CN118909052B

CN118909052B - 一种靶向gpc3的多肽及其应用

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Publication number: CN118909052B
Application number: CN202411320519.8A
Authority: CN
Inventors: 苗林; 贺凤; 宋芬; 王登; 王新波; 李向群
Original assignee: Hunan Zhongsheng Whole Peptide Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hunan Zhongsheng Whole Peptide Biotechnology Co ltd
Priority date: 2024-09-23
Filing date: 2024-09-23
Publication date: 2024-12-20
Anticipated expiration: 2044-09-23
Also published as: CN118909052A

Abstract

本发明公开了一种靶向GPC3的多肽及其应用。该靶向GPC3的多肽氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。实验结果证明，本发明靶向GPC3的多肽亲和力高，对高表达GPC3细胞具有良好的内吞作用，可以作为抗肿瘤药物的候选靶向分子，用于治疗或诊断GPC3靶点异常活化相关的癌症。

Description

一种靶向GPC3的多肽及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种靶向GPC3的多肽及其应用。

背景技术

磷脂酰肌醇蛋白聚糖是硫酸乙酰肝素(HS)糖蛋白中的一个家族，参与调控个体发育、细胞增殖和分化等过程。其中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)是硫酸乙酰肝素(HS)蛋白聚糖glypican家族的一员，可通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚，附着在细胞表面。GPC3在细胞生长、分化和迁移过程中发挥重要的作用。研究发现，GPC3在许多人类恶性肿瘤细胞和血清中表达，尤其在肝细胞癌上，GPC3特异性高表达于80％以上的人肝细胞癌细胞膜上，而在成人的正常组织中不表达。大量的研究证实GPC3可以成为肝细胞癌的治疗靶点，目前关于GPC3受体的抗体及小分子已成功合成，并已进入临床前期实验研究阶段。如专利CN200880103166.9公开了一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的单克隆抗体，其是以磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的胞外域制备的单克隆抗体，用于肿瘤诊断药物；专利CN201210152819.0则公开了一种以磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3全长片段制备的单克隆抗体，用于肿瘤诊断药物等。

目前早期肝细胞有较多的治疗手段，如手术、射频消融、化疗及生物免疫治疗，而晚期肝癌尚无有效的治疗方法。靶向特定靶点的靶向治疗是未来治疗晚期肝细胞癌的重要发展方向。靶向GPC3受体的靶向治疗有望改变目前晚期肝细胞癌治疗十分被动的局面。且随着对GPC-3与恶性肿瘤形成机制研究的深入，研究人员还发现其在多种恶性肿瘤，如肺鳞癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌、神经母细胞瘤、Wilm肉瘤、脂肪肉瘤、睾丸非精原细胞瘤、卵巢癌、黑素瘤等肿瘤中过表达。因此，开发靶向GPC3的多肽用于治疗/诊断GPC3特异性高表达的恶性肿瘤具有极高的应用价值。

参考文献：

Bhave,V.S.,et al.,Regulation of liver growth by glypican3,CD81,hedgehog,and Hhex.Am JPathol,2013.183(1):p.153-9.

Capurro,M.I.,et al.,Glypican-3inhibits Hedgehog signaling duringdevelopment by competingwithpatched for Hedgehog binding.Dev Cell,2008.14(5):p.700-11.

发明内容

本发明目的是提供一种靶向GPC3的多肽及其应用，该多肽靶向结合于肿瘤细胞中过表达的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)，在肿瘤分子诊断和靶向治疗中具有重要应用价值。

为实现上述目的，本发明一方面提供一种靶向GPC3的多肽或其药学上可接受的盐，所述多肽含有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中连续8个以上的氨基酸残基，并且，所述多肽包含25个以下的氨基酸残基，

GCINACSFLFPWGKEACAAECG(SEQ ID No.1)。

在一些实施方式中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

在一些实施方式中，本发明提供的靶向GPC3的多肽或其药学上可接受的盐的氨基酸序列与SEQ ID No.1的氨基酸序列具有至少70％或75％或80％或85％或90％或95％的序列同一性；优选的，具有95％的序列同一性。

第二方面，本发明提供了一种多肽衍生物，所述的多肽衍生物为第一方面中所述的多肽的修饰产物或经一个或多个氨基酸添加和/或替换后获得的变体。

优选地，所述多肽衍生物为SEQ ID No.1所示的多肽或其药学上可接受的盐经一个、两个或三个氨基酸添加和/或替换后获得的变体。

进一步优选地，所述多肽衍生物为SEQ ID No.1所示的多肽或其药学上可接受的盐经一个氨基酸添加和/或替换后获得的变体。

优选地，所述多肽衍生物为SEQ ID No.1所示的多肽或其药学上可接受的盐的N端或C端修饰产物，所述修饰基团选自乙酰基、氨基、烷基、芳香基、脂肪酸基、糖基、磷酸基、硫酸基、聚乙二醇(PEG)基团或肽类链接基团中的一种或多种。

进一步优选地，所述修饰选自：C端酰胺化封闭和/或N端修饰乙酰基。

本发明另一方面提供一种多核苷酸，所述多核苷酸编码上述的任一GPC3靶向多肽或多肽衍生物。

本发明另一方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的上述的GPC3靶向多肽或其药学上可接受的盐或多肽衍生物或多核苷酸及药物载体。

本发明另一方面提供权利上述的GPC3靶向多肽或其药学上可接受的盐、多肽衍生物、多核苷酸或药物制剂在制备用于预防、诊断和/或治疗与GPC3异常活化相关的癌症的药物中的用途。

优选地，所述癌症选自由以下组成的组：肝癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、肉瘤、结直肠癌、胆管细胞癌、脊索瘤、小肠癌、嗜铬细胞瘤、胃癌、肾癌、卵巢癌、膀胱癌、食道癌、头颈癌、胸腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、神经内分泌肿瘤、甲状腺癌、肠癌和骨转移等实体瘤。进一步地，所述癌症为肝癌。

1、本发明开发了一种新的GPC3的高亲和力的多肽，可用于靶向GPC3。利用GPC3在恶性肿瘤中高表达，可用于GPC3高表达的恶性肿瘤的预防、诊断和/或治疗。

2、这些多肽均为低分子量多肽，合成成本低廉，且这些多肽在GPC3细胞中内吞明显。如本文所用，“氨基酸”是指天然和非天然氨基酸。通过含前缀“L-”或“D-”(非手性的甘氨酸除外)的三字母代码来指明氨基酸的立体构型，例如，L型的氨基酸有：丙氨酸(“L-Ala”或“A”)、精氨酸(“L-Arg”或“R”)、天冬酰胺(“L-Asn”或“N”)、天冬氨酸(“L-Asp”或“D”)、半胱氨酸(“L-Cys”或“C”)、谷氨酰胺(“L-Gln”或“Q”)、谷氨酸(“L-Glu”或“E”)、甘氨酸(“Gly”或“G”)、组氨酸(“L-His”或“H”)、异亮氨酸(“L-Ile”或“I”)、亮氨酸(“L-Leu”或“L”)、赖氨酸(“L-Lys”或“K”)、甲硫氨酸(“L-Met”或“M”)、苯丙氨酸(“L-Phe”或“F”)、脯氨酸(“L-Pro”或“P”)、丝氨酸(“L-Ser”或“S”)、苏氨酸(“L-Thr”或“T”)、色氨酸(“L-Trp”或“W”)、酪氨酸(“L-Tyr”或“Y”)和缬氨酸(“L-Val”或“V”)。L-正亮氨酸和L-正缬氨酸可分别表示为(NLeu)和(NVal)。十九种天然存在的手性氨基酸具有相应的D-异构体，其通过含前缀“D-”的三字母代码来指明：丙氨酸(“D-Ala”或“a”)、精氨酸(“D-Arg”或“r”)、天冬酰胺(“D-Asn”或“a”)、天冬氨酸(“D-Asp”或“d”)、半胱氨酸(“D-Cys”或“c”)、谷氨酰胺(“D-Gln”或“q”)、谷氨酸(“D-Glu”或“e”)、组氨酸(“D-His”或“h”)、异亮氨酸(“D-Ile”或“i”)、亮氨酸(“D-Leu”或“l”)、赖氨酸(“D-Lys”或“k”)、甲硫氨酸(“D-Met”或“m”)、苯丙氨酸(“D-Phe”或“f”)、脯氨酸(“D-Pro”或“p”)、丝氨酸(“D-Ser”或“s”)、苏氨酸(“D-Thr”或“t”)、色氨酸(“D-Trp”或“w”)、酪氨酸(“D-Tyr”或“y”)和缬氨酸(“D-Val”或“v”)。

如本文所用，“肽”或“多肽”的含义是被本专业领域的技术人员所熟知的。通常情况下，肽或多肽是两个或多个氨基酸由酰胺键链接，酰胺键则由一个氨基酸的氨基与相邻氨基酸的羧基构成。本文所述的多肽可包含天然存在的氨基酸或者非天然存在的氨基酸。可被修饰成其类似物，衍生物，功能模拟物，伪肽等诸如此类包含至少两个氨基酸的化合物。

如本文所用，“药学上可接受的盐”或“可药用盐”是指本发明中所述的化合物的盐，这类盐用于哺乳动物体内时具有安全性和有效性，药学上可接受的盐的非限制性实例包括：盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、柠檬酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐、抗坏血酸盐、草酸盐、硝酸盐、梨酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、水杨酸盐、柠檬酸氢盐、酒石酸盐、马来酸盐、富马酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐。

附图说明

图1为SEQ ID No.1所示的多肽HPLC检测结果图；

图2为SEQ ID No.1所示的多肽MS检测结果图；

图3为SEQ ID No.1所示的多肽细胞内吞图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。在不脱离所附权利要求定义的本发明的精神和范围前提下，可对其在形式上和细节上作出各种变化。

本发明的多肽可以使用本领域技术人员所熟知的方法制备，包括众所周知的化学合成的方法。多肽可以在生物体中表达，并通过公知的纯化技术进行纯化。

实施例1多肽固相合成

本发明公开提供的多肽化合物及其衍生物采用固相合成的方法合成其直链前体，用DMSO氧化形成分子内两对二硫键。合成载体为Fmoc-Gly-Wang Resin树脂。合成过程中，首先将Fmoc-Gly-Wang Resin树脂在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中充分溶胀，然后该固相载体与活化后氨基酸衍生物重复缩合→洗涤→去保护Fmoc→洗涤→下一轮氨基酸缩合的操作以达到所要合成的多肽链长度，最后用三氟乙酸：水：三异丙基硅烷：苯甲硫醚(90：2.5：2.5：5，v：v：v：v)的混合溶液与树脂反应将多肽从固相载体上裂解下来，再由冷冻甲基叔丁基醚沉降后得到直链前体的固体粗品。切割后的直链前体粗品在弱碱性溶液中进行二硫键氧化得到目标多肽粗品。多肽粗品在0.1％三氟乙酸的乙腈/水的体系由C-18反相制备色谱柱纯化分离后得到多肽及其衍生物的纯品。

实验试剂

(1)SEQ ID No.1所示多肽的固相合成

SEQ ID No.1：GCINACSFLFPWGKEACAAECG

步骤1：偶联第一位氨基酸Fmoc-Gly-OH

将0.2mmol的2-Chlorotrityl chloride树脂在DCM中充分溶胀1h。称取Fmoc-Gly-OH(0.16mmol)和二异丙基乙胺(DIEA，0.64mmol)溶于8mL的DCM中并加入树脂中，在室温反应2h。反应完成后加入封闭液(10mL)DCM：甲醇：DIEA(85：10：5，v：v：v)室温10min进行封闭。封闭后的树脂用DCM洗5次，DMF洗5次。

步骤2：直链肽链合成

将步骤1中得到的树脂在DMF中充分溶胀1h。之后将依照的直链前体序列从羧基端第二位氨基酸到氨基端的顺序合成。每一个偶联周期进行如下：

20％哌啶/DMF(20％v/v，10mL)进行Fmoc-去保护两次，每次8min。

DMF冲洗树脂6-8次直到中性pH。

用DMF溶解0.5mmol的Fmoc-AA、0.5mmol的6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)和1mmol的4-甲基吗啉(NMM),加入树脂室温反应1h。

下一个氨基酸偶联之前用DMF冲洗树脂4-6次。

直链多肽合成后用DMF冲洗树脂5次，DCM冲洗树脂5次。树脂在真空中抽干。

步骤3：直链前体肽链切割

将新鲜配制的切割鸡尾酒(10mL)三氟乙酸：水：三异丙基硅烷：苯甲硫醚(90：2.5：2.5：5，v：v：v：v)加入到步骤1所得树脂中，在室温下振荡反应2小时。反应结束后将反应溶液过滤，并用三氟乙酸洗涤树脂，与反应溶液合并，用4倍体积冷MTBE沉淀得到粗品。用MTBE洗涤粗品3次，放入真空中抽干。

步骤4：多肽的纯化制备

经过0.45um膜过滤后用反相高效液相色谱系统进行分离，缓冲液为A(0.1wt％三氟乙酸，水溶液)和B(0.1wt％三氟乙酸，乙腈)。收集产物相关馏分，HPLC鉴定纯度后将纯度>95％的馏分合并，冻干，获得多肽纯品。

SEQ ID No.1所示的多肽HPLC、MS鉴定结果如图1、图2所示。

实施例2多肽样品与GPC3蛋白的亲和力

1.实验材料：

名称	厂家
		SeriesSSensorChipProteinA	Cytiva
RecombinantHumanGPC3(货号：CW66-1mg)	近岸

2.实验步骤：

用Biacore T200进行多肽与GPC3亲和力测试。使用ProteinA芯片在25℃捕获FAP蛋白约2000RU，以1×HBS，pH 7.4作为runningbuffer,在25℃进行结合实验，多肽分析物流速为30μL/min,Association 120s,dissociation 600s，选择单循环或者多浓度循环Kinetics/Affinity检测多肽样品与蛋白的结合，Gly-HCl pH＝1.5，30μL/min,30s进行芯片再生，数据用1:1结合模型进行拟合。

3.实验结果

表1多肽样品与GPC3蛋白的亲和力结果

结果表明，本发明所述的多肽与GPC3蛋白亲和力达到pm级别，亲和力高。

实施例3细胞内吞实验

实验材料：

细胞：HEK293-GPC3；阴性细胞：HEK293。

(1)主要试剂

(2)主要耗材

名称	生产品牌	货号	储存环境
				96WellTC-TreatedBlackMicroplates	Agilent	204626-100	RT

(3)细胞系

细胞系	培养基
		HEK293(阴性细胞)	DMEM+10％FBS+1％P.S
HEK293-GPC3(阳性细胞)	DMEM+10％FBS+1％P.S+0.75μg/mLPuromycin

实验步骤：

1、准备SA-Cy5稀释液：稀释比例1：50，稀释液：细胞生长培养基。

2、样品准备：从母液直接稀释到所需浓度(0.1～1μM)，稀释液：上述1准备好的SA-Cy5稀释液。室温避光预混1h。

3、加样：吸出孔中培养基，替换成对应浓度样品(0.1～1μM)，37℃，孵育2h。

4、固定：DPBS洗细胞3次，加入60μL/孔固定液，4℃，避光30min。

5、染核：DPBS洗细胞3次，加入40～50μL/孔DAPI染核液，37℃，避光20min。

6、实验结果。

实验结果如图1所示，本发明的多肽能够在高表达GPC3的细胞中通过细胞内吞进入细胞，序列对应的多肽具有良好的细胞内吞作用。

综上所述，上述结果证明了本发明的多肽具有靶向GPC3的靶向性，同时具有较好的高表达GPC3细胞穿透能力，能够实现微小肿瘤的高灵敏度活体成像，因而在实际应用中，本发明的多肽能够与抗癌药物或者显像剂结合，用于肿瘤的靶向治疗和成像。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种靶向GPC3的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种多肽衍生物，其特征在于，所述多肽衍生物为对权利要求1所述的多肽进行N端和/或C端修饰得到的产物，所述修饰选自N端乙酰基修饰和/或C端氨基修饰。

3.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述的多肽。

4.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含作为活性成分的权利要求1所述的多肽或权利要求2所述的多肽衍生物或权利要求3所述的多核苷酸。