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CN118956634A - 一种约氏乳杆菌及其组合物在缓解溃疡性结肠炎中的应用 - Google Patents

一种约氏乳杆菌及其组合物在缓解溃疡性结肠炎中的应用 Download PDF

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CN118956634A CN202410099499.XA CN202410099499A CN118956634A CN 118956634 A CN118956634 A CN 118956634A CN 202410099499 A CN202410099499 A CN 202410099499A CN 118956634 A CN118956634 A CN 118956634A
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Abstract

本发明公开了具有缓解溃疡性结肠炎功能的组合物及其应用，属于微生物和微生物添加技术领域。本发明通过体内外实验表明，包含组合物能够明显改善溃疡性结肠炎小鼠的体重减轻、疾病活动指数增加，并逆转结肠炎引起的结肠萎缩、保护结肠组织结构完整性，降低肠道内炎症水平，对结肠炎具有较好的缓解作用。同时，组合物可促进靶向促进乳杆菌属的丰度，增强约氏乳杆菌在肠道内的定殖，有利于其发挥益生效应。所述组合物用于制备缓解溃疡性结肠炎及其相关疾病药物的组合物与发酵食品，具有非常广泛的应用前景。

Description

一种约氏乳杆菌及其组合物在缓解溃疡性结肠炎中的应用
技术领域
本发明涉及有缓解溃疡性结肠炎功能的组合物及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)在全球的发病率逐年上升，影响着350多万人。其主要包括溃疡性结肠炎和克罗恩病，特征是胃肠道或结肠炎症的慢性复发和缓解。目前，IBD相关的治疗药物疗效存在个体差异，且伴随一定的副作用风险。因此，亟需寻求具有高安全性的新型疗法。有研究表明，IBD的发生发展与肠道菌群紊乱密切相关，主要变现为菌群多样性降低，一些有益菌的减少，如乳杆菌属(Lactobacillus)和产丁酸菌Faecalibacterium prausnitzi，以及一些有害菌的增加，如活泼瘤胃球菌(Ruminococcusgnavus)和黏附侵袭性大肠杆菌(Escherichia coli)。乳杆菌已被证明在治疗结肠炎方面具有巨大的潜力，其可产生吲哚类代谢物以激活免疫细胞中的芳香烃受体，促进抗炎因子的产生，维持肠道免疫平衡，某些乳杆菌还可以通过释放小分子物质而抑制致病菌的生长。
在人体的胃肠道(从口腔到粪便)中，均有乳杆菌属的分布，其中十二指肠中该菌属可占所有细菌的6％，而结肠中该菌只占到0.3％。此外，在恒河猴和啮齿类动物模型中，结肠中乳杆菌属的相对丰度为小肠中的近1/3。通常认为，乳杆菌倾向于定植与回肠而非结肠，这可能与肠道内营养竞争与生态位占据有关。然而，溃疡性结肠炎的好发部位在结肠远端与直肠，乳杆菌在结肠远端定植有限则难以充分发挥其结肠炎疗效。因此，基于微生物组导向性食品的概念，亟需挖掘一种能够在远端结肠靶向富集乳杆菌的食品组分，增强乳杆菌的益生效益。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供一种约氏乳杆菌及其复合制剂在缓解溃疡性结肠炎中的应用，目的在于解决现有具备治疗肠炎功能的乳杆菌在宿主肠道中的定植有限，并且其缓解肠道炎症的功能有限的技术问题。
本发明提供的第一个技术方案为一种组合物，所述组合物包含肠道菌和益生元；所述益生元为β-葡聚糖；所述肠道菌为约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)NSP009；所述约氏乳杆菌NSP009，已于2023年3月8日保藏于广东省科学院微生物研究所，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No:63248。
在本发明的一种实施方式中，所述约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)NSP009分离自DSS诱导的结肠炎C57BL/6小鼠结肠内容物。该菌株经测序分析，并将测序得到的序列在NCBI中进行核酸序列比对，结果显示与约氏乳杆菌的核酸序列相似度超过99％，将其命名为约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)NSP009。
所述的约氏乳杆菌NSP009具有下列性质：菌体特征：革兰氏染色阳性杆状细菌，无孢子，无鞭毛，菌体约0.5-1.5μm宽，0.5-1.5μm长。菌落特征：在培养基上形成明显地菌落，直径在0.5-1mm之间，正面形态圆形，中间凸起，边缘整齐，微白，不透明，表面湿润光滑。生长特性：该菌株为厌氧菌，最适生长温度是36℃-38℃，最适生长pH值为6.0-6.5，在含有葡萄糖的培养基中生长良好，16-24h可进入对数后期或稳定前期。
在本发明的一种实施方式中，所述的组合物中，所述约氏乳杆菌NSP009的活菌数不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
进一步，所述的组合物中，所述约氏乳杆菌NSP009的活菌数不低于1×109CFU/mL或1×109CFU/g。
在本发明的一种实施方式中，所述益生元为β-葡聚糖，所述β-葡聚糖为谷物来源，所述β-葡聚糖在所述组合物中的添加量不少于总质量的20％。
在本发明的一种实施方式中，所述约氏乳杆菌NSP009和β-葡聚糖的剂量比例为(1×106～1×1014CFU/kg)：(0.01～2g/kg)。
本发明提供第二个技术方案是第一个技术方案中所述的组合物在制备用于预防和/或治疗溃疡性结肠炎的产品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用至少包括如下一种作用：
(1)缓解结肠炎个体的体重减轻和疾病活动指数增加；
(2)缓解个体由结肠炎引起的结肠缩短和结肠损伤；
(3)降低结肠炎个体的肠道炎症水平；
(4)上调结肠炎个体肠道内吲哚乳酸的水平。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中，所述约氏乳杆菌NSP009的活菌数不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
进一步，所述产品中，所述约氏乳杆菌NSP009的活菌数不低于1×109CFU/mL或1×109CFU/g。
在本发明的一种实施方式中，所述益生元为β-葡聚糖，所述β-葡聚糖为谷物来源，所述β-葡聚糖在所述产品中的添加量不少于总质量的20％。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为药品或保健品。
在本发明的一种实施方式中，所述药品或保健品的剂型包括颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂、口服液。
在本发明的一种实施方式中，所述药品还含有药物载体和/或药用辅料。
在本发明的一种实施方式中，所述药用辅料是药学上可接受的辅料。
在本发明的一种实施方式中，所述可接受的辅料包括增稠剂、抗氧化剂、酸碱调节剂、乳化剂、防腐剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂及矫味剂中的一种或多种。
本发明的一种实施方式中，所述填充剂为淀粉、蔗糖、乳糖、硫酸钙和/或微晶纤维素。
在本发明的一种实施方式中，所述粘合剂为纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和/或聚乙烯吡咯烷酮。
在本发明的一种实施方式中，所述润湿剂为水、乙醇、淀粉和/或糖浆。
在本发明的一种实施方式中，所述崩解剂为羧甲基淀粉钠、羧丙纤维素、交联羧甲基纤维素、琼脂、碳酸钙和/或碳酸氢钠。
在本发明的一种实施方式中，所述润滑剂为滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、微粉硅胶和/或聚乙二醇。
在本发明的一种实施方式中，所述矫味剂为单糖浆、蔗糖、卵磷脂、橙皮糖浆、樱桃糖浆、柠檬、茴香、薄荷油、海藻酸钠、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、柠檬酸、酒石酸和/或碳酸氢钠。
本发明提供的第三个技术方案为一种含有第一个技术方案所述的组合物的产品。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为食品、药品或保健品。
在本发明的一种实施方式中，所述食品包括饮料、奶制品或其他含有上述组合物的食品。
在本发明的一种实施方式中，所述药品包含上述组合物，还含有药物载体和/或药用辅料。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、本发明的约氏乳杆菌NSP009是从结肠炎小鼠肠道中筛选得到的具有结肠炎改善作用的菌株。β-葡聚糖(β-glucan，BG)是一种可溶性的膳食纤维，广泛分布于燕麦、大麦和小麦种。BG可在体外、动物和人群上均能靶向促进乳杆菌的丰度。本发明中，β-葡聚糖有利于约氏乳杆菌NSP009的富集，并强化了包括约氏乳杆菌NSP009在内的乳杆菌在体内定植能力，进而显著优化了约氏乳杆菌NSP009治疗或缓解结肠炎的作用。
2、本发明的小鼠实验结果表明，由约氏乳杆菌NSP009和β-葡聚糖组成的组合物具有抵抗结肠炎引起的体重减轻、疾病活动指数增加、结肠缩短，并有效改善结肠损伤，显著降低肠道内炎症水平。此外，本发明中的组合物还具有改善结肠炎引起的ILA缺乏，进而有利于结肠炎的缓解。
生物材料保藏
一株约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)NSP009，已于2023年3月8日保藏于广东省科学院微生物研究所，分类学命名为：Lactobacillus johnsonii，保藏编号为GDMCCNo:63248，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所。
附图说明
图1为β-葡聚糖在体外可靶向富集乳杆菌属；其中，A为不同膳食纤维对乳杆菌属的体外富集作用比较；B为β-葡聚糖对约氏乳杆菌具有强富集作用。
图2为组合物对结肠炎小鼠造模期间小鼠体重与疾病活动指数的影响；其中，A为干预期间各组小鼠体重变化情况，B为干预期间小鼠疾病活动指数的变化。
图3为组合物对结肠炎小鼠结肠长度的影响及代表性结肠图片；其中，A为各组小鼠结肠代表性图片，B为结肠长度。
图4为组合物对结肠炎小鼠结肠病理损伤的影响；其中，A为结肠组织HE染色代表性切片图，B为结肠病理损伤评分。
图5为组合物对结肠炎小鼠结肠炎症水平的影响；其中，A为髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)蛋白水平，B为TNF-α水平。
图6为各组小鼠肠道菌群β-多样性的PCA图。
图7为各组小鼠粪便中约氏乳杆菌的含量。
其中，约氏乳杆菌NSP009干预组(NSP009)，β-葡聚糖干预组(BG)，约氏乳杆菌NSP009+β-葡聚糖干预组(NSP009+BG)。数据分析通过SPSS24进行单因素方差分析及Tukey’s HSD事后检验，同列中不同字母“a，b，c等”代表组间具有显著性差异(P<0.05)。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
下述实施例中涉及到的实验材料
所述小鼠购自北京维通利华实验动物有限公司，饲养于恒温(22±2℃)和恒湿(55±10％)的SPF环境下，保证12h的光照/黑暗循环，同时提供自由的标准饮食与水，适应性喂养一周后开始实验。下述实施例中所涉及的DSS(分子量36,000-50,000Da)，均购于美国MP公司。下述实施例中所涉及的MPO和TNF-α的EILSA试剂盒，均购于南京福麦斯生物技术有限公司；所涉及的BCA蛋白浓度测定试剂盒，购于上海碧云天生物技术有限公司；所涉及的逆转录试剂盒和qPCR试剂盒，均购于日本Takara公司。菊粉，购于爱尔兰Megazyme公司；木聚糖，购于上海源叶生物科技有限公司；阿拉伯半乳聚糖、苹果胶、卡拉胶、瓜尔胶和黄原胶，均购于美国Sigma-Aldrich公司；β-葡聚糖、葡甘露聚糖和阿拉伯木聚糖分别提取自青稞、铁皮石斛和大粒车前子。下述实施例中所涉及的培养基成分均购于上海源叶公司。
下述实施例中涉及培养基：
模拟结肠发酵培养基(g/L)：磷酸二氢钾1.0，碳酸氢钠3.0，氯化钾9.0，氯化钠9.0，无水硫酸镁1.2，二水和氯化钾0.2，七水合硫酸亚铁0.01，酸水解酪蛋白1.4，胰蛋白胨2.34，细菌胰蛋白胨2.34，酵母膏2.1，半胱氨酸盐酸盐1.6，胆盐0.8，氯化血红素0.1，吐温1.0，维生素K1 0.01，膳食纤维(菊粉、β-葡聚糖、阿拉伯半乳聚糖、葡甘露聚糖、苹果胶、卡拉胶、瓜尔胶、阿拉伯木聚糖、黄原胶或木聚糖)5.0，溶解于1L蒸馏水中，混合均匀，然后调整其pH为6.2-6.9，115-121℃灭菌15-20min后，即得到所述模拟结肠发酵培养基。空白对照为不添加膳食纤维的上述培养基。
MRS液体培养基(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉浸粉8.0，酵母浸粉4.0，葡萄糖20.0，磷酸氢二钾2.0，柠檬酸氢二铵2.0，乙酸钠5.0，硫酸镁0.2，硫酸锰0.04，吐温1.0，溶解于1L蒸馏水中，并加入半胱氨酸盐酸盐0.5-1g/L，混合均匀，然后调整其pH为6.6-7.0，115-121℃灭菌15-20min后，即得到所述MRS液体培养基。
MRS固体培养基的制备：在MRS液体培养基的基础上添加1.5-2％琼脂。混合均匀，然后调整其pH为6.6-7.0，115-121℃灭菌15-20min后，即得到所述MRS固体培养基。
MRS选择性培养基(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉浸粉8.0，酵母浸粉4.0，磷酸氢二钾2.0，柠檬酸氢二铵2.0，乙酸钠5.0，硫酸镁0.2，硫酸锰0.04，吐温1.0，β-葡聚糖5，溶解于1L蒸馏水中，并加入半胱氨酸盐酸盐0.5-1g/L，混合均匀，然后调整其pH为6.6-7.0，115-121℃灭菌15-20min后，即得到所述液体培养基。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
疾病活动指数评价：自DSS处理的第0天起，每日监测小鼠的腹泻程度和便血情况，结合体重变化，根据表1的评分标准计算每日的DAI(三项指标的平均值)，并绘制造模期间小鼠DAI变化曲线。
表1小鼠疾病活动指数各项指标评分标准
结肠切片HE染色与病理分析：将结肠组织浸泡于4％多聚甲醛溶液中固定24h，随后进行脱水和石蜡包埋，并切成3-4μm厚的石蜡切片，按以下步骤进行HE染色。
(1)石蜡切片脱蜡至水：将切片依次用二甲苯I脱蜡20min，二甲苯II脱蜡20min，无水乙醇I浸泡5min，无水乙醇II浸泡5min，75％酒精浸泡5min，自来水洗。
(2)苏木精染色：将切片浸泡于苏木精染液中染色3-5min，自来水洗，返蓝液反蓝，流水冲洗。
(3)伊红染色：将切片依次用85％乙醇和95％乙醇中脱水5min，再浸泡于伊红染液中染色5min。
(4)脱水封片：将切片依次用无水乙醇I浸泡5min，无水乙醇II浸泡5min，无水乙醇III浸泡5min，二甲苯I浸泡5min，二甲苯II浸泡5min，最后用中性树胶封片。
(5)显微镜镜检，图像采集分析。
根据表2的评分标准对组织损伤进行病理评分。组织学得分＝上皮损伤评分+炎症程度评分+病变深度评分。
表2组织学损伤评分标准
结肠组织MPO与相关细胞因子含量的测定：取30mg结肠组织，按1:9(w/v)加入无菌PBS和2颗3mm研磨珠，使用研磨仪对组织进行充分研磨。所得匀浆液置于4℃，10000rpm下离心10min，收集上清液用于后续测定。采用相应ELISA试剂盒检测小鼠结肠组织中MPO和TNF-α的含量，具体操作步骤与注意事项参考厂家配套说明书进行。另外，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样品的总蛋白浓度，计算每mg总蛋白中目标蛋白的含量。
粪便或发酵液DNA的提取与16S rRNA测序：采用粪便基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)并根据配套说明书对粪便或发酵液中的DNA进行提取。采用超微量分光光度计对DNA浓度与纯度进行测定。使用515F和806R引物对对其16S V4区进行PCR扩增(16SrRNA V4区扩增引物：515F：5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’；806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)。PCR体系如表3所示，按照如下流程在PCR仪上进行扩增：95℃下预变性5min；随后95℃15s，60℃15s，72℃45s，循环29次；72℃下延伸5min；降温至4℃，终止反应。使用2％的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，切下目的条带，采用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对DNA进行回收与纯化。利用Qubit荧光计对纯化后的DNA进行定量。混合适量样本的DNA以制备文库，使用Agilent 2100生物分析仪对文库质量进行检测。根据测序试剂盒对文库进行标准化和变性，最后在Miseq平台上进行双端测序。
表3PCR体系
qPCR法对细菌的检测与定量：利用梯度稀释的模式菌DNA浓度与相应Ct值构建标准曲线。以体外发酵液DNA或粪便DNA为模板，按照qPCR试剂盒(TAKARA)配制PCR体系。qPCR条件：50℃2min，95℃30s，进行初始变性；随后95℃20s，56℃30s，72℃30s，循环40次；72℃下延伸30s，终止反应。根据样品Ct值计算DNA浓度，根据需要换算相应单位。细菌引物见表4。
表4细菌PCR引物
吲哚乳酸(ILA)的检测与定量：采用有机萃取法提取小鼠结肠内容物中的代谢物，通过QTRAP 4500HPLC-MS/MS对代谢物进行分析与检测。质谱下机数据导入MultiQuant(v3.0.1)，根据相应标准曲线对目标物质进行定量分析。
实施例1：约氏乳杆菌NSP009的分离鉴定
1、粪菌的富集
收集结肠炎造模7天后的小鼠结肠内容物，迅速转移至厌氧培养箱中，加入适量含有0.1％L-半胱氨酸盐酸盐的无菌PBS后涡旋混匀，随后过100μm无菌细胞筛，获得菌液。将菌液按2％(v/v)加入含有不同膳食纤维的模拟结肠发酵培养基中，在37℃的厌氧环境下震荡培养24h。测序结果表明，十种膳食纤维中，β-葡聚糖对乳杆菌属的富集效果最强，发酵后该菌属的相对丰度可高达13.6％(图1A)。通过qPCR对菌种水平的分析，发现约氏乳杆菌是β-葡聚糖主要被富集的菌种，占所有乳杆菌属的68.6％(图1B)。
2、乳杆菌的分离与纯化
取稀释后菌液涂布至MRS固体培养基上，静置培养2～3天，用于乳杆菌的选择性培养。选择菌落数适宜的平板，分别挑取固体培养基上边缘整齐、微白、不透明、表面湿润光滑且形态一致的单菌落接种于5mL液体MRS选择性培养基中，至于37℃厌氧条件下培养24h，得到纯化培养液。
3、菌种保藏与鉴定
将步骤2中活力最好的细菌培养液作为扩增模版，使用16S通用引物(见表5)对其进行PCR扩增。PCR体系见表6，按照如下流程在PCR仪上进行扩增：95℃下预变性5min；随后95℃15s，60℃15s，72℃45s，循环29次；72℃下延伸5min；降温至4℃，终止反应。
扩增产物经1％琼脂糖电泳检测后进行一代测序。截取测序序列中的优质序列，提交至NCBI进行BLAST比对，查找相关序列的注释信息。结果显示，该序列与约氏乳杆菌的16SrDNA序列同源性超过99％。现将该菌株命名为约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)NSP009，并保藏于广东省科学院微生物研究所。
表5引物名称与序列
表6PCR体系
实施例2：组合物对溃疡性结肠炎小鼠体重与疾病活动指数的影响
1、约氏乳杆菌NSP009制剂的制备：
(1)培养方法：在无菌厌氧环境中，将约氏乳杆菌NSP009菌种在MRS固体培养基上划线，在厌氧条件下培养48h，形成单菌落后，挑取单菌落，并将其接种至MRS液体培养基，在37℃下厌氧培养16-24h，达到稳定期，此时的OD值为：1.0～1.4，制备得到种子液。
(2)保护剂的制备：以终浓度计，称取半胱氨酸盐酸盐1g/L，甘油200-300g/L，均匀溶解于蒸馏水中，115-121℃灭菌15-20min。
(3)冷冻剂的制备：将步骤(1)培养至稳定期的约氏乳杆菌NSP009种子液离心(8000rpm，10min，4℃)后，用无菌的磷酸盐缓冲液(pH 7.2)清洗1-2次后，用步骤(2)制备的保护剂重悬菌液，即得约氏乳杆菌NSP009冻存剂，于-80℃保存备用。
2、约氏乳杆菌NSP009菌剂的制备：
(1)活化菌株：将步骤1制备得到的约氏乳杆菌NSP009冻存剂在MRS固体培养基上划线，在厌氧条件下培养48h，形成单菌落后，将单菌接种至MRS液体培养基，在37℃下厌氧培养16-24h，达到稳定期(OD值为：1.1-1.4)。
(2)菌剂的制备：取100μL不同稀释倍数的步骤(1)获得的培养液涂布于MRS固体培养基，对MRS固体平板上的菌落数进行计数，计算步骤(1)液体培养基中的活菌数。用无菌磷酸盐缓冲液(pH 7.2)清洗1-2次后，将菌液制备成浓度为1×109CFU/mL的制剂。
3、β-葡聚糖制剂的制备：
将β-葡聚糖配置成浓度为40mg/mL的水溶液制剂，灌胃剂量为400mg/kg/天，灌胃小鼠体积为0.2mL/只，现配现用，备用。
4、实验方法：
本发明采用3％(w/v)DSS水溶液诱导小鼠产生溃疡性结肠炎。6周龄健康雄性C57BL/6J小鼠30只，随机分为五组(每组6只)：正常组、DSS诱导的结肠炎模型组(简称模型组)、约氏乳杆菌NSP009干预组(简称NSP009组)、β-葡聚糖干预组(简称BG组)、约氏乳杆菌NSP009+β-葡聚糖干预组(简称NSP009+BG组)。
实验流程如表7所示，经一周适应期后：
正常组：第0～14天自由饮用纯净水，同时每天灌胃0.1mL无菌PBS和0.2mL无菌蒸馏水。
模型组：第0～7天自由饮用纯净水，第8～14天自由饮用3％DSS溶液，第0～14天每天灌胃0.1mL无菌PBS和0.2mL无菌蒸馏水。
NSP009组：第0～7天自由饮用纯净水，第8～14天自由饮用3％DSS溶液，第0～14天每天灌胃0.1mL约氏乳杆菌NSP009制剂(1×109CFU/mL)和0.2mL无菌蒸馏水。
BG组：第0～7天自由饮用纯净水，第8～14天自由饮用3％DSS溶液，第0～14天每天灌胃0.1mL无菌PBS和0.2mLβ-葡聚糖制剂(400mg/kg)。
NSP009+BG组：第0～7天自由饮用纯净水，第8～14天自由饮用3％DSS溶液，第0～14天每天灌胃0.1mL约氏乳杆菌NSP009制剂(1×109CFU/mL)和0.2mLβ-葡聚糖制剂(400mg/kg)。
DSS处理期间，每天在同一时间监测小鼠体重、便稀、便血情况。
表7实验流程
5、实验结果：
各组小鼠的体重变化如图2A所示。结果表明，DSS处理可显著降低小鼠的体重(P<0.001)，其中模型组小鼠在DSS处理最后一天的体重下降至起始体重的80.5％。通过对小鼠进行组合物的干预，可显著减少小鼠体重下降(DSS处理后第7天，组合物对小鼠的体重下降恢复至起始体重的87.2％，P<0.001)。
各组小鼠的疾病活动指数变化如图2B所示。结果表明，DSS处理可逐渐增加疾病活动指数，即增加了便稀、便血和体重下降的程度。组合物干预可显著降低小鼠疾病活动指数(DSS处理后第7天，组合物对小鼠疾病活动指数降低至2.17，P<0.001)，且显著低于单独约氏乳杆菌NSP009制剂或β-葡聚糖干预(P<0.05)。
以上结果表明，本发明组合物可显著逆转DSS处理后引起的小鼠体重下降；还能显著改善结肠炎表型相关的疾病活动指数，效果优于单独灌胃益生菌或益生元。
实施例3：组合物对溃疡性结肠炎小鼠结肠长度与病理的影响
具体步骤如下：
具体实验方法同实施例2，区别在于，在第14天干预结束后，对小鼠施以安乐死。快速解剖并取出盲肠和结肠，记录结肠长度，对组织进行拍照记录。以盲肠为近端，肛门为远端，取远端1cm的结肠组织保存于4％多聚甲醛溶液中。
DSS在造成结肠炎的同时会引起小鼠结肠的萎缩，因此结肠长度通常被作为考量结肠炎严重程度的标准之一。由图3A和B可知，DSS组的结肠平均长度为4.8cm，为正常组结肠平均值的69.81％(正常组小鼠结肠长度平均为6.9cm)。通过对小鼠进行约氏乳杆菌NSP009、β-葡聚糖和二者的组合物干预，均能显著改善结肠长度缩短(P<0.001)，平均长度分别为5.7cm、5.6cm和6.2cm。其中，组合物干预后小鼠的结肠长度显著高于单独灌胃肠道菌和益生元(P<0.05)。
通过对结肠组织进行HE染色和病理分析，各组代表性切片图和病理评分结果如图4A和B所示。观察发现，正常组小鼠结肠组织结构完整、上皮细胞排列整齐，未见明显病变；模型组小鼠结肠组织结构不完整，上皮细胞排列紊乱甚至消失，隐窝结构破坏，黏膜及黏膜下层充血、水肿，黏膜固有层及黏膜下层存在广泛炎性浸润。与模型组相比，约氏乳杆菌NSP009、β-葡聚糖、二者的组合物均能显著改善结肠组织病理形态，修复黏膜损伤，减少炎性细胞侵入(P<0.001)。模型组、NSP009组、BG组、NSP009+BG组小鼠的结肠病理得分分别为10.4、7.4、7.7、6.3。其中，组合物的结肠病理得分显著低于单独灌胃肠道菌和益生元(P<0.05)。
以上结果表明，本发明的组合物可显著改善结肠炎小鼠结肠萎缩，保护结肠组织结构完整，效果显著优于优于单独灌胃益生菌或益生元。
实施例4：组合物对溃疡性结肠炎小鼠肠道内炎症水平的影响
具体步骤如下：
具体实验方法同实施例2，区别在于，在第14天干预结束后，对小鼠施以安乐死。将结肠组织保存于-80℃，用于ELISA检测。
MPO是一种由中性粒细胞产生的蛋白，是炎症反应的重要标志物，广泛用于反映肠道黏膜炎症状态。如图5A，模型组小鼠中的结肠MPO的水平相比于正常组显著提高(P<0.001)(从正常组3.2ng/mg蛋白提高至模型组51.1ng/mg蛋白)。约氏乳杆菌NSP009、β-葡聚糖、二者的组合物均能显著降低结肠炎小鼠肠道内MPO的水平(P<0.001)，分别为34.5ng/mg蛋白、33.5ng/mg蛋白和26.1ng/mg蛋白。其中，组合物干预后小鼠的MPO水平约为模型组小鼠的一半。
TNF-α是重要的细胞因子，可激活炎症细胞并引起炎症反应，因此通常被认为是促炎因子。如图5B，模型组小鼠结肠中的TNF-α较正常组显著升高(P<0.001)(从正常组8.5pg/mg蛋白提高至模型组54.6pg/mg蛋白)，但约氏乳杆菌NSP009、β-葡聚糖、二者的组合物均能显著降低其在结肠中的水平(P<0.001)，分别为27.3pg/mg蛋白、27.0pg/mg蛋白和18.9pg/mg蛋白。其中，组合物干预后小鼠的TNF-α水平相比于模型组小鼠降低了65.3％。
以上结果表明，本发明的组合物可显著下调结肠炎小鼠肠道内炎症水平，降低促炎细胞因子水平，改善肠道免疫平衡，可有效控制结肠炎的发生发展，且组合物的抗炎效果优于单独灌胃益生菌或益生元。
实施例5：组合物对溃疡性结肠炎小鼠粪便菌群的影响
具体步骤如下：
具体实验方法同实施例2，区别在于，在第14天干预结束后，收集各组小鼠粪便，用于DNA的提取和微生物组测序分析。通过β-多样性分析，模型组与组合物组小鼠肠道菌群之间存在明显差异(图6)，说明组合物干预使得肠道菌群结构发生了一定变化。
实验结果表明(表8)，模型组的乳杆菌属(Lactobacillus)丰度较正常组显著降低，为正常组的1/8，而通过约氏乳杆菌NSP009或β-葡聚糖干预可显著增加乳杆菌属的丰度，且组合物对乳杆菌属的丰度增加最多，使其恢复到正常组的近1/2。通过采用qPCR细菌定量技术，对小鼠粪便中的约氏乳杆菌进行定量，证实灌胃组合物可显著提高约氏乳杆菌在结肠远端的定植(P<0.05)。此外，模型组显著增加了嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansia)的丰度，其可能介导了粘液的降解而增加肠道通透性，引起炎症；组合物组可显著降低该细菌的丰度，或有益于保护肠粘膜屏障。瘤胃球菌属(Ruminococcus)中包含许多致病菌，如活泼瘤胃球菌，已被多数研究报道具有促进结肠炎的作用；组合物可显著降低其丰度，或有利于缓解肠道炎症。
综合本实施例结果，组合物对结肠炎小鼠的粪便菌群结构具有较好的调节作用，可增加有益菌的丰度，并降低有害菌的丰度。这表明，组合物对结肠炎小鼠的肠道环境具有良好的改善作用。
表8细菌属水平丰度表
实施例6：组合物对溃疡性结肠炎小鼠肠道内ILA水平的影响
具体步骤如下：
具体实验方法同实施例2，区别在于，在第14天干预结束后，对小鼠施以安乐死。快速取出结肠，并将结肠内容物保存于-80℃，用于ILA的检测。通过80％(v/v)甲醇提取结肠内容物中的代谢物，采用HPLC-MS/MS对ILA进行检测，浓度如表9所示。结果表明，本发明约氏乳杆菌NSP009与β-葡聚糖可显著提高结肠炎小鼠体内的ILA水平(P<0.05)；组合物对肠道内ILA的提升作用显著高于单独灌胃益生菌和益生元(P<0.05)，与正常组无显著差异(P>0.05)。说明组合物可较好改善结肠炎引起的ILA缺乏，有利于结肠炎的缓解。
表9小鼠结肠内容物中ILA的浓度
注：同列字母的不同表示存在显著性差异(P<0.05)。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一株约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)NSP009，其特征在于，已于2023年3月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:63248。
2.一种组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的约氏乳杆菌NSP009和益生元，所述益生元为β-葡聚糖。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述的组合物中，所述约氏乳杆菌NSP009的活菌数不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
4.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述β-葡聚糖在所述组合物中的添加量不少于总质量的20％。
5.根据权利要求2～4任一项所述的组合物，其特征在于，所述约氏乳杆菌NSP009和β-葡聚糖的剂量比例为(1×106～1×1014CFU/kg)：(0.01～2g/kg)。
6.权利要求2～5任一项所述的组合物在制备用于预防和/或治疗溃疡性结肠炎的药品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用至少包括如下一种作用：
(1)缓解结肠炎个体的体重减轻和疾病活动指数增加；
(2)缓解个体由结肠炎引起的结肠缩短和结肠损伤；
(3)降低结肠炎个体的肠道炎症水平；
(4)上调结肠炎个体肠道内吲哚乳酸的水平。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述述药品包含所述组合物，还含有药物载体和/或药用辅料。
9.一种产品，其特征在于，所述产品含有权利要求2～5任一项所述的组合物。
10.根据权利要求9所述的产品，其特征在于，所述产品为食品、药品或保健品。
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