CN118787658B - 一种胰高血糖素样肽-1受体特异性核酸适配体在代谢疾病干预中的应用 - Google Patents
一种胰高血糖素样肽-1受体特异性核酸适配体在代谢疾病干预中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种胰高血糖素样肽‑1受体特异性核酸适配体在代谢疾病干预中的应用。本发明利用胰高血糖素样肽‑1受体特异性适配体成功使得细胞增殖能力提高，细胞内钙离子浓度和胰岛素分泌水平升高，胰高血糖素样肽‑1(GLP‑1)通路受到激活，相关基因的mRNA表达水平提高，为如糖尿病、肥胖症等代谢类疾病的干预提供了一种稳定、低成本的分子工具。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种胰高血糖素样肽-1受体特异性核酸适配体在代谢疾病干预中的应用。
背景技术
胰高血糖素样肽-1 (glucagon-like peptide 1，GLP-1)能够通过与GLP-1受体(glucagon-like peptide 1 receptor，GLP-1R)相互作用，从而干预肥胖症等疾病的发生发展。由于GLP-1半衰期短，在体内易被降解失活，GLP-1受体激动剂(glucagon-likepeptide 1 receptor agonist, GLP-1RA)成为了新型药物，其能够在维持GLP-1药理作用的同时具有更长的半衰期。《科学》杂志将GLP-1RA的开发以及发现的可缓解肥胖相关健康问题的药物列为2023年度十大科学突破之首，可见GLP-1/GLP-1R疾病干预通路以及GLP-1RA药物在临床治疗领域的重要性。
目前，已有多种GLP-1RA获得FDA批准上市，并且其中一些也已经获批进入我国医保药品名单。GLP-1RA根据其药代动力学特征可分为短效制剂、长效制剂以及周制剂。短效GLP-1RA在体内的半衰期通常为2~5 h，而长效GLP-1RA的半衰期可达12~24 h，二者对于体重降低、胃排空率、血糖水平、胰岛素分泌的生理调控作用也存在差异。除了司美格鲁肽已有口服制剂，其他药物的给药方式均为皮下注射。已获得批准的GLP-1RA基本都是肽类化合物，其在体内的稳定性相较于GLP-1有所提高。然而，目前常见的GLP-1RA药物多为蛋白类药物，其药物成本高、批次稳定性差，在运输方面也需要严格的条件控制。因此，性质稳定、成本较低的GLP-1RA有待研发。
基于此，本发明提供了一种DNA核酸适配体类的GLP-1RA，能够有效克服目前的领域壁垒，为如糖尿病、肥胖症等代谢类疾病的干预提供了一种稳定、低成本的分子工具。
发明内容
针对现有技术的不足之处，本发明旨在提出一种胰高血糖素样肽-1受体特异性核酸适配体在代谢疾病干预中的应用，通过特异性核酸适配体的加入，解决了代谢类疾病分子干预的问题。
为达到上述目的，一方面，本发明提供一种胰高血糖素样肽-1受体特异性核酸适配体在代谢疾病干预中的应用，其特征在于，所述胰高血糖素样肽-1受体特异性核酸适配体的核苷酸序列为：5’-AAGCAGGAAATTCTAGAAGACACGTTACAAATCAATCAGAAGAACGAG-3’，如SEQID NO:1所示。
所述核酸适配体能够提升胰岛细胞增殖能力，升高细胞内钙离子浓度和胰岛素分泌水平，调控胰高血糖素样肽-1代谢通路。
进一步地，本发明提供一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含上述核酸适配体。
进一步地，本发明提供一种上述核酸适配体，或上述药物组合物在制备胰高血糖素样肽-1受体激动剂药物中的用途。
进一步地，本发明提供一种上述核酸适配体，或上述药物组合物在制备预防和/或治疗糖尿病药物中的用途。
进一步地，本发明提供一种上述核酸适配体，或上述药物组合物在制备预防和/或治疗肥胖症药物中的用途。
进一步地，本发明提供一种上述核酸适配体，或上述药物组合物在制备预防和/或治疗高血脂症药物中的用途。
附图说明
图1 不同浓度R2适配体作用于MIN6细胞后细胞的增殖率。
图2 荧光显微镜下MIN6细胞钙离子浓度信号。
图3 小鼠胰岛素ELISA Kit标准曲线。
图4 不同处理组的MIN6细胞培养基胰岛素浓度。
图5 不同处理组的MIN6细胞基因表达水平相对定量。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的构思及产生的技术效果作进一步阐述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1：核酸适配体R2对细胞增殖能力的影响
（1）将MIN6细胞接种于96孔板中，在条件为37℃，5% CO2细胞培养箱中培养24 h，至细胞贴壁，密度约为60-70%；
（2）随后吸走培养基并加入100 μL用完全培养基稀释到的不同浓度（0.5、1、2、5、10、15、20 nmol/L）的核酸适配体R2溶液并设置CK组（前期进行浓度初探），在细胞培养箱中37℃，5% CO2培养24 h；
其中，核酸适配体R2的核苷酸序列为：5’-AAGCAGGAAATTCTAGAAGACACGTTACAAATCAATCAGAAGAACGAG-3’，如SEQ ID NO:1所示；
CK序列的核苷酸序列为：5’-CCATCCCGGTCCCCCATCCCGAATTCCCATGCGCCTTACCCTACCTCC-3’，如SEQ ID NO:2所示；
（3）分别加入10 μL的CCK-8溶液到每个孔中并轻轻吸打混匀孔中溶液，放置在37℃，5% CO2细胞培养箱中孵育反应2 h，最后利用酶标仪测定各个孔中的液体在450 nm波长处的吸光度值，每组设置5个平行取平均值，实验重复三次。
经过浓度梯度的初筛，选定了浓度为0-20 nM的区间测定适配体R2对MIN6细胞的增殖活力影响，结果表明经过低浓度的适配体R2处理后，MIN6细胞的增殖能力就可以得到显著提高，当MIN6细胞受到15 nM R2适配体处理24 h后，增殖率相较于未经处理组提升了约19%（如图1所示），证明适配体R2在抑制胰岛β细胞凋亡、促进胰岛β细胞增殖方面具有显著效果。
实施例2：核酸适配体R2对细胞内钙离子浓度的影响
随后，利用荧光探针检测细胞内钙离子浓度。
（1）用PBS缓冲液将Fluo-3 AM溶液按所需剂量稀释至1 µM；
（2）待六孔板中的MIN6细胞密度在70%左右时，弃去每个孔中的培养基，再用PBS缓冲液漂洗3次；
（3）加入1 mL稀释后的Fluo-3 AM溶液到每个孔中，完成荧光探针装载需要在37ºC下孵育30分钟；
（4）探针装载完毕后，吸走孔中液体，用PBS缓冲液漂洗两遍；
（5）细胞在PBS缓冲液中再孵育20分钟，温度维持37ºC，保证MIN6细胞能够将Fluo-3 AM完全转变为Fluo-3；
（6）将六孔板放置在荧光显微镜下观察并拍照记录，可以对不同组的荧光强度进行比较。
利用Fluo-3 AM对经过适配体R2处理和未经处理的MIN6细胞胞内钙离子浓度进行表征，Fluo-3 AM在细胞内被转化为Fluo-3，在488 nm的激发波长下会呈现绿色荧光，结果如图2所示，在荧光显微镜下可以观察到经过适配体R2处理的MIN6细胞内绿色荧光十分明显，而同时只经过PBS缓冲液处理的MIN6细胞内绿色荧光很微弱，说明适配体R2能够增强MIN6细胞对钙离子的吸收，这有助于MIN6细胞分泌胰岛素。
实施例3：核酸适配体R2对细胞胰岛素分泌能力的影响
进一步地，利用双抗体夹心ELISA法测定细胞胰岛素分泌能力。
1.准备工作
（1）将冷藏的试剂盒拿到室温中放置20 min左右，平衡试剂盒中的液体；
（2）用去离子水将试剂盒中的洗涤液稀释至工作浓度；
（3）向标准品瓶子中加入标准品瓶身上的标签规定的体积的标准品稀释液，在室温中放置15 min。轻微地摇晃并用移液枪吹打混合液使标准品完全溶解，每瓶的标准品的浓度为5.5 ng/mL；
（4）取5个干净的1.5 mL离心管，然后分别加入250 μL的标准品稀释液到每个离心管中，接着按照倍数对标准品进行稀释，可以得到0、5.5、2.75、1.375、0.687、0.344、0.172ng/mL 7个浓度（标准品稀释液则为0 ng/mL）。
2.样品处理与检测
（1）接种于六孔板中的MIN6细胞分为三组，一组为正常DMEM完全培养基，一组经过5 nM随机文库处理，一组经过浓度5 nM适配体R2处理，均处理24 h；
其中，随机文库的核苷酸序列为：5’-GGAATCGAGGATTCGTTANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGACCTCTAACTCTGACAT-3’，如SEQ ID NO:3所示，其中N为随机核苷酸；
（2）处理24 h后，按组别分别吸取细胞培养基样品，500×g离心5分钟，取上清备用；
（3）取出四条预包被板条放置在96孔框架内；
（4）分别在相应孔中加入10 μL的样品和不同浓度标准品；
（5）然后在每个孔中加入100 μL辣根过氧化物酶标记小鼠胰岛素抗体，并使用试剂盒中的提供的透明封板膜覆盖封闭反应孔，室温反应2 h；
（6）孵育结束后，加入300 μL的洗涤液到每个孔中，每个孔洗涤时间为15~30秒，共洗涤五次，最后将板倒扣在吸水纸上适当用力拍干水分；
（7）加入100 μL显色剂TMB溶液到每个孔中，用试剂盒中提供的白色封板膜覆盖封闭反应孔，室温避光反应10分钟；
（8）加入50 μL的终止液到每个孔中并轻轻混匀，然后直接去使用酶标仪测量每个孔中的液体在450 nm波长处的吸光度值。
使用酶标仪测定在450 nm波长处不同浓度胰岛素标准品的吸光度值，然后输入GraphPad Prism软件绘制出小鼠胰岛素ELISA Kit标准曲线，并得到了标准曲线方程y=0.1970 x+0.02797，R2=0.993（如图3所示），根据酶标仪测得的在450 nm波长处培养基样品的吸光度值和标准曲线方程计算出不同样品的相应胰岛素浓度（如图4所示）。未经处理的细胞培养基中的胰岛素浓度为7.533 ng/mL，经过随机文库组处理的细胞培养基中的胰岛素浓度为7.630 ng/mL，经过适配体R2处理的细胞培养基中的胰岛素浓度为9.366 ng/mL。通过比较可知经过适配体R2处理的MIN6细胞培养基中的胰岛素含量明显高于另外两组，说明MIN6细胞经过适配体R2处理后分泌胰岛素的能力明显提高，培养基中胰岛素浓度提升水平大于24%，高于CCK-8实验结果中MIN6细胞的增殖率提升水平，说明实验筛选得到的适配体R2在促进MIN6细胞分泌胰岛素方面具有明显效果，进而可能在糖尿病、肥胖症或高血脂症的预防/治疗方面存在一定应用潜力。
实施例4：核酸适配体R2对细胞通路的调控
随后，通过RT-PCR方法测定GLP-1通路相关基因的表达水平。
1.各组细胞的总RNA提取
（1）将六孔板中的培养基吸净后每个孔加入600 μL的裂解液BB4，轻轻吹打5-10次至细胞裂解后的悬浊液混匀，按组转移至无RNA酶的离心管中；
（2）高速离心机室温12000×g离心5 min，吸取500 μL离心管中的上清液然后转移至新的离心管中；
（3）向每个离心管中加入500 μL的70%乙醇，轻微摇晃均匀。在离心管中有时会出现沉淀；
（4）涡旋混匀离心管中的液体和沉淀，然后将混合物全部转移到试剂盒提供的离心柱中，12000×g离心30 s，弃掉收集管内的离出液；
（5）加入500 μL的CB4溶液到离心柱中，室温12000×g离心30 s，弃掉收集管内的离出液；
（6）加入500 μL的WB4溶液到离心柱中，室温12000×g离心30 s，弃掉收集管内的离出液；
（7）重复一遍步骤（6）；
（8）高速离心机12000×g离心室温2分钟，完全离去残留在离心柱中的液体；
（9）将离心柱装进新的离心管中，向离心柱底部的膜上滴加入50 μL RNase-freeWater，在室温中静置1-2 min，在高速离心机中12000×g高速离心2 分钟，离心管中的溶液即是从MIN6细胞中提取的总RNA，可以置于-80℃冰箱保存。
2. qRT-PCR
（1）将提取的总RNA中的mRNA反转录为cDNA取出冷冻保存的提取得到的总RNA、5×FastKing-RT SuperMix和RNase-Free ddH2O，将总RNA样品放置在冰上缓慢解冻，将两种试剂放置在室温中解冻后置于冰上。使用前要将这三种溶液都震荡混匀，并快速离心使管壁上的液体聚集到管底。按照表1所示配制实验所需的反转录反应体系。
表1 反转录反应体系
按照表2所示进行反转录反应。
表2 反转录反应程序
（2）qPCR测定目的基因mRNA表达水平
根据GLP-1R信号通路，验证胰岛细胞GLP-1R信号通路中与促进胰岛素分泌、抑制细胞凋亡、诱导细胞增殖相关基因表达水平，引物序列设计如表3所示。
表3 目的基因qPCR引物序列
利用试剂盒提取不同处理组细胞的总RNA，随后对提取得到各组细胞的总RNA进行反转录，最后进行qPCR得到各处理组提取得到的基因扩增结果，运用2-△△Ct方法对各处理组的几种基因表达水平进行归一化相对定量。结果如图5所示，适配体R2可以提高MIN6细胞中的Akt1、Bcl2、NFκb1、PDX1基因的表达水平。Akt1主要调控胰岛细胞的体积和胰岛素分泌能力，当Akt1表达上调时，胰岛细胞的体积增大、胰岛素分泌能力提高；Bcl2主要调控细胞凋亡，当Bcl2表达上调时将会抑制细胞凋亡；NFκb1可以维持细胞正常生长，抑制细胞凋亡；PDX1调控胰腺发育及胰岛细胞的分化和增殖，上述几种基因对于胰岛β细胞数量与质量、胰岛素的分泌能力均有调控作用。综上可知，经过适配体R2处理后，MIN6细胞中这几种基因均有一定程度的升高，说明适配体R2对于胰岛β细胞数量与质量增加、胰岛素分泌能力提高具有一定的促进作用。
综上，本发明利用胰高血糖素样肽-1受体特异性适配体R2成功使得细胞增殖能力提高，细胞内钙离子浓度和胰岛素分泌水平升高，GLP-1通路受到激活，相关基因的mRNA表达水平提高，为如糖尿病、肥胖症、高血脂症等代谢类疾病的干预提供了一种稳定、低成本的分子工具。
上文所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
Claims (4)
1.一种胰高血糖素样肽-1受体特异性核酸适配体在制备预防和/或治疗糖尿病药物中的应用，其特征在于，所述胰高血糖素样肽-1受体特异性核酸适配体的核苷酸序列为：5’-AAGCAGGAAATTCTAGAAGACACGTTACAAATCAATCAGAAGAACGAG-3’。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述核酸适配体能够提升胰岛细胞增殖能力，升高细胞内钙离子浓度和胰岛素分泌水平，调控胰高血糖素样肽-1代谢通路。
3.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1所述的核酸适配体。
4.权利要求1所述的核酸适配体，或权利要求3所述的药物组合物在制备预防和/或治疗糖尿病药物中的用途。
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