CN118891279A

CN118891279A - 临床人IgG产品的亲和色谱生产

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Publication number: CN118891279A
Application number: CN202380026155.XA
Authority: CN
Inventors: C·菲德勒; M·普尔彻; L·诺尔
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2022-03-07
Filing date: 2023-03-06
Publication date: 2024-11-01
Also published as: MX2024010855A; KR20240154657A; WO2023170553A1; TW202342522A; AR128719A1; EP4490179A1; AU2023230335A1

Abstract

提供了一种从含有IgG的起始材料制备IgG制剂的亲和色谱方法，所述制剂包含IgG1、IgG2、IgG3和IgG4中的一者或多者。本发明的方法包括使所述含有IgG的起始材料与第一色谱介质接触，所述第一色谱介质包括结合有蛋白A的第一固体支持物，从而形成具有蛋白A结合亲和力的IgG亚类的蛋白A结合级分，并且形成包含未与蛋白A结合的IgG亚类的第一流穿液；以及使所述第一流穿液与第一亲和配体色谱介质接触，所述第一亲和配体色谱介质包括第二固体支持物，所述第二固体支持物具有与其结合的具有IgG结合亲和力的第一亲和配体，从而形成第一亲和配体结合的IgG亚类和包含未与所述第一亲和配体结合的IgG亚类结合的IgG亚类的第二流穿液。

Description

临床人IgG产品的亲和色谱生产

背景技术

来自人血浆的免疫球蛋白产品于1952年首次用于治疗免疫缺陷。最初，肌肉内或皮下施用IgG为首选方法。但是，为了注射有效治疗各种疾病所必需的更大量IgG，开发了具有较低浓度IgG(50mg/mL)的可静脉内施用的产品。通常，静脉内免疫球蛋白(IVIG)包含来自一千多名献血者血浆的汇集免疫球蛋白G(IgG)免疫球蛋白。通常含有超过95％的具有完整Fc依赖性效应子功能的未修饰IgG，和仅痕量的免疫球蛋白A(IgA)或免疫球蛋白M(IgM)，IVIG为无菌、纯化IgG产品，所述产品主要用于治疗三大类医学疾患：1.具有较低抗体水平的免疫缺陷，例如X-连锁无丙种球蛋白血症、低丙球蛋白血症(原发性免疫缺陷)和获得性免疫受损疾患(继发性免疫缺陷)；2.炎性疾病和自体免疫性疾病；以及3.急性感染。

许多IVIG商业供货商提供各种IVIG产品。与重新溶解后仅含有溶解状态中的50mg/mL蛋白质的旧冻干IVIG产品相比，最新发展为不同体积和浓度的高度纯化和浓缩的人IgG抗体的即用型无菌液体制剂。由于诸如IVIG的IgG产品由汇集的人血浆制造，因此供体血液中的病原体污染(尤其已知会导致人各种疾病的病毒)是生产过程中的严重问题。IgG产品的另一个重要考虑因素是其在储存期间的稳定性，尤其作为即用型制剂的稳定性。与IVIG相比，可皮下施用的免疫球蛋白制剂具有可居家治疗且副作用较小的优点。

在关于血清和血浆蛋白的制备和性质所公开的一系列论文的第四部分中，Cohn等人(J.Am.Chem.Soc.,1946,68(3):459-475)首先描述了血浆蛋白的醇分级方法(方法6)，所述方法允许分离富含来自人血浆的IgG的级分。几年后，Oncley等人(J.Am.Chem.Soc.,1949,71(2):541-550)通过公开导致分离出更纯IgG制剂的方法(方法9)而扩展了Cohn方法。

这些方法虽然为整个血浆源性血液因子产业奠定了基础，但无法提供具有用于治疗包括川崎综合征、免疫性血小板减少性紫癜和原发性免疫缺陷在内的多种免疫相关疾病的足够高浓度的IgG制剂。因此，开发了采用诸如离子交换色谱的各种技术的其他方法，以提供更高纯度和更高浓度IgG制剂。Hoppe等人(Munch Med Wochenschr1967(34):1749-1752)和Falksveden(瑞典专利号348942)以及Falksveden和Lundblad(Methods of PlasmaProtein Fractionation 1980)最早将离子交换色谱用于此用途。

各种现代方法采用与柱色谱结合的沉淀步骤，例如辛酸盐沉淀(Lebing等人，VoxSang 2003(84):193-201)和Cohn级分(I+)II+III乙醇沉淀(Tanaka等人，Braz J Med BiolRes 2000(33)37-30)。最近，Teschner等人(Vox Sang,2007(92):42-55)描述了一种生产10％ IVIG产品的方法，其中首先从汇集的血浆中移除冷冻沉淀物，然后进行改进的Cohn-Oncley冷乙醇分级，然后进行中间体的S/D处理、离子交换色谱、纳米过滤和任选地超滤/渗滤。

尽管这些IgG分离方法提供了纯度、安全性和产率，但从血浆中回收的IgG的产率仍然可以提高。例如，Teschner等人报导他们的方法导致IgG产率增加65％(Teschner等人，同上)。尽管比先前采用的方法有所改进，但是此IgG回收量仍然代表在分离过程中存在于汇集的血浆级分中的IgG至少损失约三分之一。

由于可用于制造血浆源性产品的血浆供应有限，可以通过将纯化整合至单个框架中来实现从共同起始血浆池中分离几种血液蛋白质。例如，IgG通常通过形成Cohn级分II+III沉淀物或Kistler-Nitschmann沉淀物A来富集，然后将其相应上清液用于生产α-1-抗胰蛋白酶和白蛋白。类似地，已经描述了几种用于从IgG免疫球蛋白制造过程中形成的副产物制造其他血浆蛋白诸如因子H的方法，包括WO 2008/113589和WO 2011/011753。

因此，需要用于制造治疗性IgG产品的改进的和更有效的方法。

此外，仍然需要产生适合于皮下和/或肌肉内施用的高浓度IgG制剂的方法。

大多数蛋白质纯化方法都涉及某种形式的色谱，其中溶解状态中的分子(流动相)基于与固体材料(固定相)的化学或物理相互作用的差异来进行分离。凝胶过滤(也称为尺寸排阻色谱或SEC)使用多孔树脂材料基于尺寸(即物理排阻)来分离分子。在离子交换色谱中，根据分子与固相材料的整体离子相互作用(即非特异性相互作用)的强度来分离分子。亲和色谱方法广泛用于蛋白质纯化，然而，所述方法尚未用于血浆蛋白诸如IgG的大规模、工业规模纯化。

亲和色谱(也称为亲和纯化)依赖于分子之间的特异性结合相互作用。特定配体被化学固定或“偶合”至固体支持物上，以使得当复杂混合物穿过柱时，针对配体具有特异性结合亲和力的那些分子变得结合。在其他样品组分被洗掉后，将结合分子从支持物上剥离，从而使其从原始样品中纯化出来。

一系列可用于生产和纯化蛋白质的亲和配体为本领域中已知的。蛋白A和蛋白G为人抗体纯化中最常用的捕获蛋白。然而，蛋白A和蛋白G有几个缺点，包括其高成本、低稳定性以及通过水解和释放肽片段而污染产品的可能性。通常，蛋白A和/或蛋白G衍生亲和树脂不能有效结合人IgG级分的所有IgG亚类。因此，需要一种有效、优选紧凑的方法，所述方法通过基于互补结合原理将蛋白A或蛋白G衍生树脂与一种或多种IgG结合树脂组合，从而允许结合更广泛范围的人IgG亚类。

本发明通过提供用于生产IgG的高效、有效色谱方法来满足这些和其他需求，在一个实施方案中，所述方法避免了血浆产品领域中目前标准的严格、耗时的乙醇分级过程。

发明内容

仍然需要从原料中纯化IgG的更高效、快速和高产率方法。由于单个IgG同种型的特征在于对其缀合表位的不同亲和力，因此允许轻松捕获和/或纯化一种或多种同型的方法将使得治疗性IgG制剂中的特定同型的亲和力得以增强并利用。本发明通过提供对含有一种或多种IgG同种型的原料进行IgG特异性亲和色谱的新方法来提供这些和其他优点。

非常意外地，本发明人已经发现，通过对血浆产物起始材料例如冷冻上清液执行两个或更多个亲和力捕获色谱步骤，可以以快速、高效和高产方式生产具有与血浆IgG亚型分布几乎一致的IgG亚型概况的高纯度(例如，>80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％)IgG产品。因此，本发明提供了一种用于生产具有与目前批准的市售IgG制剂基本一致的IgG亚型概况、杂质概况和其组合的IgG制剂的方法，并且无需诉诸经典血浆分级技术(例如，Cohn分级)。此意外发现代表了从大量血浆中分离IgG级分领域中的重大进步。

在一个示例性实施方案中，提供了一种IgG水溶液，其包含至少约99.5％ IgG和小于约0.5％杂质，其中IgG水溶液包含小于约0.0025E/mg总IgG，优选地小于约0.0020E/mg总IgG，更优选地小于约0.0015E/mg总IgG，最优选地小于约0.0012E/mg总IgG的活性的因子XI作为杂质。在另一示例性实施方案中，提供了一种IgG水溶液，其包含至少约99.5％ IgG和小于约0.5％杂质，其中IgG水溶液包含小于约3.5μg/mg总IgG，优选地小于约3.0μg/mg总IgG，更优选地小于约2.5μg/mg总IgG，最优选地小于约2.2μg/mg总IgG的水平的补体C3作为杂质。在示例性实施方案中，提供了一种IgG水溶液，其包含至少约99.5％ IgG和小于约0.5％杂质，其中IgG水溶液包含补体C3和因子XI作为杂质，其中补体C3以小于约3.5μg/mg总IgG，优选地小于约3.0μg/mg总IgG，更优选地小于约2.5μg/mg总IgG，最优选地小于约2.2μg/mg总IgG的水平存在，并且其中因子XI以小于约0.0025E/mg总IgG，优选地小于约0.0020E/mg总IgG，更优选地小于约0.0015E/mg总IgG，并且最优选地小于约0.0012E/mg总IgG的活性包含在内。在示例性实施方案中，提供了一种IgG水溶液，其包含至少约99.5％IgG和小于约0.5％杂质，其中补体C3以小于约2.5μg/mg总IgG的水平存在，并且其中因子XI以小于约0.0015E/mg总IgG的活性存在。

本发明的一个实施方案涉及一种亲和色谱方法，所述方法从含有IgG的起始材料制备IgG制剂，所述制剂包含IgG1、IgG2、IgG3和IgG4中的一者或多者的任意组合。在一个示例性实施方案中，所述方法提供了具有预定IgG亚型模式/比率、预定杂质模式和其组合的IgG制剂。在一个示例性实施方案中，模式/比率与血浆IgG亚型分布的模式/比率基本一致。

既令人惊讶又出乎意料地，第二柱，即蛋白A柱之后的柱，结合了大部分未与蛋白A柱结合的IgG亚型。在一个示例性实施方案中，第二柱上的介质为抗体。示例性抗体包括能够与一个或多个IgG亚类的共同区域结合的那些抗体。抗体可以为全长单克隆抗体或抗体片段(例如，Fab、Fab2、单链、骆驼科动物抗体片段或肽)。在一个示例性实施方案中，所述柱为CaptureSelect^TMCH1-XL亲和基质(ThermoFisher)，或具有类似IgG结合选择性的柱。

本发明的另一个意外结果是本发明人发现，可以对结合至柱上的蛋白质材料进行柱上溶剂/洗涤剂病毒灭活(SD_VI)步骤，而不会对所述过程的分离方面的保真度产生有害影响。通过将SD_VI步骤直接并入已建立的单元操作中，而不是作为独立步骤对从色谱介质中分离的材料来执行，所述发现进一步增强本发明过程的有效性和紧凑性，尤其相对于本领域中标准的分级程序而言。事实上，更意外地，将柱上SD_VI步骤并入纯化中时IgG制剂的纯度得以提高，因为预计所述步骤不会产生除了病毒灭活之外的效果。SD_VI步骤消耗或移除病毒源性杂质之外的杂质。

在示例性实施方案中，SD_VI步骤消耗或移除白蛋白、载脂蛋白A-I、补体C3、结合珠蛋白、纤维蛋白原、补体C4-B、补体C1s次组分、补体C1r次组分、载脂蛋白B-100、α-2-巨球蛋白中的至少一者或多者。在一个示例性实施方案中，这些杂质存在于来自SD_VI步骤的洗涤液中。

在各种实施方案中，SD_VI步骤在将靶治疗性蛋白质(例如，IgG)捕获在色谱介质上并产生流穿液的IQEQ步骤之后，并且在从色谱介质洗脱靶治疗性蛋白质之前执行。

本发明的示例性方法可依序进行，或作为使用两种或更多种不同IgG结合亲和树脂的阵列(串联阵列)的单个单元操作来进行或在允许全自动连续色谱的滑行装置上进行。所述原理不限于IgG，亦可用于纯化其他蛋白质，例如血浆蛋白，例如白蛋白、A1PI、FVIII等。

本文所述的本发明的示例性实施方案提供以下优点：与使用单一蛋白A或蛋白G衍生纯化、或另一种IgG结合亲和纯化的方法相比，从具有广泛范围的IgG亚类组成的原料例如血浆和/或血浆级分(例如冷冻沉淀物上清液)中纯化免疫球蛋白例如人IgG级分是更优异的。所获得IgG亚类组成的较高纯度有利于显著减少单元操作，以便将纯化的IgG产品最终制成可施用药物。

示例性方法包括(a)使含有IgG的起始材料与第一色谱介质接触，所述第一色谱介质包括结合有蛋白A的第一固体支持物，从而形成具有蛋白A结合亲和力的IgG亚类的蛋白A结合级分，并形成包含未与蛋白A结合的IgG亚类的第一流穿液；(b)使第一流穿液与第一亲和配体色谱介质接触，所述介质包括第二固体支持物，所述第二固体支持物具有与其结合的具有IgG结合亲和力的第一亲和配体，从而形成第一亲和配体结合的IgG亚类和包含未与第一亲和配体结合IgG亚类结合的IgG亚类的第二流穿液；(c)从第一色谱介质洗脱蛋白A结合级分，从而形成第一洗脱液并将第一洗脱液与第一亲和配体色谱介质接触，从而形成第二亲和配体结合IgG亚类，和第二流穿液；和(d)从第一亲和配体柱洗脱选自第一亲和配体结合的IgG亚类、第二亲和配体结合的IgG亚类和其组合的成员，从而形成第二洗脱液。

示例性亲和配体色谱介质包括VHH抗体片段。

在一个示例性实施方案中，所述方法还包括(e)在第一亲和配体色谱介质上合并第一流穿液和第二洗脱液。

在一个示例性实施方案中，所述方法包括(f)使(d)的第二洗脱液与第二亲和配体色谱介质接触，所述第二亲和配体色谱介质包括第三固体支持物，所述第三固体支持物具有与其结合的具有IgG亲和力的第二亲和配体，从而形成第三亲和配体结合的IgG亚类和包含未与第二亲和配体色谱介质结合的第四IgG亚类的第二流穿液；和(g)从第二亲和配体色谱介质洗脱选自第二亲和配体结合的IgG亚类、第四IgG亚类和其组合的成员，从而形成第三洗脱液。

在一个示例性实施方案中，所述方法包括(h)在(g)之前，在第二亲和配体色谱介质上合并第一流穿液和第二洗脱液。

在各种实施方案中，所述方法包括(i)在(b)之前，使第一色谱介质与缓冲液/洗涤剂混合物接触，所述混合物不会从第一色谱介质中洗脱具有蛋白A结合亲和力的IgG亚类的蛋白A结合级分。

在一些实施方案中，所述方法包括(j)在(g)之前，使第二亲和配体色谱介质与缓冲液/洗涤剂混合物接触，所述混合物不从第二亲和配体色谱介质洗脱第二亲和配体结合的IgG亚类。

本发明的一个示例性方面涉及一种亲和色谱方法，所述方法从缺乏蛋白A结合IgG亚类的血浆源性IgG溶液中制备富含具有低蛋白A结合亲和力的第一IgG亚类的IgG制剂。所述方法包括(a)使缺乏蛋白A结合IgG亚类的IgG溶液与第一亲和配体色谱介质接触，所述介质包括第一固体支持物，所述第一固体支持物具有与其结合的具有IgG结合亲和力的第一亲和配体，从而形成具有低蛋白A结合亲和力的第一IgG亚类的第一结合级分和第一流穿液；和(b)洗脱具有低蛋白A结合亲和力的第一IgG亚类的第一结合级分，从而形成包含富含具有低蛋白A结合的第一IgG亚类的IgG制剂的第一洗脱液。

在一个示例性实施方案中，所述方法还还包括(c)在(b)之前，使具有低蛋白A结合亲和力的第一IgG亚类的第一结合级分与缓冲液/洗涤剂溶液接触，并且随后从第一亲和配体色谱介质中移除洗涤剂溶液。

在一个示例性实施方案中，所述方法还还包括(d)在(b)之后，使第一洗脱液与第二色谱介质接触，所述第二色谱介质包括固体支持物，所述固体支持物具有与其结合的亲和配体，所述配体对具有低蛋白A结合亲和力的第二IgG亚类具有亲和力，从而形成具有低蛋白A结合亲和力的第二IgG亚类的第一结合级分；和(e)从第二色谱介质洗脱具有低蛋白A结合亲和力的第二IgG亚类的第一结合级分，从而形成第二洗脱液。

在一些实施方案中，所述方法还包括(f)在(e)之前，使具有低蛋白A结合亲和力的第二IgG亚类的第一结合级分与缓冲液/洗涤剂溶液接触，并且随后从第一色谱介质中移除洗涤剂溶液。

在各种实施方案中，所述方法还包括(g)在(a)之前，使血浆源性IgG溶液与包含与固体支持物结合的蛋白A的蛋白A色谱介质接触，从而形成对蛋白A具有高亲和力的IgG亚类的蛋白A结合级分，和富含具有低蛋白A结合亲和力的第一IgG亚类的IgG制剂。

在一个示例性实施方案中，所述方法还包括(h)从蛋白A色谱介质洗脱对蛋白A具有高亲和力的IgG亚类的蛋白A结合级分，从而形成第三洗脱液。

示例性方法包括合并第一洗脱液、第二洗脱液和第三洗脱液中的两者或更多者的步骤。

根据以下详细描述、附图和权利要求书，将清楚本发明的其他方面和优点。

附图说明

图1为蛋白A结合IgG亚类串联柱I(蛋白A和CH1-XL)的UV概况。

图2为IgG Capture Select树脂上非蛋白A结合亚类的UV概况-迭加流穿液(FT)。

图3为IgG Capture Select树脂上非蛋白A结合亚类的UV概况迭加洗脱峰。

图4为IGC02的色谱图。

图5为IGC01S的色谱图。

图6为IGC04的色谱图。

图7为IGC04银染的SDS page银染概况。1.加载，冷冻上清液，1:560稀释。2.流穿液，1:500稀释。3.WSD，柱上SD_VI，1:10稀释。4.洗涤2，1:5稀释。5.洗涤3，1:5稀释。6.洗脱液，1:100稀释。7.洗脱液，1:50稀释。8.剥离，1:10稀释。NuPAGE 4-12％ Bis-Tris Midi凝胶1.0mm。20孔目录号WG1402BX10，非还原性SDS运行缓冲液LDS-SB:NP0007，将50μl样品添加至20μl碘乙酰胺中，在+18至26℃下孵育30分钟，+50μl缓冲液LDS-SB:NP0007在70℃下孵育10分钟。泳道8和9表明洗脱液的纯度水平意外地高。

图8为IGC06的色谱图。电导率(红色)：UV280(蓝色)UV254(紫色)pH：绿色。

图9为IGC06银染的SDS page银染概况。1.分子量标记。2.空白3.加载，冷冻上清液，1:560稀释。4.流穿液，1:500稀释。5.WSD，柱上SD_VI，1:10稀释。6.洗涤2，1:5稀释。7.洗涤3，1:5稀释。8.洗脱，稀释1:100IgG级分。9.洗脱，稀释1:50IgG级分。10.剥离，1:10稀释。NuPAGE 4-12％ Bis-Tris Midi凝胶1.0mm。20孔目录号WG1402BX10。非还原性SDS运行缓冲液LDS-SB:NP0007。将50μl样品添加至20μl碘乙酰胺中，在+18至26℃下孵育30分钟。+50μl缓冲液LDS-SB:NP0007在70℃下孵育10分钟。

图10为用于将测试材料(10％多克隆免疫球蛋白)加载至蛋白A柱上的模型流程图。

图11为显示来自图10的洗脱液等分至单独柱中的模型流程图，每个柱含有单独亲和色谱介质。分别收集来自这些柱中每一者的洗脱液。

图12为显示加载至蛋白A柱上的测试材料(冷冻上清液)的模型流程图。将来自此柱的洗脱液加载至亲和色谱介质(例如，Capture Select CH1-XL)的柱中。

图13为显示加载至示例性亲和配体色谱介质(CH1-XL)上的冷冻上清液的蛋白A色谱的洗脱液的模型流程图。

图14为显示加载至蛋白A和亲和色谱介质的串联阵列上的冷冻上清液的模型流程图。加载冷冻上清液后，对阵列执行洗涤步骤。洗脱液包含广泛范围的IgG亚类。

图15为蛋白A、Capture Select CH1-XL和Capture Select IgG3的三柱阵列(TRIDEM)的模型流程图。将冷冻沉淀物加载至阵列上，并执行洗涤步骤。洗脱液包含广泛范围的IgG亚类。

图16为示例性串联和三联色谱阵列的概览。

具体实施方式

A.介绍

本文提供了使用并入至少一种基于亲和配体的亲和色谱方法的过程从原料中纯化一种或多种IgG同种型的示例性实施方案。本发明的示例性IgG制剂由含有IgG的起始材料例如冷冻沉淀物上清液制备，并提供包含经纯化的免疫球蛋白的IgG制剂。

示例性方法包括(a)使含有IgG的起始材料与第一色谱介质接触，所述第一色谱介质包括结合有蛋白A的第一固体支持物，从而形成具有蛋白A结合亲和力的IgG亚类的蛋白A结合级分，并形成包含未与蛋白A结合的IgG亚类的第一流穿液；(b)使第一流穿液与第一亲和配体色谱介质接触，所述介质包括第二固体支持物，所述第二固体支持物具有与其结合的针对选定免疫球蛋白具有结合亲和力的第一亲和配体，从而形成第一亲和配体结合的IgG亚类和包含未与第一亲和配体结合的IgG亚类的第二流穿液；(c)从第一色谱介质洗脱蛋白A结合级分，从而形成第一洗脱液并将第一洗脱液与第一亲和配体色谱介质接触，从而形成第二亲和配体结合IgG亚类，和第二流穿液；和(d)从第一亲和配体柱洗脱选自第一亲和配体结合的IgG亚类、第二亲和配体结合的IgG亚类和其组合的成员，从而形成第二洗脱液。

基于蛋白A的色谱介质不能以类似效率结合所有亚类的IgG。在示例性实施方案中，本发明提供使用基于亲和配体的亲和树脂从血浆起始材料中分离和/或纯化IgG级分和IgG亚型的方法和系统。用于本发明的示例性树脂包括最近开发用于抗体融合蛋白纯化的树脂。那些树脂在不同位点(模式)结合IgG，因此可用于补充和增强蛋白A树脂的使用，或克服基于蛋白A的树脂的缺点。

此外，本发明的基于亲和色谱的方法可以以连续或半连续模式来编排，从而实现高通量。

示例性实施方案包括专用洗涤步骤和柱上溶剂/洗涤剂、病毒灭活步骤(“柱上”SD_VI处理)，从而与传统IgG分级和纯化相比，减少了单元操作的总数。柱上SD_VI步骤可以在阵列中的任何柱或超过一个柱上执行。

本发明的示例性方法包括至少两个病毒灭活/消除步骤(例如专用SD_VI、酸性保持步骤、纳米过滤35nm)。

在各种实施方案中，本发明还提供了使用本发明的方法和/或系统产生的IgG制剂。

B.定义

尽管本文使用的术语被视为本领域普通技术人员所熟知，但本文阐述定义以有助于解释本文所公开的主题。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语皆具有与本文公开的主题所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。尽管与本文所述的方法、装置和材料类似或等效的方法、装置和材料可用于本发明公开的主题的实践或测试，但本文描述代表性方法、装置和材料。

当在本申请(包括权利要求书)中使用时，术语“一个(种)(a/an)”和“所述”是指“一个或多个(种)”。当在权利要求书和/或说明书中与术语“包括”一起使用时，单词“一个(种)(a/an)”的使用可能表示“一个(种)”，但它也与“一个或多个(种)”、“至少一个(种)”和“一个(种)或超过一个(种)”的含义一致。

对本公开的单数特征或限制的所有提及应包括相应复数特征或限制，反之亦然，除非另有说明或在进行提及的上下文中明确暗示相反。

如本文所用的方法或过程步骤的所有组合可以以任何顺序执行，除非另有说明或在产生所提及组合的上下文中明确暗示相反。

本公开的方法和装置，包括其组件，可以包括本文描述的实施方案的基本要素和限制以及本文描述或在其他方面有用的任何附加或任选组件或限制，由前述内容组成，或基本上由前述内容组成。

除非另有说明，否则在说明书和权利要求书中使用的所有表示物理尺寸、成分的数量、性质诸如反应条件等的数字应理解为在所有情况下由术语“约”来限定。因此，除非有相反指示，否则本说明书和权利要求书中给出的数值参数为近似值，它们可以根据本发明公开的主题寻求获得的期望性质而变化。

如本文所用，范围可以表示为从“约”一个特定值，和/或至“约”另一个特定值。还应当理解，存在许多本文公开的值，并且除了所述值本身之外，每个值在本文中亦被公开为“约”彼特定值。例如，如果公开值“10”，则也公开“约10”。还应理解，也公开了两个特定单元之间的每个单元。例如，如果公开了10和15，则也公开了11、12、13和14。

为了清楚起见，没有示出和描述本文描述的实行方案的所有常规特征。可以理解，在任何此类实际实行方案的开发中，为了实现开发人员的特定目标，例如顺应应用相关的限制和商业相关的限制，做出了许多实行方案特定决策，并且这些特定目标将在各个实行方案之间，以及在开发人员之间有所不同。此外，应当理解，此开发工作可能为复杂且耗时的，但是对于受益于本公开的本领域普通技术人员而言，仍然为工程设计的例行任务。

在不脱离示例性实施方案的精神和范围的情况下，可以对本公开中阐述的示例性实施方案进行许多修改和变化，此对本领域技术人员而言为显而易见的。本文所述的具体示例性实施方案仅以示例方式提供，并且本公开仅受所附权利要求的条款以及此类权利要求有权享有的均等物的全部范围限制。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域(例如，在细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学中)普通技术人员通常所理解相同的含义。标准技术用于分子、遗传和生化方法(一般参见Sambrook等人，Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.和Ausubel等人Short Protocols in Molecular Biology(1999)第4版，JohnWiley&Sons,Inc.，其以引用方式并入本文)和化学方法。此外，对于标准免疫学技术，参考Harlow和Lane,ALaboratory Manual Cold Spring Harbor,N.Y.。

如本文所用的术语“含IgG起始材料”包括血浆、非冷冻血浆、用于血浆分级过程的级分(例如Cohn级分)和重组IgG制剂，以及用于所公开过程的包括一种或多种IgG的其他原料来源。在一些实施方案中，所述术语是指含有人IgG的起始材料，但本发明不限于使用含有人源性IgG的起始材料。

如本文所用的术语“低蛋白A结合亲和力”是指不与包含固定化蛋白A的色谱介质结合或容易从所述介质上洗掉的Ig物质。具有低蛋白A结合亲和力的示例性物质是其中结合级分在高于5的pH下基本上完全从蛋白A柱洗脱，洗脱液具有大于约5mS/cm的电导率，或其组合的物质。

如本文所用，“抗体”是指基本上由一个或多个免疫球蛋白基因或其片段编码的多肽，其特异性结合并识别分析物(抗原)。公认免疫球蛋白基因包括κ(kappa)、λ(lambda)、α(alpha)、γ(gamma)、δ(delta)、ε(epsilon)和μ(mu)恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链分为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，它们又分别定义了免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。

示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元由两对多肽链组成，每对具有一条“轻链”(约25kD)和一条“重链”(约50-70kD)。每条链的N末端定义了约100至110个或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。术语可变轻链(V_L)和可变重链(V_H)分别指这些轻链和重链。

术语“抗体”和“免疫球蛋白”可互换使用，在一些实施方案中是指包含通过二硫键来互连的至少两条重链(H)和两条轻链(L)的蛋白质。各重链由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区(本文中缩写为CH)组成。在一些抗体例如天然存在的IgG抗体中，重链恒定区由铰链和三个结构域CHL CH2和CH3组成。在一些抗体例如天然存在的IgG抗体中，各轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域(本文中缩写为CL)组成。VH区和VL区可进一步再分成称为互补决定区(CDR)的高变区，其穿插有称为框架区(FR)的较保守的区。各VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端至羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、和FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。重链可能有或没有C末端赖氨酸。术语“抗体”可包括双特异性抗体或多特异性抗体。示例性亲和配体为抗体或其片段。

示例性抗体(免疫球蛋白)包括人IgA、IgD、IgG、IgE或IgM。抗体可以为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4抗体。在一些实施方案中，如本文所用，“IgG”具有天然存在的IgG抗体的结构，即，它具有与相同亚类的天然存在的IgG抗体相同数量的重链和轻链以及二硫键。例如，IgG抗体可能由两条重链(HC)和两条轻链(LC)组成，其中两条HC和LC分别由天然存在的Ig抗体中出现的相同数量和位置的二硫桥连接(除非抗体已发生突变以修饰二硫桥)。

免疫球蛋白可以来自任何通常已知同种型，包括但不限于IgA、分泌型IgA、IgG和IgM。IgG同种型在某些物种中分为亚类：在人中分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，并且在小鼠中分为IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。免疫球蛋白，例如IgG1，存在于几种同种异型中，它们最多在几个氨基酸上彼此不同。“抗体”包括例如天然存在和非天然存在的抗体；单克隆抗体和多克隆抗体；嵌合抗体和人源化抗体；人和非人抗体以及全合成抗体。

骆驼科动物抗体有时用于亲和纯化程序。很大一部分骆驼科动物抗体为单结构域抗体，它们通过没有轻链的单个重链结合结构域与其抗原相互作用。所述结构域也称为“VHH”或“VHH抗体”或“VHH结构域”。重组VHH抗体呈现最小尺寸的完整抗原结合结构域。VL结构域的不存在允许VHH抗体获得比与VL结构域缔合的VH结构域更高的结构挠性。此外，VHH的互补决定区(CDR)，尤其CDR3，在统计学上比常规VH-VL抗体更长(Muyldermans S.,J.Biotechnol.,2001,74,277-302)。

示例性亲和配体为VHH配体。“VHH配体”是指源自骆驼科动物的单结构域重链抗体或抗体片段。一般而言，VHH配体具有源自天然缺乏轻链的免疫球蛋白的重链，所述重链连接在一起形成多价单一多肽，所述多肽保留了母体完整免疫球蛋白的抗原结合亲和力，但其尺寸小得多，因此免疫原性更少。VHH配体在例如Frenken等人,J.Biotechnol.78:11-21(2000)；van der Linden等人,Biochem Biophys.Acta.1431:37-46(1999)；Spinelli等人,Biochemistry 39:1217-1222(2000)；美国专利申请公开号20030078402；2004/0142432和美国专利号6,399,763和6,670,453中详细描述。

在本发明的方法中用作色谱亲和配体的示例性VHH抗体(和片段)包括对至少一种IgG同种型具有亲和力的那些抗体。在本发明的方法中使用的示例性VHH抗体对至少第一IgG同种型的选择性高于对第二IgG同种型的选择性。

术语抗体、其片段(或亲和配体，如本文所用)的“抗原结合部分”是指保留特异性结合至抗原的能力的抗体的一个或多个片段。已经表明抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来执行。术语抗体的“抗原结合部分”中涵盖的结合片段的实例包括：(i)Fab片段(来自木瓜蛋白酶裂解的片段)或由VL、VH、LC和CH1结构域组成的类似单价片段；(ii)F(ab')2片段(来自胃蛋白酶裂解的片段)或包含两个在铰链区处通过二硫桥连接的Fab片段的类似二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人,(1989)Nature341:544-546)；(vi)分离的互补决定区(CDR)；和(vii)可以任选地通过合成接头连接的两个或更多个分离CDR的组合。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同基因编码，但是它们可以使用重组方法通过合成接头来连接，所述接头使得它们能够制成单个蛋白质链，其中VL区和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等人(1988)Science 242:423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。此类单链抗体还意图涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段可使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且所述片段可以与完整抗体相同的方式针对效用来进行筛选。抗原结合片段可通过重组DNA技术或通过抗体的酶促或化学裂解来产生。

如本文所用，术语“超滤(UF)”涵盖多种膜过滤方法，其中静水压力迫使液体抵靠半透膜。悬浮固体和高分子量的溶质得以保留，而水和低分子量溶质穿过膜。所述分离过程常用于纯化和浓缩大分子(10³-10⁶Da)溶液，尤其蛋白质溶液。根据所保留分子的大小，可以使用多种超滤膜。超滤通常通过1与1000kDa之间的膜孔径和0.01与10巴之间的操作压力来表征，特别适用于从小分子例如糖和盐中分离胶体例如蛋白质。

如本文所用，术语“渗滤”使用与超滤相同的膜进行并且为切向流过滤。在渗滤过程中，将缓冲液引入循环罐，同时从单元操作中移除滤液。在产品处于渗余物(例如IgG)中的过程中，渗滤将产品池中的组分冲洗到滤液中，从而交换缓冲液并降低不需要的物质的浓度。

术语“色谱”是指将所关注蛋白质(例如，抗体)与混合物中存在的其他分子(例如，污染物)分离的技术。通常，由于混合物的各个分子在流动相的影响下穿过固定介质迁移的速率不同，或在结合和洗脱过程中，所关注蛋白质与其他分子(例如污染物)分离。术语“基质”或“色谱基质”在本文中可互换使用，并且是指在分离过程中将所关注蛋白质(例如，含有Fc区的蛋白质，例如免疫球蛋白)与混合物中存在的其他分子分离的任何种类的吸附剂、树脂或固相。非限制性实例包括颗粒状、整体状或纤维状树脂以及可放入柱或滤筒中的膜。形成基质的材料的实例包括多糖(例如琼脂糖和纤维素)；和其他机械稳定的基质，例如二氧化硅(例如，可控孔隙玻璃)、聚(苯乙烯二乙烯基)苯、聚丙烯酰胺、陶瓷颗粒和上述任何物质的衍生物。适用于本公开的方法的典型基质类型的实例为阳离子交换树脂、亲和树脂、阴离子交换树脂或混合模式树脂。“配体”为连接至色谱基质并决定基质结合性质的官能基。“配体”的实例包括但不限于离子交换基团、疏水相互作用基团、亲水相互作用基团、亲硫相互作用基团、金属亲和基团、亲和配体、生物亲和基团和混合模式基团(上述的组合)。可用于本文的一些优选配体包括但不限于强阳离子交换基团，诸如磺丙基、磺酸；强阴离子交换基团，诸如三甲基氯化铵；弱阳离子交换基团，诸如羧酸；弱阴离子交换基团，诸如N5N二乙氨基或DEAE；疏水相互作用基团，诸如苯基、丁基、丙基、己基；以及亲和配体，诸如蛋白A、蛋白G和蛋白L。

术语“亲和色谱”是指一种蛋白质分离技术，其中所关注蛋白质(例如，所关注的含有Fc区的蛋白质或抗体)特异性结合至对所关注蛋白质具有特异性的配体。此配体通常称为亲和配体或生物特异性配体。在一些实施方案中，亲和配体(例如，蛋白A或其功能变体)共价连接至色谱基质材料，并且当溶液接触色谱基质时，可被溶解状态中的所关注蛋白质所接近。所关注蛋白质通常在色谱步骤期间保留其对亲和配体的特异性结合亲和力，而混合物中的其他溶质和/或蛋白质不会明显或特异性地结合至配体。所关注蛋白质与固定化配体的结合允许污染蛋白质或蛋白质杂质穿过色谱基质，而所关注蛋白质仍然与固相材料上的固定化配体特异性结合。然后在合适条件(例如，低pH、高pH、高盐、竞争配体等)下，从固定化配体中以活性形式移除特异性结合的所关注蛋白质，并使其与洗脱缓冲液一起穿过色谱柱，不含先前允许穿过柱的污染蛋白质或蛋白质杂质。任何组分都可以用作纯化其各自特异性结合蛋白质例如抗体的配体。然而，在根据本公开的各种方法中，蛋白A、G、A/G和/或L用作含有Fc区的靶蛋白的配体。本领域普通技术人员可以容易地确定用于从亲和配体(例如，蛋白A)洗脱靶蛋白(例如，含有Fc区的蛋白质)的条件。在一些实施方案中，蛋白G或蛋白L或其功能变体可用作生物特异性配体。在一些实施方案中，生物特异性配体诸如蛋白A在5-9的pH范围内用于结合含有Fc区的蛋白质，洗涤或再平衡生物特异性配体/靶蛋白缀合物，随后用具有约或低于4的pH且含有至少一种盐的缓冲液来洗脱。

术语“亲和配体”是指能够捕获一种或多种IgG物质的配体。示例性亲和配体选自物质混合物中的一种IgG物质，并且使用包含亲和配体的柱、过滤器或其他介质提供了一种方法，通过所述方法可以从含有一种或多种IgG物质的混合物中纯化一种或多种IgG物质。示例性亲和配体为VHH抗体或其片段。

如本文可互换使用的术语“纯化”、“分离”或“隔离”是指增加来自包含所关注蛋白质和一种或多种杂质的组合物或样品的所关注蛋白质的纯度。通常，通过从组合物中移除(完全或部分)至少一种杂质来增加所关注蛋白质的纯度。“纯化”和其等同词是指为了将治疗性蛋白质与一种或多种其他杂质(例如，大块杂质)或存在于含有治疗性蛋白质的流体中的组分(例如，血浆、Cohn级分、液体培养基蛋白质或哺乳动物细胞中存在或分泌的一种或多种其他组分(例如，DNA、RNA、其他蛋白质、内毒素、病毒等))分离，所执行的一个或多个步骤。例如，可以在初始捕获步骤期间或之后进行纯化。可以使用结合治疗性蛋白质或污染物的树脂、膜或任何其他固体支持物进行纯化(例如，通过使用亲和色谱、疏水相互作用色谱、阴离子或阳离子交换色谱或分子筛色谱)。可以使用至少一个色谱柱和/或色谱膜(例如，本文所述的任何色谱柱或色谱膜)从含有治疗性蛋白质的流体中纯化治疗性蛋白质。

例如，可以通过移除污染性非免疫球蛋白的蛋白质来纯化免疫球蛋白；它们还通过移除IgG以外的免疫球蛋白来进行纯化。移除非免疫球蛋白的蛋白质和/或移除IgG以外的免疫球蛋白导致原料中所需IgG的百分比增加。纯度可以通过本领域中已知或本文描述的标准测定来量测，其实例包括SDS-PAGE，随后为考马斯蓝染色以及色谱方法(例如，在HPLC系统上的尺寸排阻色谱(SEC))。IgG样品的纯度可以在例如使用Kodak Image Station1000或等效系统来扫描后，从SDS PAGE凝胶计算，或在Shimadzu HPLC系统上通过软件来分析SEC色谱图。如果样品至少90％、95％或99％不含除了所需产物(例如免疫球蛋白)以外的组分，则所述样品被视为纯的。

优选地，所述方法产生至少80％、85％、90％、95％或99％或更高纯度的Ig制剂。“纯的”是指其中污染性非Ig蛋白得以减少的一种或多种Ig同种型的制剂，或者它是指其中基本上不存在污染性第二同种型Ig的第一Ig同种型的制剂。在一个示例性实施方案中，本发明提供了一种IgG亚型制剂，相对于仅使用蛋白A来纯化的亚型的制剂而言，所述制剂富含所述亚型。

术语“捕获”是指为了相对于含有蛋白质的混合物，例如含有IgG的起始材料中存在的一种或多种其他组分，部分纯化或分离(例如，以重量计，至少或约5％，例如，至少或约10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、至少约95％或至少约99％纯的)，任选地浓缩，并任选地使治疗性蛋白质稳定而进行的步骤。通常，捕获使用结合治疗性蛋白质的树脂来进行(例如，通过使用亲和色谱)。从液体中捕获治疗性蛋白质的非限制性方法在本文中有所描述，并且其他方法为本领域中已知的。可以使用至少一个色谱柱和/或色谱膜(例如，本文所述的任何色谱柱和/或色谱膜)从液体介质中捕获治疗性蛋白质。在一个示例性实施方案中，本发明提供了一种使制剂富含所选Ig同种型或IgG亚型的方法，其通过在亲和柱(蛋白A除外)上捕获一种或多种所需同种型和/或亚型或除了需要富集的同种型和/或亚型以外的一种或多种同种型和/或亚型来进行。

如本文所用，术语“缓冲液”是指如下物质，由于其在溶液中的存在，使必须添加以引起pH的单位变化的酸或碱的量得以增加。缓冲溶液通过其酸-碱缀合组分的作用来抵抗pH的变化。与生物试剂一起使用的缓冲溶液通常能够维持恒定氢离子浓度，使得溶液的pH在生理范围内。传统缓冲液组分包括但不限于有机和无机盐、酸和碱。

如本文所用的与色谱相关的术语“色谱柱”或“柱”是指填充有色谱基质或树脂的容器，其通常呈圆柱体或空心柱的形式。色谱基质或树脂是提供用于纯化的物理和/或化学性质的材料。

如本文所用，术语“流穿液”或“流穿液模式”是指其中污染物在色谱过程中从混合物中移除的一般纯化方法，因为它们通常在与柱中的色谱介质结合的情况下被色谱过程保留。因为所关注蛋白质未与色谱介质(通常柱中的色谱介质)结合(或与污染物相比，其不太强地结合)，而是径直流过以待收集，所以其得以纯化。“流穿液”也是指从所述色谱模式收集的液体。在含有所关注蛋白质的液体介质从柱中流过后，任选地将结合至柱上的杂质“剥离”或从柱中移除，使得柱可以再生以便用于另一次色谱运行。此方法不同于“结合和洗脱”或“结合和洗脱模式”，其中所关注靶蛋白保留在柱内的色谱介质上，并且杂质径直流过柱。然后，所述过程涉及使用不同柱条件对所关注蛋白质进行特异性洗脱，这些条件会干扰所关注蛋白质与柱中的通常为树脂的色谱介质的结合。

术语“精制”为技术术语，并且是指为了从含有接近最终所需纯度的治疗性蛋白质的流体中移除残留痕量或少量污染物或杂质而进行的步骤。例如，可以通过使含有IgG的流体穿过色谱柱或膜吸收器来进行精制，这些色谱柱或膜吸收器选择性地结合至含有靶治疗蛋白的流体中存在的IgG(靶治疗蛋白)或少量污染物或杂质。在此实例中，色谱柱或膜吸收器的洗脱液/滤液含有治疗性蛋白质。

如本文所用，术语“污染物”或“杂质”以其最广泛含义使用以涵盖混合物中的任何不需要组分或化合物。污染物蛋白质包括但不限于由供体或宿主细胞天然产生的那些，以及与所关注蛋白质相关或衍生自所关注蛋白质的蛋白质(例如，蛋白水解片段)和其他过程相关污染物。在某些实施方案中，污染物沉淀物使用例如离心、无菌过滤、深度过滤和切向流过滤的另一种方法从细胞培养物中分离出来。在各种实施方案中，污染物是需要通过实施本发明的方法来制造一种制剂而在所述制剂中富集的同种型或IgG亚型以外的Ig同种型或和IgG亚型。在所公开过程中消除或移除的示例性污染物包括白蛋白、载脂蛋白A-I、补体C3、结合珠蛋白、纤维蛋白原、补体C4-B、补体C1s次组分、补体C1r次组分、载脂蛋白B-100、α-2-巨球蛋白中的一者或多者。在一个示例性实施方案中，这些污染物在柱上溶剂/洗涤剂步骤期间被移除。

术语“加载缓冲液”是指为了制备混合物或其他样品并将其加载至色谱单元中而使用的缓冲液。

如本文所用，“洗脱液”是指从色谱柱或色谱膜中流出的液体，其含有可检测量的蛋白质。

如本文所用，“治疗性药物物质”是指包含蛋白质例如IgG的物质，所述蛋白质通过本发明的方法从污染性蛋白质、脂质和核酸(例如，存在于液体培养基中或来自宿主细胞(例如，来自哺乳动物、酵母或细菌宿主细胞)的污染性蛋白质、脂质和核酸和生物污染物(例如，病毒和细菌污染物))中充分富集、纯化或分离。可将示例性治疗药物物质配制成药剂而无需任何进一步实质性纯化和/或净化步骤。

术语“单元操作”是指可以在从原料制造治疗性蛋白质药物物质的本发明过程中执行的功能步骤。例如，单元操作可以是过滤(例如，从含有治疗性蛋白质的流体中移除污染物细菌、酵母病毒或分枝杆菌和/或特定物质)、捕获、色谱、纯化、保持或储存、精制、病毒灭活、调节含有治疗性蛋白质的液体的离子浓度和/或pH，和/或移除不需要的盐。

在一些实施方案中，本文公开的色谱系统在滑行装置上。如本文所用，“滑行装置”是指可用作本文所述的系统的平台或支持物的三维实体结构。如果滑行装置包括一个或多个能够运动的结构(例如，轮子、辊轮或类似结构)，则滑行装置可以赋予系统或其一部分移动性。

术语“多柱色谱系统”或“MCCS”是指具有总共两个或更多个互连或切换色谱柱和/或色谱膜的系统。多柱色谱系统的非限制性实例是周期性逆流色谱系统(PCC)，其包含总共两个或更多个互连或切换色谱柱和/或色谱膜。多柱色谱系统的其他实例在本文中描述并且为本领域中已知的。本发明的示例性MCCS包括与亲和配体柱流体连接的蛋白A柱，所述亲和配体柱本身可以直接或间接与一个或多个另外亲和配体柱流体连接。

在一些实施方案中，所述方法和系统的所需蛋白质例如IgG或另一种选定Ig同种型或IgG亚型的来自原料的回收率为加载至第一柱上的原料中所含蛋白质的量的至少约40％、50％、55％或60％和最多约65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或至少约99％。在一些实施方案中，纯化回收率为至少约60％至约70％。在一个示例性实施方案中，纯化回收率为加载至第一柱上的原料中所含蛋白质的量的至少约98％或至少约99％。在各种实施方案中，IgG纯化回收率为加载至第一柱上的原料中所含IgG的量的至少约98％或至少约99％。在一个示例性实施方案中，IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4中的一者或多者的纯化回收率为加载至第一柱上的原料中所含相关IgG的量的至少约98％或至少约99％。

如本文所用，术语“混合”描述通过任何形式的搅动引起两种或更多种不同化合物或物质在溶液或悬浮液中的分布的行为。本申请中使用的术语“混合”所引起的所有成分在溶液或悬浮液中完全均匀分布为不需要的。

如本文所用，术语“溶剂”包括能够溶解或分散一种或多种其他物质的任何液体物质。溶剂可以在性质上为无机物，诸如水，或其可以为有机液体，诸如乙醇、丙酮、乙酸甲酯、乙酸乙酯、己烷、石油醚等。如术语“溶剂洗涤剂处理”中所用，溶剂表示有机溶剂(例如磷酸三正丁酯)，其为用于灭活溶液中脂质包膜病毒的溶剂洗涤剂混合物的一部分。示例性溶剂/洗涤剂过程在柱上进行并且除病毒源性污染物以外也移除血浆蛋白污染物例如上面提到的那些病毒源性。

如本文所用，术语“洗涤剂”在本申请中可与术语“表面活性剂(surfactant/surface acting agent)”互换使用。表面活性剂通常为两亲性的，即包含疏水基团(“尾部”)和亲水基团(“头部”)的有机化合物，从而使得表面活性剂可溶于有机溶剂和水。表面活性剂可以根据其头部是否存在正式带电基团进行分类。非离子表面活性剂的头部没有电荷基团，而离子表面活性剂的头部带有净电荷。两性离子表面活性剂的头部具有两个带相反电荷的基团。常见表面活性剂的一些实例包括：阴离子(基于硫酸根、磺酸根或羧酸根阴离子)：全氟辛酸盐(PFOA或PFO)、全氟辛烷磺酸盐(PFOS)、十二烷基硫酸钠(SDS)、月桂基硫酸铵和其他烷基硫酸盐、月桂醇聚醚硫酸钠(也称为月桂基醚硫酸钠，或SLES)、烷基苯磺酸盐；阳离子(基于季铵阳离子)：鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB)(又名十六烷基三甲基溴化铵)和其他烷基三甲基铵盐、氯化鲸蜡基吡啶鎓(CPC)、聚乙氧基化牛脂胺(POEA)、苯扎氯铵(BAC)、芐索氯铵(BZT)；长链脂肪酸和其盐类：包括辛酸盐、辛酸、庚酸盐、己酸、庚酸、壬酸、癸酸等；两性离子(两性)：十二烷基甜菜碱；椰油酰胺丙基甜菜碱；椰油酰两性基甘氨酸盐；非离子：烷基聚(环氧乙烷)、烷基酚聚(环氧乙烷)、聚(环氧乙烷)和聚(环氧丙烷)的共聚物(商业上称为泊洛沙姆(Poloxamer)或泊洛沙胺(Poloxamine))、烷基多葡糖苷(包括辛基葡糖苷、癸基麦芽糖苷)、脂肪醇(例如鲸蜡醇和油醇)、椰油酰胺MEA、椰油酰胺DEA、聚山梨酯(吐温20、吐温80 等)、Triton洗涤剂和十二烷基二甲基氧化胺。在一个示例性实施方案中，洗涤剂与溶剂组合，并且所述组合用于在本发明的方法中对蛋白质制剂进行病毒灭活步骤。在各种实施方案中，当本发明的制剂处于本发明的方法中使用的色谱柱上时，发生所述病毒灭活步骤。

如本文所用，“蛋白A”是指亲和配体，其为最初在金黄色葡萄球菌的细胞壁中发现的49kDa表面蛋白。所述蛋白质结合免疫球蛋白，并包含五个同源Ig结合结构域。包括固定化蛋白A的亲和色谱介质为本领域中已知的。如本领域技术人员所理解，在被视为本发明的范围内的本文公开的方法的变型中，可以使用代替或附加于蛋白A的其他亲和配体，例如蛋白G、蛋白A/G和蛋白L。本公开的那些明确公开蛋白A的部分也与其中使用代替或附加于蛋白A的蛋白G、蛋白A/G和/或蛋白L中的一者或多者的实施方案相关。

如本文所用，术语“不明显洗脱”是指当固定在色谱介质上的蛋白质与水溶液(例如缓冲液、溶剂/洗涤剂或其他混合物)接触时所述水溶液的如下性质，即没有或仅极少量蛋白质通过所述溶液从色谱介质上洗脱出来。在示例性实施方案中，小于约5％、小于约3％、小于约1％或小于约0.1％的蛋白质通过溶液从色谱介质洗脱。不明显洗脱蛋白质的示例性溶液是溶剂/洗涤剂溶液。未通过溶剂/洗涤剂溶液从色谱介质洗脱的示例性蛋白质是IgG。在示例性实施方案中，“不明显洗脱”是指小于约5％的固定在色谱介质上的IgG通过与溶剂/洗涤剂溶液接触而从色谱介质洗脱。

本文中标有符号“x”的表项指示相关组分未分析。

C.缩写词

BDS，原料药；CRS，冷冻上清液(在COHN分级中第一次沉淀后的上清液)；CV，柱体积；DFM，数据文件管理(协议系统)；E，洗脱级分；EDTA，乙二胺四乙酸；EtOH，乙醇；Fc，抗体FC结构域；FT，流穿液；HPLC，高效液相色谱；IgG，免疫γ球蛋白；IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、免疫γ球蛋白亚类1–4；IQEQ，平衡缓冲液(示例性IQEQ允许在吸收IgG后，进一步纯化来自一个或多个亲和柱的流穿液的血浆蛋白；例如，10mM乙酸钠、10mM TrisHCl、120mM NaCl，pH7.2)；MAB，单克隆抗体；MWCO，截留分子量；SD_VI，溶剂洗涤剂-病毒灭活，例如，10mM乙酸钠、10mM TrisHCl、120mM NaCl和SD_VI_MIX Triton X 10.55g/聚山梨酯80 3.21g/TnBP2.91g/kg缓冲液)；SEC，尺寸排阻色谱；TnBP，磷酸三正丁酯；vWF，von-Willebrand-Factor；W，洗涤级分；WB，蛋白质印迹；WSD，洗涤溶剂/洗涤剂。

C.实施方案

在一个示例性实施方案中，本发明涉及一种从原料例如含有IgG的起始材料来制备IgG制剂的亲和色谱方法，所述制剂包含IgG1、IgG2、IgG3和IgG4中的一者或多者。所述方法包括(a)使原料与第一色谱介质接触，所述第一色谱介质包括结合有蛋白A的第一固体支持物，从而形成具有蛋白A结合亲和力的IgG亚类的蛋白A结合级分，并形成包含未与蛋白A结合的IgG亚类的第一流穿液；(b)使第一流穿液与第一亲和配体色谱介质接触，所述介质包括第二固体支持物，所述第二固体支持物具有与其结合的具有IgG结合亲和力的第一亲和配体，从而形成第一亲和配体结合的IgG亚类和包含未与第一亲和配体结合IgG亚类结合的IgG亚类的第二流穿液；(c)从第一色谱介质洗脱蛋白A结合级分，从而形成第一洗脱液并将第一洗脱液与第一亲和配体色谱介质接触，从而形成第二亲和配体结合IgG亚类，和第二流穿液；和(d)从第一亲和配体柱洗脱选自第一亲和配体结合的IgG亚类、第二亲和配体结合的IgG亚类和其组合的成员，从而形成第二洗脱液。

在一个示例性实施方案中，所述方法包括(f)使(d)的第二洗脱液与第二亲和配体色谱介质接触，所述第二亲和配体色谱介质包括第三固体支持物，所述第三固体支持物具有与其结合的具有IgG亲和力的第二亲和配体，从而形成第三亲和配体结合IgG亚类和包含未与第二亲和配体色谱介质结合的第四IgG亚类的第二流穿液；和(g)从第二亲和配体色谱介质洗脱选自第二亲和配体结合的IgG亚类、第四IgG亚类和其组合的成员，从而形成第三洗脱液。

示例性实施方案包括专用洗涤步骤和柱上溶剂/洗涤剂、病毒灭活步骤(“柱上”SD_VI处理)，从而与传统IgG分级和纯化相比，减少了单元操作的总数。柱上SD_VI步骤可以在阵列中的任何柱或超过一个柱上执行。在各种实施方案中，通过将SD_VI步骤直接并入已建立的单元操作中，而不是作为独立步骤对从色谱介质中分离的材料来执行，柱上SD_VI进一步增强本发明过程的有效性和紧凑性，尤其相对于本领域中标准的分级程序而言。事实上，更意外地，将柱上SD_VI步骤并入纯化中时IgG制剂的纯度得以提高，因为预计所述步骤不会产生除了病毒灭活之外的效果。SD_VI步骤消耗或移除病毒源性杂质之外的杂质。

在示例性实施方案中，SD_VI步骤消耗或移除白蛋白、载脂蛋白A-I、补体C3、结合珠蛋白、纤维蛋白原、补体C4-B、补体C1s次组分、补体C1r次组分、载脂蛋白B-100、α-2-巨球蛋白中的至少一者。在一个示例性实施方案中，这些杂质存在于来自SD_VI步骤的洗涤液中。

在一个示例性实施方案中，缓冲液/洗涤剂混合物包含乙酸盐、Tris、Triton X、磷酸三(正丁基)酯(TnBP)。

在一个示例性实施方案中，缓冲液/洗涤剂混合物包含具有约10mM乙酸钠、约10mMTrisHCl和约120mM NaCl的缓冲液组分，以及每kg缓冲溶液具有约10.55g Triton X、3.21g聚山梨酯80和约2.91g TnBP的洗涤剂组分。

本发明的方法和系统提供其中IgG含量相对于原料得以显著富集的制剂。

在一个示例性实施方案中，制剂中的IgG占本发明的IgG制剂蛋白质含量的至少约90％wt/wt。

在一个示例性实施方案中，制剂中的IgG1占制剂蛋白质含量的约40％至约90％wt/wt。

在一个示例性实施方案中，制剂中的IgG2占制剂蛋白质含量的约15％至约55％wt/wt。

在一个示例性实施方案中，制剂中的IgG3占制剂蛋白质含量的约0.5％至约50％wt/wt。

在一个示例性实施方案中，制剂中的IgG4占制剂蛋白质含量的约0.1％至约20％wt/wt。

本发明的示例性方法提供了高纯度IgG制剂。在各种实施方案中，本发明提供了一种IgG同种型的高纯度制剂。

在一个示例性实施方案中，制剂中的白蛋白的量小于约5g/L，例如小于约2g/L、小于约1g/L、小于约0.4g/L、小于约0.2g/L、小于约0.1g/L或小于约0.05g/L的制剂。

在一个示例性实施方案中，制剂中的因子XI活性小于约0.01E/mLt，例如小于约0.005E/mLt，例如小于约0.001E/mLt。

在一个示例性实施方案中，制剂中存在的α-2-巨球蛋白的量小于约0.2g/L，例如小于约0.1g/L，例如小于约0.05g/L的制剂。

在一个示例性实施方案中，制剂中存在的转铁蛋白的量小于约0.4g/L小于约0.2g/L，例如小于约0.09g/L的制剂。

在一个示例性实施方案中，制剂的PL1活性小于约10nm/mL min。

在一个示例性实施方案中，制剂中存在的纤维蛋白原的量小于约60μg/mL，小于约35μg/mL，例如小于约13μg/mL的制剂。

在一个示例性实施方案中，含有IgG的起始材料为冷冻上清液。

在一个示例性实施方案中，选自包括具有蛋白A的第一固体支持物的第一色谱介质、包括结合有具有IgG结合亲和力的第一亲和配体的第二固体支持物的第一亲和配体色谱介质和其组合的成员包含在单独柱中。

在一个示例性实施方案中，本发明提供了一种系统和使用所述系统的方法，其中包含蛋白A、一种或多种亲和配体色谱介质和其组合的色谱柱中的两者或更多者在柱阵列内流体连通，并且所述柱中的两者或更多者包含第二色谱介质和第二亲和配体色谱介质。这些柱任选地通过流体入口、流体出口和将来自一个或多个柱的一个或多个出口连接至一个或多个柱的一个或多个入口的管道来流体偶合。阵列中的柱可以串联、并联或以这些配置的组合来流体连通。

在一个示例性实施方案中，第一柱的出口与第二柱的入口流体连通，允许来自第一柱的洗脱液直接加载至第二柱的入口，并因此加载至其中包含的色谱介质上。

在一个示例性实施方案中，具有蛋白A的柱的出口与第一亲和配体色谱介质的入口流体连通。

在一个示例性实施方案中，包含结合有第一亲和配体的第二色谱介质的柱的出口与包含第二亲和配体色谱介质的柱的入口流体连通。

在各种实施方案中，第一柱的出口可切换地与一个或多个第二柱的入口连通。在一个示例性实施方案中，一个或多个第一柱的出口可切换地与一个或多个第二柱的入口连通。

在一个示例性实施方案中，缺乏蛋白A结合IgG亚类的IgG溶液包含选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和其组合的成员。

在另一个示例性实施方案中，第一色谱介质对人IgG抗体的CH1结构域具有选择性亲和力。

在一个示例性实施方案中，第一色谱介质对选自IgG1和IgG3的成员的CH1结构域具有选择性亲和力，所述选择性亲和力大于对选自IgG2和IgG4的成员的CH1结构域的选择性亲和力。

在一个示例性实施方案中，从第一色谱介质、第一亲和配体色谱介质和/或第二亲和配体色谱介质洗脱使用包含甘氨酸的洗脱剂。

在一个示例性实施方案中，甘氨酸浓度为约50mM至约150mM。在一个示例性实施方案中，甘氨酸浓度为约130mM。

其他洗脱剂可用于本发明，包括但不限于柠檬酸盐、乙酸盐、MES、pH低于4.0的HCl和其组合。

本发明的一个示例性实施方案涉及一种亲和色谱方法，所述方法从缺乏蛋白A结合IgG亚类的血浆源性IgG溶液中制备富含至少具有低蛋白A结合亲和力的第一IgG亚类的IgG制剂。所述方法包括(a)使缺乏蛋白A结合IgG亚类的IgG溶液与第一亲和配体色谱介质接触，所述介质包括第一固体支持物，所述第一固体支持物具有与其结合的具有IgG结合亲和力的第一亲和配体，从而形成具有低蛋白A结合亲和力的第一IgG亚类的第一结合级分和第一流穿液；和(b)洗脱具有低蛋白A结合亲和力的第一IgG亚类的第一结合级分，从而形成包含富含具有低蛋白A结合的第一IgG亚类的IgG制剂的第一洗脱液。

缺乏蛋白A结合IgG亚类的示例性源性IgG溶液通过以下方法来制备：使含有IgG的起始材料穿过包含蛋白A的色谱介质，使具有蛋白A亲和力的一个或多个IgG亚类结合，并且通常在流穿液中，从色谱介质收集对蛋白A没有足够亲和力以便在此过程中保持与蛋白A结合的那些IgG亚类。

在一个示例性实施方案中，所述方法还包括(c)在(b)之前，使具有低蛋白A结合亲和力的第一IgG亚类的第一结合级分与缓冲液/洗涤剂溶液接触，并且随后从第一亲和配体色谱介质中移除洗涤剂溶液。

在一个示例性实施方案中，所述方法还包括(d)在(b)之后，使第一洗脱液与第二色谱介质接触，所述第二色谱介质包括固体支持物，所述固体支持物具有与其结合的亲和配体，所述配体对具有低蛋白A结合亲和力的第二IgG亚类具有亲和力，从而形成具有低蛋白A结合亲和力的第二IgG亚类的第一结合级分；和(e)从第二色谱介质洗脱具有低蛋白A结合亲和力的第二IgG亚类的第一结合级分，从而形成第二洗脱液。

本发明的示例性方法使用串联的两个、三个或更多个柱。将起始蛋白混合物应用于第一柱(例如，蛋白A)的入口，然后使预选体积的洗涤溶液穿过所述柱，移除未结合的IgG和杂质，并且在一些实施方案中，使混合物中的蛋白质群体前进穿过第一柱并进入一个或多个后续柱。任选地收集离开最终柱的流穿液。在洗涤循环之后，洗脱剂，在一些实施方案中为弱酸性洗脱剂，进入第一柱的入口，将结合至色谱介质的蛋白质群体洗脱至第二柱中，使结合至第二柱管中的色谱介质的蛋白质群体穿过装置的末端，或者在一些实施方案中，进入填充有第三色谱介质的第三柱，诸如此类。在洗脱步骤中，将与第一柱中的色谱介质(例如，第二亲和配体介质)结合的蛋白质群体从所述介质中解吸，进入第二柱中并与第二柱中的第二色谱介质结合。吸附至第二介质上的蛋白质也如此，在存在第三柱的实施方案中其被解吸并进入第三柱，在不存在第三柱的那些实施方案中任选地在第二柱的末端处得以收集，或在第三柱的末端处得以收集。任选地对第三柱和后续柱重复上述过程。

在一个示例性实施方案中，来自每个柱或柱的子集的流穿液和/或洗脱液可以在加载至后续柱上之前单独收集或汇集。使用串联柱的组合和一个或多个单独柱的实施方案也在本发明的范围内。

本文还提供了通过本发明的方法制备的IgG制剂。在一个示例性实施方案中，制剂具有与人血浆基本一致的IgG亚型概况。在一个示例性实施方案中，制剂具有与人血浆基本一致的杂质概况。在一个示例性实施方案中，制剂具有与商业多克隆IgG制剂例如Gammagard液体、Kiovig、Cuvitru基本一致的IgG亚型概况和杂质概况。

根据本发明的IgG水溶液可以通过一个或多个离子交换步骤并通过将其配制成最终药学上可接受的制剂来进一步处理。

在一个示例性实施方案中，提供了一种IgG水溶液，其包含至少约99.5％ IgG和小于约0.5％杂质，其中IgG水溶液包含小于约0.0025E/mg总IgG，优选地小于约0.0020E/mg总IgG，更优选地小于约0.0015E/mg总IgG，最优选地小于约0.0012E/mg总IgG的活性的因子XI作为杂质。

在示例性实施方案中，提供了一种IgG水溶液，其包含至少约99.5％ IgG和小于约0.5％杂质，其中IgG水溶液包含小于约3.5μg/mg总IgG，优选地小于约3.0μg/mg总IgG，更优选地小于约2.5μg/mg总IgG，最优选地小于约2.2μg/mg总IgG的水平的补体C3作为杂质。

在示例性实施方案中，提供了一种IgG水溶液，其包含至少约99.5％ IgG和小于约0.5％杂质，其中IgG水溶液包含补体C3和因子XI作为杂质，其中补体C3以小于约3.5μg/mg总IgG，优选地小于约3.0μg/mg总IgG，更优选地小于约2.5μg/mg总IgG，最优选地小于约2.2μg/mg总IgG的水平存在，并且其中因子XI以小于约0.0025E/mg总IgG，优选地小于约0.0020E/mg总IgG，更优选地小于约0.0015E/mg总IgG，最优选地小于约0.0012E/mg总IgG的活性存在。在示例性实施方案中，提供了一种IgG水溶液，其包含至少约99.5％IgG和小于约0.5％杂质，其中IgG水溶液包含补体C3和因子XI作为杂质，其中补体C3以小于约2.5μg/mg总IgG的水平存在，并且其中因子XI以小于约0.0015E/mg总IgG的活性存在。

以下实施例用于说明本发明的某些示例性实施方案，不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。评估了亲和纯化方法开发与当前可用IgG产品等效或更好的下一代人IgG产品的能力。迄今为止，尚未大规模使用亲和纯化来代替分级，以便从含有IgG的起始材料中纯化IgG或其他蛋白质。

实施例

实施例1

1.1实验概述

最初实验用纯化的血浆源性多克隆IgG作为起始材料来进行。目的是以已在临床应用中使用的确定的IgG产品作为基准，快速收集信息。

在第一次筛选中，第二亲和纯化步骤的几个潜在候选物作为平行运行的独立色谱运行来评估。关于串联方法，进一步如下所述来执行：

1.用蛋白A衍生树脂捕获IgG的主要部分

2.使用替代IgG结合亲和树脂来捕获蛋白A捕获物的流穿液(FT)中存在的残留IgG

在下一步骤中，选择具有最佳结合性质(容量)的树脂用于额外实验设置。在此方法中，评估了从冷冻上清液中捕获IgG。

第一组实验被设计来对在“串联”阵列中用以捕获全部系列的IgG亚类的蛋白A和树脂的组合进行筛选。使用液体纯化血浆源性多克隆IgG制剂作为起始材料。

第二组实验被设计来直接使用改进的Cohn冷冻上清液作为起始材料来优化IgG亚类系列。

1.2生物材料

1.纯化的血浆源性多克隆IgG

2.冷冻上清液

1.3缓冲液

用于实验的所有缓冲液均在操作部门制备。缓冲液储存在+2至+8℃下。

1.4树脂的选择

对于直接捕获，Mab select PrismA(GE Healthcare)由于对氢氧化钠具有高耐受性而被选中。

冷冻上清液含有除FVIII和vWF外的所有凝血因子，冷冻沉淀后它们会减少。此事实可能导致在树脂上部分凝结和沉淀，因此需要有效再生和清洁程序。

选择用于捕获残留IgG亚群的树脂为由Thermo Fisher提供的市售色谱树脂。

表1.为改进的IgG捕获而筛选的树脂的列表

树脂
	1.CaptureSelect^TMFcXL亲和基质
2.CaptureSelect^TMCH1-XL亲和基质
	3.CaptureSelect^TMKappaXL亲和基质
4.CaptureSelect^TMIgG-Fc(ms)亲和基质
	5.CaptureSelect^TMLC-Lambda(Hu)亲和基质
6.CaptureSelect^TMKappaXP亲和基质
	7.CaptureSelect^TMIgG3亲和基质*

*未在筛选阶段应用，此归因于Capture Select CH1-XL、FcXL和FcMS能够结合纯化的多克隆IgG溶液中≥97％的IgG3。

1.5单个单元操作/集群的评估

表2.筛选阶段使用的缓冲液

1.6阶段1的色谱方案(Prisma亲和)

具有以下尺寸的色谱柱用于蛋白A捕获步骤：

柱：3.2cm h＝7.5cm A＝8.04cm² V＝60.3ml

表3.色谱方案IG_MAX

1.7筛选阶段/实验的结果

a.含有纯化的IgG的起始材料对MAb Select PrismA的亲和力

蛋白A捕获柱上的色谱运行如先前在阶段1的色谱方案中概述来执行，计算出的柱负载为30mg IgG/ml树脂。

在图1中，示出了流穿液UV概况。在使用含有IgG的起始材料的此实验设置中，低消光提供了关于人IgG高结合效率的信息。

使用含IgG的起始材料的PrismA运行的流穿液级分(UV 280信号)。

将此流穿液级分加以收集并用作进一步筛选对免疫球蛋白亚群具有不同特异性的亲和树脂的负载，如树脂的选择中所述。

1.8MabSelect PrismA树脂的负载和流穿液(FT)级分的IgG含量和亚类分布

表4.运行IGR01：“流穿液(FT)”中的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4

	IgG1	IgG2	IgG3	IgG4
					负载[mg]	1218.5	547.1	52.03	65.42
FT[mg]	18.6	<0.1	33.4	<0.1
					FT中的％²	1.5	<0.1	64.2	<0.1

.¹基于比率，其中IgG3为1部分/比率以IgG3的x倍部分给出

.²在PrismA流穿液中发现的IgG亚类的百分比

在Mab Select PrismA的流穿液中仅发现大量IgG3。

实施例2

2.1阶段2(树脂筛选)的色谱方案

具有以下尺寸的色谱柱用于使用蛋白A捕获流穿液的树脂筛选运行：

柱：10cm h＝3至4cm A＝0.79cm²V＝3.5至4.5ml

这些运行的色谱程序列出于树脂筛选运行的色谱程序下。

2.2树脂筛选运行的色谱程序

表5.树脂筛选的色谱方案

2.3Capture Select流穿液评估UV 280nm信号

图2示出了经过筛选的树脂的流穿液概况。对于例如抗λ或抗CH1-XL，观察到不同UV 280信号高度。较低流穿液UV水平导致较高UV洗脱峰。

2.4Capture Select洗脱液评估UV280 nm信号

图3示出经过筛选的树脂的洗脱概况。观察到不同UV280信号高度和面积。CaptureSelect CH1-XL显示出最高峰和最大峰面积。

基于这些数据，对CaptureSelect树脂进行了排序。最有效树脂为CaptureSelectCH1-XL。

2.5数据评估

a.含有纯化IgG的起始材料的PrismA流穿液的Capture Select亲和洗脱液的峰面积总结

表6示出了所测试的不同亲和柱的峰面积(UV280 nm)。Protein A树脂的分析结果列出于MabSelect PrismA树脂的负载和流穿液(FT)级分的IgG含量和亚类分布下。IgG2和IgG4几乎定量捕获，IgG1和IgG3的捕获效率较低。这些亚型被第二树脂捕获。CaptureSelect CH1-XL被鉴定为结合Mab Select PrismA流穿液的大部分残留IgG亚种。所述树脂作为第二柱引入以运行后续实验。

表6.色谱图评估(峰面积)

实施例3

3.1Capture Select树脂结合Mab Select PrismA流穿液中剩余IgG亚类的评估

在下表中，总结了使用不同Capture Select柱从Mab select PrismA的流穿液级分中回收IgG1和IgG3。仅列出流穿液和洗脱级分。部分可能在流穿液级分(低于检测限)和洗涤和洗脱后级分(未分析)中。

表7.Capture Select CH1 XL运行编号：CH1XL

	IgG1	IgG1	IgG3	IgG3
					负载	2.97mg	100％	5.33mg	100％
FT	低于检测限	n.a	低于检测限	n.a
					洗脱液	2.54mg	85.4％	3.77mg	70.8％

n.a＝不适用

表8.Capture Select KAPPA XL运行编号：KAPPA XL

	IgG1	IgG1	IgG3	IgG3
					负载	2.38mg	100％	4.27mg	100％
FT	低于检测限	n.a	0.94mg	22.1％
					洗脱液	低于检测限	n.a	1.28mg	30.0％

n.a＝不适用

表9.Capture Select LC_LAMBDA(Hu)运行编号：LAMBDA(Hu)

	IgG1	IgG1	IgG3	IgG3
					负载	2.88mg	100％	5.17mg	100％
FT	低于检测限	n.a	1.88mg	36.3％
					洗脱液	1.66mg	57.7％	1.19mg	22.9％

n.a＝不适用

表10.Capture Select FcXL运行编号：FcXL

	IgG1	IgG1	IgG3	IgG3
					负载	2.52mg	100％	4.52mg	100％
FT	低于检测限	n.a	0.02mg	2.8％
					洗脱液	2.17mg	86.0％	2.94mg	65.0％

n.a＝不适用

表11.Capture Select KAPPA XP运行编号：KAPPA_XP_P

	IgG1	IgG1	IgG3	IgG3
					负载	2.90mg	100％	5.20mg	100％
FT	低于检测限	n.a	1.53mg	29.4％
					洗脱液	2.96mg	102.0％	2.89mg	55.7％

n.a＝不适用

表12.Capture Select FcMS运行编号：FcMS

	IgG1	IgG1	IgG3	IgG3
					负载	2.37mg	100％	4.25mg	100％
FT	低于检测限	n.a	0.12mg	2.8％
					洗脱液	1.91mg	80.7％	2.88mg	67.8％

n.a＝不适用

实施例4

4.1变体IGC02

a.IGC02中使用的缓冲液组成

表13.缓冲液组成

4.2IGC02运行

IGC02分两个步骤进行–首先在MAB Select PrismA上进行亲和，并且作为第二步骤，将MAB Select PrismA流穿液应用至Capture Select CH1_XL上。

来自Cohn分级过程的冷冻上清液在实验前未经任何进一步处理而被引入纯化过程。

a.第一步骤

用IQEQ缓冲液将MAB-Select PrismA(GE Healthcare，目录号：17-5498-02,ID:3.2cm h＝7.5cm A＝8.04cm² V＝60.3ml)平衡后，将冷冻上清液应用至柱上，接触时间约为6min。

加载后，使用2CV缓冲液IQEQ进行第一次洗涤，以移除树脂中未结合的蛋白质(添加至流穿液中)。通过应用IQEQ_VI缓冲液来进行SD_VI柱上处理，所述缓冲液含有1kg IQEQ缓冲液中的10.55gTriton X-100、3.21g聚山梨酯80和2.91g TnBP的洗涤剂组合物(对应于1％/0.3％/0.3％的Triton X100/聚山梨酯80/TnBP)。通过在4CV内以4ml/min的流速将结合蛋白与IQEQ_VI缓冲液接触至少约60分钟来运行柱上SD_VI。任选地收集洗涤液用于分析。

洗涤2使用IQEQ缓冲液来进行，以进一步消除杂质，并以10CV和10ml/min的流速清洗SD_VI试剂。任选地收集洗涤液用于分析。

通过应用5CV的E1缓冲液(100mM甘氨酸，pH 3.2)，进行洗脱。使用E2缓冲液(100mM甘氨酸，pH 2.7)执行清洁程序(剥离)的第一步骤。

在4CV的IQEQ缓冲液的再平衡后，柱得以再生并储存。

再生程序和储存在再生程序中进行了描述。

实施例5

5.1柱

MAB Select PrismA

GE Healthcare，目录号：17-5498-02

批号：10264190

ID:3.2cm h＝7.5cm A＝8.04cm² V＝60.3ml(目标)

表14.色谱方案

a.色谱图IGC02

参见图4。

5.1第二步骤IGC01S

用IQEQ缓冲液将Capture Select CH1-XL(Thermo Fisher，目录号：2943452050,ID:1.0cm h＝3.8cm A＝0.79cm² V＝3.0ml)平衡后，将MAB Select PrismA流穿液(IGC02)应用至柱上，接触时间约为10min。

加载后，使用5CV缓冲液IQEQ进行第一次洗涤，以移除树脂中未结合的蛋白质(添加至流穿液中)。通过应用IQEQ_VI缓冲液来进行SD_VI柱上处理，所述缓冲液含有1kg IQEQ缓冲液中的10.55gTriton X-100、3.21g聚山梨酯80和2.91g TnBP的洗涤剂组合物。通过在10CV(100min)内以0.3ml/min的流速将结合蛋白与IQEQ_VI缓冲液接触至少60分钟，进行SD_VI柱上。

洗涤2使用IQEQ缓冲液进行，以进一步消除杂质，并以20CV和0.8ml/min的流速清洗SD_VI试剂。

通过应用10CV的E2缓冲液(100mM甘氨酸，pH 2.7)，进行洗脱。

在10CV的IQEQ缓冲液的再平衡后，柱得以再生并储存。

再生程序和储存在再生程序中进行了描述。

5.2柱

Capture Select CH1XL

Thermo Fisher，目录号：2943452050

批号：170426-01

ID:10cm h＝3.8cm A＝0.79cm² V＝3.0ml

表15.色谱方案

a.色谱图IGC01S

参见图5。

5.3运行IGC02的结果

表16.“PrismA流穿液(FT)”中的IGC02 IgG1、IGg2、IgG3和IgG4

	IgG1	IgG2	IgG3	IgG4
					负载[mg]	761.5	338.2	51.66	65.77
FT[mg]	34.43	x^a	36.36	x^a
					FT中的％²	4.5％	x^a	70.4％	x^a

.¹基于比率，其中IgG3为1部分/比率以IgG3的x倍部分给出

.²在PrismA流穿液中发现的IgG亚类的百分比

在Mab Select PrismA的流穿液中仅发现大量IgG3。

x^a低于检测限的值

表17.Capture Select CH1_XL上的IgG1和IgG3

x^a低于检测限的值

{注意：此柱基本上捕获了所有IgG1和IgG3}

实施例6

6.1变体IGC04

a.实施例6中使用的缓冲液组成

表18.缓冲液组成

6.2IGC04

来自Cohn的冷冻上清液是纯化过程的起始材料，在实验前无需任何进一步处理。实验在+2至+8℃下进行。

在平衡串联的MAB-Select PrismA(GE Healthcare，目录号：17-5498-02,ID:3.2cm h＝7.5cm A＝8.04cm² V＝60.3ml)和Capture Select CH1-XL Thermo Fisher，目录号：2943452050)ID:2.2cm h＝3.6cm A＝3.81cm² V＝13.7ml(第一柱的流穿液直接加载至第二柱)之后，将冷冻上清液应用至柱上，CH1-XL柱的接触时间约为6min[2.3ml/min]。

加载后，使用2CV缓冲液IQEQ进行第一次洗涤，以移除树脂中未结合的蛋白质。通过应用IQEQ_VI缓冲液来进行SD_VI柱上处理，所述缓冲液含有1kg IQEQ缓冲液中的10.55gTriton X-100、3.21g聚山梨酯80和2.91g TnBP的洗涤剂组合物(将洗涤剂组合物的组分混合约15分钟；随后在混合下添加至IQEQ缓冲液中)。通过在4CV内以4ml/min的流速将结合蛋白与IQEQ_VI缓冲液接触最少60分钟来运行柱上SD_VI。对于SD_VI步骤：将16.6g/Kg SD_VI_MIX添加至10mM乙酸钠、10mM TrisHCl、120mM NaCl，pH 7.2。SD_VI_MIX是通过按10.55gTriton X100/3.21g聚山梨酯80/2.91gTnPB(磷酸三正丁酯)的比率混合洗涤剂/溶剂至少15min并在混合下将其添加至缓冲液来制备。

洗涤2使用W2缓冲液进行，以进一步消除杂质，并以5CV和10ml/min的流速洗掉SD_VI试剂。通过以10ml/min的流速应用6CV的IQEQ缓冲液来执行第三个，即最后一个洗涤步骤。

通过应用5CV的E1缓冲液(100mM甘氨酸，pH 3.2)，进行洗脱。

使用E2缓冲液(100mM甘氨酸，pH 2.7)执行清洁程序(剥离)的第一步骤。

在4CV的IQEQ缓冲液的再平衡后，柱得以再生并单独储存。

CV为两根柱(CH1-XL和Capture Select CH1-XL)的总体积。

再生程序和储存在再生程序中进行了描述。

实施例7

如下所述处理来自实施例6(IGC04)的洗脱液。所述实施例被描述为实施例6-变体IGC04。

7.1串联柱阵列

a.柱1

MAB Select Prism A

GE Healthcare，目录号：17-5498-02

批号：10264190

ID:3.2cm h＝7.5cm A＝8.04cm² V＝60.3ml(目标)

b.柱2

Capture Select CH1XL

Thermo Fisher，目录号：2943452050

批号：170426-01

ID:2.2cm h＝3.6cm A＝3.81cm² V＝13.7ml

柱体积1+2：74.0ml程序化：74.506(柱1+2+连接-定义为1CV)

表19.色谱方案

柱体积1+2：74.0ml程序化：74.506(柱1+2+连接-定义为1CV)

*柱上的接触时间约为6min

对级分WSD进行了采样并详细分析。对W2和W3级分进行了采样并在SDS PAGE银染色中进行分析。

c.色谱图IGC04

参见图6。

7.2实施例7的结果和数据

表20.如通过免疫分析(ELISA)确定的IgG的浓度

级分	负载	FT	洗脱液	剥离
					IgG浓度	4.92mg/ml	0.23mg/ml	8.70mg/ml	0.03mg/ml

表21.产率IgG亚类分布负载与洗脱液

亚类	范围	负载	洗脱液	步骤产率
					IgG 1	50–70％	62.3％	65.8％	87.1％
IgG 2	26.7–37.3％	28.1％	28.2％	82.6％
					IgG 3	>2.5％	6.4％	2.6％	34.0％
IgG 4	>2.5％	3.2％	3.4％	86.3％
					IgA	n.a	100％	12.0％	12.0％
IgG	n.a	100％	92.9％	92.9％
					IGM	n.a	100％	22.5％	22.5％

n.a＝不适用

产品/杂质概况

产生关于IMAX_FC_CRS_04WSD(含有SD_VI试剂的洗涤缓冲液)和洗脱液IMAX_FC_CRS_04(串联的两个柱MAB Select Prism A和Captur Select CH1_XL的洗脱液)的蛋白质概况的LC-MS数据，所述洗脱液代表亲和纯化后的中间产物级分。通过RP-HPLC-ESI-MS/MS确定SD_VI柱上病毒灭活洗涤级分的杂质概况，以及洗脱液的产物/杂质概况。将样品用TCA来沉淀，还原，烷基化，用胰蛋白酶消化，随后用与Eclipse Orbitrap联用的ThermoUltiMate Cap-HPLC进行分析(RP-HPLC-ESI-MSMS分析)。使用“Proteome Discoverer”软件分析数据。结果包括每个样品的蛋白质组成和相对蛋白质丰度(无标记定量)。

结果

结果列于表22和表23中。所有检测到的不同免疫球蛋白变体被合并至一个蛋白质条目“免疫球蛋白”中，并总结了所有相应面积百分比值。登录号来自UniProt KB。面积％值为0.00％表示可以检测和识别蛋白质，但相对量低于0.01％的临限值

结论

级分IMAX_FC_CRS_04WSD(“洗涤级分”)包含在柱上SD_VI期间消除的杂质。“洗涤级分”样品具有66.96％免疫球蛋白和33.04％其他蛋白质的蛋白质组成。可以检测和识别150种不同蛋白质。(表22)。WSD中的血清淀粉样蛋白A-2蛋白、异戊二烯半胱氨酸氧化酶1、富含亮氨酸的α-2糖蛋白、凝血因子XI、蛋白多糖4、羧肽酶B2、性激素结合球蛋白、脂联素、透明质酸结合蛋白2、嗜中性粒细胞防御素1、Ras相关蛋白Rap-1b、转化生长因子-β诱导蛋白ig-h3、整合素β-3、备解素或羧肽酶N催化链基本上为0％。

“洗脱液”样品具有99.57％免疫球蛋白和0.43％其他蛋白质的蛋白质组成。可以检测和识别26种不同蛋白质。(表23)。洗脱液代表高纯度人IgG池(>99％)，与目前市售IgG产品相比具有更高质量。亲和洗脱液基本上含有0％的α-1-酸性糖蛋白2、转甲状腺素蛋白、载脂蛋白B-100、C4b结合蛋白α链、纤连蛋白、富含组氨酸的糖蛋白、补体C5或妊娠带蛋白。

表22.WSD(洗涤级分)的杂质概况

表23.亲和洗脱液E1的产物/杂质概况

表24.亲和洗脱液(LC-MS运行IMAX_FC_CRS_04)的杂质概况

a.SDS PAGE银染概况

参见图7。

实施例8

8.1

a.实施例8中使用的缓冲液组成

表25.缓冲液组成

8.1.运行

将来自Cohn分级过程的冷冻上清液用作纯化过程的起始材料，在实验前无需任何进一步处理。在平衡串联的MAB-Select PrismA(GE Healthcare，目录号：17-5498-02,ID:3.2cm h＝7.5cm A＝8.04cm²V＝60.3ml)和Capture Select CH1-XL(Thermo Fisher，目录号：2943452050,ID:2.2cm h＝3.6cm A＝3.81cm² V＝13.7ml)和Capture Select IgG3(Thermo Fisher，目录号：191304010,ID:2.2cm h＝3.1cm A＝3.81cm² V＝11.8ml)的3个柱的阵列之后，将冷冻上清液应用至柱上，CH1-XL柱的接触时间约为6min[2.3ml/min]。

加载后，使用2CV缓冲液IQEQ进行第一次洗涤，以移除树脂中未结合的蛋白质。通过应用IQEQ_VI缓冲液来进行SD_VI柱上处理，所述缓冲液含有1kg IQEQ缓冲液中的10.55gTriton X-100、3.21g聚山梨酯80和2.91g TnBP的洗涤剂组合物。通过在4CV内以4ml/min的流速将结合蛋白与IQEQ_VI缓冲液接触至少60分钟，进行SD_VI柱上。

通过应用5CV的E1缓冲液(100mM甘氨酸，pH 3.2)，进行洗脱。使用E2缓冲液(100mM甘氨酸，pH 2.7)执行清洁程序(剥离)的第一步骤。在4CV的IQEQ缓冲液的再平衡后，柱得以再生并单独储存。

8.2Tridem柱阵列：

a.柱1

MAB Select Prism A

GE Healthcare，目录号：17-5498-02

批号：10264190

ID:3.2cm h＝7.5cm A＝8.04cm² V＝60.3ml

b.柱2

Capture Select CH1XL

Thermo Fisher，目录号：2943452050

批号：170426-01

ID:2.2cm h＝3.6cm A＝3.81cm² V＝13.7ml

c.柱3

Thermo Fisher，目录号：191304010

批号：151012-01

ID:2.2cm h＝3.1cm A＝3.81cm² V＝11.8ml

柱体积1+2+3：85.8ml程序化：86.4(柱1+2+3+连接)

8.3色谱图

参见图8。

8.4运行结果和数据

a.产率IgG亚类分布负载与洗脱液

Tridem阵列提供了一种高效方法，可将Cohn级分纯化为与血浆IgG亚类分布相当的IgG模式。IgG亚类的比率与商业IVIG产品中的模式几乎相同。只有IgG4的量更高。SDS-PAGE银染证实了亲和洗脱液的高纯度。

表26.产率IgG亚类分布负载与洗脱液

*参考，人血清

b.亲和洗脱液的杂质概况

表27.亲和洗脱液(LC-MS运行IMAX_FC_CRS_06)*的杂质概况

杂质	洗脱液	负载
			白蛋白	<0.335g/L	x
因子XI	<0.01E/ml	0.93E/ml
			α2-巨球蛋白	<0.185g/L	x
转铁蛋白	<0.0884g/L	x
			PL1活性	<10nm	x
纤维蛋白原	13.0μg/ml	x
			Amidolyt S2222	<5nm/ml min	6.51nm/ml min
Amidolyt S2251	<5nm/ml min	5.56nm/ml min
			Amidolyt S2288	<5nm/ml min	10.9nm/ml min
Amidolyt S2302	<5nm/ml min	7.45nm/ml min
			C3 ELISA	4.8μg/ml	x

*串联的三个免疫亲和柱

b.SDS PAGE银染概况

参见图9。

IgG亚类的广泛模式通过使用串联的两个和/或三个包含互补免疫球蛋白结合树脂的柱的组合，从含有IgG的起始材料(冷冻上清液，Gammagard液体)中获得的。所得中间体(洗脱液)的纯度高得惊人，可与单克隆抗体纯化中使用的亲和纯化步骤相媲美。

实施例9

9.1装备

对于这些实验，使用了所述系统配备了能够在线监测UV吸收(2mm流动池)、电导率、压力、温度和pH，并进行电子记录的探针。色谱单元使用系统软件Unicorn 7.3来操作。

表28.色谱滑行装置

9.2再生程序

a.Capto Select PRISM A通常使用1M NaOH通过应用2CV进行再生，总时间为30分钟。

表29.STRIP PRISM A后的再生序列(100mM甘氨酸pH 2.7)CV：60ml

b.Capture Select CH1-XL使用50％(w/w)乙二醇、10％(w/w)乙醇胺、0.1％聚山梨酯80、pH 8.5(PDAM缓冲液)应用4CV来再生，总时间为60分钟。

表30.STRIP CH1_XL后的再生序列(100mM甘氨酸pH 2.7)CV：15ml

色谱步骤

缓冲液/样品

入口阀

CV

流量(ml/min)

出口阀

级分

平衡

IQEQ

A1

2

--

废物

再生

PDAM

S1

4

1

--

废物

平衡

IQEQ

A1

5

2

--

废物

储存

IQEQ_VI

A2

5

2

---

废物

在US10,125,189(皮下使用高浓度免疫球蛋白制剂的制备方法(Method toproduce a highly concentrated immunoglobulin preparation for subcutaneoususe))；US 9,468,675(通过精细二氧化硅处理移除丝氨酸蛋白酶(Removal of serineproteases by treatment with finely divided silicon dioxide))；US 8,993,734(以提高的产率生产免疫球蛋白制剂的方法(Method to produce an immunoglobulinpreparation with improved yield))；US 9,782,477(血浆中免疫球蛋白的I-IV-1级分沉淀(Fraction I-IV-1precipitation of immunoglobins from plasma))；US20150133636(生物分子的纯化(Purification of Biological Molecules))；US 20170218012(治疗性蛋白质原料药的集成连续制造(Integrated Continuous Manufacturing of TherapeuticProtein Drug Substances))中包括可与本文公开的亲和色谱生产过程一起应用或另外应用的技术和过程。所有前述参考文献均以引用方式整体并入本文。

尽管已经根据具体示例性实施方案和实施例描述了本发明，但是应当理解，本文所公开的实施方案仅用于说明目的，并且本领域技术人员可以在不脱离所附权利要求书所阐明的本发明的精神和范围的情况下进行各种修改和变更。

参考文献

本文引用的所有参考文献，包括以下参考文献，并且包括但不限于以下或说明书其他部分中引用的所有专利、专利申请和非专利文献，以引用方式整体并入本文。

1)DOI：105772/36427Affinity Chromatography for Purification of IgGfrom Human Plasma,Hofbauer L.et al.

2)US8945895B2 Methods of purifying recombinant ADAMTS13 and otherproteins and compositions thereof.

3)WO2019133677Adeno-associated virus purification methods.

Claims

1.一种从含有IgG的起始材料制备IgG制剂的亲和色谱方法，所述制剂包含IgG1、IgG2、IgG3和IgG4中的一者或多者，所述方法包括：

(a)将所述含有IgG的起始材料与第一色谱介质接触，所述第一色谱介质包括结合有蛋白A的第一固体支持物，从而形成具有蛋白A结合亲和力的IgG亚类的蛋白A结合级分，并形成包含未与蛋白A结合的IgG亚类的第一流穿液；

(b)使所述第一流穿液与第一亲和配体色谱介质接触，所述第一亲和配体色谱介质包括第二固体支持物，所述第二固体支持物具有与其结合的具有IgG结合亲和力的第一亲和配体，从而形成第一亲和配体结合的IgG亚类和包含未与所述第一亲和配体结合的IgG亚类结合的IgG亚类的第二流穿液；

(c)从所述第一色谱介质洗脱所述蛋白A结合级分，从而形成第一洗脱液并使所述第一洗脱液与所述第一亲和配体色谱介质接触，从而形成第二亲和配体结合的IgG亚类，和第二流穿液；和

(d)从第一亲和配体柱洗脱选自所述第一亲和配体结合的IgG亚类、所述第二亲和配体结合的IgG亚类和其组合的成员，从而形成第二洗脱液。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一流穿液和所述第二洗脱液在所述第一亲和配体色谱介质上合并。

3.根据权利要求2所述的方法，其还包括：

(e)使(d)的所述第二洗脱液与第二亲和配体色谱介质接触，所述第二亲和配体色谱介质包括第三固体支持物，所述第三固体支持物具有与其结合的具有IgG亲和力的第二亲和配体，从而形成第三亲和配体结合的IgG亚类和包含未与所述第二亲和配体色谱介质结合的第四IgG亚类的第二流穿液；和

(f)从所述第二亲和配体色谱介质洗脱选自所述第二亲和配体结合的IgG亚类、所述第四IgG亚类和其组合的成员，从而形成第三洗脱液。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述第一流穿液和所述第二洗脱液在所述第二亲和配体色谱介质上合并。

5.根据权利要求1所述的方法，其还包括：

(g)在(b)之前，使所述第一色谱介质与缓冲液/洗涤剂混合物接触，所述缓冲液/洗涤剂混合物不会从所述第一色谱介质中洗脱具有蛋白A结合亲和力的IgG亚类的蛋白A结合级分。

6.根据权利要求3所述的方法，其还包括：

(h)在(f)之前，使所述第二亲和配体色谱介质与缓冲液/洗涤剂混合物接触，所述缓冲液/洗涤剂混合物不会明显地从所述第二亲和配体色谱介质洗脱所述第二亲和配体结合的IgG亚类。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述缓冲液/洗涤剂混合物包含乙酸盐、Tris、Triton X、磷酸三(正丁基)酯(TnBP)。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述缓冲液/洗涤剂混合物包含：

具有约10mM乙酸钠、约10mM TrisHCl和约120mM NaCl的缓冲液组分，和具有约10.55gTriton X、3.21g聚山梨酯80和约2.91g TnBP/kg缓冲溶液的洗涤剂组分(相对于1kg缓冲液，约16.6gSD_VI试剂)。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述制剂中的IgG占所述制剂的蛋白质含量的至少约90％(wt/wt)。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述制剂中的IgG1占所述制剂的蛋白质含量的约40％至约90％(wt/wt)。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述制剂中的IgG1占所述制剂的蛋白质含量的约50％至约70％(wt/wt)。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述制剂中的IgG2占所述制剂的蛋白质含量的约10％至约50％(wt/wt)。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述制剂中的IgG2占所述制剂的蛋白质含量的约27％至约37％(wt/wt)。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述制剂中的IgG3占所述制剂的蛋白质含量的约0.1％至约50％(wt/wt)。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述制剂中的IgG3占所述制剂的蛋白质含量的约0.5％至约8％(wt/wt)。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述制剂中的IgG4占所述制剂的蛋白质含量的约3％至约70％(wt/wt)。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述制剂中的IgG4占所述制剂的蛋白质含量的约0.5％至约8％(wt/wt)。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中：

(i)所述制剂中的IgG1占所述制剂的蛋白质含量的约50％至约70％(wt/wt)；

(ii)所述制剂中的IgG2占所述制剂的蛋白质含量的约27％至约37％(wt/wt)；

(iii)所述制剂中的IgG3占所述制剂的蛋白质含量的约2.5％至约8％(wt/wt)；和

(iv)所述制剂中的IgG4占所述制剂的蛋白质含量的约3％至约70％(wt/wt)。

19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述制剂中的白蛋白的量小于约5g/L所述制剂。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述制剂中的因子XI活性小于约0.01E/mL。

21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述制剂中存在的α-2-巨球蛋白的量小于约0.2g/L所述制剂。

22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述制剂中存在的转铁蛋白的量小于约0.09g/L所述制剂。

23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述制剂的PL1活性小于约10nm/mLmin。

24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述制剂中存在的纤维蛋白原的量小于约35μg/mL所述制剂。

25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述含有IgG的起始材料为冷冻上清液。

26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中选自包括具有蛋白A的第一固体支持物的所述第一色谱介质、包括结合有具有IgG结合亲和力的第一亲和配体的第二固体支持物的所述第一亲和配体色谱介质和其组合的成员包含在单独柱中。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述柱中的两者或更多者在阵列内流体连通，并且其中所述柱中的两者或更多者包含第二色谱介质和第二亲和配体色谱介质。

28.根据权利要求27所述的方法，其中第一柱的出口与第二柱的入口流体连通。

29.根据权利要求28所述的方法，其中具有蛋白A的所述柱的出口与所述第一亲和配体色谱介质的入口流体连通。

30.根据权利要求27所述的方法，其中含有所述第二色谱介质的所述柱的出口与含有所述第二亲和配体色谱介质的所述柱的入口流体连通。

31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中缺乏蛋白A结合IgG亚类的所述IgG溶液包含选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和其组合的成员。

32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一色谱介质对人IgG抗体的CH1结构域具有选择性亲和力。

33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一色谱介质对选自IgG1和IgG3的成员的CH1结构域具有选择性亲和力，所述选择性亲和力大于对选自IgG2和IgG4的成员的CH1结构域的选择性亲和力。

34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中从所述第一色谱介质、所述第一亲和配体色谱介质、所述第二亲和配体色谱介质洗脱使用包含甘氨酸的洗脱剂。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述甘氨酸浓度为约50mM至约150mM。

36.一种从缺乏蛋白A结合IgG亚类的血浆源性IgG溶液制备富含具有低蛋白A结合亲和力的第一IgG亚类的IgG制剂的亲和色谱方法，所述方法包括：

(a)使缺乏蛋白A结合IgG亚类的所述IgG溶液与第一亲和配体色谱介质接触，所述第一亲和配体色谱介质包括第一固体支持物，所述第一固体支持物具有与其结合的具有IgG结合亲和力的第一亲和配体，从而形成具有低蛋白A结合亲和力的所述第一IgG亚类的第一结合级分和第一流穿液；和

(b)洗脱具有低蛋白A结合亲和力的所述第一IgG亚类的所述第一结合级分，从而形成包含富含具有低蛋白A结合的所述第一IgG亚类的所述IgG制剂的第一洗脱液。

37.根据权利要求36所述的方法，其还包括：

(c)在(b)之前，使具有低蛋白A结合亲和力的所述第一IgG亚类的所述第一结合级分与缓冲液/洗涤剂溶液接触，并且随后从所述第一亲和配体色谱介质中移除所述洗涤剂溶液。

38.根据权利要求36所述的方法，其还包括：

(d)在(b)之后，使所述第一洗脱液与第二色谱介质接触，所述第二色谱介质包括固体支持物，所述固体支持物具有与其结合的亲和配体，所述亲和配体对具有低蛋白A结合亲和力的第二IgG亚类具有亲和力，从而形成具有低蛋白A结合亲和力的第二IgG亚类的第一结合级分；和

(e)从所述第二色谱介质洗脱具有低蛋白A结合亲和力的所述第二IgG亚类的所述第一结合级分，从而形成第二洗脱液。

39.根据权利要求38所述的方法，其还包括：

(f)在(e)之前，使具有低蛋白A结合亲和力的所述第二IgG亚类的所述第一结合级分与缓冲液/洗涤剂溶液接触，并且随后从所述第一色谱介质中移除所述洗涤剂溶液。

40.根据权利要求36所述的方法，其还包括：

(g)在(a)之前，使血浆源性IgG溶液与包含与固体支持物结合的蛋白A的蛋白A色谱介质接触，从而形成对蛋白A具有高亲和力的IgG亚类的蛋白A结合级分，和富含具有低蛋白A结合亲和力的第一IgG亚类的所述IgG制剂。

41.根据权利要求36所述的方法，其还包括：

(h)从所述蛋白A色谱介质中洗脱对蛋白A具有高亲和力的IgG亚类的所述蛋白A结合级分，从而形成第三洗脱液。

42.根据权利要求36-41中任一项所述的方法，其还包括合并所述第一洗脱液、所述第二洗脱液和所述第三洗脱液中的两者或更多者的步骤。

43.一种IgG水溶液，其包含至少约99.5％IgG和小于约0.5％杂质，其中所述IgG水溶液包含小于约0.0025E/mg总IgG，优选地小于约0.0020E/mg总IgG，更优选地小于约0.0015E/mg总IgG，并且最优选地小于约0.0012E/mg总IgG的活性的因子XI作为杂质。

44.一种IgG水溶液，其包含至少约99.5％IgG和小于约0.5％杂质，其中所述IgG水溶液包含小于约3.5μg/mg总IgG，优选地小于约3.0μg/mg总IgG，更优选地小于约2.5μg/mg总IgG，并且最优选地小于约2.2μg/mg总IgG的水平的补体C3作为杂质。