CN118845509B - 一种抗衰组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗衰组合物及其应用，所述抗衰组合物包括γ‑氨基丁酸、硫酸锌和腺嘌呤。本发明通过γ‑氨基丁酸与硫酸锌、腺嘌呤的协同复配，可以抑制人成纤维细胞的衰老，可以促进胶原蛋白的表达，具有协同增效作用。本发明所提供的抗衰组合物，使用低剂量的γ‑氨基丁酸就能发挥显著的抗衰作用，在实际使用过程中可以通过组合物各成分之间的复配，减少γ‑氨基丁酸的添加量，减少γ‑氨基丁酸的皮肤刺激和过敏反应，增加使用舒适度。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗衰组合物，还涉及该组合物的应用，属于抗衰技术领域。
背景技术
γ-氨基丁酸（GABA）是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，广泛存在于自然界的动物脑中以及天然植物中。它不仅是人体自身合成的活性物质，广泛分布于各个器官中，还具有多种生理功能，包括调节心律失常、改善脂质代谢、防止动脉硬化、调节激素分泌及防止皮肤老化等。在护肤方面，GABA的功效主要体现在以下几个方面：
抗衰老：随着年龄的增长，体内的GABA含量减少，导致神经元细胞长期得不到放松，可能引起皮肤肌肉的过度紧缩，形成皱纹。GABA可以刺激成纤维细胞合成胶原和透明质酸，促进真皮重塑、抗氧化和帮助表皮屏障的修护，从而减少皱纹的形成，使皮肤更有弹性。
修复和舒缓：GABA具有镇静舒缓的作用，能够调节皮肤敏感度，减少皮肤对外界刺激的反应，适用于敏感肌肤和疲劳肌肤。它还可以促进夜间肌肤修复和舒缓疲劳，帮助肌肤恢复健康状态。
抗氧化：作为一种抗氧化剂，GABA可以帮助抵御自由基损伤，减缓皮肤老化过程，使皮肤更年轻富有弹性。它适合在晚间使用，有助于促进夜间肌肤修复和舒缓疲劳。
虽然GABA具有良好的抗衰功效，但是γ-氨基丁酸在较高浓度下可能会刺激肥大细胞释放组胺，导致毛细血管通透性增加、平滑肌收缩及腺体分泌增多等效应，进而诱发或加重皮肤过敏症状，引起皮肤过敏反应。
目前有较多的含有γ-氨基丁酸的护肤组合物的报道，例如CN116987142A、CN114470005A、CN114515253A、CN114681368A等，但这些现有技术中仅提出了γ-氨基丁酸和不同的成分组合起到不同的护肤效果，对于γ-氨基丁酸在使用过程中存在的上述缺陷，都没有涉及。
发明内容
本发明创造性的发现，将γ-氨基丁酸与硫酸锌、腺嘌呤组合后，具有协同增效作用，在低添加量下能够明显抑制成纤维细胞衰老、促进胶原蛋白表达，发挥显著抗衰作用。基于此，可以降低γ-氨基丁酸用量，从而避免γ-氨基丁酸在较高浓度下使用对皮肤带来的不良反应。
本发明提供了一种抗衰组合物，其包括γ-氨基丁酸、硫酸锌和腺嘌呤。
上述抗衰组合物中，所述γ-氨基丁酸、硫酸锌和腺嘌呤的质量比为40～220：0.04～0.25：0.08～7。
上述抗衰组合物中，所述γ-氨基丁酸、硫酸锌和腺嘌呤的质量比优选为50～200：0.05～0.2：0.1～5。
本发明还提供了上述抗衰组合物在制备促进胶原蛋白生成的产品中的应用。
进一步的，上述应用中，所述胶原蛋白包括Ⅲ型胶原蛋白。
进一步的，上述应用中，所述促进胶原蛋白生成的产品包括护肤品、药品或医疗器械产品。
本发明还提供了上述抗衰组合物在制备抑制成纤维细胞衰老的产品中的应用。
进一步的，上述应用中，所述抑制成纤维细胞衰老的产品包括护肤品、药品或医疗器械产品。
本发明还提供了一种护肤品，所述护肤品中包含上述抗衰组合物。
上述护肤品中，所述γ-氨基丁酸在护肤品中的含量为10～1000mg/L。
上述护肤品中，所述硫酸锌在护肤品中的含量为0.1～10mg/L。
上述护肤品中，所述腺嘌呤在护肤品中的含量为0.1～10mg/L。
上述护肤品中，所述护肤品中还包括护肤品领域可接受的活性成分和/或辅料。
本发明具有以下有益效果：
1.本发明所提供的抗衰组合物，通过γ-氨基丁酸与硫酸锌、腺嘌呤的协同复配，能够促进胶原蛋白Ⅲ (COLⅢ)在人成纤维细胞中的表达，可以促进对人成纤维细胞（HFF）衰老的改善，抑制人成纤维细胞的衰老，具有协同增效作用。
2.本发明所提供的抗衰组合物，通过γ-氨基丁酸与硫酸锌、腺嘌呤的协同复配，可以促进胶原蛋白的表达，尤其是Ⅲ型胶原蛋白的表达，具有协同增效作用。
3.本发明所提供的抗衰组合物，使用低剂量的γ-氨基丁酸就能发挥显著的抗衰作用，在实际使用过程中可以通过组合物各成分之间的复配，减少γ-氨基丁酸的添加量，减少γ-氨基丁酸的皮肤刺激和过敏反应，增加使用舒适度。
4.本发明所提供的抗衰组合物成分简单、原料易得，无需复杂制备过程，成本较低，便于推广使用和商业化生产。
附图说明
图1是DMEM 空白对照组与实施例3对胶原蛋白III在蛋白水平的免疫荧光定量结果。
具体实施方式
以下对本发明的示范性实施例做出说明，其中包括本发明实施例的各种细节以助于理解，应当将它们认为仅仅是示范性的。因此，本领域普通技术人员应当认识到，可以对这里描述的实施例做出各种改变和修改，而不会背离本发明的范围和精神。同样，为了清楚和简明，以下的描述中省略了对公知功能和结构的描述。
除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本发明还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准。
本发明涉及一种组合物，所述“组合物”只要能够实现本发明所述效果即可，所述“组合物”包括但不限于将各成分同时使用或依次使用。所述“同时使用”包括在同一制剂中一起使用或在不同制剂中分开使用。所述“依次使用”包括在不同制剂中依次使用，对于依次使用的顺序没有任何限制。
本发明提供了一种抗衰组合物，所述抗衰组合物中包括γ-氨基丁酸、硫酸锌和腺嘌呤。经实验验证，这三者组合使用时能明显抑制人成纤维细胞的衰老，能明显促进胶原蛋白的表达，表现出明显的增效作用。这一组合物的使用可以降低γ-氨基丁酸的用量，降低γ-氨基丁酸用量过大对皮肤带来的不良刺激。
在本发明某一具体实施方式中，所述抗衰组合物中含有40～220质量份的γ-氨基丁酸，例如40份、50份、60份、70份、80份、90份、100份、110份、120份、130份、140份、150份、160份、170份、180份、190份、200份、210份、220份等，优选为50～200质量份。
在本发明某一具体实施方式中，所述抗衰组合物中含有0.04～0.25质量份的硫酸锌，例如0.04份、0.05份、0.06份、0.07份、0.08份、0.09份、0.1份、0.11份、0.12份、0.13份、0.14份、0.15份、0.16份、0.17份、0.18份、0.19份、0.2份、0.21份、0.22份、0.23份、0.24份、0.25份等，优选为0.05～0.2质量份。
在本发明某一具体实施方式中，所述抗衰组合物中含有0.08～7质量份的腺嘌呤，例如0.08份、0.09份、0.1份、0.2份、0.3份、0.4份、0.5份、0.6份、0.7份、0.8份、0.9份、1.0份、1.1份、1.2份、1.3份、1.4份、1.5份、1.6份、1.7份、1.8份、1.9份、2.0份、2.1份、2.2份、2.3份、2.4份、2.5份、2.6份、2.7份、2.8份、2.9份、3.0份、3.1份、3.2份、3.3份、3.4份、3.5份、3.6份、3.7份、3.8份、3.9份、4.0份、5.1份、5.2份、5.3份、5.4份、5.5份、5.6份、5.7份、5.8份、5.9份、6.0份、6.1份、6.2份、6.3份、6.4份、6.5份、6.6份、6.7份、6.8份、6.9份、7.0份等，优选为0.1～5质量份。
本发明所使用的γ-氨基丁酸、硫酸锌和腺嘌呤均为市售产品，即可以选择纯品，又可以选择含有它们的提取物或水合物，例如，硫酸锌可以选择七水硫酸锌。
在本发明某一具体实施方式中，所述抗衰组合物除了γ-氨基丁酸、硫酸锌和腺嘌呤外，还包括化妆品领域可接受的其他活性成分和/或辅料。所述其他活性成分可以为具有美白、保湿、祛痘、消炎、抑菌、抗衰老、抗氧化、祛皱等至少一种功效的活性成分。所述辅料可以为油脂、溶剂、表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、保湿剂、pH调节剂、功能助剂、香料、色素等中的至少一种的辅料。
本发明还提供了上述抗衰组合物的制备方法，其将各组分混合均匀即可。各组分的混合方式不限，先后顺序不限。
本发明还提供了上述抗衰组合物在制备促进胶原蛋白生成的产品中的应用，其应用方式可以为作为原料用于制备促进胶原蛋白生成的产品中。
在本发明某一具体实施方式中，所述促进胶原蛋白生成的产品中的胶原蛋白包括各种对人体有益的胶原蛋白，尤其包括Ⅲ型胶原蛋白。
在本发明某一具体实施方式中，所述促进胶原蛋白生成的产品包括护肤品、药品或医疗器械产品。
本发明还提供了上述抗衰组合物在制备抑制成纤维细胞衰老的产品中的应用，其应用方式可以为作为原料用于制备抑制成纤维细胞衰老的产品中。
在本发明某一具体实施方式中，所述抑制成纤维细胞衰老的产品包括护肤品、药品或医疗器械产品。
本发明还提供了一种护肤品，所述护肤品中包含上述抗衰组合物。
在本发明某一具体实施方式中，所述γ-氨基丁酸在护肤品中的含量为10～1000mg/L，例如10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L、30mg/L、35mg/L、40mg/L、45mg/L、50mg/L、55mg/L、60mg/L、65mg/L、70mg/L、75mg/L、80mg/L、85mg/L、90mg/L、95mg/L、100mg/L、105mg/L、110mg/L、115mg/L、120mg/L、125mg/L、130mg/L、135mg/L、140mg/L、145mg/L、150mg/L、155mg/L、160mg/L、165mg/L、170mg/L、175mg/L、180mg/L、185mg/L、190mg/L、195mg/L、200mg/L、205mg/L、210mg/L、215mg/L、220mg/L、225mg/L、230mg/L、235mg/L、240mg/L、245mg/L、250mg/L、255mg/L、260mg/L、265mg/L、270mg/L、275mg/L、280mg/L、285mg/L、290mg/L、295mg/L、300mg/L、305mg/L、310mg/L、315mg/L、320mg/L、325mg/L、330mg/L、335mg/L、340mg/L、345mg/L、350mg/L、355mg/L、360mg/L、365mg/L、370mg/L、375mg/L、380mg/L、385mg/L、390mg/L、395mg/L、400mg/L、405mg/L、410mg/L、415mg/L、420mg/L、425mg/L、430mg/L、435mg/L、440mg/L、445mg/L、450mg/L、455mg/L、460mg/L、465mg/L、470mg/L、475mg/L、480mg/L、485mg/L、490mg/L、495mg/L、500mg/L、505mg/L、510mg/L、515mg/L、520mg/L、525mg/L、530mg/L、535mg/L、540mg/L、545mg/L、550mg/L、555mg/L、560mg/L、565mg/L、570mg/L、575mg/L、580mg/L、585mg/L、590mg/L、595mg/L、600mg/L、605mg/L、610mg/L、615mg/L、620mg/L、625mg/L、630mg/L、635mg/L、640mg/L、645mg/L、650mg/L、655mg/L、660mg/L、665mg/L、670mg/L、675mg/L、680mg/L、685mg/L、690mg/L、695mg/L、700mg/L、705mg/L、710mg/L、715mg/L、720mg/L、725mg/L、730mg/L、735mg/L、740mg/L、745mg/L、750mg/L、755mg/L、760mg/L、765mg/L、770mg/L、775mg/L、780mg/L、785mg/L、790mg/L、795mg/L、800mg/L、805mg/L、810mg/L、815mg/L、820mg/L、825mg/L、830mg/L、835mg/L、840mg/L、845mg/L、850mg/L、855mg/L、860mg/L、865mg/L、870mg/L、875mg/L、880mg/L、885mg/L、890mg/L、895mg/L、900mg/L、905mg/L、910mg/L、915mg/L、920mg/L、925mg/L、930mg/L、935mg/L、940mg/L、945mg/L、950mg/L、955mg/L、960mg/L、965mg/L、970mg/L、975mg/L、980mg/L、985mg/L、990mg/L、995mg/L、1000mg/L，以及它们之间的任意范围值。
在本发明某一具体实施方式中，所述硫酸锌在护肤品中的含量为0.1～10mg/L，例如0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3mg/L、0.4 mg/L、0.5 mg/L、0.6mg/L、0.7 mg/L、0.8 mg/L、0.9mg/L、1.0 mg/L、1.1 mg/L、1.2 mg/L、1.3mg/L、1.4 mg/L、1.5 mg/L、1.6mg/L、1.7 mg/L、1.8 mg/L、1.9 mg/L、2.0 mg/L、2.1 mg/L、2.2 mg/L、2.3mg/L、2.4 mg/L、2.5 mg/L、2.6mg/L、2.7 mg/L、2.8 mg/L、2.9 mg/L、3.0 mg/L、3.1 mg/L、3.2 mg/L、3.3mg/L、3.4 mg/L、3.5mg/L、3.6mg/L、3.7 mg/L、3.8 mg/L、3.9 mg/L、4.0 mg/L、4.1 mg/L、4.2 mg/L、4.3mg/L、4.4 mg/L、4.5 mg/L、4.6mg/L、4.7 mg/L、4.8 mg/L、4.9 mg/L、5.0 mg/L、5.1 mg/L、5.2mg/L、5.3mg/L、5.4 mg/L、5.5 mg/L、5.6mg/L、5.7 mg/L、5.8 mg/L、5.9 mg/L、6.0 mg/L、6.1 mg/L、6.2 mg/L、6.3mg/L、6.4 mg/L、6.5 mg/L、6.6mg/L、6.7 mg/L、6.8 mg/L、6.9 mg/L、7.0 mg/L、7.1 mg/L、7.2 mg/L、7.3mg/L、7.4 mg/L、7.5 mg/L、7.6mg/L、7.7 mg/L、7.8mg/L、7.9 mg/L、8.0 mg/L、8.1 mg/L、8.2 mg/L、8.3mg/L、8.4 mg/L、8.5 mg/L、8.6mg/L、8.7 mg/L、8.8 mg/L、8.9 mg/L、9.0 mg/L、9.1 mg/L、9.2 mg/L、9.3mg/L、9.4 mg/L、9.5mg/L、9.6mg/L、9.7 mg/L、9.8 mg/L、9.9 mg/L、10.0 mg/L。
在本发明某一具体实施方式中，所述腺嘌呤在护肤品中的含量为0.1～10mg/L，例如0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3mg/L、0.4 mg/L、0.5 mg/L、0.6mg/L、0.7 mg/L、0.8 mg/L、0.9mg/L、1.0 mg/L、1.1 mg/L、1.2 mg/L、1.3mg/L、1.4 mg/L、1.5 mg/L、1.6mg/L、1.7 mg/L、1.8 mg/L、1.9 mg/L、2.0 mg/L、2.1 mg/L、2.2 mg/L、2.3mg/L、2.4 mg/L、2.5 mg/L、2.6mg/L、2.7 mg/L、2.8 mg/L、2.9 mg/L、3.0 mg/L、3.1 mg/L、3.2 mg/L、3.3mg/L、3.4 mg/L、3.5mg/L、3.6mg/L、3.7 mg/L、3.8 mg/L、3.9 mg/L、4.0 mg/L、4.1 mg/L、4.2 mg/L、4.3mg/L、4.4 mg/L、4.5 mg/L、4.6mg/L、4.7 mg/L、4.8 mg/L、4.9 mg/L、5.0 mg/L、5.1 mg/L、5.2mg/L、5.3mg/L、5.4 mg/L、5.5 mg/L、5.6mg/L、5.7 mg/L、5.8 mg/L、5.9 mg/L、6.0 mg/L、6.1 mg/L、6.2 mg/L、6.3mg/L、6.4 mg/L、6.5 mg/L、6.6mg/L、6.7 mg/L、6.8 mg/L、6.9 mg/L、7.0 mg/L、7.1 mg/L、7.2 mg/L、7.3mg/L、7.4 mg/L、7.5 mg/L、7.6mg/L、7.7 mg/L、7.8mg/L、7.9 mg/L、8.0 mg/L、8.1 mg/L、8.2 mg/L、8.3mg/L、8.4 mg/L、8.5 mg/L、8.6mg/L、8.7 mg/L、8.8 mg/L、8.9 mg/L、9.0 mg/L、9.1 mg/L、9.2 mg/L、9.3mg/L、9.4 mg/L、9.5mg/L、9.6mg/L、9.7 mg/L、9.8 mg/L、9.9 mg/L、10.0 mg/L。
在本发明某一具体实施方式中，所述护肤品中还包括护肤品领域可接受的活性成分和/或辅料。所述其他活性成分可以为具有美白、保湿、祛痘、消炎、抑菌、抗衰老、抗氧化、祛皱等至少一种功效的活性成分。所述辅料可以为油脂、溶剂、表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、保湿剂、pH调节剂、功能助剂、香料、色素等中的至少一种的辅料。
实施例
本发明对试验中所用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述，在下面的实施例中，如果无其他特别的说明，％表示wt％，即重量百分数。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品，其中，实施例和对比例中所述的原料来源如表1所示，所用的实验试剂和细胞系如表2所示，所用的实验仪器如表3所示。
实施例1
分别称取一定量的γ-氨基丁酸、七水硫酸锌、腺嘌呤，添加到含有10% FBS 的DMEM高糖培养基中，混合均匀，得到抗衰组合物。其中，γ-氨基丁酸的含量为200mg/L，硫酸锌的含量为0.06mg/L，腺嘌呤的含量为5mg/L，γ-氨基丁酸、硫酸锌、腺嘌呤的质量比为200：0.06：5。
实施例2
分别称取一定量的γ-氨基丁酸、七水硫酸锌、腺嘌呤添加到含有10% FBS 的DMEM高糖培养基中，混合均匀，得到抗衰组合物。其中，γ-氨基丁酸的含量为200mg/L，硫酸锌的含量为0.06mg/L，腺嘌呤的含量为0.1mg/L，γ-氨基丁酸、硫酸锌、腺嘌呤的质量比为200：0.06：0.1。
实施例3
分别称取一定量的γ-氨基丁酸、七水硫酸锌、腺嘌呤添加到含有10% FBS 的DMEM高糖培养基中，混合均匀，得到抗衰组合物。其中，γ-氨基丁酸的含量为75mg/L，硫酸锌的含量为0.17mg/L，腺嘌呤的含量为5mg/L，γ-氨基丁酸、硫酸锌、腺嘌呤的质量比为75：0.17：5。
实施例4
分别称取一定量的γ-氨基丁酸、七水硫酸锌、腺嘌呤添加到含有10% FBS 的DMEM高糖培养基中，混合均匀，得到抗衰组合物。其中，γ-氨基丁酸的含量为50mg/L，硫酸锌的含量为0.06mg/L，腺嘌呤的含量为0.3mg/L，γ-氨基丁酸、硫酸锌、腺嘌呤的质量比为50：0.06：0.3。
实施例5
分别称取一定量的γ-氨基丁酸、七水硫酸锌、腺嘌呤添加到含有10% FBS 的DMEM高糖培养基中，混合均匀，得到抗衰组合物。其中，γ-氨基丁酸的含量为50mg/L，硫酸锌的含量为0.17mg/L，腺嘌呤的含量为5mg/L，γ-氨基丁酸、硫酸锌、腺嘌呤的质量比为50：0.17：5。
对比例1
称取一定量的γ-氨基丁酸添加到含有10% FBS 的DMEM高糖培养基中，混合均匀，得到组合物。其中，γ-氨基丁酸的含量为50mg/L。
对比例2
称取一定量的γ-氨基丁酸添加到含有10% FBS 的DMEM高糖培养基中，混合均匀，得到组合物。其中，γ-氨基丁酸的含量为75mg/L。
对比例3
称取一定量的γ-氨基丁酸添加到含有10% FBS 的DMEM高糖培养基中，混合均匀，得到组合物。其中，γ-氨基丁酸的含量为200mg/L。
对比例4
称取一定量的七水硫酸锌添加到含有10% FBS 的DMEM高糖培养基中，混合均匀，得到组合物。其中，硫酸锌的含量为0.06mg/L。
对比例5
称取一定量的七水硫酸锌添加到含有10% FBS 的DMEM高糖培养基中，混合均匀，得到组合物。其中，硫酸锌的含量为0.17mg/L。
对比例6
称取一定量的腺嘌呤添加到含有10% FBS 的DMEM高糖培养基中，混合均匀，得到组合物。其中，腺嘌呤的含量为0.1mg/L。
对比例7
称取一定量的腺嘌呤添加到含有10% FBS 的DMEM高糖培养基中，混合均匀，得到组合物。其中，腺嘌呤的含量为0.3 mg/L。
对比例8
称取一定量的腺嘌呤添加到含有10% FBS 的DMEM高糖培养基中，混合均匀，得到组合物。其中，腺嘌呤的含量为5 mg/L。
对比例9
分别称取一定量的γ-氨基丁酸、七水硫酸锌、腺嘌呤添加到含有10% FBS 的DMEM高糖培养基中，混合均匀，得到组合物。其中，γ-氨基丁酸的含量为500mg/L，硫酸锌的含量为5.6mg/L，腺嘌呤的含量为10mg/L，γ-氨基丁酸、硫酸锌、腺嘌呤的质量比为500：5.6：10。
试验例1 对人成纤维细胞衰老的影响
实验方法：D-半乳糖诱导HFF衰老
实验样品：实施例1-5以及对比例1-9制备的组合物。
空白对照品：含有10% FBS 的DMEM高糖培养基。
具体步骤如下：
1）细胞接种:将HFF细胞以1×104细胞/mL、每孔1mL接种于24孔板中，培养箱(37℃,5％CO2)中孵育过夜。
2）给药培养:使用空白对照品、实施例1-5及对比例1-9的实验样品分组给药,每组设置3个复孔，每孔加入1mL样品,培养箱(37℃,5％CO2)中培养48小时。
3）诱导细胞衰老: 48小时后，更换新鲜的空白对照品、实施例1-5及对比例1-9的实验样品对细胞继续培养，并在每孔加入D-半乳糖至终浓度10g/L诱导细胞衰老。
4）衰老细胞染色: 继续培养72h后收样，使用细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒对衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)进行染色，标记衰老细胞，染色具体步骤如下：
①吸除孔中培养基，用PBS洗涤细胞1次后，每孔加入1mL β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15分钟；
②吸除染色固定液，用PBS洗涤细胞3次，每次3分钟；
③吸除PBS，每孔加入1mL染色工作液(染色工作液配置方法：β-半乳糖苷酶染色液A：10μL；β-半乳糖苷酶染色液B：10μL；β-半乳糖苷酶染色液C：930μL；X-Gal溶液：50μL)；
④37℃烘箱孵育过夜，铝箔包裹避光防蒸发；
⑤去除以上染色工作液，每孔加入1mL PBS。使用蔡司普通倒置显微镜拍摄照片。
5）染色结果分析: 对SA-β-gal染色阳性(呈蓝色)的细胞进行计数，计算SA-β-gal染色阳性细胞率及SA-β-gal染色阳性细胞抑制率。
SA-β-gal染色阳性细胞率=染色阳性细胞数/总细胞数×100%；
SA-β-gal染色阳性细胞抑制率=（空白对照组染色阳性细胞率-实验组染色阳性细胞率）/空白对照组染色阳性细胞率×100%。
实验结果如下表4所示：
注：组间比较采用t检验，*P<0.05 表示有统计学差异，**P<0.01 表示有显著性统计学差异，***P<0.001 为有极其显著的统计学差异。
通过上表可以看出，添加实施例1-5制备的组合物后，SA-β-gal染色阳性细胞抑制率明显提升，高于对比例1-9。
为说明本发明提供的抗衰组合物中的各组分具有协同效应作用，而不仅仅是各组分作用的简单加和，我们使用COLBY公式：E理论=X+Y+Z-（X*Y+X*Z+Y*Z）/100+X*Y*Z/10000进行验证，其中X、Y、Z分别为单一组分单独处理的SA-β-gal阳性细胞抑制率，E理论为组合物处理后的理论SA-β-gal阳性细胞抑制率，E实际为组合物处理后的实际SA-β-gal阳性细胞抑制率；E实际＞E理论为增效；E实际＜E理论为拮抗；E实际=E理论为加和。
其中，实施例1的E理论由对比例3、4、8的数据计算得到，实施例2的E理论由对比例3、4、6的数据计算得到，实施例3的E理论由对比例2、5、8的数据计算得到，实施例4的E理论由对比例1、4、7的数据计算得到，实施例5的E理论由对比例1、5、8的数据计算得到。
协同效应判定结果如下表5所示。
从表5可以看出，实施例1-5的E实际均大于E理论，说明本发明制备的抗衰组合物中各组分在抑制人成纤维细胞衰老方面具有协同增效作用。
试验例2对III型胶原蛋白(COL3A1)基因在人成纤维细胞中表达的影响
实验方法：实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)
实验样品：实施例3及对比例2、5、8制备的组合物。
空白对照品：含有10% FBS 的DMEM高糖培养基。
具体步骤如下：
1）细胞接种:将HFF细胞以2×104细胞/mL、每2mL铺于6孔板中，培养箱(37℃、 5％CO2)中孵育过夜。
2）给药培养:使用空白对照品、实施例3及对比例2、5、8的实验样品分组给药,每组设3个复孔，每孔加入2mL样品,培养箱(37℃,5％CO2)中培养72小时后收样。
3）提取RNA:使用FastPure® Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2 试剂提取各组细胞的RNA，提取操作在生物安全柜中室温下进行，使用无菌、无RNAse 耗材，步骤如下：
①吸除细胞培养基上清，在每孔中加入0.5mL Buffer RL对细胞进行消化裂解；
②观察至无明显细胞团后，将裂解样本转移至FastPure gDNA-Filter ColumnsⅢ 中，12,000 rpm 离心30 sec 后收集滤液；
③向滤液中加入0.25 mL无水乙醇，混合均匀后转移至FastPure RNA Columns Ⅲ中，12,000 rpm 离心30 sec后弃滤液；
④在FastPure RNA Columns Ⅲ管中加入0.7mL Buffer RW1， 12,000 rpm 离心30 sec后弃滤液；
⑤在FastPure RNA Columns Ⅲ管中加入0.7mL Buffer RW2， 12,000 rpm 离心30 sec后弃滤液；
⑥在FastPure RNA Columns Ⅲ管中加入0.5mL Buffer RW2， 12,000 rpm 离心2min后，转移FastPure RNA Columns Ⅲ至收集管中，加入0.1 mL RNase-free ddH2O，室温静置1 min后，12,000 rpm离心1 min，洗脱RNA完成提取；
⑦提取的RNA置于冰上操作，通过酶标仪在260nm/280nm测量吸光度值检测RNA纯度和浓度。
4）RNA逆转录:使用PrimeScript™ RT Reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒将提取的各组RNA逆转录成相应的cDNA,步骤如下：
①按照下表6配制去除基因组DNA反应液,混匀后室温静置5min，去除提取RNA中的基因组DNA：
②按照下表7配制逆转录反应液,混匀后将液体离心至管底，反应液在VeritiProPCR仪运行温度程序(37℃ 5min; 85℃ 5sec; 4℃ 维持)完成逆转录反应：
5）实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR):使用 TB Green® Premix Ex Taq™试剂盒在QuantStudio3 RT-qPCR仪上完成。步骤如下：
①按表8 PCR反应液，每组3个复孔，使用的引物序列如下：
COL3A1 (forward: CGCCCTCCTAATGGTCAAGG-3; reverse:TTCTGAGGACCAGTAGGGCA)；
Human beta actin (forward: GAGCATCCCCCAAAGTTCACAA; revese:GTGGGGTGGCTTTTAGGATG)。
②液体混匀并离心至管底，在QuantStudio3 RT-qPCR仪上运行温度程序(第一阶段：95°C,30s,1个循环;第二阶段：95°C,5s, 60°C,30s,40个循环; 第三阶段：95°C,15s,60°C,1min,1个循环;95°C,15s,1个循环)。
③PCR反应结束后,以β-Actin作为内源性参照对各组数据进行归一化处理,采用2-△△Ct法测定Ⅲ型胶原蛋白目标基因RNA的表达量，计算Ⅲ型胶原蛋白基因表达水平和Ⅲ型胶原蛋白基因表达提升量。
Ⅲ型胶原蛋白基因表达水平=实验组Ⅲ型胶原蛋白RNA表达量/空白对照组Ⅲ型胶原蛋白RNA表达量*100%；
Ⅲ型胶原蛋白基因表达提升量=实验组Ⅲ型胶原蛋白基因表达水平-空白对照组Ⅲ型胶原蛋白基因表达水平。
经计算，实验结果如表9所示。
注：组间比较采用t检验，*P<0.05 表示有统计学差异，**P<0.01 表示有显著性统计学差异，***P<0.001 为有极其显著的统计学差异。
从表9可以看出，实施例3制备的组合物能够显著提升胶原蛋白表达，我们同样采用COLBY公式验证组合物的协同作用，COLBY公式以及协同效应判断方式如试验例1中记载所示，验证结果如表10所示：
由表10可以看出，实施例3的E实际大于E理论，说明本发明制备的抗衰组合物中各组分在促进胶原蛋白表达方面具有协同增效作用。
试验例3对胶原蛋白在人成纤维细胞中蛋白表达的影响
实验方法：细胞免疫荧光染色
实验样品：实施例3。
空白对照品：含有10% FBS 的DMEM高糖培养基。
具体步骤如下：
1）细胞接种:将HFF细胞以2×104细胞/mL、每1mL铺于24孔板中，培养箱(37℃、5％CO2)中孵育过夜。
2）给药培养:使用空白对照品、实施例3的实验样品分组给药,每组设3个复孔，每孔加入1mL样品,培养箱(37℃,5％CO2)中培养72小时后收样。
3）免疫荧光染色:按照以下步骤对各组细胞进行免疫荧光染色：
①细胞固定：每孔加入1mL 4%多聚甲醛溶液固定样品15分钟，用PBS溶液清洗样品3次；
②细胞封闭：每孔加入1mL 1%BSA溶液，在37℃封闭样品2小时,孵育完成后使用PBST溶液清洗样品3次。
③一抗孵育：每孔加入0.5mL 1%BSA溶液，并加入1μL Ⅲ型胶原蛋白抗体(COL3A1(E3K9U) Rabbit mAb，1:500稀释)，在4℃过夜孵育，孵育完成后使用PBST溶液清洗样品3次。
④荧光二抗孵育及Phalloidin-iFluor 594染色：每孔加入0.5mL 1%BSA溶液，并加入0.5μL 荧光二抗(山羊抗兔IgG H&L Alexa Fluor® 488 ，1:1000稀释)及0.5μL 的Phalloidin-iFluor 594(1:1000稀释)，在37°C培养箱中避光孵育2小时。完成染色后使用PBST溶液清洗样品3次。
⑤DAPI核质染色：每孔加入0.5mL 含有2μg/mL DAPI的PBS溶液，在37°C培养箱中避光孵育15分钟进行染色。染色完成后，使用PBS溶液清洗样品3次。
⑥全部染色完成后使用荧光显微镜在相应通道检测荧光信号。
实验结果如图1所示，其中，第一列是使用空白对照组培养的人成纤维细胞，第二列是使用实施例3培养的人成纤维细胞；第一行为染色后绿色荧光通道的图片，第二行为三个通道整合的图片(红色为细胞骨架染色的Phalloidin-iFluor 594，蓝色为核质染色的DAPI、绿色为荧光染色的III型胶原蛋白，通过通道整合的图片可以看到细胞定位)。从图中可以看出,实施例3代表III型胶原蛋白的绿色荧光较空白对照组显著提升，说明本发明制备的抗衰组合物中各组分可以促进III型胶原蛋白的表达。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (9)
1.一种抗衰组合物，其特征在于，包括γ-氨基丁酸、硫酸锌和腺嘌呤，所述γ-氨基丁酸、硫酸锌和腺嘌呤的质量比为40～220：0.04～0.25：0.08～7。
2.根据权利要求1所述的抗衰组合物，其特征在于，所述γ-氨基丁酸、硫酸锌和腺嘌呤的质量比为50～200：0.05～0.2：0.1～5。
3.权利要求1或2所述的抗衰组合物在制备促进胶原蛋白生成的产品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述胶原蛋白包括Ⅲ型胶原蛋白。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述促进胶原蛋白生成的产品包括护肤品、药品或医疗器械产品。
6.权利要求1或2所述的抗衰组合物在制备抑制成纤维细胞衰老的产品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抑制成纤维细胞衰老的产品包括护肤品、药品或医疗器械产品。
8.一种护肤品，其特征在于，包含权利要求1或2所述的抗衰组合物。
9.根据权利要求8所述的护肤品，其特征在于，包括下述条件中的至少一种：
条件1：所述γ-氨基丁酸在护肤品中的含量为10～1000mg/L；
条件2：所述硫酸锌在护肤品中的含量为0.1～10mg/L；
条件3：所述腺嘌呤在护肤品中的含量为0.1～10mg/L；
条件4：所述护肤品中还包括护肤品领域可接受的活性成分和/或辅料。
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