法及筛选方法，可采用本领域常规方法。具体方法可包括以下步骤：
一、重组质粒构建
根据GenBank公开的蜡样芽胞杆菌非溶血性肠毒素NheA基因序列(其中抗原蜡样芽胞杆菌非溶血性肠毒素NheA的基因序列见SEQ ID No.1)，以及氨基酸序列(SEQ IDNo.2)，由无锡天霖生物科技有限公司负责优化和合成完整基因pET 28a-NheA，之后转化至BL21感受态细胞中，涂布平板培养。
二、蛋白表达与纯化
从LB的平板中挑选单菌落接种至含有氨苄霉素的LB液体培养基37℃过夜，次日，按1％接种量将细菌接种至新鲜的LB液体培养基中，37℃培养至对数期(OD6000.6-0.8)，之后加入诱导试剂IPTG，低温诱导培养16h，收集菌体，超声破碎菌体后4000xg离心去除细菌碎片，之后12000xg离心30min收集上清液，采用Ni-NTA纯化系统纯化出目的蛋白NheA，采用Ni-NTA纯化系统纯化出目的蛋白NheA，PBS透析去除咪唑，NanoDrop One仪器测定浓度，-20至-30℃保存。
进一步的，ELISA方法可采用本领域通用方法，具体可包括如下步骤：
(一)制备特异性单克隆抗体：以Nhe A蛋白为免疫原，免疫6～8周龄的BALB/c小鼠，经免疫、融合，筛选对NheA蛋白强阳性的细胞进行亚克隆，得到杂交瘤细胞株KET、SFD，进一步制备腹水，最终获取NheA蛋白特异性单克隆抗体KET和SFD；
(二)筛选配对单克隆抗体：纯化步骤(一)中获取的NheA蛋白特异性单克隆抗体，并分别标记辣根过氧化物酶HRP，鉴定标记成功后进行夹心法配对；
(三)建立NheA蛋白特异性夹心ELISA方法：将步骤(二)中获取的配对单克隆抗体，以单克隆抗体KET用作包被抗体，单克隆抗体SFD用作检测抗体，所述检测抗体为辣根过氧化物酶所标记(SFD-HRP)；酶标板上包被单克隆抗体KET用于特异性捕获NheA蛋白，然后检测抗体即酶标抗体SFD-HRP与捕获的NheA结合，底物(TMB)加入后被HRP催化并在450nm产生吸收值，根据P/N值判定结果，其中：若NheA被包被抗体KET捕获并与酶标抗体SFD-HRP结合，并催化底物在450nm产生吸收值，若P/N≥2.1，判定为阳性；否则被判定为阴性。
进一步的，所述具体检测步骤可参考本领域常用方法，具体可包括如下步骤：
(1)包被：用4μg/mL的单克隆抗体KET包被在酶标板上，用量100μL/孔，并于37℃温育1～3h；
(2)洗涤：用PBST洗板三次，每次3min，用量200μL/孔，然后甩干反应板；
(3)封闭：用含0.2％明胶的CBS封闭板孔，用量300μL/孔，于37℃封闭1～3h；
(4)洗涤：同步骤(2)；
(5)样品：用PBST将NheA蛋白进行梯度稀释(例如可按3倍梯度从300ng/mL连续稀释至0.4ng/mL，具体可根据实际情况进行调整)，另设一个PBST空白对照，每孔加入100μL样品，于37℃温育0.5～2h；
(6)洗涤：同步骤(2)；
(7)加2μg/mL酶标抗体SFD-HRP，用量100μL/孔，并于37℃反应0.5～2h；
(8)洗涤：洗板四次；
(9)显色：按照TMB与底物液比例为1:5加显色液，用量100μL/孔，显色10～20min；
(10)终止：加终止液50μL/孔；
(11)测定：用酶标仪检测OD450。
进一步的，所述配对参数可包括：4μg/mL包被抗体KET，包被液为pH 9.6、0.05M的碳酸盐缓冲液，标品(包括ctxA蛋白)浓度50ng/mL，标品稀释液为pH 7.2、0.01M的PBST，酶标抗体SFD-HRP浓度可为2μg/mL。
下述实施例中涉及的培养基如下：
LB液体培养基：蛋白胨(2％)，酵母提取物(1％)，氯化钠(2％)；
HAT培养基：20％胎牛血清，1×HAT，500mL RPMI-1640，0.5％双抗；
RPMI-1640基础培养基，购买自Gibco公司；
下述实施例中涉及的溶液的配置如下：
实施例1NheA重组蛋白制备
1、重组质粒构建
根据GenBank公开的NheA基因序列，基因序列见SEQ ID No.1，以及氨基酸序列(SEQ ID No.2)，由无锡天霖生物科技有限公司负责优化和合成完整质粒pET28a-Nhe A。将质粒pET28a-NheA转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中，涂布在含有卡那霉素的LB平板上培养。
2、蛋白表达与纯化
从LB的平板中挑选单菌落接种至含有卡那霉素的LB液体培养基37℃过夜，次日，按1％接种量将细菌接种至新鲜的LB液体培养基中，37℃培养至对数期(OD600＝0.6-0.8)，之后加入诱导试剂IPTG，低温诱导培养16h，收集菌体，超声破碎菌体后4000xg离心去除细菌碎片，之后12000xg离心30min收集上清液，采用Ni-NTA纯化系统纯化出目的蛋白NheA(参照Ni-NTA纯化系统说明书进行)。取梯度洗脱的收集液进行SDS-PAGE验证(参见图1)，对有目的条带的洗脱液用0.01M PBS透析去除咪唑。用NanoDrop One仪器测定浓度，-20℃保存备用。
实施例2
一、制备特异性单克隆抗体
1、实验动物：选择6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫；
2、乳化：将实施例1中表达的蛋白与等量完全或不完全弗氏佐剂进行乳化，乳化完全后准备皮下多点注射小鼠；
3、免疫：
将新购的BLAB/c小鼠按5只/笼随机分组，先在动物屏障环境中饲养7～10天，使其适应环境。以NheA蛋白为免疫原，分别颈背部皮下多点注射免疫小鼠。首次免疫，免疫剂量为100μg/只，取适量免疫原与等体积弗氏完全佐剂混合，在双通道注射乳化器上充分乳化，形成油包水的乳化液，免疫小鼠。四周后进行第一次加强免疫，免疫剂量为50μg/只，免疫原与等体积弗氏不完全佐剂混合乳化。之后每间隔三周进行一次加强免疫，免疫剂量均为50μg/只，免疫佐剂均为弗氏不完全佐剂。
4、采血：第二次加强免疫后一周，从小鼠尾静脉采血，获得抗血清。采用间接非竞争酶联免疫法测定抗血清效价。
5、细胞融合：
(1)骨髓瘤细胞SP2/0的饲养。融合前十天复苏冻存的SP2/0细胞，并进行扩大培养。取一部分SP2/0用HAT培养基培养24小时，观察细胞是否会凋亡。
(2)饲养细胞准备：融合前一天取健康的Balb/c小鼠的饲养细胞进行铺板，细胞浓度为细胞至1×105个/mL，每孔100μL。
(3)SP2/0的准备：把细胞轻轻吹下来，收集至离心管中，记下溶液总体积，混匀并取少量细胞适当稀释后进行计数。脾细胞的准备：取出融合小鼠的脾脏，用1640基础培养基冲洗脾脏，且使脾脏处于湿润的环境中，研磨脾脏，用基础培养基冲洗残留在针芯和滤网上的脾脏细胞，收集研磨液，记录总体积。取部分研磨液进行计数。
(4)SP2/0细胞和脾细胞按照1:5～1:10的比例在离心管中混匀，1000rpm/min离心7min，弃上清。加入1mL已经在37℃水中预热好的PEG1450，接着滴入已经预热好的15mL的RPMI-1640基础培养基终止反应，1000rpm/min离心7min，弃上清，加入HAT完全培养基重悬，每孔加入100μL，放置细胞培养箱中培养，五天后观察融合结果。
6、阳性细胞筛选与克隆化
(1)在融合后第五天观察细胞，对细胞团较大的孔进行换液，第三天取细胞上清液到包有50ng/孔抗原的板中，ELISA试验检测，阳性孔需要再换一次液，隔天再次检测，对两次都检测为阳性的孔进行克隆化。
(2)用有限稀释法对阳性细胞进行克隆化，一般要进行三次克隆化，最后得到杂交瘤细胞株KET和杂交瘤细胞株SFD。
7、腹水的制备
(1)在注射杂交瘤细胞株前7～14天对接种的BaLb/c小鼠腹腔注射1mL的灭菌后的石蜡油。
(2)每只小鼠腹腔注射2×105～1×106个杂交瘤细胞株，注射体积为1mL。一般7～14天后小鼠腹部明显隆起，行动缓慢时可以抽取腹水。
(3)把收集到的腹水4℃、12000rpm/min离心30min，取上清，分装置于-20℃保存。
8、抗体的纯化和保存
采用辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水，0.01M PBS透析后得到单克隆抗体KET和单克隆抗体SFD，采用微量紫外方法测定其浓度后分装后放入-20℃保存。
二、抗体效价测定步骤：
(1)将NheA蛋白用0.05M，pH9.6的碳酸盐包被缓冲液稀释至0.1μg/mL后包被在96孔酶标板上，100μL/孔，于37℃温育箱内温育2h，取出酶标板后将板甩干，每孔注入200μL洗涤液PBST溶液，摇床上振荡3min，用力甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，继续洗涤2次，以下洗涤方法相同；
(2)充分洗涤后，用封闭缓冲液(0.2％明胶的CBS)封闭酶标板，200μL/孔，于37℃温育箱内温育2h后取出，洗涤，烘干待用；
(3)将抗体KET和SFD分别梯度稀释10000、20000、40000、80000、160000、320000和640000倍。分别对应加入到酶标板的前7行，第8行加入稀释液作对照，100μL/孔，37℃孵育35min后洗涤、拍干；
(4)每孔加入100μL，1:3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育35min后洗涤四次、拍干；
(5)每孔加入100μL显色液(TMB与底物液比例为1:5)，暗处37℃反应15min，取出后每孔加入50μL终止液(10％的硫酸)，用酶标仪测定吸光值OD450(结果如图3、图4所示)。由图3和图4可以看出，小鼠抗血清滴度超过320k，达到融合要求。
三、特异性双抗体夹心法测定步骤：
a、包被：用4μg/mL的单克隆抗体KET包被酶标板，100μL/孔，37℃温育2h；
b、洗涤：用PBST洗板三次，每次3min，200μL/孔，然后甩干反应板；
c、封闭：含0.2％明胶的CBS，200μL/孔，37℃封闭2h；
d、洗涤：用PBST洗板三次，每次3min，200μL/孔，然后甩干反应板；
e、样品：用PBST将NheA按3倍梯度从300ng/mL连续稀释至0.4ng/mL(300ng/mL、100ng/mL、33.33ng/mL、11.11ng/mL、3.4ng/mL、1.2ng/mL、0.4ng/mL)，另设一个PBST空白对照。每孔加入100μL样品，于37℃温育l h；
f、洗涤：用PBST洗板三次，每次3min，200μL/孔，然后甩干反应板；
g、加酶标抗体(SFD-HRP，2μg/mL)，100μL/孔，37℃反应1h；
h、洗涤：洗板四次；
i、显色：加显色液(TMB与底物液比例为1:5)100μL/孔，显色12min；
j、终止：加终止液(10％的硫酸)，50μL/孔；
k、测定：用酶标仪检测OD450值。
四、建立的单克隆抗体KET为包被抗体，单克隆抗体SFD为检测抗体的双抗体夹心ELISA检测方法检测曲线的建立和检测范围的确立：用0.05M，pH 9.6的碳酸盐包被缓冲液稀释抗体KET至4μg/mL，每孔加100μL，4℃过夜。洗涤，含0.2％明胶的CBS，200μL/孔，37℃封闭2小时。洗涤，分别加入不同浓度的用PBST缓冲液溶液稀释的重组Nhe A蛋白作为抗原(300ng/mL、100ng/mL、33.33ng/mL、11.11ng/mL、3.4ng/mL、1.2ng/mL、0.4ng/mL)，每孔100μL，37℃孵育1小时。洗涤，每孔分别加入100μL稀释的酶标抗体SFD-HRP(2μg/mL)，37℃孵育1小时。洗涤，每孔分别加入100μL显色液TMB，显色12分钟，加入50μL终止液(10％H2SO4)。酶标仪读取450nm吸光度数值OD450，分析数据，根据数据做出标准曲线。在Nhe A浓度在0.4ng/mL～300ng/mL范围内，随着Nhe A浓度的升高，ELISA反应OD450值升高，NheA浓度与OD450值呈线性相关，因此本方法的检测范围为：0.4ng/mL～300ng/mL，检测限为P/N大于2.1时的抗原浓度，即0.28ng/mL。并绘制了KET为包被抗体，SFD为检测抗体的双抗体夹心ELISA检测方法的标准曲线(图5)。
实施例3
测定单克隆抗体对常见的微生物毒素如肉毒毒素、金黄色葡萄球菌肠毒素SEA、SEB、SEC、SED、SEE、蜡样芽胞杆菌非溶血性毒素Nhe C、溶血性毒素HBLA、HBL2的交叉反应率，结果如图6所示；可以看出，本发明所得单克隆抗体与微生物毒素如肉毒毒素、金黄色葡萄球菌肠毒素SEA、SEB、SEC、SED、SEE、蜡样芽胞杆菌非溶血性毒素Nhe C、溶血性毒素HBLA、HBL2均无交叉，说明本发明的单克隆抗体特异性好，建立的检测方法特异性高。
为了验证检测试剂盒的实用性，选用牛奶和大米基质作为样本进行添加回收实验，具体如下表1所示：
表1
由表1可以看出，将配对的单克隆抗体KET-SFD用于牛奶和大米样本检测，分别添加高中低即100ng/mL、50ng/mL和5ng/mL三个浓度，并用ELISA检测，回收率在84.2％-108.28％，变异系数均小于10％。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.产生蜡样芽胞杆菌非溶血性肠毒素Nhe A单克隆抗体的一对杂交瘤细胞株，其特征在于，包括已于2024年04月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No. 45910；
以及已于2024年04月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.45911。
2.一种蜡样芽胞杆菌非溶血性肠毒素Nhe A单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌产生。
3.一种组合物，其特征在于，包括权利要求2所述蜡样芽胞杆菌非溶血性肠毒素Nhe A单克隆抗体。
4.一种试纸条，其特征在于，包括权利要求2所述蜡样芽胞杆菌非溶血性肠毒素Nhe A单克隆抗体或权利要求3所述组合物。
5.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述蜡样芽胞杆菌非溶血性肠毒素Nhe A单克隆抗体或权利要求3所述组合物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，包括作为标记抗体的单克隆抗体和作为包被抗体的单克隆抗体；
其中，所述作为标记抗体的单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No.45911的杂交瘤细胞株分泌；所述作为包被抗体的单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No.45910的杂交瘤细胞株分泌。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒选自酶联免疫检测试剂盒、荧光免疫检测试剂盒或化学发光免疫检测试剂盒。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为双抗体夹心法免疫检测试剂盒。
9.一种蜡样芽胞杆菌非溶血性肠毒素Nhe A的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：利用权利要求5-8中任一项所述的试剂盒进行检测。
10.权利要求1所述的杂交瘤细胞株、权利要求2所述的蜡样芽胞杆菌非溶血性肠毒素Nhe A单克隆抗体、权利要求3所述的组合物、权利要求4所述的试纸条或权利要求5-8任一项所述的试剂盒在检测含蜡样芽胞杆菌非溶血性肠毒素Nhe A的制剂中的应用。
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