CN118792343A - 一种木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因的应用，属于基因工程技术领域。本发明的木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因或其相关生物材料的应用，包括如下任一项所述的应用：A1、提高植物株高和提高植物茎秆粗度；A2、培育大株型植物株系；A3、培育抗倒伏植物株系；所述木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明发现荷花中木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因(Nn2g12674)参与调控植物茎秆发育，在油菜中过表达该基因，能够显著提高油菜的株高和茎秆粗度，为荷花及其他植物株型改良以及功能改进提供了新的技术指导。

Description

一种木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因的应用。

背景技术

荷花(Nelumbo nucifera Gaertn.)为睡莲科(Nelumbonaceae)莲属(Nelumbo)多年水生草本植物，为中国十大传统名花中唯一的水生花卉，其色、香、姿、韵各有不同，具有极高的观赏价值。荷花分为中国莲系、美国莲系、中美杂种莲系三大系。根据荷花品种分类标准，将株型大小(包括与之成正相关的花径大小)列为2级标准，以此具体划分株型和花径，规定立叶高50cm以上，叶径30cm以上，花径18cm以上为大株型或大花型品种，凡低于其中某一项指标者，均列入中、小型品种。大株型品种与中株型品种通常群植于水岸用于园林、庭院造景以及切花观赏，如‘宜良千瓣’(N.nucifera‘Yiliang Qianban’)、‘友谊牡丹莲’(N.nucifera‘Youyi Mudan’)等，而小型品种则于小型容器栽植，用于家庭园艺观赏，如‘星火’(N.nucifera‘Xinghuo’)、烟雨(N.nucifera‘Yanyu’)等。而随着基因工程和分子生物技术的发展，通过特殊株型基因挖掘和功能解析，分子育种成为快速获得理想株型品种的捷径。

植物细胞壁作为地球上最丰富的生物质贮存库，具有支撑和保护的功能，决定细胞的形态和机械特征，同时感受细胞外信号，对植物生长发育至关重要。其主要组成部分包括纤维素、半纤维素和果胶质等结构多糖、木质素及少量蛋白质和矿物质。XTH基因编码的蛋白质催化半纤维成分木葡聚糖分子的水解与合成，参与植物细胞壁的伸长延展，具有两种酶的活性：一种是木葡聚糖内转糖苷酶(XET)，主要作用在木葡聚糖的β-1,4的糖苷键催化使其断裂从而生成的糖基与其他低聚糖分子结合；另一种酶的活性为水酶活性(XEH)，参与催化木葡聚糖分子的水解。有研究表明，XTH参与多种植物的生命活动，与植物的生长发育有密切的关系。例如在模式植物拟南芥中AtXTH9在花芽和花枝的茎尖分生组织中特异表达，推测其与茎和花枝的伸长有关，进一步研究发现该基因缺失突变会造成植株节间变短。豌豆茎段实验证明木葡聚糖内转糖苷酶整合木葡聚糖抑制茎细胞壁的伸长，而添加寡聚糖能够促进茎的伸长。对2个赤豆XTH基因(VaXTH1和VaXTH2)的表达谱进行研究，发现VaXTH1基因在茎节间基部高表达，而VaXTH2在节间顶部高表达，且其均响应于生长素引起的节间伸长过程，推测这两个XTH基因在茎伸长中发挥作用。过表达BcXTH1基因促进转基因拟南芥花枝延长，株高显著增加。综上，XTH在植物的生长发育，尤其是茎伸长和株高增加中发挥着重要作用。

目前株型育种是荷花育种的重要方向之一，传统的荷花株型育种主要手段是通过在杂交技术或者是实生选育育种实现，其存在着周期长、效率低、不确定性大等不足；基因工程技术的出现可以通过特殊株型基因的挖掘和功能解析，快速获得理想的株型品种。目前尚未有荷花XTH家族基因参与荷花株型建成的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因的应用，以解决上述现有技术存在的问题。本发明发现荷花中木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因(Nn2g12674)参与调控植物茎秆发育，在油菜中过表达该基因，能够显著提高油菜的株高和茎秆粗度，为荷花及其他植物株型改良以及功能改进提供了新的技术指导。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供了木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因或其相关生物材料的应用，包括如下任一项所述的应用：

A1、提高植物株高和提高植物茎秆粗度；

A2、培育大株型植物株系；

A3、培育抗倒伏植物株系；

所述木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

优选的，所述相关生物材料为如下B1～B3中的任意一种：

B1、包含所述木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因的表达盒；

B2、包含所述木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因的重组载体；

B3、包含所述木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因的重组微生物。

本发明提供了一种重组载体，包含如SEQ ID NO.3所示序列的木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因。

本发明提供了一种重组微生物，包含如SEQ ID NO.3所示序列的木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因，或包含上述所述的重组载体。

本发明提供了一种提高植物株高和茎秆粗度的方法，将木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因或其相关生物材料转导入植物体内，使木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因稳定过表达，提高植物株高和茎秆粗度；

所述木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述相关生物材料为如下B1～B3中的任意一种：

B1、包含所述木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因的表达盒；

B2、包含所述木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因的重组载体；

B3、包含所述木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因的重组微生物。

本发明提供了一种培育大型植物株系的方法，将木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因或其相关生物材料转导入植物体内，使木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因稳定过表达，培育得到大型植物株系；

所述木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述相关生物材料为如下B1～B3中的任意一种：

B1、包含所述木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因的表达盒；

B2、包含所述木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因的重组载体；

B3、包含所述木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因的重组微生物。

本发明提供了一种培育抗倒伏植物株系的方法，将木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因或其相关生物材料转导入植物体内，使木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因稳定过表达，培育得到抗倒伏植物株系；

所述木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述相关生物材料为如下B1～B3中的任意一种：

B1、包含所述木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因的表达盒；

B2、包含所述木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因的重组载体；

B3、包含所述木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因的重组微生物。

本发明公开了以下技术效果：

本发明从荷花大株型品种中克隆了木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因(Nn2g12674)，通过构建该基因的过表达载体pGWB418(4×Myc)-NnXTH23-NOS并转化油菜，对过表达油菜株系在植物株高、茎粗增加等方面进行一系列研究，充分证明了木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因参与到了植物茎秆发育中，并扮演着重要的角色。通过调控基因的表达，增加植物的株高及茎粗，对阐明基因的生物学功能具有重要意义。

选育调控荷花株高、茎粗的植物材料一直为荷花育种家所重视，本发明克隆得到的基因，将有助于解决荷花株型改良问题。基因的克隆将有助于培育大、中型荷花品种，也为在植物性状改良方面的应用提高了理论与实践依据；在荷花的育种实践、品种改良及品种推广具有重要的实践指导价值，也为其他植物株型育种增加了遗传资源。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因(Nn2g12674)与已知的拟南芥AtXTH23基因的氨基酸序列比对结果；

图2为pGWB418(4×Myc)-NnXTH23-NOS载体的构建过程示意图；其中，LB：T-DNA左边界；35S：花椰菜病毒35S启动子；NOS：终止子；RB：T-DNA右边界；

图3为农杆菌介导的油菜下胚轴遗传转化流程图；

图4为过表达转基因油菜阳性植株的鉴定和表达量分析结果；其中，A为过表达转基因油菜阳性植株的鉴定结果，PCR扩增载体上的Kan基因片段，目标大小为289bp；B为过表达转基因油菜阳性植株中表达水平的检测结果；

图5为野生型油菜(WT)与(OE)过表达植株的株高检测结果图；A为野生型油菜(WT)与(OE)过表达植株的表型图，标尺为20cm；B为野生型油菜(WT)与(OE)过表达植株的株高测量值统计结果；

图6为野生型油菜(WT)与(OE)过表达植株的茎秆粗度检测结果图；A为野生型油菜(WT)与(OE)过表达植株成熟期茎秆的侧视图，标尺为10cm；B为野生型油菜(WT)与(OE)过表达植株成熟期茎秆的横截面图，标尺为2cm；C为野生型油菜(WT)与(OE)过表达植株成熟期茎秆粗度的测量值统计结果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因(Nn2g12674)的提取、克隆和测序

(1)木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因(Nn2g12674)的分离和克隆

选取荷花大株型品种‘歌乐灵音’品种(西南林业大学国家荷花种质资源库提供)作为实验材料，采用Super总RNA提取试剂盒(购自Promega公司，美国)提取荷花茎秆总RNA，RNA提取完成后后用DNaseI(购自Promega公司试剂盒)处理，RNA完整性通过1.2％(w/v)琼脂糖胶(EtBr)电泳检测(5V/cm)。核酸浓度的测定在IMPLEN Nano Photometer-N50系列超微量紫外分光光度计(德国)上进行。RNA260/280比值在1.9到2.1之间，260/230比值大于2.0，浓度大于500ng/μL的RNA可用于下一步的分析。cDNA的合成是利用IIQRT SuperMix for qRNA(+gDNA wiper)试剂盒(购自Vazyme公司，中国)进行的，以1μg总RNA为模板，与4μL 4×gDNAwiper Mix，DEPC-water混匀，总体积16μL，42℃2min，放于冰上骤冷2-3min；再加入5×Hiscript II qRT Super Mix II 4μL混匀，总体积为20μL；然后50℃15min，85℃5sec，每份cDNA稀释到200μL后-20℃保存待用。

使用In-fusion克隆引物Nn2g12674-418F和Nn2g12674-418R来扩增目标条带，利用TransTaq HiFi DNA Polymerase(北京全式金生物公司)扩增，PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1min 30sec，32个循环；72℃延伸5min。胶1％的琼脂糖凝胶电泳后，回收PCR产物，回收方法参照UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)进行操作。

将上述PCR产物克隆进pGWB418载体。首先将pGWB418载体用AfeI和SacI进行双酶切，酶切体系为：pGWB418(1700ng/μL)15μL，rCutsmartt Buffer 5μL，AfeI(10000U/L)1μL，SacI(20000U/L)1μL，无菌水补齐终体积至50μL，37℃酶切过夜。1％的琼脂糖凝胶电泳后，回收单一线性化载体片段。PCR产物与pGWAB418线性化载体的连接体系为：4.5μL目的片段，0.5μLpGWB418载体，5μL SolutionⅠ(宝生物工程(大连)有限公司)在16℃下连接过夜。通过热激发将连接产物转化DH5α感受态，菌液涂于含100mg/L Kan抗生素的LB固体平板上，约生长10-12h后，挑选单菌落做菌落进行PCR，引物为通用引物418F/R。将阳性菌落送到生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

引物信息如下：

Nn2g12674-418F：5’-GACTTGAACGGTAGCGCTCCAGTTCCTCATACTTCGAGAGTC-3’(SEQID NO.1)；

Nn2g12674-418R：5’-TCGGGGAAATTCGAGCTCCTCTAAGATGTGTTGGTGTCGG-3’(SEQ IDNO.2)。

(2)木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因(Nn2g12674)序列分析

经测序，上述引物扩增出的基因核苷酸序列全长为949bp(SEQ ID NO.3)，其上含有一个长为891bp的开放阅读框ORF(SEQ ID NO.4)，使用ClustalX(Thompson JD,GibsonTJ,Plewniak F,et al.The ClustalX windows interface:flexible strategies formultiple sequence alignment aided by quality analysis tools.Nucleic AcidsResearch,1997,25:4876-82)程序进行氨基酸序列的比对发现，这个目标条带与拟南芥的AtXTH23在氨基酸水平上高度同源(相似72.3％)，与在NCBI上比对的结果一致(图1)。该基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

SEQ ID NO.3：

CCAGTTCCTCATACTTCGAGAGTCCTACTATCCAAATCTCCGCTCAACAATTACCTATGGCTTCTTCTCATGGGTTTTTCTTAAAATCTCTGTTTTGTTTTCTGGTTTTGATATCTTTGGCCATTGCTACCGTTTCAGCTAGTAGTTTCAACCAAGACTTCGACATCACATGGGGCGATGGTCGAGCAAAGATACTCAACAATGGGGATCTTCTCACTCTGTCCCTTGACAAAGCCTCTGGCTCTGGCTTCCAATCCAGGCACGAGTACCTCTTTGGTAAGATAGACATGCAGCTCAAGCTCGTCGCCGGCAACTCAGCCGGCACGGTCACGGCCTACTACTTATCATCTCAGGGTCCGACCCATGACGAGATTGACTTCGAATTTCTCGGCAACCTCAGCGGTGATCCCTATATTCTACACACTAATGTCTTCAGCCAGGGGAAGGGAAACAGGGAGCAACAGTTCTATCTCTGGTTCGATCCTACAGCAGACTTCCACACTTATTCCATTCTCTGGAACCCCCAACGCATTATCTTCTCTGTAGATGGAATACCCATAAGAGAATTCAAGAACTCAGAATCCATTGGAGTTCCATTCCCCAAGAATCAGGCCATGAGGATCTACTCCAGCCTATGGAATGCTGATGATTGGGCCACAAGGGGTGGCCTTGTCAAGACCGATTGGACAAAAGCACCATTTACAGCTTCCTATAGAAACTTCAACGCCAACGCCTGCATCATGTCTTCAGGCTCCTCTTCTTGTGACTCCAAATCTCCCACTTCAACAACTGACAATCTCCAATGGCTCTCGCAAGAGCTGGACTCAGCTGGTCAAGAGAGGATGAAATGGGTGCAGAACAATTATATGATCTACAATTACTGCACAGATACAAAGCGTTTTCCTCAGGGCCTCCCTCCTGAGTGCTCCGACACCAACACATCTTAGAG。

SEQ ID NO.4：

ATGGCTTCTTCTCATGGGTTTTTCTTAAAATCTCTGTTTTGTTTTCTGGTTTTGATATCTTTGGCCATTGCTACCGTTTCAGCTAGTAGTTTCAACCAAGACTTCGACATCACATGGGGCGATGGTCGAGCAAAGATACTCAACAATGGGGATCTTCTCACTCTGTCCCTTGACAAAGCCTCTGGCTCTGGCTTCCAATCCAGGCACGAGTACCTCTTTGGTAAGATAGACATGCAGCTCAAGCTCGTCGCCGGCAACTCAGCCGGCACGGTCACGGCCTACTACTTATCATCTCAGGGTCCGACCCATGACGAGATTGACTTCGAATTTCTCGGCAACCTCAGCGGTGATCCCTATATTCTACACACTAATGTCTTCAGCCAGGGGAAGGGAAACAGGGAGCAACAGTTCTATCTCTGGTTCGATCCTACAGCAGACTTCCACACTTATTCCATTCTCTGGAACCCCCAACGCATTATCTTCTCTGTAGATGGAATACCCATAAGAGAATTCAAGAACTCAGAATCCATTGGAGTTCCATTCCCCAAGAATCAGGCCATGAGGATCTACTCCAGCCTATGGAATGCTGATGATTGGGCCACAAGGGGTGGCCTTGTCAAGACCGATTGGACAAAAGCACCATTTACAGCTTCCTATAGAAACTTCAACGCCAACGCCTGCATCATGTCTTCAGGCTCCTCTTCTTGTGACTCCAAATCTCCCACTTCAACAACTGACAATCTCCAATGGCTCTCGCAAGAGCTGGACTCAGCTGGTCAAGAGAGGATGAAATGGGTGCAGAACAATTATATGATCTACAATTACTGCACAGATACAAAGCGTTTTCCTCAGGGCCTCCCTCCTGAGTGCTCCGACACCAACACATCTTAG。

SEQ ID NO.5：

MASSHGFFLKSLFCFLVLISLAIATVSASSFNQDFDITWGDGRAKILNNGDLLTLSLDKASGSGFQSRHEYLFGKIDMQLKLVAGNSAGTVTAYYLSSQGPTHDEIDFEFLGNLSGDPYILHTNVFSQGKGNREQQFYLWFDPTADFHTYSILWNPQRIIFSVDGIPIREFKNSESIGVPFPKNQAMRIYSSLWNADDWATRGGLVKTDWTKAPFTASYRNFNANACIMSSGSSSCDSKSPTSTTDNLQWLSQELDSAGQERMKWVQNNYMIYNYCTDTKRFPQGLPPECSDTNTS。

实施例2木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因(Nn2g12674)过表达转基因油菜植株的获得

(1)植物过表达载体的构建

在克隆扩增引物两端分别加上Afel和Sacl酶切位点，将设计的引物分别命名为Nn2g12674-418F(SEQ ID NO.1)和Nn2g12674-418R(SEQ ID NO.2)，按实施例1的方法扩增得到PCR产物。将pGWB418载体用AfeI和SacI进行双酶切，酶切体系为：pGWB418(1700ng/μL)15μL，rCutsmartt Buffer 5μL，AfeI(10000U/L)1μL，SacI(20000U/L)1μL，无菌水补齐终体积至50μL，37℃酶切过夜。1％的琼脂糖凝胶电泳后，回收单一线性化载体片段，命名为pGWB418(4×Myc)线性化载体。

利用In-fusion酶将上述扩增获得的PCR产物连入pGWB418(4×Myc)线性化载体，筛选阳性克隆并测序鉴定，从而获得荷花转基因过量表达载体，该载体命名为pGWB418(4×Myc)-NnXTH23-NOS。构建过程如图2所示，在该载体T-DNA区内含有抗卡那霉素的基因序列，过量表达的启动子为D35s启动子。

(2)油菜的遗传转化

通过常规的下胚轴侵染法将重组质粒(即过量表达载体)pGWB418(4×Myc)-NnXTH23-NOS转入农杆菌GV3101，筛选并分化成苗，具体步骤如下(转化流程见图3)：

a.播种：用75％的酒精清洗甘蓝型油菜westar种子1min，再用0.1％的升汞溶液清洗种子5min，最后用无菌水清洗种子5次；用灭过菌的镊子把种子放入M0固体培养基(1962年配方的MS无机盐和微量元素4.404g/L，调pH至5.8-5.9，加琼脂7g/L，按照常规高压蒸汽灭菌法进行灭菌)中，将接种的种子在24℃下，暗培养5天。

b.农杆菌的活化：播种3天后，取-80℃保存的农杆菌菌种GV3101在含有利福平(50mg/mL)、庆大霉素(50mg/mL)和卡那霉素(50mg/mL)的LB固体培养基上划线，28℃培养16h。挑单菌落于5mL含有利福平(50mg/mL)、庆大霉素(50mg/mL)和卡那霉素(50mg/mL)的LB液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养20-24h，使农杆菌生长至对数期。取500μL培养好的菌液于50mL的LB液体培养基(含三种抗生素)扩大培养约12h。

c.侵染菌液制备：把活化好的农杆菌液倒入2个50mL无菌离心管中，3500r pm离心15min，去上清，置于冰上，用1mL的DM液体培养基(1962年配方的MS无机盐和微量元素4.404g/L，蔗糖30g/L，调培养基的pH至5.8-5.9，121℃灭菌20min，灭菌完成无菌操作台内加入2,4-D 1mg/L，AS100mmol/L，KT 0.3mg/L)清洗菌液，离心，去上清，加入2-3mL的DM液体培养基重悬菌体，使侵染菌液OD600约为0.6左右。

d.侵染外植体：把步骤c中的侵染菌液置于冰上，同时，用解剖刀切好步骤a中暗培养甘蓝型油菜幼苗的下胚轴(每段下胚轴的长度为0.8-1.0cm为宜)，用无菌镊子把切好的下胚轴转入装有侵染菌液的平皿，视菌液浓度侵染15-30min(每隔3min摇晃一下)。

e.共培养：将侵染完成的外植体转至装有滤纸的平皿(应提前灭菌处理)中，吸干外植体表面可见的侵染液，然后转入M1固体培养基(1962年配方的MS无机盐和微量元素4.404g/L，甘露醇18g/L，蔗糖30g/L，2,4-D 2mg/L，KT 0.3mg/L，调培养基的pH至5.8-5.9，加琼脂7g/L，灭菌后加入100mmol/LAS)中，24℃暗培养40-48h。

f.筛选：将共培养完成的外植体转至M2固体培养基(1962年配方的MS无机盐和微量元素4.404g/L，甘露醇18g/L，蔗糖30g/L，2,4-D 2mg/L，KT 0.3mg/L,调培养基的pH至5.8-5.9，加琼脂7g/L)上，进行20天的筛选培养，条件为：24℃，16h光照/8h暗培养。

g.分化培养：将筛选后的外植体转至M3固体培养基(1962年配方的MS无机盐和微量元素4.404g/L，葡萄糖10g/L，木糖0.25g/L，酵母浸出(液)膏(MES)0.6g/L，调培养基的pH至5.8-5.9，加琼脂7g/L，灭菌后加入玉米素(ZT)2mg/L，IAA 0.1mg/L，TMT250mg/L，Kan25mg/L)上，开始分化培养，每隔15-20天继代一次，直到分化出芽(培养条件与步骤f中筛选条件一致)。

h.生根培养：等到分化出芽的幼苗上能发现明显生长点后，用解剖刀贴着愈伤组织和芽相接的位置，小心翼翼地把幼苗切下(操作过程中一定要小心不能伤害到生长点)，然后把幼苗转移至M4固体培养基(1962年配方的MS无机盐和微量元素2.202g，sucrose10g/L，IBA0.5 mg/L，调培养基的pH至5.8-5.9，加琼脂7g/L，灭菌后加入TMT 250mg/L，Kan25mg/L)中生根。

(3)过表达转基因阳性植株的鉴定

取转化植株幼嫩叶片，采用CTAB法进行DNA的提取，用PCR扩增载体上的Kan基因进行阳性苗鉴定，所用的引物信息如下：

Bn-Kan-F：5’ACTGGGCACAACAGACAATCG3’(SEQ ID NO.6)；

Bn-Kan-R：5’GCATCAGCCATGATGGATACTTT3’(SEQ ID NO.7)。

对照为非转基因的野生型植株(WT)。

CTAB法提取DNA的具体步骤如下：

采用常规CTAB法进行DNA的提取。具体步骤为：取长度为1～2cm的幼嫩甘蓝型油菜叶片，放置于提前预冷的研钵中，途中加2～3次液氮研磨至细微的浆状后，转移到1.5mL离心管中，加入700μL 2×CTAB溶液。70℃温育30min，间隔6min轻柔摇晃一次，70℃温育30min间隔10min轻柔摇晃一次。冷却至室温，再加入700μL体积比为25:24:1的Tris饱和酚：氯仿：异戊醇，反复颠倒混匀后轻轻摇动40次左右。在3100rpm，室温离心15min。吸取上清约500μL，加入等体积的24:1的氯仿：异戊醇。摇匀后在3100rpm，室温离心15min。弃上清加入冰冻的-20℃无水乙醇1mL在-20℃冰浴30min后，12000rpm，室温离心10min。用75％的酒精泡洗并反复吹打沉淀3min去盐。倒掉酒精，风干后每个样品加30-50μL ddH₂O溶解。抽提的甘蓝型油菜基因组DNA，用Nanodrop微量核酸检测仪检测浓度。

检测结果如图4中A所示，2、3、7、8、18、22这6个转化植株均能够扩增出预期大小的电泳条带(289bp)，而野生型与ddH₂O对照则没有电泳条带，表明转基因油菜基因组中已经含有外源基因DNA片段。将鉴定得到的转基因阳性植株编号前面加OE。

(4)过表达转基因油菜的qRT-PCR鉴定

a.甘蓝型油菜叶片基因组RNA的提取

利用Super总RNA提取试剂盒(购自Promega公司，美国)，抽提WT和步骤(3)中鉴定出的过表达阳性株系叶片的总RNA。并利用IIQ RT SuperMix for qRNA(+gDNAwiper)试剂盒(Vazyme公司，中国)将RNA反转录成cDNA。

b.实时荧光定量PCR

为了确定在油菜中是否过量表达，以上述提取到的cDNA为模板，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法对步骤(3)鉴定得到的转基因植株进行分析。qRT-PCR使用Green Realtime PCR Master Mix-Plus-试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)，采用油菜管家基因BnActin7作为内标基因，其引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。BnActin7(GeneID:LOC106418315)的qRT-PCR引物信息如下：

BnActin7-F1：5’-TCTTCCTCACGCTATCCTCCG-3’(SEQ ID NO.8)；

BnActin7-R1：5’-AGCCGTCTCCAGCTCTTGC-3’(SEQ ID NO.9)。

基因的qRT-PCR引物信息如下为：

Q-Nn2g12674-F：5’-ACAACCAGTTCCTCATACTTCG-3’(SEQ ID NO.10)；

Q-Nn2g12674-R：5’-ATCTTTGCTCGACCATCGCC-3’(SEQ ID NO.11)。

(该对引物是以实施例1中测序得到的核苷酸序列设计的qRT-PCR特异性引物)

PCR程序：95℃预变性30sec，然后经40个循环(95℃10sec、60℃10sec、72℃26sec)。

检测结果如图4中的B所示(柱为平均值±SD，n>3个生物独立样本，显示单个数据点；采用双尾t检验确定各组的显著性差异：****P<0.0001，*P<0.05，ns无显著性差异)，OE-2、OE-3、OE-7、OE-8、OE-18、OE-22株系的表达水平均显著高于非转基因的野生型对照，其中最显著的为OE-22和OE-8株系，二者的表达量与野生型相比分别增加了5244.81％和6509.38％，表明这几个株系为独立的过表达转基因株系。

实施例3木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因(Nn2g12674)过表达转基因油菜T2代株高增加及茎秆增粗的评价

(1)过表达株系T2代油菜株高的测定

对角果发育成熟期的野生型油菜(WT)与转基因株系OE-3、OE-8、OE-22的株高进行测定，每个株系至少测量3株，测量高度为育苗盆至最高处花序顶端；结果如图5所示，OE-3株系的株高与WT相比增加了37.89％，OE-8株系的株高与WT相比增加了29.82％，而OE-22株系的株高与WT相比增加了36.90％，表明木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因在增强植株株高上应用效果良好。

(2)过表达株系T2代油菜茎粗的测定

收取角果发育成熟的转基因油菜茎秆，测量方法为，每个株系随机选至少3株植株，用数字游标卡尺测量植株的倒数一节间中部直径，且尽可能保证测量部位一致，结果如图6所示，OE-3、OE-8、OE-22株系与野生型相比均增加了20％以上，其中OE-22茎粗增加最为显著，增加了35.08％，表明木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因在茎秆增粗方面起着重要作用。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因或其相关生物材料的应用，其特征在于，包括如下任一项所述的应用：

A1、提高植物株高和提高植物茎秆粗度；

A2、培育大株型植物株系；

A3、培育抗倒伏植物株系；

所述木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述相关生物材料为如下B1～B3中的任意一种：

B1、包含所述木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因的表达盒；

B2、包含所述木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因的重组载体；

B3、包含所述木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因的重组微生物。

3.一种重组载体，其特征在于，包含如SEQ ID NO.3所示序列的木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因。

4.一种重组微生物，其特征在于，包含如SEQ ID NO.3所示序列的木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因，或包含如权利要求3所述的重组载体。

5.一种提高植物株高和茎秆粗度的方法，其特征在于，将木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因或其相关生物材料转导入植物体内，使木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因稳定过表达，提高植物株高和茎秆粗度；

所述木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述相关生物材料为如下B1～B3中的任意一种：

B1、包含所述木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因的表达盒；

B2、包含所述木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因的重组载体；

B3、包含所述木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因的重组微生物。

6.一种培育大型植物株系的方法，其特征在于，将木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因或其相关生物材料转导入植物体内，使木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因稳定过表达，培育得到大型植物株系；

所述木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述相关生物材料为如下B1～B3中的任意一种：

B1、包含所述木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因的表达盒；

B2、包含所述木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因的重组载体；

B3、包含所述木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因的重组微生物。

7.一种培育抗倒伏植物株系的方法，其特征在于，将木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因或其相关生物材料转导入植物体内，使木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因稳定过表达，培育得到抗倒伏植物株系；

所述木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述相关生物材料为如下B1～B3中的任意一种：

B1、包含所述木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因的表达盒；

B2、包含所述木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因的重组载体；

B3、包含所述木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因的重组微生物。