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CN118834956B - 引物和探针组合物、试剂盒及在检测emx1、chfr基因甲基化中的应用 - Google Patents

引物和探针组合物、试剂盒及在检测emx1、chfr基因甲基化中的应用 Download PDF

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CN118834956B CN202411333754.9A CN202411333754A CN118834956B CN 118834956 B CN118834956 B CN 118834956B CN 202411333754 A CN202411333754 A CN 202411333754A CN 118834956 B CN118834956 B CN 118834956B
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Abstract

本发明具体公开了引物和探针组合物、试剂盒及在检测EMX1、CHFR基因甲基化中的应用，所述引物和探针组合物包括引物对及探针组，引物对包括如SEQ ID NO：4‑5、SEQ ID NO：7‑8、SEQ ID NO：10‑11所示的核苷酸序列；探针组包括如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列。引物和探针组设计在目的基因或目的基因启动子附近CpG位点，可特异性的和发生甲基化的序列结合，用于检测EMX1、CHFR基因甲基化可实现高灵敏性、高特异性、准确快速检测，以适用于肝细胞癌辅助诊断。

Description

引物和探针组合物、试剂盒及在检测EMX1、CHFR基因甲基化中 的应用
技术领域
本发明涉及体外核酸检测领域，特别涉及引物和探针组合物、试剂盒及在检测EMX1、CHFR基因甲基化中的应用。
背景技术
肝癌是最常见的人类肿瘤之一，肝癌可分为原发性和转移性两大类，原发性肝癌主要包括肝细胞癌（HCC）、肝内胆管癌（CCA）和混合型肝细胞癌-胆管癌（cHCC-CCA）三种不同病理学类型。肝细胞癌(HCC)约占原发性肝癌的75%。
HCC的早期诊断对于早期干预和生存至关重要。多项研究表明，早期监测可能会提高总体生存率，国际指南建议肝硬化患者应接受HCC筛查，因为肝硬化患者每年发生HCC的风险在2-4%之间。美国肝病协会 (AASLD) 将以下患者归类为发生 HCC 的高风险患者：肝硬化患者（Child Pugh A期和B期）、肝硬化患者（Child Pugh C期等待肝移植）以及患者无肝硬化但患有 HBV。
AASLD（美国肝病研究协会）目前建议高危患者每六个月接受一次腹部超声监测检测。然而，只有不到五分之一的高危患者接受 HCC 筛查。此外，腹部超声检测早期 HCC的敏感性仅为45% ，使用AFP生物标志物检测进行额外筛查可能会提高HCC检出率，AFP是一种血清糖蛋白，其升高与肝脏恶性肿瘤相关，即使使用组合方法，检测HCC的敏感性约为63%。磁共振成像(MRI)和计算机断层扫描(CT)诊断HCC的总灵敏度分别为65%和72%。然而，对于小于2 cm的HCC, CT和MRI的敏感性分别仅为48%和62%，而对于小于1 cm的HCC，CT和MRI的敏感性更低。
肝活检仍然是HCC的可靠诊断工具，经皮、超声引导的肝活检是最常用的方法。组织活检的主要缺点是其侵入性;最重要的风险是出血。因此，肝癌的临床诊断需求远未得到满足。基于精准医学的理念，发展新型的血液学诊断是提高HCC早期诊断的关键策略。
目前正在研究大量候选标记物，其中，cfDNA甲基化是一种有前景的标记物，DNA甲基化为DNA化学修饰的一种形式，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5号碳位共价结合一个甲基基团；能够在不改变DNA序列的前提下，影响表达、基因与蛋白质互作等；一般来说，cfDNA来源于死细胞，例如白细胞，但在癌症患者中，由于肿瘤细胞坏死或凋亡，肿瘤本身也可以将一小部分cfDNA释放到循环中。可以分析这种循环肿瘤来源的 DNA (ctDNA)，以了解肿瘤特有的基因甲基化模式。研究表明，某些肿瘤相关基因的异常甲基化在肿瘤发生早期即可出现，可作为诊断和监测的特异性标志物。事实上，对cfDNA中全基因组图谱的比较揭示了对肿瘤具有特异性的高甲基化或低甲基化基因标记物（称为 DNA 甲基化标记物 (DMM)），因此可以准确区分早期HCC和肝硬化。
在众多检测甲基化的方法中，高效、快速、操作简便的实时荧光定量PCR是主要方法之一。目前，临床一线缺乏准确性高的无创的肝细胞癌辅助诊断技术，开发基于基因甲基化检测的的产品，用于肝癌辅助诊断成为必要。
发明内容
本发明的目的在于提出引物和探针组合物、试剂盒及在检测EMX1、CHFR基因甲基化中的应用，实现高灵敏性、高特异性、准确快速检测以适用于肝细胞癌辅助诊断。
在前期位点筛选工作中，我们通过224例肝癌临床样本和276例正常人样本的血浆样本进行RRBS甲基化位点检测，同时参考了公共数据库，从数百万甲基化位点中，优选了10个差异化甲基化靶点（DMR），但是，该体系由于位点较多，导致成本和实用性较差，为此，我们从中优选了5个靶点，通过对额外122例样本(包含50例病人和72例健康人)的qPCR检测，最终筛选出2个靶标，并确定了合适的阈值。
需要指出的是，并非任一引物的设计都是能够实现高灵敏度及特异性检测，原因有两点：首先，同一基因的CpG位点可能多达数千个，不同的CpG位点的检测效能是有一定差异的；其次，不同基因的检测效能是有所差异的，通过增加检测基因的个数可以一定程度上提高灵敏度和特异性，但是基因数目增加会导致实用性大大降低，本发明基于基因组范围内百万级别的甲基化位点，选择最佳的CpG位点，以及最佳的基因组合，实现较高的灵敏度和特异性，满足临床需求的同时，兼顾较好的适用性。
鉴于此，本发明的方案为：
本发明的第一个方面，提供用于检测EMX1、CHFR基因甲基化的引物和探针组合物，包括引物对及探针组，引物对包括如SEQ ID NO：4-5、SEQ ID NO：7-8、SEQ ID NO：10-11所示的核苷酸序列；探针组包括如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列；
进一步地，所述探针组5’端均标记有荧光基团，3’端均标记有荧光淬灭基团；
优选地，所述荧光基团分别不同地选自FAM、VIC、CY5、ROX、HEX、JOE、NED、TexasRed或CY3；所述淬灭基团分别独立地选自MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或TAMRA；
优选地，所述探针组中，如SEQ ID NO：6所示的探针序列5 '端标记FAM荧光报告基团，3 '端标记BHQ-1荧光淬灭基团；如SEQ ID NO：9所示的探针序列5 '端标记VIC荧光报告基团，3 '端标记BHQ-1荧光淬灭基团；如SEQ ID NO：12所示的探针序列5 '端标记有CY5荧光报告基团，3 '端标记BHQ-3荧光淬灭基团；
本发明的第二个方面，EMX1、CHFR基因甲基化检测试剂盒，包括以上第一个方面所述的引物和探针组合物。本发明提供的试剂盒，采用TaqMan探针多重荧光PCR的方法，引物探针被设计在目的基因或目的基因启动子附近CpG位点，可特异性的和发生甲基化的序列结合，并发生PCR反应，而未发生甲基化的序列则不能与之结合。另外，同时检测转化后的内参基因ACTB，用以评估DNA模板是否合格。
Taqman探针法的工作原理为：
利用Taq酶的5’→3’外切酶活性，由于探针的5’端标以荧光报告基团（如FAM），靠近3’端标以荧光淬灭基团，两者之间构成能量传递结构。因此，当探针保持完整时，5’端荧光报告基团所激发出的荧光信号被3’端淬灭基团吸收或抑制，不出现荧光信号变化。当PCR反应体系中有目的基因存在，就会扩增出特异核酸片段，荧光探针即会根据碱基配对的原理与之杂交，当PCR进入延伸（复制）期，Taq酶从引物3’端开始，随新链沿DNA模板延伸，当延伸到探针结合的位置时，在其5’→3’端外切酶活性作用下，将探针切断。此时，荧光报告基团和淬灭基团间的能量传递结构被破坏，淬灭基团的淬灭作用被解除，荧光报告基团的荧光信号释放出来。PCR反应每复制一个特异核酸片段，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。随着荧光信号的积累，便可通过荧光PCR仪检测出来。相对的，当探针序列与目的基因序列不匹配时，探针无法与目标序列结合，PCR延伸过程中就无法切断此特异性探针，也就不会出现相应的荧光信号。
进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品、PCR反应混合液和纯化水。
优选地，所述阳性对照为EMX1、CHFR甲基化基因序列质粒，所述阴性对照为正常基因组转化后的DNA；和/或，所述PCR反应混合液包含DNA聚合酶、dNTP、Mg2+、辅助增强剂及缓冲液。
本发明第三个方面，提出第二个方面所述试剂盒在非诊断为目的检测EMX1、CHFR基因甲基化中的应用。非诊断为目的的检测包括无法追溯至人的样本的检测，如某样本在实验室条件下基因甲基化的检测，检测结果仅代表样本自身结果，即EMX1、CHFR基因甲基化的存在或不存在。
本发明第四个方面，提出一种非诊断目的检测EMX1、CHFR基因甲基化的方法，步骤包括：
提取待测样品中基因组DNA并进行亚硫酸氢盐转化；
以转化的DNA为模板，使用第二个方面所述试剂盒进行荧光定量PCR反应；
根据荧光定量PCR检测结果，判断待测样本中基因的甲基化状态。
进一步地，所述待测样本为血液、血清或血浆。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明提供的引物和探针组设计在目的基因或目的基因启动子附近CpG位点，可特异性的和发生甲基化的序列结合，用于检测EMX1、CHFR基因甲基化可实现高灵敏性、高特异性、准确快速检测，以适用于肝细胞癌辅助诊断。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明所述EMX1甲基化位点引物探针设计图。
图2为本发明所述CHFR甲基化位点引物探针设计图。
图3为本发明所述ACTB甲基化位点引物探针设计图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰明白，以下结合附图和具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并不是为了限定本发明。
实施例1 试剂盒的设计
DNA甲基化是DNA化学修饰的一种形式，即一个甲基基团以共价键的形式结合到CpG双核苷酸上胞嘧啶的第5 位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶。为了对DNA进行CpG胞嘧啶甲基化的检测，需要将DNA进行亚硫酸氢盐转化处理，使没有甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），而已甲基化的胞嘧啶则不会发生转化，从而特异性的区分开甲基化和未甲基化目的基因。
转化后的野生型EMX1靶标序列、CHFR靶标序列，及ACTB靶标序列分别如SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3所示。根据图1-3所示的基因位点设计引物或探针。上述EMX1和CHFR基因的引物探针组合，通过扩增引物对检测探针的巧妙设计，避免了多个引物对及对应的检测探针之间的相互干扰；并经验证，使用上述引物探针组合检测EMX1和CHFR基因甲基化，特异性好，灵敏度高。
具体地，EMX1和CHFR甲基化基因以及参照位点PCR扩增引物及荧光素修饰特征列见表1。
表1：3个位点的PCR扩增引物对、探针组与荧光素标记特征
具体地，检测试剂盒还包括用于检测EMX1和CHFR基因甲基化的PCR扩增体系，包括DNA聚合酶、dNTP、Mg2+、PCR缓冲体系、PCR增强剂、PCR稳定剂中的至少一种，包含Tris、KCl（10mM~500mM）、(NH4)2SO4（10mM~500mM）、甘油（1%~50%）、BSA（0.001mg/mL~1mg/mL）、Tween20（0.1%~10%）、二硫苏糖醇（1mM/mL~100mM/mL）、甜菜碱（0.1M~3M）以及DMSO（0.1%~10%）。汇总如表2所示。
表2：肝癌EMX1和CHFR甲基化检测试剂盒成分
实施例2 检测过程及结果
1.样本预处理：
本试剂盒检测前需要进行样本DNA提取与转化，使用血浆 DNA 提取和亚硫酸盐转化试剂盒（使用试剂盒名称：QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit；货号：55114；EZ DNAMethylation-Lightning Kit；公司名称：ZYMO RESEARCH；）进行样本预处理；
本试剂盒所需的血浆样本体积应大于为2ml，按照血浆DNA提取和亚硫酸盐转化试剂盒说明书要求进行预处理。处理后的血浆DNA可直接用于本试剂盒检测。
2.样本检测：
1) 取出在-15～-25℃条件下避光保存的试剂盒，将试剂盒组份平衡至室温；
2) 取出相应数量的96孔板或PCR反应管；
3) 根据当次实验所进行的反应数计算并移取相应量的试剂，反应数指标本次检验量加上1个空白对照（以纯化水代替DNA）、1个突变对照、1 个正常对照，剩余试剂放回-15～-25℃条件下避光保存；
4) 按表3方案配制反应；
表3：反应体系 (20µL体系)
5) 模板溶液指1中预处理后的样本混合溶液、甲基化阳性质控品、甲基化阴性质控品、空白对照品；
6) 将96孔板封膜或盖好PCR反应管盖，振荡均匀，2000rpm离心10秒，将其放入荧光定量PCR仪内；
7) 按表4条件进行PCR扩增。
表4：扩增程序
3.结果分析
参照各仪器使用说明书进行设置，以下分析以ABI系列仪器为例：
1) 调整荧光信号阈值至甲基化对照品检测结果中甲基化阴性质控品所对应的靶标荧光通道无信号，ACTB荧光通道有检测信号；以ABI 7500型荧光定量PCR仪为例，设置基线 10～22 个循环，荧光信号阈值为25000左右时可获得理想的检测结果；
2) 本试剂盒检测结果中荧光通道对应被检目的基因如表5所示。
表5：
4.质量控制
1) 外源对照
该试剂盒包含阳性对照品和阴性对照品。应在每次反应中添加这些对照品以检测反应是否成功，同时确保反应的有效性。阳性对照品和阴性对照品的反应Ct值应该在有效范围内，如表6，如果反应Ct值在其有效范围之外，此次测试结果无效。
表6：
2) 内源对照
内源对照能够检测亚硫酸盐转化的ACTB基因，同时能够检测样品是否满足实验要求（包括样本制备是否正确，样本 DNA 含量是否满足要求）。如果ACTB的Ct值超出有效范围，则反应无效。因为过高的Ct值表示BisDNA浓度过低或者PCR反应的抑制。
3)空白对照品：检测结果中检测通道Ct值无信号。若信号升起，且Ct值≤34，则此次实验结果无效，建议重新实验。
5.结果判读
PCR 结果的判定见表7。
表7：
*:靶标基因（EMX1和CHFR）的Ct值与ACTB的Ct值差值。（ PCR结果的阴阳性以Ct 值为判定标准，而不以S型曲线判定）
6.实例检测结果
某血浆样本来源于肝细胞癌患者和健康人，共计100例。具体如表8所示。
表8：
样本信息和检测结果如表9所示。
表9：
序号 ACTB EMX1-Ct EMX1-△Ct CHFR-Ct CHFR-△Ct 临床诊断 结果判读
1 27.9 28.2 0.3 28.5 0.6 肝细胞癌 阳性
2 29.9 34.6 4.7 30.7 0.8 肝细胞癌 阳性
3 27 28.2 1.2 29 2 肝细胞癌 阳性
4 29.5 30.6 1.1 30.3 0.8 肝细胞癌 阳性
5 32 32.1 0.1 37.2 5.2 肝细胞癌 阳性
6 26.2 30 3.8 30.5 4.3 肝细胞癌 阳性
7 31 36.1 5.1 32.8 1.8 肝细胞癌 阳性
8 26.6 32.3 5.7 29.1 2.5 肝细胞癌 阳性
9 29.1 33.3 4.2 34.9 5.8 肝细胞癌 阳性
10 30.2 33.8 3.6 32.7 2.5 肝细胞癌 阳性
11 26.8 31.2 4.4 30.6 3.8 肝细胞癌 阳性
12 28.5 34.3 5.8 28.6 0.1 肝细胞癌 阳性
13 28.7 31.1 2.4 29.5 0.8 肝细胞癌 阳性
14 25.5 28.6 3.1 28.5 3 肝细胞癌 阳性
15 29.2 31.1 1.9 30.1 0.9 肝细胞癌 阳性
16 27.6 31 3.4 29 1.4 肝细胞癌 阳性
17 30.3 34.3 4 40.1 9.8 肝细胞癌 阳性
18 25.4 29.3 3.9 40.4 15 肝细胞癌 阳性
19 27.6 31.7 4.1 43 15.4 肝细胞癌 阳性
20 28 33.3 5.3 39.1 11.1 肝细胞癌 阳性
21 26.2 28.1 1.9 42.1 15.9 肝细胞癌 阳性
22 27.7 33.5 5.8 37.9 10.2 肝细胞癌 阳性
23 28 29.8 1.8 35.7 7.7 肝细胞癌 阳性
24 26.3 29.8 3.5 39.9 13.6 肝细胞癌 阳性
25 30.6 35 4.4 37.2 6.6 肝细胞癌 阳性
26 26.9 32.7 5.8 34.2 7.3 肝细胞癌 阳性
27 31.2 32.7 1.5 39.6 8.4 肝细胞癌 阳性
28 31.2 33.2 2 37 5.8 肝细胞癌 阳性
29 25.3 40 14.7 29 3.7 肝细胞癌 阳性
30 30.9 45 14.1 35.9 5 肝细胞癌 阳性
31 29.5 39.8 10.3 34 4.5 肝细胞癌 阳性
32 26.1 30.1 4 31.4 5.3 肝细胞癌 阳性
33 31.6 31.2 -0.4 37.4 5.8 肝细胞癌 阳性
34 26 37.7 11.7 30.7 4.7 肝细胞癌 阳性
35 25.8 32.8 7 26.6 0.8 肝细胞癌 阳性
36 27.8 44.4 16.6 28.6 0.8 肝细胞癌 阳性
37 28.2 36.9 8.7 30.5 2.3 肝细胞癌 阳性
38 31.1 41.3 10.2 31.8 0.7 肝细胞癌 阳性
47 25.1 38.7 13.6 29.3 4.2 肝细胞癌 阳性
48 25.6 39.9 14.3 29.8 4.2 肝细胞癌 阳性
49 25.8 34.3 8.5 30.8 5 肝细胞癌 阳性
50 25.8 36.4 10.6 30.5 4.7 肝细胞癌 阳性
39 27.6 37 9.4 42.6 15 肝细胞癌 阴性
40 29.5 44.3 14.8 35.5 6 肝细胞癌 阴性
41 31 43 12 44.8 13.8 肝细胞癌 阴性
42 27.4 40.6 13.2 42.7 15.3 肝细胞癌 阴性
43 25.1 38.1 13 37.1 12 肝细胞癌 阴性
44 26.7 37.4 10.7 33.2 6.5 肝细胞癌 阴性
45 26.9 36.9 10 36.8 9.9 肝细胞癌 阴性
46 27.6 43.9 16.3 38.4 10.8 肝细胞癌 阴性
51 25.2 45 19.8 45 19.8 健康人 阴性
52 29.8 45 15.2 45 15.2 健康人 阴性
53 26 45 19 45 19 健康人 阴性
54 26.8 45 18.2 45 18.2 健康人 阴性
55 31.7 45 13.3 45 13.3 健康人 阴性
56 25.3 45 19.7 45 19.7 健康人 阴性
57 31 45 14 45 14 健康人 阴性
58 28.9 45 16.1 45 16.1 健康人 阴性
59 29.5 45 15.5 45 15.5 健康人 阴性
60 26.6 45 18.4 45 18.4 健康人 阴性
61 25.2 45 19.8 45 19.8 健康人 阴性
62 28.6 45 16.4 45 16.4 健康人 阴性
63 26.1 45 18.9 45 18.9 健康人 阴性
64 25 45 20 45 20 健康人 阴性
65 30.7 45 14.3 45 14.3 健康人 阴性
66 27.4 45 17.6 45 17.6 健康人 阴性
67 30.9 45 14.1 45 14.1 健康人 阴性
68 28.2 45 16.8 45 16.8 健康人 阴性
69 28.9 45 16.1 45 16.1 健康人 阴性
70 31.8 45 13.2 45 13.2 健康人 阴性
71 31.9 45 13.1 45 13.1 健康人 阴性
72 26.5 45 18.5 45 18.5 健康人 阴性
73 31.7 45 13.3 45 13.3 健康人 阴性
74 29.2 45 15.8 45 15.8 健康人 阴性
75 27.9 45 17.1 30.5 2.6 健康人 阳性
76 30.5 45 14.5 31.2 0.7 健康人 阳性
77 25.4 31.2 5.8 45 19.6 健康人 阳性
78 30.6 29.3 -1.3 45 14.4 健康人 阳性
79 30.3 45 14.7 45 14.7 健康人 阴性
80 28.3 45 16.7 45 16.7 健康人 阴性
81 31.2 45 13.8 45 13.8 乙肝 阴性
82 30 45 15 45 15 乙肝 阴性
83 25.6 45 19.4 45 19.4 乙肝 阴性
84 31.8 45 13.2 45 13.2 乙肝 阴性
85 28.6 45 16.4 45 16.4 乙肝 阴性
86 25.6 45 19.4 45 19.4 肝硬化 阴性
87 25.9 45 19.1 45 19.1 肝硬化 阴性
88 31.4 45 13.6 45 13.6 肝硬化 阴性
89 25.5 45 19.5 45 19.5 肝硬化 阴性
90 31.6 45 13.4 45 13.4 肝硬化 阴性
91 30.3 45 14.7 45 14.7 肝硬化 阴性
92 26.7 45 18.3 45 18.3 肝硬化 阴性
93 28.6 45 16.4 45 16.4 肝硬化 阴性
94 26 45 19 45 19 肝硬化 阴性
95 27.5 45 17.5 45 17.5 脂肪肝 阴性
96 31 45 14 45 14 脂肪肝 阴性
97 28.3 45 16.7 45 16.7 脂肪肝 阴性
98 30.7 45 14.3 45 14.3 脂肪肝 阴性
99 26.5 45 18.5 45 18.5 脂肪肝 阴性
100 26.6 45 18.4 45 18.4 脂肪肝 阴性
综合两个标志物的检测结果，按照如下公式计算得到灵敏度和特异性：
灵敏度＝检测结果为阳性的肝细胞癌样本数/总的肝细胞癌样本数；
特异性＝检测结果为阴性的非肝细胞癌癌样本数/总的非肝细胞癌样本数；
根据上述公式，EMX1和CHFR基因的组合灵敏度达到了84％，特异性达到了92％，从而较好的弥补了现有检测手段，例如常规AFP等手段准确性低的不足，对于及时检出癌症早期病变具有重要意义。
本发明并不仅仅限于说明书和实施方式中所描述，因此对于熟悉领域的人员而言可容易地实现另外的优点和修改，故在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念的精神和范围的情况下，本发明并不限于特定的细节、代表性的设备和这里示出与描述的图示示例。

Claims (10)

1.引物和探针组合物，用于检测EMX1、CHFR基因甲基化，其特征在于，包括引物对及探针组，引物对包括如SEQ ID NO：4-5、SEQ ID NO：7-8、SEQ ID NO：10-11所示的核苷酸序列；探针组包括如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的引物和探针组合物，其特征在于，所述探针组5’端均标记有荧光基团，3’端均标记有荧光淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的引物和探针组合物，其特征在于，所述荧光基团分别不同地选自FAM、VIC、CY5、ROX、HEX、JOE、NED、Texas Red或CY3；所述淬灭基团分别独立地选自MGB、BHQ1、BHQ2、BHQ3或TAMRA。
4.根据权利要求2所述的引物和探针组合物，其特征在于，所述探针组中，如SEQ IDNO：6所示的探针序列5 '端标记FAM荧光报告基团，3 '端标记BHQ1荧光淬灭基团；如SEQ IDNO：9所示的探针序列5 '端标记VIC荧光报告基团，3 '端标记BHQ1荧光淬灭基团；如SEQ IDNO：12所示的探针序列5 '端标记有CY5荧光报告基团，3 '端标记BHQ3荧光淬灭基团。
5.EMX1、CHFR基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-4任意一项所述的引物和探针组合物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品、PCR反应混合液和纯化水。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为EMX1、CHFR甲基化基因序列质粒，所述阴性对照为正常基因组转化后的DNA；和/或，所述PCR反应混合液包含DNA聚合酶、dNTP、Mg2+、辅助增强剂及缓冲液。
8.权利要求5-7任意一项所述试剂盒在非诊断为目的检测EMX1、CHFR基因甲基化中的应用。
9.一种非诊断目的检测EMX1、CHFR基因甲基化的方法，其特征在于，步骤包括：
提取待测样品中基因组DNA并进行亚硫酸氢盐转化；
以转化的DNA为模板，使用权利要求5-7任意一项所述试剂盒进行荧光定量PCR反应；
根据荧光定量PCR检测结果，判断待测样本中基因的甲基化状态。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述待测样本为血液、血清或血浆。
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