CN118846202A - 一种用于感染创面止血和治疗的伤口敷料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及创伤敷料技术领域，特别是涉及一种用于感染创面止血和治疗的伤口敷料及其制备方法。本发明的伤口敷料包括如下组分：HACC‑MMT、SA、Ca‑EDTA和GDL；本发明通过在敷料中引入壳聚糖季铵盐改性蒙脱土，在Ca‑EDTA和GDL的共同作用下与SA交联，得到的敷料既具备良好的力学性能，也具备较好的抗菌、抗炎效果，可以提供更为全面的治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及创伤敷料技术领域，特别是涉及一种用于感染创面止血和治疗的伤口敷料及其制备方法。
背景技术
皮肤是人体的主要器官之一，可维持人体内环境稳定和阻止微生物侵入；防止人体内水分和电解质的流失；经由感受温度、压力等外界刺激，从而对人体体温、传感、免疫、排泄等功能进行调节。因此，当皮肤受到损伤时，对伤口应进行及时有效地保护处理，防止创面受到感染对机体造成二次伤害。对于受伤的人体，在皮肤正常的生理功能受到破坏的情况下，医用敷料可以保护人体，避免其受到更大损伤。冷冻干燥形成的医用伤口敷料可以避免使用有机溶剂对样品带来污染，且在低温下可保证材料的活性和稳定性。同时，其与出血创面接触后，能迅速吸收血液中的水分，使局部血液快速浓缩，血流减缓，由于血液浓缩，血小板聚集，激活凝血因子，缩短凝血时间，起到快速止血的作用。除此以外，其中的活性成分释放还可以治疗感染伤口。
创口大量出血而得不到有效控制是事故中伤员死亡的主要原因，而在其后的创口愈合过程中，细菌感染则是威胁伤员生命的最大因素，然而目前的伤口敷通常无法完全满足止血迅速、对伤口刺激性小以及具有良好的生物相容性和生物可降解性的特点，甚至很多伤口敷料多加入凝血酶、抗生素来干预凝血系统以促进血液凝固和抵抗细菌感染，这往往会影响人体内的离子平衡，同时也易产生细菌耐药性。因此，现在迫切需要开发一种多功能且高效的新型医用伤口敷料，既能有效控制感染，又能促进伤口愈合，并且具有广谱抗菌和抗炎特性。
壳聚糖是由甲壳素产生脱乙酰化反应后衍生而成，此类衍生物具有抗菌作用，其自然界中唯一带正电的碱性多糖，在创伤愈合中发挥着重要的作用，具有良好的生物相容性，生物可降解性，止血、抗菌、愈合剂以及镇痛剂，但壳聚糖在凝胶海绵等敷料中力学性能差，同时单一形式的壳聚糖效果不是很好。因此需要对其进行改进。如中国专利文本CN109260501 A 中公开了一种生物降解型创伤敷料的制备方法，首先采用稀土盐对壳聚糖进行改性，然后将改性后壳聚糖，和改性细菌纤维素混合，加入交联剂得到敷料。稀土盐具有很好的抗炎杀菌作用，同时具有良好的抗菌活性，将其改性壳聚糖，用于增强壳聚糖的抗菌性，改性的细菌纤维素引入纳米蒙脱石，一部分可以增强细菌纤维素本身的抗菌性，另一部分在壳聚糖、细菌纤维素交联过程中稀土盐与纳米蒙脱石进行配位，继而在交联网状结构下进一步结合，提高材料体系的稳定性。
发明内容
为了解决上述问题，本发明开发了一种用于感染创面止血和治疗的伤口敷料，该敷料中引入壳聚糖季铵盐改性蒙脱土，同时配合海藻酸钠形成网络凝胶结构，得到的敷料具有良好的机械性能，止血迅速、对伤口刺激性小、且具有良好的生物相容性和生物降解能。同时，该伤口敷料能够对抗细菌感染，且不会产生细菌耐药性。
本发明第一方面提供了一种用于感染创面止血和治疗的伤口敷料，包括如下组分：HACC-MMT、SA、Ca-EDTA和GDL；所述HACC-MMT是通过如下方法制备得到的，包括步骤：通过将壳聚糖与(3-氯-2-羟丙基)三甲基氯化铵反应制备得到HACC，然后在蒙脱土溶液中加入相当于蒙脱土2.0倍CEC（阳离子交换量）的制备得到的HACC，于40-70℃恒温条件下搅拌反应，然后离心干燥得到所述的HACC-MMT。
通过将壳聚糖与(3-氯-2-羟丙基)三甲基氯化铵（CHPTMAC）反应制备壳聚糖季铵盐HACC，改性得到的HACC具有更好的水溶性。同时，HACC作为阳离子高分子可以对蒙脱土进行改性，以调节蒙脱土纳米片层表面性质，壳聚糖季铵盐通过分子链上大量的阳离子基团与蒙脱土片层表面的负电荷中心形成多位点结合形成改性后的蒙脱土。同时，HACC还可能利用未结合链段与SA(海藻酸钠)分子链上的羧基之间的静电作用形成互穿型凝胶网络，增强伤口敷料的缓释性能。另外HACC-MMT在Ca-EDTA和GDL的共同作用下可与SA原位交联，绿色无污染。
本发明实施例的蒙脱土包括常规意义理解的纳米蒙脱土，即脱土系蒙皂石粘土（包括钙基、钠基、钠-钙基、镁基蒙粘土）经剥片分散、提纯改型、超细分级、有机复合而成，蒙脱土含量大于95%。也可以是以蒙脱石为主的含水粘土矿经过剥片分散、提纯改型、超细分级、有机复合而成的相关纳米产品，蒙脱石含量大于≥ 60%，如膨润土。只要其中，蒙脱土成分含量≥60%，产品粒径为纳米级即可。
壳聚糖季铵盐HAAC为水速溶阳离子，具有良好的抗菌性、成膜性、阳离子吸附性、吸湿保湿性、絮凝性、抗静电性等性能；其抗菌性能优于壳聚糖及其它壳聚糖衍生物。通常是由壳聚糖与(3-氯-2-羟丙基)三甲基氯化铵（CHPTMAC）反应制备；优选地，HACC是通过如下方法制备得到的，包括步骤：
在50 ℃条件下，将壳聚糖分散于pH=8-11的NaOH 溶液中，持续搅拌1 h使其活化。然后将(3-氯-2-羟丙基)三甲基氯化铵溶液滴加入上述活化后的混合液中，加热至70 ℃，持续搅拌5-12 h后，将混合液pH调至中性，然后离心、透析、冷冻干燥，得到HACC。
可以采用酸溶液调节至中性，如盐酸溶液，硫酸溶液，硝酸溶液等。
搅拌时间可以是5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h等。
优选地，所述3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵溶液浓度为60wt%，所述NaOH溶液浓度为40v/v%-60 v/v%，壳聚糖：NaOH溶液：3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵溶液=2g：100mL：40mL。
优选地，本发明实施例的用于感染创面止血和治疗的伤口敷料，还包括表EGCG（没食子儿茶素没食子酸酯）。复合伤口敷料中载入EGCG，可进一步提升抗菌能力和抗炎效果，清除创面部位过量的ROS，降低炎症反应，促进细胞粘附，进而实现创面快速愈合的目的。
本发明的另一方面还提供了上述的用于感染创面止血和治疗的伤口敷料的制备方法，包括如下步骤：
配制溶液A—— HACC-MMT 的NaCl溶液、溶液B——SA的NaCl溶液、溶液C—— Ca-EDTA溶液；
将溶液A和溶液B混合均匀，得到混合溶液D；
在混合溶液D中加入溶液C混合均匀，然后加入GDL混合均匀，
最终得到的混合液倒入模具，放置充分凝胶，然后冷冻干燥得到敷料。
HACC-MMT和SA溶液先混合形成基本的胶凝网络，然后加入 Ca-EDTA作为交联剂，进一步加入GDL（D-葡萄糖酸内酯）交联，原位交联固化，绿色无污染，交联制备的复合水凝胶敷料具有优异的力学性能、一定的孔隙结构和吸水膨胀性能、可控的降解性能。
优选地，所述溶液A中，HACC-MMT浓度为1wt%，NaCl 含量为0.5M；所述溶液B中，SA浓度为2wt%，NaCl 含量为0.5M；所述溶液A与溶液B的体积比为（3-1）:（1-3）；所述溶液C中，Ca-EDTA浓度为0.2M，溶液C的添加量为1ml；所述GDL与溶液C中的Ca-EDTA 的摩尔比为2.5：1。
优选地，在4 ℃条件下放置8-20h充分凝胶。
优选地，所述溶液C是通过如下方法配制的：将EDTA-2Na·2H2O分散在蒸馏水中，充分搅拌使其完全溶解，然后在超声条件下加入无水CaCl2固体，溶液中Ca2+与EDTA的摩尔比例是1：1，最终，将该混合溶液pH调至7.0，配制成溶液C。
优选地，还包括，在混合溶液D中加入溶液C 和GDL之前，在混合溶液D中加入EGCG粉末搅拌均匀，然后再依次加入溶液C、GDL。
优选地，所述EGCG粉末的加入量为混合溶液D体积占比的1-5%，机械性能较好。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明的敷料中利用壳聚糖季铵盐对蒙脱土进行改性，使其生物相容性和水溶性提升；并加入EGCG作为活性成分，发挥抗菌、抗炎的作用；与传统单一功能的伤口敷料相比，本发明集成了止血、抗炎以及抗菌三种功能于一体，提供了更为全面的治疗效果；
2、本发明敷料原材料通过改性方法简单，可自行制备所得，价格便宜，安全可靠；
3、本发明的敷料制备方法采用原位交联法使用Ca-EDTA与GDL进行联，绿色无污染，交联制备的复合水凝胶敷料具有优异的力学性能。
4、本发明的制备方法制备得到敷料具有良好的机械性能、一定的孔隙结构和吸水膨胀性能、可控的降解性能、优异的细胞相容性和细胞增殖能力；同时还具备良好的抗菌、抗炎和消除ROS、促进血管新生的作用。
附图说明
图1 （A）实施例2、6、7、8压缩应力-应变曲线；（B）实施例2、6、7、8施加外力情况下压缩过程的照片；
图2 对比例1、2、4和实施例7（A）体外全血凝固时间；（B）在对应凝固时间的数码照片；
图3为实施例4、5和对比例3的全血凝血指数（BCI）测试结果。
具体实施方式
下列实施例可用来进一步说明本发明，但不意味着限制本发明。有必要指出，实施例只用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容做出一些非本质的改进和调整，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明实施例所用试剂、材料、设备如无特殊说明，均为市售来源；对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
其中，
壳聚糖——麦克林，脱乙酰度≥95%，粘度100-200 mpa.s。
蒙脱土MMT——江苏先丰纳米科技，XFI44 1318-93-0，100 g。
海藻酸钠SA——麦克林，CP，粘度200±20mpa.s。
D-葡萄糖酸内酯GDL——麦克林，99%。
表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG——麦克林，95%。
实施例1
作为本发明所述用于感染创面止血和治疗的伤口敷料的一种实施例，本实施例包括以下的组分：HACC-MMT 、 SA 、Ca-EDTA、GDL。
本实施例所述用于感染创面止血和治疗的伤口敷料的制备方法，包括以下步骤：
1. 配制浓度为1% HACC-MMT (含0.5M NaCl)溶液，记为溶液A；
2. 配制浓度为2% SA (含0.5M NaCl)溶液，记为溶液B；
3. 配制浓度为0.2M Ca-EDTA溶液，记为溶液C；
4. 将上述溶液A和溶液B按照体积比1：1混合均匀，得到混合溶液D；
5. 在混合溶液D中加入1 mL 溶液C搅拌10 min；
6. 称取与Ca-EDTA摩尔比为2.5的GDL加入步骤5得到的混合溶液，搅拌5min使其均匀；
7. 将步骤6得到的混合溶液倒入模具中，在4 ℃条件下放置12 h使其充分凝胶。然后冷冻干燥36 h得到敷料样品。
实施例2
作为本发明所述用于感染创面止血和治疗的伤口敷料的一种实施例，本实施例包括以下组分：HACC-MMT 、 SA 、Ca-EDTA、GDL。
本实施例所述用于感染创面止血和治疗的伤口敷料的制备方法，包括以下步骤：
1. 配制浓度为1% HACC-MMT (含0.5M NaCl)溶液，记为溶液A；
2. 配制浓度为2% SA (含0.5M NaCl)溶液，记为溶液B；
3. 配制浓度为0.2M Ca-EDTA溶液，记为溶液C；
4. 将上述溶液A和溶液B按照体积比1：2混合均匀，得到混合溶液D；
5. 在混合溶液D中加入1 mL 溶液C搅拌10 min；
6. 称取与Ca-EDTA摩尔比为2.5的GDL加入步骤5得到的混合溶液，搅拌5min使其均匀；
7. 将步骤6得到的混合溶液倒入模具中，在4 ℃条件下放置12 h使其充分凝胶。然后冷冻干燥36 h得到敷料样品。
实施例3
作为本发明所述用于感染创面止血和治疗的伤口敷料的一种实施例，本实施例包括以下组分：HACC-MMT 、 SA 、Ca-EDTA、GDL。
本实施例所述用于感染创面止血和治疗的伤口敷料的制备方法，包括以下步骤：
1. 配制浓度为1% HACC-MMT (含0.5M NaCl)溶液，记为溶液A；
2. 配制浓度为2% SA (含0.5M NaCl)溶液，记为溶液B；
3. 配制浓度为0.2M Ca-EDTA溶液，记为溶液C；
4. 将上述溶液A和溶液B按照体积比1：3混合均匀，得到混合溶液D；
5. 在混合溶液D中加入1 mL 溶液C搅拌10 min；
6.称取与Ca-EDTA摩尔比为2.5的GDL加入步骤5得到的混合溶液，搅拌5min使其均匀；
7.将步骤6得到的混合溶液倒入模具中，在4 ℃条件下放置12 h使其充分凝胶。然后冷冻干燥36 h得到敷料样品。
实施例4
作为本发明所述用于感染创面止血和治疗的伤口敷料的一种实施例，本实施例包括以下组分：HACC-MMT 、SA 、Ca-EDTA、GDL。
本实施例所述用于感染创面止血和治疗的伤口敷料的制备方法，包括以下步骤：
1. 配制浓度为1% HACC-MMT (含0.5M NaCl)溶液，记为溶液A；
2. 配制浓度为2% SA (含0.5M NaCl)溶液，记为溶液B；
3. 配制浓度为0.2M Ca-EDTA溶液，记为溶液C；
4. 将上述溶液A和溶液B按照体积比2：1混合均匀，得到混合溶液D；
5. 在混合溶液D中加入1 mL 溶液C搅拌10 min；
6.称取与Ca-EDTA摩尔比为2.5的GDL加入步骤5得到的混合溶液，搅拌5min使其均匀；
7.将步骤6得到的混合溶液倒入模具中，在4 ℃条件下放置12 h使其充分凝胶。然后冷冻干燥36 h得到敷料样品。
实施例5
作为本发明所述用于感染创面止血和治疗的伤口敷料的一种实施例，本实施例包括以下组分：HACC-MMT 、SA 、Ca-EDTA、GDL。
本实施例所述用于感染创面止血和治疗的伤口敷料的制备方法，包括以下步骤：
1. 配制浓度为1% HACC-MMT (含0.5M NaCl)溶液，记为溶液A；
2. 配制浓度为2% SA (含0.5M NaCl)溶液，记为溶液B；
3. 配制浓度为0.2M Ca-EDTA溶液，记为溶液C；
4. 将上述溶液A和溶液B按照体积比3：1混合均匀，得到混合溶液D；
5. 在混合溶液D中加入1 mL 溶液C搅拌10 min；
6. 称取与Ca-EDTA摩尔比为2.5的GDL加入步骤5得到的混合溶液，搅拌5min使其均匀；
7. 将步骤6得到的混合溶液倒入模具中，在4 ℃条件下放置12 h使其充分凝胶。然后冷冻干燥36 h得到敷料样品。
实施例6
作为本发明所述用于感染创面止血和治疗的伤口敷料的一种实施例，本实施例包括以下组分：HACC-MMT 、SA 、Ca-EDTA、GDL、EGCG。
本实施例所述用于感染创面止血和治疗的伤口敷料的制备方法，包括以下步骤：
1. 配制浓度为1% HACC-MMT (含0.5M NaCl)溶液，记为溶液A；
2. 配制浓度为2% SA (含0.5M NaCl)溶液，记为溶液B；
3. 配制浓度为0.2M Ca-EDTA溶液，记为溶液C；
4. 将上述溶液A和溶液B按照体积比2：1混合均匀，得到混合溶液D；
5. 在步骤4得到的混合溶液D中加入占比为1 %（v/v）的EGCG粉末搅拌30 min混匀；
6. 在步骤5得到的混合溶液中加入1 mL 溶液C搅拌10 min；
7.称取与Ca-EDTA摩尔比为2.5的GDL加入步骤6得到的混合溶液，搅拌5min使其均匀；
8.将步骤7得到的混合溶液倒入模具中，在4 ℃条件下放置12 h使其充分凝胶。然后冷冻干燥36 h得到敷料样品。
实施例7
作为本发明所述用于感染创面止血和治疗的伤口敷料的一种实施例，本实施例包括以下组分：HACC-MMT 、SA 、Ca-EDTA、GDL、EGCG。
本实施例所述用于感染创面止血和治疗的伤口敷料的制备方法，包括以下步骤：
1. 配制浓度为1% HACC-MMT (含0.5M NaCl)溶液，记为溶液A；
2. 配制浓度为2% SA (含0.5M NaCl)溶液，记为溶液B；
3. 配制浓度为0.2M Ca-EDTA溶液，记为溶液C；
4. 将上述溶液A和溶液B按照体积比2：1混合均匀，得到混合溶液D；
5. 在混合溶液D中加入占比为3 %（v/v）的EGCG粉末搅拌30 min混匀；
6. 在步骤5得到的混合溶液中加入1 mL 溶液C搅拌10 min；
7. 称取与Ca-EDTA摩尔比为2.5的GDL加入步骤6得到的混合溶液，搅拌5min使其均匀；
8. 将步骤7得到的混合溶液倒入模具中，在4 ℃条件下放置12 h使其充分凝胶。然后冷冻干燥36 h得到敷料样品。
实施例8
作为本发明所述用于感染创面止血和治疗的伤口敷料的一种实施例，本实施例包括以下组分：HACC-MMT 、SA 、Ca-EDTA、GDL、EGCG。
本实施例所述用于感染创面止血和治疗的伤口敷料的制备方法，包括以下步骤：
1. 配制浓度为1% HACC-MMT (含0.5M NaCl)溶液，记为溶液A；
2. 配制浓度为2% SA (含0.5M NaCl)溶液，记为溶液B；
3. 配制浓度为0.2M Ca-EDTA溶液，记为溶液C；
4. 将上述溶液A和溶液B按照体积比2：1混合均匀，得到混合溶液D；
5. 在混合溶液D中加入占比为5 %（v/v）的EGCG粉末搅拌30 min混匀；
6. 在步骤5得到的混合溶液中加入1 mL 溶液C搅拌10 min；
7. 称取与Ca-EDTA摩尔比为2.5的GDL加入步骤6得到的混合溶液，搅拌5min使其均匀；
8. 将步骤7得到的混合溶液倒入模具中，在4 ℃条件下放置12 h使其充分凝胶。然后冷冻干燥36 h得到敷料样品。
对比例1
作为本发明所述用于感染创面止血和治疗的伤口敷料的一种对比例，本对比例包括以下组分： SA 、Ca-EDTA、GDL
本对比例所述用于感染创面止血和治疗的伤口敷料的制备方法，包括以下步骤：
1. 配制浓度为2% SA (含0.5M NaCl)溶液，记为溶液B；
2. 配制浓度为0.2M Ca-EDTA溶液，记为溶液C；
3. 在溶液B中加入1 mL 溶液C搅拌10 min；
4. 称取与Ca-EDTA摩尔比为2.5的GDL加入步骤3得到的混合溶液，搅拌5min使其均匀；
5. 将步骤4得到的混合溶液倒入模具中，在4 ℃条件下放置12 h使其充分凝胶。然后冷冻干燥36 h得到敷料样品。
对比例2
作为本发明所述用于感染创面止血和治疗的伤口敷料的一种对比例，本对比例包括以下组分： SA、Ca-EDTA、GDL、MMT
本对比例所述用于感染创面止血和治疗的伤口敷料的制备方法，包括以下步骤：
1. 配制浓度为1% MMT混悬液，记为溶液A’；
2. 配制浓度为2% SA (含0.5M NaCl)溶液，记为溶液B；
3. 配制浓度为0.2M Ca-EDTA溶液，记为溶液C；
4. 将上述溶液A’和溶液B按照体积比2：1混合均匀，得到混合溶液D’；
5. 在混合溶液D’中加入1 mL 溶液C搅拌10 min；
6. 称取与Ca-EDTA摩尔比为2.5的GDL加入步骤5得到的混合溶液，搅拌5min使其均匀；
7. 将步骤6得到的混合溶液倒入模具中，在4 ℃条件下放置12 h使其充分凝胶。然后冷冻干燥36 h得到敷料样品。
对比例3
作为本发明所述用于感染创面止血和治疗的伤口敷料的一种对比例，本对比例包括以下组分： SA 、Ca-EDTA、GDL、EGCG
本对比例所述用于感染创面止血和治疗的伤口敷料的制备方法，包括以下步骤：
1. 配制浓度为2% SA (含0.5M NaCl)溶液，记为溶液B；
2. 配制浓度为0.2M Ca-EDTA溶液，记为溶液C；
3. 在溶液B中加入占比为3 %（v/v）的EGCG粉末搅拌30 min混匀；
4. 在步骤3得到的混合溶液中加入1 mL 溶液C搅拌10 min；
5.称取与Ca-EDTA摩尔比为2.5的GDL加入步骤4得到的混合溶液，搅拌5min使其均匀；
6. 将步骤5得到的混合溶液倒入模具中，在4 ℃条件下放置12 h使其充分凝胶。然后冷冻干燥36 h得到敷料样品。
对比例4
作为本发明所述用于感染创面止血和治疗的伤口敷料的一种对比例，本实施例包括以下组分：SA 、Ca-EDTA、GDL、EGCG、MMT
本对比例所述用于感染创面止血和治疗的伤口敷料的制备方法，包括以下步骤：
1. 配制浓度为1% MMT混悬液，记为溶液A’；
2. 配制浓度为2% SA (含0.5M NaCl)溶液，记为溶液B；
3. 配制浓度为0.2M Ca-EDTA溶液，记为溶液C；
4. 将上述溶液A和溶液B按照体积比2：1混合均匀，得到混合溶液D’；
5. 在混合溶液D中加入占比为3 %（v/v）的EGCG粉末搅拌30 min混匀；
6. 在步骤5得到的混合溶液中加入1 mL 溶液C搅拌10 min；
7. 称取与Ca-EDTA摩尔比为2.5的GDL加入步骤6得到的混合溶液，搅拌5min使其均匀；
8. 将步骤7得到的混合溶液倒入模具中，在4 ℃条件下放置12 h使其充分凝胶。然后冷冻干燥36 h得到敷料样品。
上述实施例和对比例中溶液A、B、C的配制方法如下：
(1)、溶液A——HACC-MMT溶液的配制
1.1壳聚糖季铵盐（HACC）的制备
在50 ℃条件下，将2.0 g壳聚糖分散于100 mL 体积分数为 40 %的NaOH (pH=11)溶液中，持续搅拌1 h使其活化。然后将40 mL (3-氯-2-羟丙基)三甲基氯化铵（CHPTMAC）溶液滴加入上述活化后的混合液中，加热至70 ℃。持续搅拌7 h后，用体积分数为10 %的 HCl溶液将混合液pH调至中性，然后6000 r/min离心20 min以除去剩余未溶解壳聚糖。最后，将离心所得上清液以去离子水为透析介质透析3-4d，途中多次更换去离子水以使溶液透析完全。将透析后的溶液进行冷冻干燥，即得到壳聚糖季铵盐（HACC）。于4 ℃条件下密封储存，备用。
1.2壳聚糖季铵盐改性蒙脱土（HACC-MMT）的制备
将5.0 g蒙脱土（钠基蒙脱土，阳离子交换量（CEC）为1 mol/g）充分分散于250 mL去离子水中，高速搅拌2 h。随后，加入相当于蒙脱土2.0倍CEC 的壳聚糖季铵盐，于60 ℃恒温条件下搅拌反应4 h。反应完成后，于6000 r/min条件下离心20 min（3-4次），去除未反应的壳聚糖季铵盐。离心后的样品于60 ℃下干燥至恒重，即得壳聚糖季铵盐改性蒙脱土（HACC-MMT）。
1.3 HACC-MMT溶液的配制
称取0.1g的HACC-MMT分散于10 mL水中，搅拌均匀后得到1% HACC-MMT溶液。
(2)溶液A’——1% MMT混悬液的在制备；
称取0.1g蒙脱土（钠基蒙脱土，阳离子交换量（CEC）为1 mol/g）分散于10 mL水中，搅拌均匀后得到1% MMT溶液。
(3)溶液B——海藻酸钠（SA）溶液的制备
称取2 g的海藻酸钠溶于100 mL水中，充分溶解后得到2 % SA溶液。
(4) 溶液C——Ca-EDTA溶液的配制
在100 mL蒸馏水中将7.46 g的EDTA-2Na·2H2O分散，充分搅拌使其完全溶解。在超声条件下加入无水CaCl2固体2.22 g，使得溶液中其中Ca2+与EDTA的摩尔比例是1：1。最终，将该混合溶液pH调至7.0，配制成0.2 M Ca-EDTA溶液备用。
效果分析：
1. 伤口敷料吸水性能分析
表1 伤口敷料吸水率、吸水膨胀比
测试方法：使用比重法，准确计算出单位质量伤口敷料吸收液体的重量，得到其吸水率。在室温下，将预先称量过的伤口敷料样品浸泡在PBS溶液中。浸泡10 min后，用滤纸吸去试样表面过多的液滴，称其重量。吸水率计算公式如下：
ms(%) = (m1-m0) / m0×100 %
其中，ms-吸水率，单位%；m0-样品初始质量，单位g；m1-样品充分吸水的质量，单位g。
通过测量伤口敷料吸收PBS前后的直径和高度来得到其吸水膨胀比。伤口敷料吸水体积膨胀比计算公式如下：
Vr (%) = (D1 2×H1) / (D0 2×H0) × 100 %
其中，Vr-体积膨胀比，单位%； D0、D1-吸水前后海绵直径，单位 mm； H0、H1-吸水前后海绵高度，单位 mm；
表1结果说明：当创伤导致无法控制的大出血时，伤口敷料是否具备很好的吸液能力，能否将伤口渗出液安全、快速的吸收，从而避免创面的二次感染，是判断它是否是优秀的止血外用敷料的标准。要想达到快速止血的效果，就必须快速吸除伤口渗出液，并激活体内凝血级联反应，在创伤表面快速形成血凝块，从而将创面封闭气起来，达到快速止血的作用。在表1中，可以看到实施例3吸水性能最好，实施例2吸水性能相当。同时，伤口敷料的吸水体积膨胀比呈现出类似的结果。壳聚糖季铵盐通过离子交换反应与蒙脱土片层表面的负电荷位点结合，不仅增强了蒙脱土表面的疏水性，而且改性蒙脱土通过壳聚糖季铵盐与海藻酸钠分子链的静电作用形成更稳定的结构，有效减少了蒙脱土膨润土纳米片层的堆垛聚集。
2.压缩性能测试
图1 （A）实施例2、6、7、8压缩应力-应变曲线；（B）实施例2、6、7、8施加外力情况下压缩过程的照片
测试方法：将400 μL的敷料前体溶液置于48孔板，经过冷冻干燥机干燥后形成直径为9mm，高为6 mm的圆柱形敷料。在恒湿环境下放置过夜后，以 5 mm/min 的速率将敷料压缩至原来高度的90 %，并记录样品的应力(MPa)和应变(%)之间的关系。同时拍照记录伤口敷料在施加外力情况下的变化
图1结果说明：为了减少患者的不适和疼痛，敷料在伤口上使用时应具有良好的压缩性能。因此，使用压缩应变-应力曲线评估敷料的机械强度。如图1A 所示，实施例2，6，7敷料的抗压强度均在1600 Kpa左右，说明在敷料中添加适度EGCG对海绵的力学性能影响不大。然而，实施例8 的应力为1473.74 Kpa，说明EGCG添加量过多，敷料的力学性能有所降低，同时在制备过程中容易出现开裂现象。此外，如图1B所示，敷料原始照片、压缩照片和恢复照片均表现出柔韧的力学性能。相比而言，实施例2和6压缩后恢复能力较好，基本可以在5min左右基本恢复至原来形状和高度。实施例7和8在很长一段时间内慢慢恢复，并且形状有所改变，高度有所降低，恢复能力较差，并不能完全恢复至原始状态
3.体外凝血能力
图2 对比例1、2、4和实施例7（A）体外全血凝固时间；（B）在对应凝固时间的数码照片
测试方法：将10 mg止血材料置于洁净的EP管中。将100 μL抗凝血和20 μL的CaCl2（0.2 mol/L）溶液依次加入其中并混合均匀。然后在37℃的恒温水浴中，每隔15 s将其倒置，对离心管中血液的凝聚程度进行观察。体外全血凝固时间为血液完全不流动时的时间。空白组未添加止血材料。
图2结果说明： 我们使用体外全血凝固时间来评估复合敷料的止血能力。体外全血凝固时间被用来对止血材料与血液接触后，对血液凝聚产生的影响进行评价，其凝血时间越短，就意味着该材料的止血效果越好。实施例7有优异的促进体外凝血的能力，与空白对照组相比，我们的复合伤口敷料体外凝血时间均有显著性差异。这大概率与敷料的孔隙率密切相关。与正常的血液体外凝固时间相比，时间均缩短，表明所制备止血材料能有效促进血液的体外凝固。
4. 体外抑菌性能测试
表2 体外抑菌率（%）
测试方法：将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌复苏后培养至对数生长期，离心，收集细菌后重悬于生理盐水中，最终菌液浓度为1×108CFU/mL。在24孔板中加入对应的敷料后，向对照组加入500 μL生理盐水。随后在每孔内加入100 μL稀释好的细菌悬液和1 mL无菌生理盐水，在37 ℃下孵育24小时，梯度稀释后涂布于LB琼脂平板，计数。
表2结果说明：HACC和EGCG是起主要抗菌作用的成分，添加量越高，抗菌作用越强。这主要是因为EGCG可抑制脂肪酸合成过程中特定还原酶活性，减少细菌有毒代谢产物的产生，有效抑制ATP酶活性，削弱细菌产生能量的能力，干扰细菌DNA复制，影响DNA酶、细菌明胶酶、等多种酶的生物学功能，从而减少细菌入侵，发挥抑菌作用。而HACC自身的抗菌活性主要源于其聚阳离子性。该特性使其与微生物细胞表面的负电荷成分间形成相互静电作用，在低浓度时通过静电作用使细菌絮凝；在高浓度时吸附在细菌细胞表面，形成一层高分子膜，阻碍细菌与外界物质交换，导致菌体细胞新陈代谢紊乱而死亡。
5、全血凝血指数（BCI）
测试方法：将海绵敷料置于24孔板，将其置于37 ℃恒温保温5 min，然后依次滴加抗凝血100 μL和20 μL，0.2 mol/L的CaCl2溶液于水凝胶上，进行水凝胶-血液10 min共孵育后，加入蒸馏水5 mL，摇匀5 min，并在560 nm波长下对溶液吸光度值进行检测。设立不加入止血材料作为对照组。
BCI (%) = ODsample/ ODcontrol× 100%
式中，BCI-凝血指数，单位%；ODsample-样品的OD值；ODcontrol-空白组的OD值。
图3结果说明：壳聚糖季铵盐对蒙脱土进行改性后与海藻酸钠交联形成复合止血材料后，全血凝血指数显著降低，说明这会复合材料的止血能力。
综上可以看出，单独添加蒙脱土时，蒙脱土会附着在网络结构中，填充敷料孔隙，造成堆垛聚集，引起海藻酸钠敷料凝胶的吸水性能和膨胀比显著下降，而且抗菌效果改善不明显（对比例1和对比例2）。而利用壳聚糖季铵盐对蒙脱土进行改性后在将其引入海藻酸钠溶液，通过离子交联和静电相互作用形成凝胶，制备得到的敷料不仅具有良好的吸水性、膨胀比，抗菌效果也有显著提升（实施例1-5）；进一步的，加入适量的ECGC(实施例6-8），还可以进一步提高抗菌性能。另外，通过对比例3和4可以看出，单独加入ECGC，虽然吸水性、膨胀比及抗菌效果还不错，但凝血效果及能力较差。
由此说明，改性产物壳聚糖季铵盐-蒙脱土既改善了蒙脱土表面性质，而且还可通过壳聚糖季铵盐与海藻酸钠分子链的静电作用形成更稳定的结构，有效减少蒙脱土膨润土纳米片层的堆垛聚集，改善性能。同时，在Ca-EDTA和GDL的共同作用下海藻酸钠分子链上的羧基可与Ca2+之间形成离子交联，生成互穿型凝胶网络，增强伤口敷料的均匀性和稳定性，同时对缓释性能和凝血效果也有一定的改善。除此以外，基于以上稳定的凝胶网络结构，我们在其中负载EGCG，EGCG可在其中稳定缓释，以进一步增强敷料的抗菌、抗炎效果。综合而言，我们所制备的HACC-MTT/SA/EGCG敷料用于感染创面止血和治疗具有潜在优势。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种用于感染创面止血和治疗的伤口敷料，其特征在于，包括如下组分：HACC-MMT、SA、Ca-EDTA和GDL；
所述HACC-MMT是通过如下方法制备得到的，包括步骤：
通过将壳聚糖与3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵反应制备得到HACC，然后在蒙脱土溶液中加入相当于蒙脱土2.0倍CEC的制备得到的HACC，于40-70℃恒温条件下搅拌反应，然后离心干燥得到所述的HACC-MMT。
2.根据权利要求1所述的用于感染创面止血和治疗的伤口敷料，其特征在于，所述HACC是通过如下方法制备得到的，包括步骤：
在50℃条件下，将壳聚糖分散于pH＝8-11的NaOH溶液中，持续搅拌1h使其活化；然后将(3-氯-2-羟丙基)三甲基氯化铵溶液滴加入上述活化后的混合液中，加热至70℃，持续搅拌5-12h后，将混合液pH调至中性，然后离心、透析、冷冻干燥，得到HACC。
3.根据权利要求2所述的用于感染创面止血和治疗的伤口敷料，其特征在于，所述3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵溶液浓度为60wt％，所述NaOH溶液浓度为40v/v％-60v/v％，壳聚糖：NaOH溶液：3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵溶液＝2g：100mL：40mL。
4.根据权利要求1-3任一项所述的用于感染创面止血和治疗的伤口敷料，其特征在于，还包括EGCG。
5.如权利要求1-4任一项所述的用于感染创面止血和治疗的伤口敷料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
配制溶液A——HACC-MMT的NaCl溶液、溶液B——SA的NaCl溶液、溶液C——Ca-EDTA溶液；
将溶液A和溶液B混合均匀，得到混合溶液D；
在混合溶液D中加入溶液C混合均匀，然后加入GDL混合均匀，
最终得到的混合液倒入模具，放置充分凝胶，然后冷冻干燥得到敷料。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，
所述溶液A中，HACC-MMT浓度为1wt％，NaCl含量为0.5M；
所述溶液B中，SA浓度为2wt％，NaCl含量为0.5M；
所述溶液A与溶液B的体积比为(3-1):(1-3)；
所述溶液C中，Ca-EDTA浓度为0.2M，溶液C的添加量为1ml；
所述GDL与溶液C中的Ca-EDTA的摩尔比为2.5：1。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在4℃条件下放置8-20h充分凝胶。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述溶液C是通过如下方法配制的：将EDTA-2Na·2H2O分散在蒸馏水中，充分搅拌使其完全溶解，然后在超声条件下加入无水CaCl2固体，溶液中Ca2+与EDTA的摩尔比例是1：1，最终，将该混合溶液pH调至7.0，配制成溶液C。
9.根据权利要求5-8任一项所述的制备方法，其特征在于，还包括，在混合溶液D中加入溶液C和GDL之前，在混合溶液D中加入EGCG粉末搅拌均匀，然后再依次加入溶液C、GDL。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述EGCG粉末的加入量为混合溶液D体积占比的1-5％。
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