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CN118894934A - 抗人il-15的抗体及其用途 - Google Patents

抗人il-15的抗体及其用途 Download PDF

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CN118894934A
CN118894934A CN202310498953.4A CN202310498953A CN118894934A CN 118894934 A CN118894934 A CN 118894934A CN 202310498953 A CN202310498953 A CN 202310498953A CN 118894934 A CN118894934 A CN 118894934A
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antibody
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万姝南
刘志刚
周晓巍
郝小勃
胡俊杰
刘玉兰
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Beijing Wisdomab Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Beijing Wisdomab Biotechnology Co ltd
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Abstract

本申请公开了结合人IL‑15的抗体，编码所述抗体的核酸分子、包含所述核酸分子的载体、包含所述核酸分子或载体的宿主细胞、制备和纯化所述抗体的方法及所述抗体的应用。

Description

抗人IL-15的抗体及其用途
技术领域
本申请大体涉及基因工程和抗体药物领域；具体而言，涉及结合人IL-15的抗体及其用途。
背景技术
IL-15基因位于人类染色体4q31上，由九个(1-8和4A)外显子和八个内含子组成，其中4个外显子(5至8)编码成熟蛋白质。IL-15蛋白表达有局限性，在转录翻译过程中受到严格调节，主要表达于单核细胞/巨噬细胞和树突状细胞[1]。IL-15是一种四α螺旋束细胞因子，IL-15受体由IL-15Rα、IL-2Rβ和γc组成，其中IL-15Rα为IL-15独有，IL-2Rβ是IL-2和IL-15的共受体，γc(CD132)是许多细胞因子包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-21的共同受体。IL-15Rα与IL-15结合后形成高亲和力的稳定复合物，后递呈给激活的T细胞或NK细胞上的IL-2Rβ和γc，形成高亲和力免疫突触[2]。由于共享受体亚单位(IL-2Rβ和γc)，IL-2和IL-15触发几个类似的下游信号通路，包括Janus激酶(JAK)信号转导蛋白和转录激活蛋白(STAT)，发挥增殖、抑制凋亡的生理功能。
白癜风是一种慢性自身免疫性疾病，其特征是皮肤色素脱失，皮肤或粘膜上出现不同形状和大小的白色斑块，这是由产色素细胞-黑色素细胞丢失破坏引起，影响美容美观。白癜风影响全球约0.5％-2.0％的人口，两性之间无显著差异，不同地理区域的发生率不同。白癜风分为节段型白癜风、非节段型白癜风和混合型。其中非节段型白癜风在30岁以下年轻人中占比约87％，表现为双侧对称，全身分布[3]。
J.M Richmond研究组发现，在皮肤组织中存在一种CD8+记忆性组织驻留T细胞TRm，TRm形成后可在组织中停留至少半年且在炎症环境中增加。对白癜风患者病变皮肤进行活检证实，病变组织中存在大量的活跃的TRm[4]。白癜风常在同一位置复发，提示TRm在疾病进展中起重要作用。IL-15是维持TRm长期存活所必需的细胞因子，IL-15与TRm细胞表面的受体结合，维持TRm存活并刺激TRm分泌IFN-γ/颗粒酶/穿孔素，杀伤黑色素细胞。同时IFN-γ还可以激活下游JAK-STAT通路，使皮肤角质细胞分泌CXCL9和CXCL10，招募更多的黑色素细胞特异性CD8+T细胞，通过正反馈循环增加炎症[5]。IL-15是潜在的治疗白癜风药物的新靶点。
因此，开发针对IL-15的功能性抗体对于治疗IL-15介导的疾病具有重要的意义。
发明概述
第一方面，本申请提供了结合人IL-15的抗体，其包含含HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列的重链可变区以及含LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列的轻链可变区，其中
所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:27所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQID NO:34所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示以及所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示；
所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:27所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQID NO:37所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示以及所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示；
所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:27所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQID NO:37所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示以及所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示；
所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:32所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQID NO:40所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示以及所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示；或者
所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:45所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQID NO:47所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:48所示以及所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示；
其中，HCDR和LCDR的氨基酸序列根据Kabat定义。
在第一方面的一些实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:13、19、21、22或43所示。
在第一方面的一些实施方案中，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:14、20、23或44所示。
在第一方面的一些实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:13所示，以及所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示，以及所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示；
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示，以及所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示；
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示，以及所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示；或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示，以及所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示。
第二方面，本申请提供了结合人IL-15的抗体，其中所述抗体的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:13、19、21、22和43中任一项具有至少90％的同一性，并且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:14、20、23和44中任一项具有至少90％的同一性。
在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体为全抗体、Fab片段、F(ab’)2片段或单链Fv片段(scFv)；和/或
所述抗体为单克隆抗体；和/或
所述抗体还包含选自IgG1亚型、IgG2亚型或IgG4亚型的重链恒定区；和/或
所述Fc片段的第234、235和331位的氨基酸分别为F、E和S；和/或
所述重链恒定区的第252、254和256位的氨基酸分别为Y、T和E；和/或
所述抗体还包含选自κ亚型或者λ亚型的轻链恒定区；
其中，抗体恒定区氨基酸位置按照EU numbering确定。
在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体结合人IL-15和/或猴IL-15；和/或所述抗体能够抑制IL-15的活性。
第三方面，本申请提供了核酸分子，其编码第一方面或第二方面所述的抗体。
第四方面，本申请提供了药物组合物，其包含第一方面或第二方面所述的抗体以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
第五方面，本申请提供了第一方面或第二方面所述的抗体、或第四方面所述的药物组合物在制备用于预防或治疗IL-15介导的疾病的药物中的用途。
第六方面，本申请提供了预防或治疗IL-15介导的疾病的方法，其包括向有需要的个体给予第一方面或第二方面所述的抗体、或第四方面所述的药物组合物。
附图说明
图1显示了抗人IL-15单克隆抗体与不同种属IL-15的结合能力。
图2显示了抗人IL-15单克隆抗体的表位分析结果。其中，图2A显示了抗人IL-15单克隆抗体阻断AMG714纯化噬菌体和人IL-15的结合结果；图2B展示了抗人IL-15单克隆抗体阻断CALY-002纯化噬菌体和人IL-15的结合结果。
图3显示了抗人IL-15单克隆抗体在HEK-blue IL-2细胞上的活性结果。
图4显示了抗人IL-15单克隆抗体在NK-92细胞上的活性结果。
序列说明
SEQ ID NO:1显示了人(homo sapiens)IL-15胞外区(hIL-15)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2显示了人(homo sapiens)IL-15Ra胞外区(hIL-15Ra)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3显示了食蟹猴(Macaca fascicularis)IL-15胞外区(mfIL-15)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4显示了食蟹猴(Macaca fascicularis)IL-15Ra胞外区(mfIL-15Ra)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5显示了鼠(Mus musculus)IL-15胞外区(mIL-15)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6显示了鼠(Mus musculus)IL-15Ra胞外区(mIL-15Ra)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7显示了His标签(His)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8显示了鼠抗体IgG1的Fc段(mFc1)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9显示了人(homo sapiens)IgG1亚型重链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10显示了人IgG1m3亚型重链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11显示了人(homo sapiens)κ亚型轻链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:12显示了人(homo sapiens)λ亚型轻链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:13显示了抗人IL-15单克隆抗体R1A3的重链可变区R1A3VH的氨基酸序列。
SEQ ID NO:14显示了抗人IL-15单克隆抗体R1A3的轻链可变区R1A3VK的氨基酸序列。
SEQ ID NO:15显示了抗人IL-15单克隆抗体AMG714的重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:16显示了抗人IL-15单克隆抗体AMG714的轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:17显示了抗人IL-15单克隆抗体CALY-002的重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:18显示了抗人IL-15单克隆抗体CALY-002的轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:19显示了抗人IL-15单克隆抗体R4G4VH+R22F11VK的重链可变区R4G4VH的氨基酸序列。
SEQ ID NO:20显示了抗人IL-15单克隆抗体R4G4VH+R22F11VK和R2H2VH+R22F11VK的轻链可变区R22F11VK的氨基酸序列。
SEQ ID NO:21显示了抗人IL-15单克隆抗体R2H2VH+R22F11VK的重链可变区R2H2VH的氨基酸序列。
SEQ ID NO:22显示了抗人IL-15单克隆抗体R26H10的重链可变区R26H10VH的氨基酸序列。
SEQ ID NO:23显示了抗人IL-15单克隆抗体R26H10的轻链可变区R26H10VK的氨基酸序列。
SEQ ID NO:24显示了引物PmCGR的核苷酸序列。
SEQ ID NO:25显示了引物PmCKR的核苷酸序列。
SEQ ID NO:26显示了重链可变区R1A3VH、R4G4VH和R2H2VH的HCDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:27显示了重链可变区R1A3VH、R4G4VH和R2H2VH的HCDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:28显示了重链可变区R1A3VH的HCDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:29显示了重链可变区R4G4VH的HCDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:30显示了重链可变区R2H2VH的HCDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:31显示了重链可变区R26H10VH和R6E11VH的HCDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:32-33分别显示了重链可变区R26H10VH的HCDR2和HCDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:34-36分别显示了轻链可变区R1A3VK的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列
SEQ ID NO:37-39分别显示了轻链可变区R22F11VK的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:40-42分别显示了轻链可变区R26H10VK的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:43显示了抗人IL-15单克隆抗体R6E11的重链可变区R6E11VH的氨基酸序列。
SEQ ID NO:44显示了抗人IL-15单克隆抗体R6E11的轻链可变区R6E11VK的氨基酸序列。
SEQ ID NO:45-46分别显示了重链可变区R6E11VH的HCDR2和HCDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：47-49分别显示了轻链可变区R6E11VK的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:50显示了DP47抗体的重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:51显示了DP47抗体的轻链可变区的氨基酸序列。
发明详述
本申请的发明人通过抗体工程技术得到了新的抗人IL-15的抗体。在本申请的多个方面，提供了新的抗人IL-15的抗体，编码所述抗体的核酸分子、包含所述核酸分子的载体、包含所述核酸分子或载体的宿主细胞、制备和纯化所述抗体的方法及所述抗体的医学和生物学应用。根据本申请提供的抗体的可变区的氨基酸序列，可构建全长的抗体分子作为药物用于预防或治疗人IL-15介导的疾病。
除非另外指明，本申请的实施采用本领域常规的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学以及免疫学技术。
除非另外指明，本申请中所用的术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。
定义
如本文所用术语“抗体”是指能够经由至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区中的抗原识别位点特异性结合到靶标的免疫球蛋白分子。靶标包括但不限于碳水化合物、多聚核苷酸、脂质、多肽等。本文所使用的“抗体”不仅包括完整的(即全长的)抗体，而且还包括其抗原结合片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、其变异体、包含抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、双抗体、线性抗体、单链抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)及任何其他包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的修改配置，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体及共价修饰的抗体。
通常，完整或全长的抗体包含两个重链和两个轻链。每个重链含有重链可变区(VH)和第一、第二及第三恒定区(CH1、CH2及CH3)。每个轻链含有轻链可变区(VL)和恒定区(CL)。全长的抗体可以是任何种类的抗体，例如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或上述的子类)，但抗体不需要属于任何特定的类别。根据重链恒定结构域的抗体氨基酸序列，可以将免疫球蛋白指定为不同的类别。通常，免疫球蛋白有五种主要的类别：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，而且这些类别中有几个可以再被进一步区分成子类(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。对应于不同免疫球蛋白类别的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ、以及μ。不同类别的免疫球蛋白的子单元结构和三维结构是公知的。
如本文所用术语“抗原结合片段或抗原结合部分”是指负责结合抗原的完整抗体分子的一部分或区域。抗原结合域可以包含重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)或上述两者。VH和VL中的每个通常含有三个互补决定区CDR1、CDR2及CDR3。
本领域技术人员公知，互补决定区(CDR，通常有CDR1、CDR2及CDR3)是可变区中对抗体的亲和力和特异性影响最大的区域。VH或VL的CDR氨基酸序列有两种常见的定义方式，即Chothia定义和kabat定义。参阅例如Kabat,“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”，National Institutes of Health,Bethesda，Md.(1991)7；A1-Lazikani等人，J.Mol.Biol.273:927-948(1997)8；以及Martin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:9268-9272(1989)9。对于给定抗体的可变区氨基酸序列，可以根据Chothia定义或者Kabat定义来确定VH和VL氨基酸序列中的CDR氨基酸序列。在本申请的实施方案中，利用Kabat定义CDR氨基酸序列。
对于给定抗体的可变区氨基酸序列，可以通过多种方式分析可变区氨基酸序列的中CDR氨基酸序列，例如可以利用在线软件Abysis确定(http://www.abysis.org/)。
抗原结合片段的实例包括但不限于：(1)Fab片段，其可以是具有VL-CL链和VH-CH1链的单价片段；(2)F(ab’)2片段，其可以是具有两个Fab’片段的二价片段，该两个Fab’片段由铰链区的二硫桥(即Fab’的二聚物)连接；(3)具有抗体的单臂的VL和VH域的Fv片段；(4)单链Fv(scFv)，其可以是由VH结构域和VL结构域经由胜肽连接符组成的单一多胜肽链；以及(5)(scFv)2，其可以包含两个由胜肽连接符连接的VH结构域和两个VL结构域，该两个VL结构域是经由二硫桥与该两个VH结构域组合。
如本文所用术语“特异性结合”是指两个分子之间的非随机结合反应，例如抗体至抗原表位的结合。
如本文所用术语“单克隆抗体”是指由基本同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能在少量个体中存在自然发生的突变以外，组成群体的各个抗体是相同的。
如本文所用术语“人源化抗体”是指抗体的恒定区部分(即CH和CL区)或抗体全部由人类抗体基因所编码。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。人源化抗体包括嵌合抗体、改型抗体和全人源化抗体等。
第一方面，本申请提供了结合人IL-15的抗体，其包含含HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列的重链可变区以及含LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列的轻链可变区，其中
所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:27所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQID NO:34所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示以及所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示；
所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:27所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQID NO:37所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示以及所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示；
所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:27所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQID NO:37所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示以及所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示；
所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:32所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQID NO:40所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示以及所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示；或者
所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:45所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQID NO:47所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:48所示以及所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示；
其中，HCDR和LCDR的氨基酸序列根据Kabat定义。
在第一方面的一些实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:13所示。
在第一方面的一些实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:19所示。
在第一方面的一些实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:21所示。
在第一方面的一些实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:22所示。
在第一方面的一些实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:43所示。
在第一方面的一些实施方案中，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:14所示。
在第一方面的一些实施方案中，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:20所示。
在第一方面的一些实施方案中，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:23所示。
在第一方面的一些实施方案中，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:44所示。
在第一方面的一些实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:13所示，以及所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。
在第一方面的一些实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:19所示，以及所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。
在第一方面的一些实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:21所示，以及所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。
在第一方面的一些实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:22所示，以及所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示。
在第一方面的一些实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:43所示，以及所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示。
第二方面，本申请提供了结合人IL-15的抗体，其中所述抗体的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:13、19、21、22和43中任一项具有至少90％的同一性，并且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:14、20、23和44中任一项具有至少90％的同一性。
在第二方面的一些实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列与SEQ IDNO:13、19、21、22和43中任一项具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。
在第二方面的一些实施方案中，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ IDNO:14、20、23和44中任一项具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。
在第二方面的一些实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列与SEQ IDNO:13、19、21、22和43中任一项所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。
在第二方面的一些实施方案中，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ IDNO:14、20、23和44中任一项所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。
在第二方面的一些实施方案中，SEQ ID NO:13、19、21、22和43中任一项所示的氨基酸序列的C端或N端区域还可以被截短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，而仍然保持类似的所述抗体的重链可变区的功能。
在第二方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO:13、19、21、22和43中任一项所示的氨基酸序列的C端或N端区域添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，得到的氨基酸序列仍然保持类似的所述抗体的重链可变区的功能。
在第二方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO:13、19、21、22和43中任一项所示的氨基酸序列的C端或N端以外的区域添加或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，只要改变后的氨基酸序列基本上保持类似的所述抗体的重链可变区的功能。
在第二方面的一些实施方案中，SEQ ID NO:14、20、23和44中任一项所示的氨基酸序列的C端或N端区域还可以被截短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，而仍然保持类似的所述抗体的轻链可变区的功能。
在第二方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO:14、20、23和44中任一项所示的氨基酸序列的C端或N端区域添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，得到的氨基酸序列仍然保持类似的所述抗体的轻链可变区的功能。
在第二方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO:14、20、23和44中任一项所示的氨基酸序列的C端或N端以外的区域添加或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，只要改变后的氨基酸序列基本上保持类似的所述抗体的轻链可变区的功能。
在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体为全抗体、Fab片段、F(ab’)2片段或单链Fv片段(scFv)。
在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体为全人源抗体或人源化抗体。
在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体为单克隆抗体。
在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体还包含选自IgG1亚型、IgG2亚型或IgG4亚型的重链恒定区。
在第一方面和第二方面的一些具体实施方案中，所述重链恒定区为IgG1亚型，例如IgG1m3亚型。
在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述Fc片段的第234、235和331位的氨基酸分别为F、E和S；其中，抗体恒定区氨基酸位置按照EU numbering确定。
在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述重链恒定区的第252、254和256位的氨基酸分别为Y、T和E；其中，抗体恒定区氨基酸位置按照EU numbering确定。
在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体还包含选自κ亚型或者λ亚型的轻链恒定区。
在第一方面和第二方面的一些具体实施方案中，所述抗体还包含选自κ亚型的轻链恒定区。
在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体结合人IL-15。
在第一方面和第二方面的一些具体实施方案中，所述抗体结合重组人IL-15(SEQID NO:1)。
在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体结合猴IL-15。
在第一方面和第二方面的一些具体实施方案中，所述抗体结合重组猴IL-15(SEQID NO:3)。
在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体结合IL-15和IL-15α的复合物，例如人IL-15和人IL-15α的复合物、或猴IL-15和猴IL-15α的复合物。
在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体能够抑制IL-15的活性。
在第一方面和第二方面的一些具体实施方案中，所述抗体抑制IL-15诱导分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)分泌的能力。
在第一方面和第二方面的一些具体实施方案中，所述抗体抑制IL-15诱导NK92细胞增殖的能力。
在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体不结合鼠IL-15，例如重组鼠IL-15(SEQ ID NO:5)。
第三方面，本申请提供了核酸分子，其编码第一方面或第二方面所述的抗体。
在第三方面的一些实施方案中，所述核酸分子可以包括DNA分子及RNA分子。所述核酸分子可以为单链或双链，且可为cDNA。
在第三方面的一些实施方案中，所述核酸分子可操作地连接到调控氨基酸序列，调控氨基酸序列可以被用所述载体转化过的宿主细胞识别。
第四方面，本申请提供了药物组合物，其包含第一方面或第二方面所述的抗体以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
在第四方面的一些实施方案中，所述药物组合物用于预防或治疗IL-15介导的疾病。
在第四方面的一些实施方案中，所述IL-15介导的疾病选自：白癜风、乳糜泻、嗜酸性食道炎和大颗粒淋巴细胞白血病。
在第四方面的一些实施方案中，所述药物组合物还可以包含下述中的一种或多种：润滑剂，如滑石粉、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化剂；悬浮剂；防腐剂，如苯甲酸、山梨酸和丙酸钙；增甜剂和/或调味剂等。
在第四方面的一些实施方案中，可将本申请中的药物组合物配制为片剂、丸剂、粉剂、锭剂、酏剂、悬液、乳剂、溶液、糖浆、栓剂或胶囊等形式。
在第四方面的一些实施方案中，可以利用任何生理上可接受的给药方式递送本申请的药物组合物，这些给药方式包括但不限于：口服给药、肠胃外给药、经鼻给药、直肠给药、腹膜内给药、血管内注射、皮下给药、经皮给药、吸入给药等。
在第四方面的一些实施方案中，可以通过混合具有所需纯度的试剂与视情况的药学上可接受的载体、赋形剂等，以冻干制剂或水溶液的形式配制用于治疗用途的药物组合物用于存储。
第五方面，本申请提供了第一方面或第二方面所述的抗体、第四方面所述的药物组合物在制备用于预防或治疗IL-15介导的疾病的药物中的用途。
在第五方面的一些实施方案中，所述IL-15介导的疾病选自：白癜风、乳糜泻、嗜酸性食道炎和大颗粒淋巴细胞白血病。
第六方面，本申请提供了预防或治疗IL-15介导的疾病的方法，其包括向有需要的个体给予第一方面或第二方面所述的抗体，或第四方面所述的药物组合物。
在第六方面的一些实施方案中，所述IL-15介导的疾病选自：白癜风、乳糜泻、嗜酸性食道炎和大颗粒淋巴细胞白血病。
在其他方面，本申请还提供了包含所述核酸分子的载体、包含所述核酸分子或所述载体的宿主细胞以及产生所述抗体的方法。在一些实施方案中，产生抗体的方法包括培养宿主细胞以便于表达核酸。在一些实施方案中，产生抗体的方法还包括从宿主细胞培养基中回收抗体。
应当理解，以上详细描述仅为了使本领域技术人员更清楚地了解本申请的内容，而并非意图在任何方面加以限制。本领域技术人员能够对所述实施方案进行各种改动和变化。
实施例
以下实施例仅用于说明而非限制本申请范围的目的。
实施例1：重组蛋白的制备
制备和鉴定IL-15特异性抗体的过程中需要用到多种不同的重组蛋白，包括人IL-15(hIL15，SEQ ID NO:1)和人IL-15Rα(hIL-15Rα，SEQ ID NO:2)共同表达组成的超级激动剂、猴IL-15(mfIL-15，SEQ ID NO:3)和猴IL-15Rα(mfIL-15Rα，SEQ ID NO:4)共同表达组成的超级激动剂、鼠IL-15(mIL-15，SEQ ID NO:5)和鼠IL-15Rα(mIL-15Rα，SEQ ID NO:6)共同表达组成的超级激动剂。在IL-15Rα的C端添加His标签(His，SEQ ID NO:7)，或者小鼠抗体IgG1的Fc段(mFc1，SEQ ID NO:8)，有利于重组蛋白的纯化和功能鉴定。在制备重组抗体时，抗体重链恒定区可以是人IgG1亚型(SEQ ID NO:9)或者选定的人IgG1亚型的各种突变体，如IgG1m3(SEQ ID NO:10)；轻链恒定区可以是人κ亚型(SEQ ID NO：11)或者人λ亚型(SEQID NO:12)。
根据Uniprot数据库中重组蛋白的氨基酸序列，设计并合成上述各种重组蛋白的基因(包含His或者mFc1标签)。利用常规的分子生物学技术将合成的各种重组蛋白基因克隆至合适的真核表达载体(如Invitrogen公司的pcDNA3.1等)，然后利用脂质体(如Invitrogen公司的293fectin等)或者其他阳离子转染试剂(如PEI等)将制备的重组蛋白表达质粒转染入HEK293细胞(如Invitrogen公司的HEK293F)，在无血清悬浮培养条件下培养3-4天。然后通过离心等方式收获培养上清。
利用金属螯合亲和层析柱(如GE公司的HisTrap FF等)对培养上清中的His标签融合表达的重组蛋白进行一步纯化。用ProteinA/G亲和层析柱(如GE公司的Mabselect SURE等)对抗体和Fc融合表达的重组蛋白进行一步纯化。然后利用脱盐柱(如GE公司的Hitrapdesaulting等)将重组蛋白保存缓冲液置换为PBS(pH7.0)或者其他合适的缓冲液。过滤除菌后，分装保存于-20℃备用。
实施例2：从全人源Fab噬菌体文库中筛选抗hIL-15单克隆抗体
2.1全人源Fab库的筛选
以实施例1制备的重组人IL-15+IL-15Rα超级激动剂为抗原，利用固相筛选策略(实验方案参考噬菌体展示：通用实验指南，(美)克拉克森(Clackson,T.)，(美)洛曼(Lowman,H.B.)编；马岚等译，化学工业出版社，2008.5)[6]筛选制备的全人源Fab噬菌体文库(参见中国专利申请第202210871809.6号)[7]。通过结合、洗脱、中和、感染、扩增的方式共进行了3轮筛选，最终获得1株特异性结合人IL-15的单克隆抗体R1A3(重链可变区R1A3VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；轻链可变区R1A3VK的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示)。
利用常规分子生物学手段，将R1A3制备成IgG1m3亚型全抗体，同时参照美国专利第US7153507B2号[8]，合成AMG714的重链可变区(SEQ ID NO:15)和轻链可变区(SEQ ID NO:16)，制备成IgG1m3亚型全抗体AMG714用于对照研究。同理，参照美国专利第US10301384B2号[9]，合成CALY-002的重链可变区(SEQ ID NO:17)和轻链可变区(SEQ ID NO:18)，制备成IgG1m3亚型全抗体CALY-002用于对照研究。
2.2抗人IL-15单克隆抗体R1A3的亲和力分析
利用Biacore T200通过表面等离子共振技术测定抗IL-15单克隆抗体的亲和力。氨基偶联试剂盒(BR-1000-50)、人抗体捕获试剂盒(BR-1008-39)、S系列CM5芯片(14100530)和pH 7.4的10×HBS-EP(BR100669)等相关试剂和耗材均购自GE healthcare。依照试剂盒中的说明书，用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide，NHS)对羧基化CM5芯片表面进行活化，将抗人IgG(Fc)抗体(捕获抗体)用10mM乙酸钠(pH 5.0)稀释至25μg/mL，之后以流速10μL/min注射以实现大约10000个响应单位(RU)的偶联量。注射捕获抗体之后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，稀释抗IL-15单克隆抗体至1μg/mL，10μL/min注射，保证200RU左右的抗体被抗人Fc的抗体捕获。然后将IL-15+IL-15Rα复合物设置一系列的浓度梯度(例如1.23nM、3.7nM、11.1nM、33.3nM和100nM)，以流速30μL/min从低浓度到高浓度进行注射，结合时间为90s，解离时间为1200s，以流速10μL/min注射3M MgCl2共30s对芯片表面进行再生。使用BiacoreT200评估软件第3.2.1版，通过1:1结合模型拟合结合和解离传感图来计算结合速率(Ka)和解离速率(Kd)。以比率Kd/Ka计算解离平衡常数(KD)。拟合结果如表1所示。表1.抗人IL-15单克隆抗体结合人IL-15(IL-15+IL-15Rα复合物)的亲和力常数
Ka(M-1s-1) Kd(s-1) KD(M)
AMG714 1.679E+6 1.219E-3 7.259E-10
CALY-002 1.337E+6 3.190E-4 2.386E-10
R1A3 1.410E+6 5.371E-4 3.810E-10
实施例3：R1A3突变体的制备
3.1 R1A3重组突变库的制备
利用常规分子生物学手段，通过在重链可变区R1A3VH的CDR3中引入突变，构建基于R1A3VH的CDR3突变库，设计的突变方案如表2所示，构建库容为2E+7，正确率为82％。
表2基于R1A3VH的CDR3突变库的突变方案
初始氨基酸 设计氨基酸 简并密码子
G G、V、A或D GNT
G G、V、A或D GNT
H H、Q、N、K、D或E VAM
W W TGG
N H、Q、N、K、D或E VAM
A C、Y、S、A、D或G KVT
F F、S、Y、I、N或T WHT
D D、E、N、K、H或Q VAM
F F、S、Y、I、N或T WHT
3.2 R1A3重组突变库的筛选
基于重组库噬菌体呈现系统(参见中国专利申请第202210871809.6号的实施例1)，将制备的R1A3重链突变库和全人源轻链抗体库进行重组，构建重组Fab突变库。以实施例1制备的重组人IL-15+IL-15Rα超级激动剂为抗原，利用固相筛选策略(实验方案参考噬菌体展示：通用实验指南，(美)克拉克森(Clackson,T.)，(美)洛曼(Lowman,H.B.)编；马岚等译，化学工业出版社，2008.5)筛选制备的重组Fab突变库，通过结合、洗脱、中和、感染、扩增的方式共进行了3轮筛选，最终得到抗人IL15单克隆抗体R4G4VH+R22F11VK(重链可变区R4G4VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示；轻链可变区R22F11VK的氨基酸序列如SEQ IDNO:20所示)和R2H2VH+R22F11VK(重链可变区R2H2VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示；轻链可变区R22F11VK的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示)。
3.3 R1A3突变体亲和力分析
参照实施例2.2，使用Biacore T200对抗人IL-15单克隆抗体R1A3及其突变体亲和力进行分析，结果见表3。
表3.抗人IL-15单克隆抗体R1A3及其突变体结合人IL-15(IL-15+IL-15Rα复合物)的亲和力常数
Ka(M-1s-1) Kd(s-1) KD(M)
R4G4VH+R22F11VK 8.377E+5 2.898E-4 3.459E-10
R2H2VH+R22F11VK 7.910E+5 2.994E-4 3.786E-10
R1A3 1.555E+6 5.481E-4 3.525E-10
AMG714 1.775E+6 1.110E-3 6.249E-10
实施例4：从鼠免疫库筛选鼠抗人IL-15单克隆抗体
4.1hIL-15小鼠免疫库的制备
以实施例1中制备的重组蛋白hIL-15+hIL-15Rα和mfIL-15+mfIL-15Rα超级激动剂为抗原，免疫6-8周龄的BALB/c小鼠，免疫剂量为50μg/只小鼠，每14天加强免疫1次，初免后8周处死小鼠并收集脾细胞。使用小鼠淋巴细胞分离液(达科为生物技术股份有限公司，CAT#DKW33-R0100)对小鼠脾脏淋巴细胞进行分离，利用细胞总RNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，CAT#DP430)，将分离的淋巴细胞进行总RNA的提取。以提取的总RNA为模板，利用第一链cDNA合成试剂盒(Thermo scientific，CAT#K1621)分别合成抗体重链可变区和轻链可变区，反转录引物采取基因特异性引物，引物配对区分别位于抗体重链恒定区和抗体轻链恒定区，具体序列分别为PmCGR:TGCATTTGAACTCCTTGCC(SEQ ID NO:24)和PmCKR:CCATCAATCTTCCACTTGAC(SEQ ID NO:25)。将合成的cDNA立即存放于-70℃保存备用。然后以反转录得到的cDNA为模板，参考文献(Krebber A,Bornhauser S,Burmester J,etal.,Reliable cloning of functional antibody variable domains from hybridomasand spleen cell repertoires employing a reengineered phage display system.JImmunol Methods.1997；201(1):35-55[10]，通过引用方式将上述文献的全部内容并入本文中)合成引物，并利用PCR分别扩增编码鼠抗体VH和VK的核苷酸序列，然后分别克隆至重组质粒pHGDisn-attP-new和pHKb-attB-new(重组质粒的制备方法请参见中国专利申请第202210871809.6号的实施例1)。
将制备的PHGDisn-attP-new-mVHs重链库(库容6.1E+7，正确率63％)和PHKb-attB-new-mVKs轻链库(库容7.4E+7，正确率78％)进行重组(参见中国专利申请第202210871809.6号的实施例1)，制备小鼠重组噬菌体文库，构建库容达到2.7E+11，测序正确率为60％。
4.2 hIL-15小鼠免疫库的筛选
以实施例1制备的重组人IL-15+IL-15Rα和猴IL-15+IL-15Rα超级激动剂为抗原，利用固相筛选策略(实验方案参考噬菌体展示：通用实验指南，(美)克拉克森(Clackson,T.)，(美)洛曼(Lowman,H.B.)编；马岚等译，化学工业出版社，2008.5)筛选制备的小鼠重组噬菌体文库。通过结合、洗脱、中和、感染、扩增的方式共进行了3轮筛选，最终获得1株特异性结合人IL-15的鼠单克隆抗体R6E11(重链可变区R6E11VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示；轻链可变区R6E11VK的氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示)。
4.3鼠抗人IL-15单克隆抗体R6E11亲和力分析
参照实施例2.2，使用Biacore T200对抗IL-15单克隆抗体R6E11亲和力进行分析，结果见表4。
表4.鼠抗人IL-15抗体R6E11结合人IL-15(IL-15+IL-15Rα复合物)的亲和力常数
Ka(M-1s-1) Kd(s-1) KD(M)
R6E11 3.873E+5 2.668E-4 6.890E-10
AMG714 1.286E+6 7.033E-4 5.467E-10
CALY-002 1.030E+6 2.074E-4 2.013E-10
实施例5：鼠单克隆抗体R6E11的人源化
5.1R6E11的人源化
对鼠源单克隆抗体R6E11进行人源化以降低其免疫原性。人源化方案采取经典的框架移植策略(J Immunol，2002Jul 15；169(2)：1119-25)[11]。将R6E11的重链可变区和轻链可变区分别与IMGT数据库中的人抗体胚系基因序列相比较，选择合适的胚系基因序列以提供抗体的框架区1至3(FR1+FR2+FR3)，选择合适的J区基因序列以提供框架区4(FR4)。这个模板可以根据多种因素选出，例如抗体的相对总长度、CDR的大小、位于抗体框架区(FR)和超变区(CDR)之间连接处的氨基酸残基、序列整体的同源性等。所选的模板可以是多个序列的混合物或者可以是共有模板，目的是尽可能维持亲本互补决定区(CDR)的合适构象。最终得到了1个人源化突变体的重链可变区突变体R6E11VH-h3和1个人源化的轻链可变区突变体R6E11VK-h3。
5.2人源化R6E11突变体的筛选
鉴于人源化突变体R6E11VH-h3+R6E11VK-h3的重链序列中包含脱氨基位点NG和NA，对R6E11VH-h3进行突变设计以改善其理化性质，突变方案如表5所示。构建库容为2E+7，正确率为47％。
表5基于R6E11VH-h3突变库的突变方案
基于重组库噬菌体呈现系统(参见中国专利申请第202210871809.6号的实施例1)，将制备的R6E11VH-h3突变库和全人源轻链抗体库进行重组，构建重组Fab突变库。通过固相筛选的方法，利用人IL-15+IL-15Rα超级激动剂抗原对构建的重组Fab突变库共进行3轮筛选富集，最终得到理化性质改善的包含全人源轻链的单克隆抗体R26H10(重链可变区R26H10VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示；轻链可变区R26H10VK的氨基酸序列如SEQ IDNO:23所示)。
5.3 R6E11人源化突变体亲和力分析
参照实施例2.2，使用Biacore T200对抗人IL-15鼠单克隆抗体R6E11及其人源化突变体进行了亲和力分析，结果见表6。
表6.抗人IL-15鼠单克隆抗体R6E11及其人源化突变体结合人IL-15(IL-15+IL-15Rα复合物)的亲和力常数
Ka(M-1s-1) Kd(s-1) KD(M)
R6E11 4.059E+5 3.989E-4 9.828E-10
R26H10 2.522E+5 3.077E-4 1.220E-9
实施例6：抗人IL-15单克隆抗体与不同种属IL-15的结合及亲和力分析
将制备的人IL-15(hIL-15+hIL-15Rα-His复合物)、食蟹猴IL-15(mfIL-15+mfIL-15Rα-His复合物)和小鼠IL-15(mIL-15+mIL-15Rα-mFc1复合物)分别包被于96孔ELISA板，1μg/mL，100μL/孔，4℃包被过夜。利用封闭液(3％脱脂乳-PBST)在37℃封闭1小时后，分别加入各抗IL-15单克隆抗体，37℃结合1小时。PBST洗涤ELISA板，加入HRP小鼠抗人IgG(北京博奥森生物技术有限公司，bsm-0297M-HRP)，37℃结合1小时。PBST洗涤ELISA板，加入OPD底物显色液，5-10分钟后用1M的H2SO4终止显色，酶标仪492nm/630nm双波长测定光密度值。ELISA分析结果(图1)显示，抗人IL-15抗体R1A3、R2H2VH+R22F11VK、R4G4VH+R22F11VK和R26H10都交叉识别人IL-15和食蟹猴IL-15，所有分子都不识别小鼠IL-15。
参考实施例2.2，使用Biacore T200分析抗人IL-15单克隆抗体结合人IL-15和食蟹猴IL-15的亲和力，结果如表7和表8所示。
表7抗人IL-15单克隆抗体结合人IL-15(hIL-15+hIL-15Rα复合物)的亲和力常数
Ka(M-1s-1) Kd(s-1) KD(M)
R1A3 6.209E+5 3.801E-4 6.122E-10
R2H2VH+R22F11VK 3.570E+5 2.036E-4 5.703E-10
R4G4VH+R22F11VK 4.495E+5 1.956E-4 4.351E-10
R26H10 2.083E+5 2.358E-4 1.132E-9
AMG714 5.123E+5 7.616E-4 1.487E-9
CALY-002 6.969E+5 2.352E-4 3.374E-10
表8抗人IL-15单克隆抗体结合食蟹猴IL-15(mfIL-15+mfIL-15Rα复合物)的亲和力常数
Ka(M-1s-1) Kd(s-1) KD(M)
R1A3 5.519E+5 3.983E-4 7.216E-10
R2H2VH+R22F11VK 3.650E+5 1.712E-4 4.629E-10
R4G4VH+R22F11VK 3.844E+5 1.723E-4 4.482E-10
R26H10 2.104E+5 2.102E-2 9.991E-8
AMG714 5.834E+5 1.237E-3 2.120E-9
CALY-002 1.274E+6 1.882E-4 1.477E-10
实施例7：抗人IL-15单克隆抗体的表位分析
将人IL-15(hIL-15+hIL-15Rα-his复合物)包被于96孔ELISA板，1μg/mL，100μL/孔，4℃包被过夜。利用封闭液(3％脱脂乳-PBST)于37℃封闭1小时。用固定浓度的抗人IL-15纯化噬菌体(AMG714为4×1011cfu/mL，CALY-002为1×1010cfu/mL)分别对抗人IL-15单克隆抗体(R1A3、R2H2VH+R22F11VK、R4G4VH+R22F11VK、R26H10、AMG714和CALY-002)进行梯度稀释，起始浓度为30μg/mL，3倍梯度稀释，共11个浓度梯度，100μL/孔加入封闭好的96孔ELISA板中，于37℃孵育1小时。使用PBST洗涤ELISA板，然后加入HRP标记抗M13二抗(北京义翘神州科技股份有限公司，11973-MM05T-H)，于37℃孵育1小时。使用PBST洗涤ELISA板，加入OPD底物显色液，5-10分钟后用1M的H2SO4终止显色，使用酶标仪测定492nm/630nm双波长光密度值。ELISA分析结果如图2所示，R26H10结合人IL-15的表位与AMG714不同(图2A)，与CALY-002相似或有交叉(图2B)；R1A3、R2H2VH+R22F11VK和R4G4VH+R22F11VK结合人IL-15的表位与AMG714相似或者有交叉(图2A)，与CALY-002不同(图2B)；AMG714结合人IL-15的表位与CALY-002不同(图2B)。
实施例8：抗人IL-15单克隆抗体在HEK-Blue IL-2细胞上的活性评价
HEK-Blue IL2细胞是在HEK293衍生细胞中稳定转染人CD25(IL-2Rα)，CD122(IL-2Rβ)和CD132(IL-2Rγ)基因，通过JAK-STAT5通路实现IL-2的信号，同时，HEK-blue细胞中还引入了STAT5诱导的分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报告基因，在IL-2或IL-15的刺激下，HEK-Blue IL-2细胞可激活JAK/STAT5，分泌SEAP，使用SEAP检测试剂盒QUANTI-BlueTMSolution可以监测SEAP的量，从而实现对于IL-2或IL-15的活性监测。
HEK-Blue IL-2细胞株购自Invivogen公司。配制DMEM+5％灭活FBS做为测试培养基，HEK-Blue IL-2细胞用测试培养基重悬至5*105个/mL。抗体用5ng/mL的人IL-15(hIL-15+hIL-15Rα复合物)做为稀释液，抗体浓度梯度为400nM起始，4倍稀释，10个浓度点。将100μL抗体和100μL细胞混合，二氧化碳培养箱(37℃，5％ CO2)中培养20小时。离心取20μL上清，与180μL Quanti-blue(Invivogen,货号rep-qbs)混合后于37℃孵育1-2小时，使用酶标仪(Biotek，型号800TS)在630nm处检测吸光度。用Graphpad Prism 7.0软件对原始数据进行统计处理。DP47抗体(阴性对照，参照美国专利申请US 20160200833A1[12]制备，其中重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:50和51所示)。结果见图3，R1A3、R4G4VH+R22F11VK、R2H2VH+R22F11VK和R26H10这4个分子的活性高于CALY-002和AMG-714，具体IC50数据见表9。
表9抗人IL-15单克隆抗体在HEK-Blue IL-2细胞上的活性
实施例9：抗人IL-15单克隆抗体在NK92细胞上的活性评价
NK92细胞株购自南京科佰生物科技有限公司，是一种依赖IL-2增殖的细胞株，IL-2饥饿时IL-15可促进细胞增殖。提前一天饥饿NK92(不加IL-2空白培养)，第2天用不加IL-2的培养基将细胞重悬至5*105个/mL。抗体用12ng/mL的人IL-15(hIL-15+hIL-15Rα-his复合物)做为稀释液，抗体浓度梯度为400nM起始，4倍稀释，10个浓度点。将100μL抗体和100μL细胞混合，二氧化碳培养箱(37℃、5％CO2)中培养2天。用Cell Titer-发光细胞活力测定(Cell Titer-Luminescent Cell Viability Assay，Promega，货号G7571)检测细胞增殖情况，使用酶标仪(Molecular Devices，型号SpectraMax I3X)进行全波长荧光检测。使用Graphpad Prism7.0软件对原始数据进行统计处理。DP47抗体为阴性对照。
结果参见图4，R1A3、R26H10、R4G4VH+R22F11VK和R2H2VH+R22F11VK这4个抗人IL-15单克隆抗体的活性高于AMG-714，与CALY-002相近。其中，CALY-002在NK92细胞中不能完全抑制IL-15的活性。具体IC50数据见表10。
表10抗人IL-15单克隆抗体在NK92细胞上的活性
IC50(nM)
R26H10 0.133
R4G4VH+R22F11VK 0.109
R2H2VH+R22F11VK 0.119
R1A3 0.126
AMG-714 0.299
CALY-002 0.106
序列信息
SEQ ID NO:1
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
SEQ ID NO:2
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKE
SEQ ID NO:3
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISHESGDTDIHDTVENLIILANNILSSNGNITESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
SEQ ID NO:4
ITCPPPVSVEHADIRVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNIAHWTTPSLKCIRDPLLARQRPAPPFTVTTAGVTPQPESLSPSGKE
SEQ ID NO:5
NWIDVRYDLEKIESLIQSIHIDTTLYTDSDFHPSCKVTAMNCFLLELQVILHEYSNMTLNETVRNVLYLANSTLSSNKNVAESGCKECEELEEKTFTEFLQSFIRIVQMFINTS
SEQ ID NO:6
GTTCPPPVSIEHADIRVKNYSVNSRERYVCNSGFKRKAGTSTLIECVINKNTNVAHWTTPSLKCIRDPSLAHYSPVPTVVTPKVTSQPESPSPSAKE
SEQ ID NO:7
HHHHHH
SEQ ID NO:8
ASVPRDSGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
SEQ ID NO:9
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:10
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:11
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:12
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
SEQ ID NO:13
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKVSGYFFTTYWIGWVRQMPGKGLEYMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGGHWNAFDFWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:14
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQFDASQTFGQGTKLEIS
SEQ ID NO:15
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKVSGYFFTTYWIGWVRQMPGKGLEYMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGGNWNCFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:16
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQRYGSSHTFGQGTKLEIS
SEQ ID NO:17
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASEFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVATISRGGDYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRVSMITGGWAMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:18
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVDITGNTYLEWYQQRPGQSPRLLIYKVFNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQDSFVPYTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO:19
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKVSGYFFTTYWIGWVRQMPGKGLEYMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGGHWNAFDIWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:20
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVIGSYLAWYQQKPGQAPRLLIYSASKLASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQHYSTPGTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:21
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKVSGYFFTTYWIGWVRQMPGKGLEYMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGGHWNSFDTWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:22
QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLTTYAVHWIRQPPGKALEWLGVIWGAGSTDYNPSFMSRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCAKNAAYYVMDYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO:23
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVIYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYAASKLASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQRASYPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:24
TGCATTTGAACTCCTTGCC
SEQ ID NO:25
CCATCAATCTTCCACTTGAC
SEQ ID NO:26
TYWIG
SEQ ID NO:27
IIYPGDSDTRYSPSFQG
SEQ ID NO:28
GGHWNAFDF
SEQ ID NO:29
GGHWNAFDI
SEQ ID NO:30
GGHWNSFDT
SEQ ID NO:31
TYAVH
SEQ ID NO:32
VIWGAGSTDYNPSFMS
SEQ ID NO:33
NAAYYVMDY
SEQ ID NO:34
RASQSVSSSYLA
SEQ ID NO:35
GASRRAT
SEQ ID NO:36
QQFDASQT
SEQ ID NO:37
RASQSVIGSYLA
SEQ ID NO:38
SASKLAS
SEQ ID NO:39
QQHYSTPGT
SEQ ID NO:40
RASQSVIYSYLA
SEQ ID NO:41
AASKLAS
SEQ ID NO:42
QQRASYPLT
SEQ ID NO:43
EVKLKESGPSLVQPSQSLSITCTVSGFSLTTYAVHWVRQSPGKGLEWLGVIWGAGSTDYNAAFMSRLSITKDNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYFCAKNGAYYVMDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO:44
EIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVSYMHWFQQRPGTSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPLTFGAGTKLEIK
SEQ ID NO:45
VIWGAGSTDYNAAFMS
SEQ ID NO:46
NGAYYVMDY
SEQ ID NO:47
SASSSVSYMH
SEQ ID NO:48
STSNLAS
SEQ ID NO:49
QQRSSYPLT
SEQ ID NO:50
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGSGFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:51
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGQGTKVEIK
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Claims (10)

1.结合人IL-15的抗体，其包含含HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列的重链可变区以及含LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列的轻链可变区，其中
所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ IDNO:34所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示以及所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示；
所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ IDNO:37所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示以及所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示；
所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ IDNO:37所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示以及所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示；
所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ IDNO:40所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示以及所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示；或者
所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ IDNO:47所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:48所示以及所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示；
其中，HCDR和LCDR的氨基酸序列根据Kabat定义。
2.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13、19、21、22或43所示。
3.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14、20、23或44所示。
4.如权利要求1-3中任一项所述的抗体，其中
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，以及所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示，以及所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示；
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示，以及所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示；
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示，以及所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示；或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示，以及所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示。
5.结合人IL-15的抗体，其中所述抗体的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:13、19、21、22和43中任一项具有至少90％的同一性，并且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:14、20、23和44中任一项具有至少90％的同一性。
6.如权利要求1-5中任一项所述的抗体，其中
所述抗体为全抗体、Fab片段、F(ab’)2片段或单链Fv片段(scFv)；优选地，所述抗体为全人源抗体或人源化抗体；和/或
所述抗体为单克隆抗体；和/或
所述抗体还包含选自IgG1亚型、IgG2亚型或IgG4亚型的重链恒定区；优选地，所述重链恒定区为IgG1亚型；更优选地，所述重链恒定区为IgG1m3亚型；和/或
所述Fc片段的第234、235和331位的氨基酸分别为F、E和S；和/或
所述重链恒定区的第252、254和256位的氨基酸分别为Y、T和E；和/或
所述抗体还包含选自κ亚型或者λ亚型的轻链恒定区；优选地，所述轻链恒定区为κ亚型；
其中，抗体恒定区氨基酸位置按照EU numbering确定。
7.如权利要求1-6中任一项所述的抗体，其中
所述抗体结合人IL-15和/或猴IL-15；和/或
所述抗体能够抑制IL-15的活性，例如抑制IL-15诱导分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)分泌的能力和/或抑制IL-15诱导NK92细胞增殖的能力。
8.核酸分子，其编码权利要求1-7中任一项所述的抗体。
9.药物组合物，其包含权利要求1-7中任一项所述的抗体以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
10.权利要求1-7中任一项所述的抗体、或权利要求9所述的药物组合物在制备用于预防或治疗IL-15介导的疾病的药物中的用途；优选地，所述IL-15介导的疾病选自：白癜风、乳糜泻、嗜酸性食道炎和大颗粒淋巴细胞白血病。
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