CN118831079A - 一种治疗耐药结核的药物及其组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体公开了Lefamulin在耐药结核治疗中的应用。本发明发现Lefamulin可以有效抑制结核分枝杆菌标准株和临床分离株，甚至对耐多药结核分枝杆菌也对具有相同的抑制效果。此外，本发明发现Lefamulin与其他临床常见抗结核药物联合可以增强其抑制效果。因此，Lefamulin可作为候选药物应用于抗结核分枝杆菌感染药物的开发，对于防治结核病尤其是耐药结核病具有重要的意义。

Description

一种治疗耐药结核的药物及其组合物

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种半合成截短侧耳素类药物在耐药结核治疗中的应用。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,M.tb)感染引起，严重威胁人类健康的重大传染病。世界卫生组织(WorldHealth Organization,WHO)发表的全球结核病报告指出，全球约有20亿～30亿口感染M.tb，2022年新发结核病病例约1060万，约有130万人死于与结核病相关的疾病(WorldHealth Organization.Global tuberculosisreport 2023.[R]Geneva:World llealth Organization,2023.)。虽然近年来我国结核病发病率有所下降，但仍是结核病发病率较高的国家之一，而耐药结核病的流行加剧了我国结核病控制的难度。2022年全球新发耐多药结核(Multidrugresistant-tuberculosis,MDR-TB)病例约41万例，然而确诊并纳入规范治疗的耐多药或利福平耐药结核病患者仅有43％，治疗成功率63％。我国是结核病高负担国家，2022年我国新发结核病患者约为75万。同时，我国也是MDR-TB高负担国家之一，全球排名第四位，2022年耐药结核病新发病例约7万(高静韬，刘宇红.2019年世界卫生组织全球结核病报告要点解读[J],国际呼吸杂志,2020,40(3):161-166.)。由于有效抗生素的使用，敏感结核病的治愈率可达85％，但MDR-TB治疗可选药物局限、治疗周期长且治愈率仅为50％。抗结核药物分为一线药和二线药，一线药在结核病的治疗中起主要作用，但若结核分枝杆菌出现耐药现象时，一线药的治愈率将有所下降，不能满足治疗需求，需及时选用二线药进行治疗，但对于多耐药、广泛耐药结核病的治疗，许多二线药的疗效也不理想，甚至出现有些患者无药可用的情况(马志强,陈薇,王晓燕,等.208例耐药结核病患者耐药特征分析[J].中国实验诊断学,2024,28(03):304-306.)。因此，临床上急需新的抗结核药物或挖掘现有药物的抗结核分枝杆菌活性，对于结核病尤其是耐药结核病的治疗至关重要。

Lefamulin是由NabrivaTherapeutics研发并于2019年8月于FDA批准上市，用于治疗成人社区获得性细菌性肺炎。在我国，由住友制药(苏州)有限公司上海分公司研发的Lefamulin，也于2023年11月17日获得国家食品药品监督局批准上市用于治疗成人社区获得性细菌性肺炎。社区获得性肺炎(community-acquiredpneumonia,CAP)是全球范围内最常见的感染性疾病之一，具有高发病率和病死率。其发病率随着年龄的增长而升高，给患者和医保系统带来沉重的经济负担。在美国5％～15％的CAP病例由肺炎链球菌造成，其他病原体有流感嗜血杆菌、黏膜炎莫拉菌、铜绿假单胞菌以及嗜肺性军团菌等非典型致病菌。Lefamulin是首个患者可以全身用药的半合成截短侧耳素类抗生素，在临床前和临床试验中，Lefamulin显示出对常见引起CAP的病原体的抑制活力。其抗菌机制不同于其他抑制蛋白质合成的抗生素，遵循一种独特的与原核生物核糖体相结合的作用模式。它与50S核糖体大亚基相互作用，其母核与A位点结合，C14侧链则伸向了肽转移中心核糖体的P位点，能与50S大亚基的23S rRNA结合，抑制肽基转移酶的活性，所以能干扰细菌蛋白质的合成，导致细菌死亡。Lefamulin只选择性地抑制原核细胞蛋白质的合成，但对真核细胞没有影响，也不与哺乳动物的核糖体相互作用。由于作用机制不同于其他临床上常用的抗生素，Lefamulin导致耐药性发生的倾向较低。此外，基于LEAP 1和LEAP 2两个临床Ⅲ期试验的数据，Lefamulin有良好的安全性，所有不良反应都是轻微或中度的，且在停药后2d内可自行消退(罗志敏,朱迎春,王海荣.治疗社区获得性肺炎的截短侧耳素类抗生素Lefamulin[J].中国医药导刊,2020,22(06):397-400.)。目前，尚未有Lefamulin抑制结核分枝杆菌的相关报道。

发明内容

本发明发现Lefamulin具有抑制结核分枝杆菌活性的作用，据此完成本发明。

第一方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含Lefamulin和另一种抗结核分枝杆菌感染的药物，

所述药物组合物具有以下至少一种功效：

a)抑制结核分枝杆菌活性；

b)抗结核分枝杆菌感染；

c)预防和/或治疗结核分枝杆菌所致疾病。

进一步，所述的结核分枝杆菌包括结核分枝杆菌标准株、结核分枝杆菌临床分离株或结核分枝杆菌感染的患者携带的结核分枝杆菌。

优选的，所述结核分枝杆菌为泛敏感和耐药的结核分枝杆菌。

进一步，所述另一种抗结核分枝杆菌感染药物包括抗生素和其他能够有利于抑制或杀灭结核分枝杆菌或提供患者抵抗力的药物中的一种或多种。

更进一步，所述抗生素包括利福平、贝达喹啉、利奈唑胺、德拉马尼、左氧氟沙星、莫西沙星、氯法齐明、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、链霉素、异烟肼和/或乙硫异烟胺中的一种或多种；所述其他药物包括维生素、氨基酸、蛋白质和/或矿物质中的一种或多种。

进一步，所述药物组合物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。

更进一步，所述载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)和/或肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)中的一种或多种。

优选的，所述载体材料为水溶性载体材料。

进一步，所述药物组合物可以制成多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂和/或冻干粉针剂中的一种或多种。

进一步，所述制剂可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂和/或各种微粒给药系统中的一种或多种。

进一步，所述片剂可以广泛使用本领域公知的各种载体，包括稀释剂与吸收剂、湿润剂与粘合剂、崩解剂、崩解抑制剂、吸收促进剂和/或润滑剂中的一种或多种。

更进一步，所述稀释剂与吸收剂包括但不限于淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素和/或硅酸铝中的一种或多种。

进一步，所述湿润剂与粘合剂包括但不限于水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾和/或聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种。

进一步，所述崩解剂包括但不限于干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素和/或乙基纤维素中的一种或多种。

进一步，所述崩解抑制剂包括但不限于蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂和/或氢化油等。

进一步，所述吸收促进剂包括但不限于季铵盐和/或十二烷基硫酸钠中的一种或多种。

进一步，所述润滑剂包括但不限于滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡和/或聚乙二醇中的一种或多种。

进一步，所述片剂还可以进一步制成包衣片，包括糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，双层片和多层片。

进一步，所述丸剂可以广泛使用本领域公知的各种载体，包括稀释剂与吸收剂、粘合剂和/或崩解剂。

更进一步，所述稀释剂与吸收剂包括但不限于葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土和/或滑石粉中的一种或多种。

进一步，所述粘合剂包括但不限于阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊和/或面糊中的一种或多种。

进一步，所述崩解剂包括但不限于琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素和/或乙基纤维素中的一种或多种。

进一步，所述栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体，包括但不限于聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶和/或半合成甘油酯中的一种或多种。

进一步，所述注射用制剂包括但不限于溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和/或混悬剂中的一种或多种。

更进一步，所述注射用制剂可以使用本领域常用的所有稀释剂，包括但不限于水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇和/或聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯中的一种或多种。

进一步，所述注射用制剂为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖、甘油、常规的助溶剂、缓冲剂和/或pH调节剂中的一种或多种。

进一步，所述各种制剂如需要也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。

进一步，所述产品可以经注射给药、腔道给药、呼吸道给药或粘膜给药。

更进一步，所述注射给药包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腔内注射等；所述腔道给药包括经直肠或阴道给药；所述呼吸道给药包括经鼻腔给药。

第二方面，本发明提供一种Lefamulin在制备抑制结核分枝杆菌产品中的应用。

进一步，所述的结核分枝杆菌包括结核分枝杆菌标准株、结核分枝杆菌临床分离株或结核分枝杆菌感染的患者携带的结核分枝杆菌。

优选的，所述结核分枝杆菌为泛敏感和耐药的结核分枝杆菌。

进一步，所述抑制结核分枝杆菌产品包括药物和/或抑菌剂中的一种或多种。

第三方面，本发明提供一种Lefamulin在制备预防和/或治疗结核分枝杆菌感染导致的疾病的药物中的应用。

其中Lefamulin通过如下方式发挥作用：

1)Lefamulin抑制结核分枝杆菌活性；

2)Lefamulin杀灭结核分枝杆菌。

进一步，所述的结核分枝杆菌包括结核分枝杆菌标准株、结核分枝杆菌临床分离株或结核分枝杆菌感染的患者携带的结核分枝杆菌。

优选的，所述结核分枝杆菌为泛敏感和耐药的结核分枝杆菌。

进一步，所述预防和/或治疗结核分枝杆菌感染导致的疾病的药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。

更进一步，所述载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)和/或肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)中的一种或多种。

优选的，所述载体材料为水溶性载体材料。

进一步，所述预防和/或治疗结核分枝杆菌感染导致的疾病的药物可以制成多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂和/或冻干粉针剂中的一种或多种。

进一步，所述制剂可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂和/或各种微粒给药系统中的一种或多种。

进一步，所述片剂可以广泛使用本领域公知的各种载体，包括稀释剂与吸收剂、湿润剂与粘合剂、崩解剂、崩解抑制剂、吸收促进剂和/或润滑剂中的一种或多种。

更进一步，所述稀释剂与吸收剂包括但不限于淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素和/或硅酸铝中的一种或多种。

进一步，所述湿润剂与粘合剂包括但不限于水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾和/或聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种。

进一步，所述崩解剂包括但不限于干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素和/或乙基纤维素中的一种或多种。

进一步，所述崩解抑制剂包括但不限于蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂和/或氢化油等。

进一步，所述吸收促进剂包括但不限于季铵盐和/或十二烷基硫酸钠中的一种或多种。

进一步，所述润滑剂包括但不限于滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡和/或聚乙二醇中的一种或多种。

进一步，所述片剂还可以进一步制成包衣片，包括糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，双层片和多层片。

进一步，所述丸剂可以广泛使用本领域公知的各种载体，包括稀释剂与吸收剂、粘合剂和/或崩解剂。

更进一步，所述稀释剂与吸收剂包括但不限于葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土和/或滑石粉中的一种或多种。

进一步，所述粘合剂包括但不限于阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊和/或面糊中的一种或多种。

进一步，所述崩解剂包括但不限于琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素和/或乙基纤维素中的一种或多种。

进一步，所述栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体，包括但不限于聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶和/或半合成甘油酯中的一种或多种。

进一步，所述注射用制剂包括但不限于溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和/或混悬剂中的一种或多种。

更进一步，所述注射用制剂可以使用本领域常用的所有稀释剂，包括但不限于水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇和/或聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯中的一种或多种。

进一步，所述注射用制剂为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖、甘油、常规的助溶剂、缓冲剂和/或pH调节剂中的一种或多种。

进一步，所述各种制剂如需要也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。

进一步，所述预防和/或治疗结核分枝杆菌感染导致的疾病的药物可以经注射给药、腔道给药、呼吸道给药或粘膜给药。

更进一步，所述注射给药包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腔内注射等；所述腔道给药包括经直肠或阴道给药；所述呼吸道给药包括经鼻腔给药。

有益效果

1、本发明发现Lefamulin可以有效抑制结核分枝杆菌标准株，对结核分枝杆菌标准株H37Rv的MIC为1μg/mL。

2、本发明发现Lefamulin可以有效抑制结核分枝杆菌临床分离株，对临床分离结核分枝杆菌菌株(非MDR-TB)的MIC₅₀为0.5μg/mL，MIC₉₀为4μg/mL；即使是耐多药结核分枝杆菌，Lefamulin依然可以有效抑制其生长，其MIC₅₀为1μg/mL，MIC₉₀为4μg/mL。

3、本发明发现Lefamulin与抗结核新药贝达喹啉(Bedaquiline)联合表现为协同作用，与其他临床常见抗结核药物联合表现为加和作用。

4、本发明发现Lefamulin单独作用于胞内结核分枝杆菌具有很好的抑菌作用，与抗结核药联合应用可以增强其抑制效果；Lefamulin与Bedaquiline处理后，相比对照组菌载量分别降低了41.67％±12.42％和76.67％±6.83％；当二者联合处理后，Lefamulin+Bedaquiline双药相比对照组菌载量降低了83.33％±8.84％。

5、本发明发现Lefamulin可作为候选药物应用于抗结核分枝杆菌感染药物的开发，对于防治结核病尤其是耐药结核病具有重要的意义。

附图说明

图1为Lefamulin对26株结核分枝杆菌临床分离株(非MDR)的MIC值分布。

图2为Lefamulin对25株结核分枝杆菌临床分离株(MDR)的MIC值分布。

图3为Lefamulin联合贝达喹啉对巨噬细胞内结核分枝杆菌的抑菌活性评价。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

术语解释

耐多药结核(multi-drug resistant,MDR-TB)：结核分枝杆菌对包括异烟肼、利福平同时耐药在内的至少二种以上的一线抗结核药物耐药。

一线抗结核药物：异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇和链霉素。

社区获得性细菌性肺炎：(Community acquired bacterial pneumonia,CABP)是指在医院外罹患的感染性肺实质炎症，包括具有明确潜伏期的病原体感染在入院后于潜伏期内发病的肺炎。其最主要的病原菌是肺炎链球菌，此外，还包括流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌及金黄色葡萄球菌等。

截短侧耳素：是20世纪50年代发现的一种具有抗菌活性的天然产物，由高等真菌担子菌刚侧耳属Pleurotsmutilus和Pleurots passeckerianus菌种经深层培养产生的一类具有骈三环骨架的二萜化合物。

材料说明：

结核分枝杆菌标准株H37Rv：购自ATCC，编号为ATCC27294。

Lefamulin：购自MedchemExpress，货号HY-16908A。分子式为C₃₀H₄₉NO₇S，分子量为567.78，CAS号为1350636-82-6，其结构式如下：

实施例1Lefamulin对结核分枝杆菌标准菌株抑菌活性检测

1、Lefamulin溶液的配制：将Lefamulin用二甲亚砜(DMSO)溶解，配制8mg/ml的Lefamulin母液，过滤除菌，保存。将Lefamulin母液用7H9培养基配置成浓度为64μg/mL的Lefamuline溶液。在96孔板的第1列加入浓度为64μg/mL的Lefamuline溶液，混匀后，从第1列孔依次梯度稀释至第10列后，吸出100μl弃掉；在第11列和12列分别加入7H9培养基，作为对照孔。每个浓度设置2个复孔，进行3次重复实验。

2、菌液的配制：将结核分枝杆菌(ATCC27294)在中性罗氏培养基中进行培养至对数期，刮取对数期的菌株，将菌落置于磨菌瓶中研磨均匀，用7H9培养基稀释菌悬液并比浊至1麦氏，再以1：20的比例加入到7H9培养基中混匀后得到结核分枝杆菌悬液。

3、分别向第1-11列内每孔加入等量结核分枝杆菌悬液，使每孔中最终容积一致，菌液终浓度4×10⁵CFU/mL，此时第1-10列内各孔内的最终药物浓度依次为32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL、0.0625μg/mL，并设立阳性对照孔(第11列，未加药物的含菌培养基)和阴性对照孔(第12列未加菌液和药物的培养基)，每个浓度设置2个复孔，进行3次重复实验。

4、将所述96孔板放至温箱中培养，培养7天。

5、向微孔板中加入阿尔玛蓝和5％吐温-80的预混显色液，继续培养后观察96孔板颜色变化。

6、判定标准：蓝色孔为无菌生长，粉色孔为有菌生长，阻止颜色由蓝色变为粉红色的最低药物浓记为能抑制结核分枝杆菌(ATCC27294)生长的最小抑菌浓度(MIC)。

结果表明，Lefamulin对结核分枝杆菌H37Rv(ATCC27294)的MIC为1μg/mL。

实施例2Lefamulin对临床分离结核分枝杆菌菌株抑菌活性检测

按照实施例1中的方法，检测Lefamulin对26株临床分离结核分枝杆菌菌株(非MDR-TB)的抑菌活性。

如表1所示，Lefamulin对26株结核分枝杆菌临床分离株的MIC范围为0.0625μg/mL-4μg/mL，MIC₅₀＝0.5μg/mL，MIC₉₀＝4μg/mL，证明Lefamulin对临床分离结核分枝杆菌菌株(非MDR-TB)具有较好的体外抑菌活性。MIC浓度分布统计结果如图1所示。

表1

按照实施例1中的方法，检测Lefamulin对25株临床分离结核分枝杆菌菌株(MDR-TB)的抑菌活性。

如表2所示，Lefamulin对25株结核分枝杆菌临床分离株的MIC范围为0.25μg/mL-4μg/mL，MIC₅₀＝1μg/mL，MIC₉₀＝4μg/mL，证明Lefamulin对临床分离结核分枝杆菌菌株(MDR-TB)具有较好的体外抑菌活性。MIC浓度分布统计结果如图2所示。

表2

实施例3Lefamulin与临床常见抗结核药物联合对结核分枝杆菌标准菌株抑菌活性评价

3.1药物的配制

将Lefamulin DMSO溶解，配制8mg/ml的Lefamulin母液，过滤除菌，保存。其余抗结核药物：利福平(Rifampicin，RFP)、异烟肼(Isoniazid，INH)、贝达喹啉(Bedaquiline，BDQ)、利奈唑胺(Linezolid，LZD)、氯法齐明(Clofazimine，CFZ)、德拉马尼(Delamanid，DLM)同上，配置浓度为8mg/ml，备用。

3.2药物板子的配制

3.2.1利福平药板准备

在96孔板2-10列，B-G列，每孔加入50μl的7H9培养基(含10％OADC)；在2-10列的第H行加入100μl的16×MIC浓度的利福平药物溶液；从第H行孔中吸出50μl至第G行中，依次梯度稀释至第B行后，吸出50μl弃掉；最后在第2列的第B-H行补加50μl的7H9培养基，完成利福平药物板的配置。其余药物板配置同上。

3.2.2Lefamulin药板准备

根据1.1.1中准备的药物板子的数量，确定Lefamulin需要配置的体积；准备20ml16×MIC浓度的Lefamulin药物；再准备7个试管，每管中加入10ml的7H9培养基，标好序号；从16×MIC浓度的Lefamulin药液进行倍比稀释，使各管最终药物浓度依次为16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL，分别标记为16×、8×、4×、2×、1×、1\2×、1\4×、1\8×；吸取50μl 16×的Lefamulin药物加入到96孔板第10列，8×Lefamulin加入第9列，依次类推，直至加到第3列；第1列A-D孔加入100μl的7H9培养基；在第1列E-H孔加入200μl的7H9培养基，作为阴性对照；最后在A行3-10列补加50μl的7H9培养基，完成96孔板药物准备。

3.3菌液准备

将结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，ATCC27294)在中性罗氏培养基中进行培养至对数期，刮取对数期的菌株，将菌落置于磨菌瓶中研磨均匀，用7H9培养基稀释菌悬液并比浊至1麦氏，再以1：20的比例加入到7H9培养基中混匀后得到结核分枝杆菌悬液，备用。

3.4加菌液

在96孔板第3-10列、第2列B-H行和第1列A-D行加入稀释好的菌液；其中，第1列A-D行作为阳性对照。

3.5培养及判定结果

将所述96孔板放至温箱中培养7-9天；向微孔板中加入刃天青(购自SIGMA,货号：R7017-5G)显色液，继续培养后观察96孔板颜色变化，读结果。

3.6结果判定标准

蓝色孔为无菌生长，粉色孔为有菌生长，阻止颜色由蓝色变为粉红色的最低药物浓记为能抑制结核分枝杆菌结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，ATCC27294)生长的最小抑菌浓度(MIC)；在组合中抑制生长的抗生素的最低浓度(CIC)；FICI被确定为单个抗生素的分数抑制浓度(FIC)的总和，公式如下：

FIC＝CIC/MIC

FICI＝CICA/MICA+CICB+MICB

当FICI值分别≤0.5、0.5-1.0、1.0-4.0或>4.0时，抗生素的联合作用被认为是协同作用、加和作用、无关或具有拮抗作用。

3.7结果

如表3所示，Lefamulin与抗结核新药贝达喹啉表现为协同作用，与其他测试的抗结核药物表现为加和作用。

表3.Lefamulin与核心抗结核药物的体外相互作用情况

抗生素名称	FICI	联合作用效果
			Lefamulin/利福平RIF	0.625	加和作用
Lefamulin/异烟肼INH	0.75	加和作用
			Lefamulin/贝达喹啉BDQ	0.5	协同作用
Lefamulin/利奈唑胺LZD	0.75	加和作用
			Lefamulin/氯法齐明CFZ	0.625	加和作用
Lefamulin/德拉马尼DLM	0.625	加和作用

实施例4、Lefamulin联合贝达喹啉对巨噬细胞内结核菌的抑菌活性评价4.1细胞准备

1、培养细胞：配置1640完全培养基(0.1％双抗+10％胎牛血清(FBS))，在细胞培养瓶中培养THP-1细胞。

2、收集细胞并计数和稀释：THP-1细胞为悬浮细胞，培养好的细胞收集离心，弃去上清。再次加入含双抗的完全细胞培养液重悬细胞，并对细胞进行计数。根据计数结果将细胞稀释为1×10⁶个/mL。

3、加入佛波酯(PMA)：准备巨噬细胞分化刺激物PMA，加入细胞悬液中使其终浓度为100ng/mL。

4、铺板：准备培养板，将上述细胞铺至培养板中。使每孔中细胞数为5×10⁵个，静置培养，使单核细胞分化为巨噬细胞。

5、洗去PMA：培养后，巨噬细胞贴壁生长，弃上清，PBS缓冲液清洗，加不含双抗的完全细胞培养液，于细胞培养箱中继续孵育。

4.2细菌准备

1、将收集到的菌悬液，离心后弃上清。用不含双抗的完全细胞培养液重悬，测OD₆₀₀值，调整细菌OD₆₀₀值为0.6，对应的细菌浓度约为1×10⁸个/mL。

2、按照MOI＝1:1感染细胞，OD₆₀₀＝0.6的菌悬液需要继续加入完全细胞培养液稀释100倍后用于感染细胞。

4.3细菌感染细胞

1、已贴壁生长的巨噬细胞弃上清，PBS溶液清洗后弃上清。

2、加入准备好的菌悬液。

3、细胞培养箱中孵育，弃上清，用PBS清洗，去除细胞外细菌。

4.4目标药物孵育

已洗去细胞外细菌的巨噬细胞24孔板中分别加入含有浓度为2μg/ml的Lefamulin、Bedaquiline、Bedaquiline+Lefamulin和相同体积的DMSO的1640完全培养基，继续孵育。

4.5菌落计数

1、分别在药物孵育0天、1天、3天时使用0.01％的Triton(用PBS稀释)裂解细胞，孵育完成后裂解完全。

2、将裂解液原液转移至96孔板中，每孔原液在96孔板中做2个复孔。

3、使用96孔板对原液进行梯度稀释。

4、每个梯度稀释的菌液吸取分别吸取10μl，滴在7H10(含10％OADC)的固体琼脂平板上。

5、等待平板上液体吸收干燥后关上盖子，封上封口膜，倒置于温箱中培养3-4周。

4.6结果解读

如表4所示，Lefamulin单药3天后，相比DMSO对照组菌载量降低了5×10³CFU。Bedaquiline单药处理3天后，相比DMSO组菌载量降低了9.2×10³CFU；Lefamulin+Bedaquiline双药联合处理3天后，相比DMSO对照组菌载量降低了1.02×10⁴CFU。

如图3所示，Lefamulin处理3天后，相比DMSO对照组菌载量降低了41.67％±12.42％。Bedaquiline处理3天后，相比DMSO对照组菌载量降低了76.67％±6.83％；Lefamulin+Bedaquiline双药联合处理3天后，相比DMSO对照组菌载量降低了83.33％±8.84％，相比于单药治疗，在治疗3天后Lefamulin联合Bedaquiline有效提高了其对胞内结核分枝杆菌的杀菌作用。

表4不同药物处理H37Rv感染THP-1细胞后胞内存活情况

Claims (10)

1.一种药物组合物，所述药物组合物包含Lefamulin和另一种抗结核分枝杆菌感染的药物，所述Lefamulin结构式如下：

2.如权利要求1所述的药物组合物，所述的结核分枝杆菌包括结核分枝杆菌标准株、结核分枝杆菌临床分离株或结核分枝杆菌感染的患者携带的结核分枝杆菌；优选的，所述结核分枝杆菌为泛敏感和耐药的结核分枝杆菌。

3.如权利要求1或2任一项所述的药物组合物，所述另一种抗结核分枝杆菌感染药物包括抗生素和其他能够有利于抑制或杀灭结核分枝杆菌或提供患者抵抗力的药物中的一种或多种。

4.如权利要求1-3任一项所述的药物组合物，利福平、贝达喹啉、利奈唑胺、德拉马尼、左氧氟沙星、莫西沙星、氯法齐明、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、链霉素、异烟肼和/或乙硫异烟胺中的一种或多种；所述其他药物包括维生素、氨基酸、蛋白质和/或矿物质中的一种或多种。

5.如权利要求1-4任一项所述的药物组合物，所述药物组合物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。

6.如权利要求1-5任一项所述的药物组合物，所述药物组合物可以制成多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂和/或冻干粉针剂中的一种或多种。

7.一种Lefamulin在制备抑制结核分枝杆菌产品中的应用。

8.如权利要求7所述的抑制结核分枝杆菌产品，所述产品包括药物和/或抑菌剂中的一种或多种。

9.一种Lefamulin在制备预防和/或治疗结核分枝杆菌感染导致的疾病的药物中的应用，其中Lefamulin通过如下方式发挥作用：

1)Lefamulin抑制结核分枝杆菌活性；

2)Lefamulin杀灭结核分枝杆菌。

10.如权利要求9所述的应用，所述的结核分枝杆菌包括结核分枝杆菌标准株、结核分枝杆菌临床分离株或结核分枝杆菌感染的患者携带的结核分枝杆菌；优选的，所述结核分枝杆菌为泛敏感和耐药的结核分枝杆菌。