CN118785916A - 以普通拟杆菌治疗大肠癌和/或发炎疾病之方法 - Google Patents

Abstract

本揭示提供一种用于预防、改善及/或治疗需要此类预防、改善及/或治疗之个体中之大肠癌之方法，其包含向该个体投与包含有效量之普通拟杆菌(Bacteroides plebeius)或其代谢物之组合物。

Description

以普通拟杆菌治疗大肠癌和/或发炎疾病之方法

技术领域

本揭示关于微生物之应用。特定言之，本揭示关于使用细菌治疗大肠病症之方法。

背景技术

大肠直肠癌(CRC)为全球第三流行之人类癌症且为最致命之癌症(Siegel等人,CACancer J Clin.2014；64(2):104-17)。已报导大肠癌之发展与肠道慢性炎症相关，且若干肠道微生物有助于促进或抑制肿瘤细胞增殖以及发挥免疫调节功能(Garrett等人,Science.2019；364(6446):1133-5)。在机制上，CRC为多因子及多步骤调节过程。其中，活性含氧物(ROS)之产生及肠上皮细胞中之藉由表观遗传及/或遗传变化进行之受体介导之传讯之活化引发该过程。随后，不健康的膳食及微生物菌群失调藉由抗肿瘤发炎细胞之损失及微环境中之促肿瘤细菌之富集来持续促进肿瘤发展(Garrett等人,Science.2019；364(6446):1133-5；Gagnière等人,World J Gastroenterol.2016；22(2):501-18；Genua等人,Front Oncol.2021；11:626349)。

由于次世代及第三代定序技术之出现，肠道微生物相之菌种或是菌株组成得以鉴别，且此技术之出现极大的促进自CRC临床数据中搜寻新的有害及有益细菌，该等细菌可使用动物模型进一步验证。目前，已鉴别出一些致癌细菌，包括具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)(Rubinstein等人,EMBO Rep.2019；20(4)；Brennan等人,Nat RevMicrobiol.2019；17(3):156-66)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)(Koliarakis等人,Int J Mol Sci.2019；20(17))、肠毒性脆弱类杆菌(Bacteroridesfragilis)(Dejea等人,Science.2018；359(6375):592-7)以及聚酮合成酶阳性(pks+)大肠杆菌(Escherichia coli)(Arthur等人,Science.2012；338(6103):120-3)。一般而言，此等病原菌配备有可与上皮细胞受体相互作用之毒性因子，诸如病原菌细胞表面配位体或毒素。该相互作用干扰细胞传讯之稳态，且引起不受控之细胞增殖，破坏大肠上皮障壁功能且经由产生趋化介素来引发组织炎症。随后，此引起细菌易位及严重的免疫细胞浸润(Kostic等人,Cell Host Microbe.2013；14(2):207-15；Wu等人,Nat Med.2009；15(9):1016-22)。另外，一些细菌可直接与肿瘤细胞表面结合且产生代谢物以抑制肿瘤抑制性免疫细胞之活化(Brennan等人,Nat Rev Microbiol.2019；17(3):156-66)。总而言之，肠道微生物为大肠癌发展进程之重要组成部分。

因此，需要开发用于治疗大肠癌之新策略。

发明内容

本揭示提供一种用于预防、改善及/或治疗需要此类预防、改善及/或治疗之个体中之大肠癌之方法，其包含向个体投与包含有效量之普通拟杆菌或其代谢物之组合物。

本揭示之普通拟杆菌之有效量之某些实施例的范围为约10⁵CFU至约10⁹CFU、约10⁵CFU至约10⁸CFU、约10⁵CFU至约10⁷CFU、约10⁵CFU至约10⁶CFU、约10⁶CFU至约10⁹CFU、约10⁷CFU至约10⁹CFU、约10⁸CFU至约10⁹CFU、约10⁶CFU至约10⁸CFU，或约10⁷CFU。

在本揭示之一些实施例中，大肠癌由大肠炎症诱导。

在本揭示之一些实施例中，方法用于减少肿瘤数目及/或肿瘤大小。

在本揭示之一些实施例中，方法用于降解岩藻醣以抑制肿瘤形成。

本揭示提供一种用于预防、改善及/或治疗需要此类预防、改善及/或治疗之个体中的大肠之发炎疾病之方法，其包含向个体投与包含有效量之普通拟杆菌或其代谢物之组合物。

在本揭示之一些实施例中，发炎疾病为大肠炎诱导之炎症。

本揭示提供一种用于调节需要此类调节之个体之肠道中的细菌丰富度之方法，其包含向个体投与包含有效量之普通拟杆菌或其代谢物之组合物。

在本揭示之一些实施例中，方法用于增加细菌丰富度。丰富度增加之细菌之实例包括(但不限于)类球布劳特氏菌(Blautia coccoides)。

在本揭示之一些实施例中，方法用于降低细菌丰富度。丰富度降低之细菌之实例包括(但不限于)阿克曼氏菌属(Akkermansia sp.)、杜氏杆菌属(Dubosiella sp.)、穆瑞氏菌属(Muribaculaceae sp.)、梭菌属(Closteridale sp.)、嗜胆菌属(Bilophila sp.)或厚壁菌门(Firmicutes)。

本揭示亦提供一种用于调节需要此类调节之个体中之细胞激素效应之方法，其包含向个体投与包含有效量之普通拟杆菌或其代谢物之组合物。

在本揭示之一些实施例中，方法用于调节细胞激素表现或细胞激素受体基因表现。在一个态样中，在本揭示之一些实施例中，方法用于上调与神经活性配位体-受体相互作用、钙传讯路径、cGMP-PKG传讯路径、胆汁分泌、胆碱激导性突触、闸控性信道活性、信道活性、被动跨膜转运子活性、离子通道活性及/或UDP-醣苷基转移酶活性有关之细胞激素。在另一态样中，方法系用于下调与金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)感染、肺结核、吞噬体、NOD样受体传讯路径、免疫受体活性、肽酶抑制剂活性及/或内肽酶抑制剂活性有关之细胞激素。

本揭示提供一种用于增加需要此类增加之个体中之CCAAT强化子结合蛋白δ(Cebpd)、2型含有锚蛋白重复及BTB域之基因(Abtb2)、DNA接合酶1(Lig1)、Spda、Mard1、Six2及/或Ugy2b5之表现之方法，其包含向个体投与包含有效量之普通拟杆菌或其代谢物之组合物。

本揭示提供一种用于减少需要此类减少之个体中之Cxcr2、Clec4e、Cxcl3、Lgals7及/或Mmp8之表现之方法，其包含向个体投与包含有效量之普通拟杆菌或其代谢物之组合物。

本揭示提供一种用于刺激需要此类刺激之个体中的初级胆汁酸之产生之方法，其包含向个体投与包含有效量之普通拟杆菌或其代谢物之组合物。

在本揭示之一些实施例中，初级胆汁酸为胆酸(CA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)、α-鼠胆酸(α-MCA)或β-鼠胆酸(β-MCA)。

本揭示提供一种用于活化需要此类活化之个体中之G蛋白偶联受体(GPCR)之方法，其包含向个体投与包含有效量之普通拟杆菌或其代谢物之组合物。

在本揭示之一些实施例中，普通拟杆菌为来自日本微生物保藏中心(JapanCollection of Microorganisms；JCM)之JCM 12973。

在本揭示之一些实施例中，普通拟杆菌包含于培养物、溶胞产物或生物样品中。生物样品之实例包括(但不限于)大便样品。

在本揭示之一些实施例中，本文所描述之方法进一步包含向个体投与有效量之益生元。在本揭示之一些实施例中，益生元包含膳食纤维。特定言之，益生元包含海藻。在本揭示之一些实施例中，海藻为紫菜。在本揭示之一个实施例中，海藻为条斑紫菜(Porphyrayezoensis)。在另一态样中，海藻呈粉末形式。

在本揭示之一些实施例中，如本文所描述之组合物及益生元为同时、单独或依序共同投与，或以共调配物形式组合共同投与。

在本揭示之一些实施例中，组合物呈适合于经口服之形式。

图式简单说明

图1显示在无菌小鼠中之海藻膳食+普通拟杆菌(B.plebeius)定殖之大肠组织RNA-Seq分析。其显示使用无菌小鼠之普通拟杆菌经管喂给予及海藻膳食干预之示意图。在第1天进行一次普通拟杆菌经管喂给予且以4天为间隔提供海藻膳食，其间穿插有其对照膳食。进行粪便DNA之普通拟杆菌特异性PCR以验证普通拟杆菌之定殖。

图2A至图2C显示使用海藻膳食及普通拟杆菌定殖之SPF小鼠之微生物相相对丰富度及群落分析。图2A显示使用SFP小鼠之普通拟杆菌经管喂给予及海藻膳食干预之示意图。进行粪便DNA之普通拟杆菌特异性PCR以验证普通拟杆菌之定殖。包括粪便DNA样品之16S全长PCR(V1-V9)作为对照。图2B及图2C显示在比较海藻膳食与海藻膳食+普通拟杆菌微生物群落时，吾人使用LEfSe(线性判别分析效应大小(Linear discriminant analysis(LDA)Effect Size))分析，在门层面，显示所有门。在属层面，仅显示p值小于0.05之属。

图3A至图3D显示海藻膳食及普通拟杆菌抑制AOM/DSS诱导之大肠癌发生。图3A显示在SPF小鼠中，使用海藻膳食促使普通拟杆菌定殖，随后进行AOM/DSS诱导之发炎性癌，AOM经腹腔注射后，进行三轮SDD，之示意时间轴。图3B显示来自经AOM/DSS处理之使用海藻膳食(n＝9)及海藻膳食+普通拟杆菌(n＝10)之SPF小鼠之大肠。呈现两个组中之各组之代表性大肠组织。如图所示，远程大肠朝向左侧定向。图3C显示藉由大肠组织肿瘤之定量来计算经AOM/DSS处理之使用海藻膳食(n＝9)及海藻膳食+普通拟杆菌(n＝10)之SPF小鼠之肿瘤数目及负荷值。图3D显示四组小鼠(亦即，使用海藻之对照组(n＝4)、使用海藻膳食+普通拟杆菌之对照组(n＝4)、使用海藻膳食之AOM/DSS组(n＝4)及使用海藻膳食+普通拟杆菌之AOM/DSS组(n＝4))之大肠瑞士卷(Swiss-rolled)组织苏木素-伊红染色。比例尺：200μm。

图4A至图4B显示在使用海藻膳食及普通拟杆菌定殖之SPF小鼠中，AOM/DSS诱导之发炎性癌发生之菌相丰富度与群落分析。图4A显示以香农多样性(Shannon diversity)分析以评估经AOM/DSS处理之使用海藻膳食或海藻膳食+普通类杆菌拓殖之小鼠之微生物群落之丰富度及均匀度。图4B显示在比较海藻膳食与海藻膳食+普通拟杆菌微生物群落时，吾人使用LEfSe(线性判别分析(LDA)效应大小分析)，在门层面，显示所有门。在属层面，仅显示p值小于0.05之属。

图5显示无菌小鼠中之海藻膳食+普通拟杆菌定殖之粪便代谢物分析。其显示藉由GC-MS来对粪便短链脂肪酸含量进行定量，其中，乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸及癸酸之含量计算为粪便样品之mg/Kg。**P<0.01且***P<0.001。ns：不显著。

实施方式

除非另外定义，否则本文所使用之所有科学或技术术语具有与一般熟习本揭示所属技术者所理解相同之含义。与本文所描述之方法及物质类似或等效之任何方法及物质可由一般熟习此项技术者理解及使用以实践本揭示。

必须注意，除非上下文另外清楚指示，否则如本说明书及随附权利要求中所使用，单数形式“一(a/an)”及“该”包括多数个指示物。因此，除非上下文另外需要，否则单数术语应包括多数且多数术语应包括单数。

如本文所使用，术语“视情况”或“视情况地”意谓随后描述之事件或状况可能发生或可能不发生，且该描述包括该事件或状况发生之情况及不发生之情况。举例而言，词组“视情况包含药剂”意谓该药剂可能存在或可能不存在。

通常，范围在本文中由“约”一个特定值及/或至“约”另一个特定值表示。当表示此类范围时，一个实施例包括自一个特定值及/或至另一特定值之范围。类似地，当值藉由使用词语“约”表示为近似值时，应理解，特定值形成另一实施例。亦将理解，范围中之各者之端点相对于及独立于另一端点均为有意义的。如本文中所使用，术语“约”系指±20％、优选±10％且甚至更佳±5％。

术语“及/或”用于指两种事物或所提及之两种事物中之任一者。

术语“预防(preventing/prevention)”在此项技术中为公认的，且当与病状结合使用时，其包括相对于未接受药剂之个体，在病状发作之前投与药剂以降低个体中之医学病状的发生率或严重程度或延迟其症状之发作。

术语“治疗(treatment/treating/treat)”通常指获得所需药理学及/或生理学效应。该效应就完全或部分预防病症、疾病或其症状而言可为预防性的，且就部分或完全治愈病症、疾病及/或归因于其之症状而言可为治疗性的。本文所使用之“治疗＝”涵盖对哺乳动物(优选人类)中之病症之任何治疗，且包括(1)抑制个体中之病症、疾病或其症状之发展，或(2)缓解或改善个体中之病症、疾病或其症状。

如本文所使用，术语“大肠癌”亦指大肠直肠癌或肠癌。大肠癌指大肠(结肠)或直肠(大肠末端)中发生之恶性疾病，且包括在大肠、直肠及阑尾中之癌生长，包括腺癌。大肠直肠癌之前为腺瘤(起源于上皮之赘瘤)，其来源于腺组织或展现结构清楚的腺瘤。

如本文所使用，术语“疾病”可与“病症”或“病状”互换使用。

如本文所使用，术语“个体”为可受益于投与如本文所揭示之化合物或组合物之任何动物。在一些实施例中，个体为哺乳动物，例如人类、灵长类动物、犬、猫、马、牛、猪、啮齿动物，诸如大鼠或小鼠。通常，哺乳动物为人类。

如本文所使用，术语“需要治疗”指由照护者(例如医师、护理师、护理从业者或在人类情况下，个人；在动物(包括非人类哺乳动物)情况下，兽医)作出之判断，且此类判断为个体需要治疗或将受益于治疗。此判断基于属于照护者之专业知识领域内且包括以下知识之多种因素作出：个体罹患或将罹患由可藉由本揭示之化合物治疗之病状引起之疾病。

术语“投与”包括允许本揭示之药剂发挥其预期功能之投与途径。

术语如本文所提供之活性成分之“有效量”意谓足以提供所需功能之所需调节之成分之量。如下文将指出，视个体之病况、身体状况、年龄、性别、物种及体重、组合物之特定特性及调配物等而定，所需精确量将随各个体而变化。可调节给药方案以诱导最佳治疗反应。举例而言，可每天投与若干个分次剂量，或可如治疗情形之紧急状态所指示按比例减少剂量。因此，无法指定精确“有效量”。然而，一般熟习此项技术者仅利用常规实验便可确定适当有效量。

术语“代谢物”指由微生物(诸如普通拟杆菌)产生之任何化合物、物质或副产物。特定言之，代谢物具有如本文所描述之特定效应，诸如预防、改善及/或治疗大肠癌；预防、改善及/或治疗大肠之发炎疾病；调节肠道中之细菌丰富度；调节细胞激素效应；增加CCAAT强化子结合蛋白δ(Cebpd)、2型含有锚蛋白重复及BTB域之基因(Abtb2)、DNA接合酶1(Lig1)、Spda、Mard1、Six2及/或Ugy2b5之表现；减少Cxcr2、Clec4e、Cxcl3、Lgals7及/或Mmp8之表现；刺激初级胆汁酸之产生；或活化G蛋白偶联受体(GPCR)。

如本文所使用，术语细菌菌株之“培养物”指在培养基中培养细菌菌株之后获得之产物。

如本文所使用，术语“培养基”为此项技术中已知用于支持细胞(尤其细菌，诸如普通拟杆菌)之生长之任何固体或液体培养基。在某些优选实施例中，如本文所描述之培养基能够支持细菌(例如普通拟杆菌)之生长。在此类实施例中，培养基通常含有碳源、氮源、无机盐及维持细菌处于存活状态所需之任何其他营养物。

如本文所使用，术语细菌菌株之“溶胞产物”指在破坏细菌菌株的细胞壁及/或细胞膜之后获得的含有胞内物质之产物。细菌菌株之溶胞产物可藉由此项技术中已知之各种技术获得，诸如音波处理、均质化、渗压冲击、冷冻及解冻方法、酶溶解方法及其类似技术。

如本文所使用，术语“样品”指自人类或动物个体获得之样品。如本文所描述之样品含有普通拟杆菌。在本揭示之一些实施例中，样品为大便样品。

术语“可食用载剂”指适用于与个体之组织接触之化合物、材料、组合物及/或剂型。各载剂必须在与调配物之其他成分兼容之意义上亦为“可接受”的。

如本文所使用，术语“医药学上可接受”指在合理医学判断范畴内，适用于与个体(人类或非人类动物)之组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理益处/风险比相称之化合物、材料、组合物及/或剂型。各载剂、赋形剂等必须在与调配物之其他成分兼容之意义上亦为“可接受”的。适合之载剂、赋形剂等可见于标准医药学文献中。

如本文所使用，“益生元”指实现可(或可不)赋予宿主益处之特定变化(在胃肠道微生物相(诸如普通拟杆菌)之组成及/或活性方面)之成分。在一些实施例中，益生元可为可食用的食物或饮料或其成分。在一些实施例中，益生元可为选择性酦酵成分。益生元可包括复合碳水化合物、胺基酸、肽、矿物质或用于细菌组合物存活之其他必需营养组分。益生元包括(但不限于)胺基酸、生物素、果寡糖、半乳寡糖、半纤维素(例如阿拉伯木聚糖(arabinoxylan)、木聚糖、木葡聚糖及葡甘聚醣)、菊寡糖、几丁质、乳酮糖、甘露寡糖、富含低聚果糖之菊寡糖、树胶(例如瓜尔胶(guar gum)、阿拉伯胶(gum arabic)及卡拉胶(carregenaan))、低聚果糖、低聚葡萄糖、塔格糖(tagatose)、抗性麦芽糊精(例如抗性淀粉)、反式半乳寡糖、果胶(例如木糖聚半乳糖醛酸(xylogalactouronan)、柑橘果胶、苹果果胶及鼠李糖聚半乳糖醛酸-I(rhamnogalacturonan-I))、膳食纤维(例如大豆纤维、甜菜纤维、豌豆纤维、玉米麸及燕麦纤维)以及木寡糖。

如本文所使用，如本文所使用之术语“组合”、“治疗组合”或“医药组合”定义一个单位剂型中之固定组合或用于组合投与之分装部分之套组，其中化合物A及化合物B可同时独立地或以某些时间间隔分开地投与。

氧化偶氮甲烷(AOM)及聚葡萄糖硫酸钠(DSS)诱导之小鼠大肠炎发炎性癌发生为常用模型。在此模型中，肿瘤负荷及数目藉由抗生素治疗来调节(Zackular等人,mBio.2013；4(6):e00692-13；Zackular等人,mSphere.2016；1(1))。此表明细菌群落结构对于大肠癌发展至关重要。另外，一些细菌所产生之代谢物使得该等细菌具有调节肿瘤形成之功能。举例而言，一些厚壁菌门细菌可产生短链脂肪酸(亦即，丁酸酯)以调节经由GPR43及GPR109进行之大肠细胞传讯，从而抑制肿瘤形成(Singh等人,Immunity.2014；40(1):128-39)。特别地，此等微生物利用膳食纤维及抗性淀粉来促进其定殖及有效代谢物产生。迄今为止，已报导若干种细菌会促进大肠稳态及抑制大肠癌发展(Gamallat等人,BiomedPharmacother.2016；83:536-41；Verma等人,Nutr Cancer.2013；65(1):84-91；Karczewski等人,Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol.2010；298(6):G851-9；Kuugbee等人,Dig Dis Sci.2016；61(10):2908-20)。

因此，本揭示提供一种用于预防、改善及/或治疗需要此类预防、改善及/或治疗之个体中之大肠癌之方法，其包含向个体投与包含有效量之普通拟杆菌或其代谢物之组合物。在本揭示之一些实施例中，肿瘤大小减小。

在本揭示之一些实施例中，普通拟杆菌(B.plebeius)之经管喂可抑制大肠炎发炎性癌发生。普通拟杆菌定殖有助于产生代谢物，包括丙酸、牛胆酸、胆酸、α-鼠胆酸及β-鼠胆酸以及熊脱氧胆酸。在本揭示之一些实施例中，在普通拟杆菌之治疗中，丙酸浓度增加。由普通拟杆菌引起之大量丙酸产生可归因于此细菌可极有效地使用岩藻糖及鼠李糖且参与丙二醇路径之事实。普通拟杆菌具有若干种碳水化合物降解酶，包括α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶及α-岩藻糖苷酶。

本揭示提供一种用于刺激需要此类刺激之个体中的初级胆酸之产生之方法，其包含向个体投与包含有效量之普通拟杆菌或其代谢物之组合物。在本揭示之一些实施例中，初级胆酸为胆酸(CA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)、α-鼠胆酸(α-MCA)或β-鼠胆酸(β-MCA)。

本揭示提供一种用于预防、改善及/或治疗需要此类预防、改善及/或治疗之个体中的大肠之发炎疾病之方法，其包含向个体投与包含有效量之普通拟杆菌或其代谢物之组合物。

本揭示提供一种用于增加需要此类增加之个体之肠道中的细菌丰富度之方法，其包含向个体投与包含有效量之普通拟杆菌或其代谢物之组合物。本揭示提供一种用于减少需要此类减少之个体之肠道中的细菌丰富度之方法，其包含向个体投与包含有效量之普通拟杆菌或其代谢物之组合物。

在本揭示之一些实施例中，普通拟杆菌经管喂建立独特的肠道微生物群落结构。微生物分类分析揭示，普通拟杆菌定殖可增加类球布劳特氏菌丰富度且减少阿克曼氏菌属、杜氏杆菌属及厚壁菌门。在肿瘤发展之后，普通拟杆菌定殖减少穆瑞氏菌属、梭菌属及嗜胆菌属含量。

本揭示亦提供一种用于调节需要此类调节之个体中之细胞激素效应之方法，其包含向个体投与包含有效量之普通拟杆菌或其代谢物之组合物。RNA-Seq路径分析揭示，普通拟杆菌定殖抑制所选细胞激素及细胞激素受体基因之表现且促进与神经活性配位体-受体相互作用相关之传讯路径。在本揭示之一些实施例中，方法系用于调节细胞激素表现或细胞激素受体基因表现。在一个态样中，在本揭示之一些实施例中，方法用于上调与神经活性配位体-受体相互作用、钙传讯路径、cGMP-PKG传讯路径、胆汁分泌、胆碱激导性突触、闸控性信道活性、信道活性、被动跨膜转运子活性、离子通道活性及/或UDP-醣苷基转移酶活性有关之细胞激素。在另一态样中，方法用于下调与金黄色葡萄球菌感染、肺结核、吞噬体、NOD样受体传讯路径、免疫受体活性、肽酶抑制剂活性及/或内肽酶抑制剂活性有关之细胞激素。

本揭示提供一种用于增加需要此类增加之个体中之的CCAAT强化子结合蛋白δ(Cebpd)、2型含有锚蛋白重复及BTB域之基因(Abtb2)、DNA接合酶1(Lig1)、Spda、Mard1、Six2及/或Ugy2b5之表现之方法，其包含向个体投与包含有效量之普通拟杆菌或其代谢物之组合物。

本揭示提供一种用于减少需要此类减少之个体中之Cxcr2、Clec4e、Cxcl3、Lgals7及/或Mmp8之表现之方法，其包含向个体投与包含有效量之普通拟杆菌或其代谢物之组合物。

本揭示提供一种用于活化需要此类活化之个体中之G蛋白偶联受体(GPCR)之方法，其包含向个体投与包含有效量之普通拟杆菌或其代谢物之组合物。

在本揭示之一些实施例中，普通拟杆菌为来自日本微生物保藏中心(JCM)之JCM12973，其亦称为M12或DSM17135。

在本揭示之一些实施例中，本文所描述之方法进一步包含向个体投与有效量之益生元。在本揭示之一些实施例中，益生元为海藻。已证实海藻补充剂膳食尤其促进小鼠中之普通拟杆菌定殖(Kearney等人,Cell Rep.2018；24(7):1842-51)。在本揭示之一些实施例中，海藻为紫菜。在本揭示之一个实施例中，海藻为条斑紫菜。在另一态样中，海藻呈粉末形式。

在本揭示之一些实施例中，组合物及益生元系同时、分开或依序共同投与，或以共调配物形式组合共同投与。如本文所使用，如本文所使用之术语“组合”定义一个单位剂型中之固定组合或用于组合投与之分装部分之套组，其中化合物A及化合物B可同时独立地或以某些时间间隔分开地投与。如本文所使用，如本文所使用之术语“共同投与”或“组合投与”定义为涵盖向单个患者投与所选治疗剂，且意欲包括其中药剂未必藉由相同投与途径或在相同时间投与之治疗方案。

本揭示之组合物可呈适合于投与，尤其经口服之任何形式。

本揭示之组合物之实例为营养组合物，包括食品且尤其为乳制品。

组合物可为例如胶囊、锭剂、饮料、散剂或乳制品。优选地，本揭示之组合物为营养品或医药产品、营养补充剂或医疗食品。

本揭示之营养组合物亦包括食品补充剂及功能性食品。“食品补充剂”表示一种产品，其由通常用于粮食中之化合物制成，但呈锭剂、散剂、胶囊、饮剂之形式或通常不与食物相关之任何其他形式且对健康具有有益作用。“功能性食品”为一种亦对健康具有有益作用之食物。特定言之，食品补充剂及功能性食品可具有针对病症之生理作用(保护性或治疗性)。

若根据本揭示之组合物为膳食补充剂，则其可按原样投与，可与适合之可饮用液体，诸如水、酸乳、牛奶或果汁混合，或可与固体或液体食品混合。在此情形下，膳食补充剂可呈锭剂、丸剂、胶囊、口含锭、颗粒、散剂、悬浮液、药囊、片剂、糖剂、条剂、糖浆之形式及相应投与形式，通常呈单位剂量形式。优选地，包含本揭示之组合物之膳食补充剂以锭剂、口含锭、胶囊或散剂形式投与，以习知的用于制备膳食补充剂之方法制造。

本文所描述之组合物可为医药学上可接受之组合物，其可包括一或多种医药学上可接受之载剂、赋形剂、黏合剂、稀释剂或其类似物。本揭示之组合物可经调配以用于各种投与途径，例如经口服。其亦可与递送媒剂组合提供，诸如在一些囊封技术中。

对于经口服与，可接受散剂、悬浮液、颗粒、锭剂、丸剂、胶囊、胶囊锭及囊片作为固体剂型。此等剂型可藉由例如使本文所揭示之一或多种化合物与至少一种添加剂(诸如淀粉或其他添加剂)混合来制备。适合之添加剂为蔗糖、乳糖、纤维素糖、甘露糖醇、麦芽糖醇、聚葡萄糖、淀粉、琼脂、海藻酸盐、几丁质、壳聚糖、果胶、黄蓍胶、阿拉伯胶、明胶、胶原蛋白、酪蛋白、白蛋白、合成或半合成聚合物或甘油酯。视情况地，口服剂型可含有其他成分以辅助投与，诸如惰性稀释剂，或润滑剂(诸如硬脂酸镁)，或防腐剂(诸如对羟基苯甲酸酯或山梨酸)，或抗氧化剂(诸如抗坏血酸、生育酚或半胱胺酸)、崩解剂、黏合剂、增稠剂、缓冲剂、甜味剂、调味剂或芳香剂。锭剂及丸剂可用此项技术中已知的适合之包衣材料进一步处理。

用于经口服与之液体剂型可呈医药学上可接受之乳液、糖浆、酏剂、悬浮液及溶液形式，其可含有惰性稀释剂，诸如水。医药调配物及组合物可使用无菌液体(诸如(但不限于)油、水、乙醇及此等物质之组合)制备为液体悬浮液或溶液。可添加医药学上适合之界面活性剂、悬浮剂、乳化剂以用于经口或非经肠投与。

应理解，若在本文中引用任何先前技术公开案，则此类引用不构成对该公开案形成此项技术中之公共常识之一部分的承认。

尽管已出于清楚理解之目的而以说明及实例方式详细地提供揭示内容，但熟习此项技术者将显而易见，可在不脱离本揭示之精神或范畴的情况下进行各种改变及修改。因此，前述描述及实例不应视为限制性的。

实例

方法

含特定菌及SPF小鼠

在吾人之研究中使用六至八周龄雄性C57BL/6JN无菌小鼠，其在隔离器中培育及处理。对于SPF小鼠，吾人在两个不同动物设施(亦即，AS核心及LAC)使用雄性6至8周龄小鼠进行独立AOM/DSS小鼠模型。包括海藻膳食、普通拟杆菌接种及AOM/DSS大肠炎诱导之癌发生小鼠模型之所有程序均经批准。

细菌菌株及厌氧培养条件

普通拟杆菌(菌株类型JCM 12973＝M12＝DSM17135)系购自日本微生物保藏中心(JCM)。此细菌之真实性由藉由整合Illumina短读段及长片段定序而进行之全基因体定序来验证。所组装之序列及基因体标注图列于GitHub(https://github.com/hunglinchen2003/Bacteria-WGS-assembly)中。使用厌氧血琼脂板(Anaerobic BloodAgar Plate；Ana.BAP)及厌氧庖肉培养基(Cooked Chopped Meat Medium)在厌氧操作台(Whitley DG250 Workstation)中培养普通拟杆菌。普通拟杆菌之储存及解冻条件与参考物品相同(Kearney等人,Cell Rep.2018；24(7):1842-51)。

普通拟杆菌经管喂给予及海藻膳食治疗

为采集用于经管喂给予实验之活细菌，吾人将细菌培养物离心48小时且随后用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)洗涤两次，将细菌调节至10⁸CFU/ml，且藉由经管喂给予对各小鼠施用100μl细菌(10⁷CFU)。将100μl PBS用于管饲对照小鼠治疗组。在用于DNA提取及代谢物分析之实验方案开始之前，自个别动物收集粪便样品持续1至3天。在第1天，吾人进行10⁷CFU普通拟杆菌管喂。如各图之实验时间表中所述，海藻膳食组在指定时间接受含有1％紫菜之定制AIN-93啮齿动物膳食。一般而言，吾人用海藻膳食喂养小鼠四天且改回对照膳食(AIN-93饲料)。有机紫菜海藻粉末原料系由条斑紫菜(RawNori.com,USA)制成。由Research Diet Inc.(New Brunswick,NJ,USA)调配及制造研究动物膳食。

粪便DNA提取

根据方案使用QIAamp Fast DNA大便微型套组(QIAGEN)自大便样品提取DNA。简言之，将小于200mg之大便样品藉由钢珠悬浮于200μl inhibitEX缓冲剂中且藉由强涡旋来均质化持1分钟。接着，将悬浮液在95℃下加热5分钟。在10,000×g离心10分钟后，将15μl蛋白酶K添加至200μl悬浮液中，添加200μl AL缓冲剂(由QIAamp Fast DNA大便微型套组提供)，随后在70℃下培育10分钟。在将200μl乙醇(96-100％)添加至600μl悬浮液中之后，将混合物涂覆至旋转管柱，且舍弃滤液。随后藉由AW1及AW2缓冲剂进行两个洗涤步骤，用100μlATE缓冲剂溶离旋转管柱中之DNA。藉由nonodrop2000(Thermo Fisher Scientific,SanJose,CA,USA)量测DNA之浓度。

样品制备、库建构及定序

使用Qubit dsDNA HS分析法(Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA,USA)来定量经纯化之DNA，且藉由Agilent 4200磁带机系统(Agilent Technologies,Palo Alto,CA,USA)检验DNA之完整性。按照用户手册中之说明，使用LoopSeq 16S长读段24-plex套组(Loop Genomics,San Hose,CA,USA)生成全长16S rDNA扩增子。使用成对末端150bp模式用Illumina NovaSeq平台(Illumina,San Diego,CA,USA)对库进行定序。样品制备、库建构及定序系由Welgene Biotech Co.,Ltd.进行。

细菌分类及群落分析

使用CLC基因体工作台微生物基因体学模块(35)将经组装之片段重迭组映射至定制SILVA V132(34)及NCBI策展之Refseq完整基因体数据库。为验证吾人用于分类分析之生物信息学管线，吾人使用ZymoBIOMICS微生物群落之LoopSeq 16S rRNA全长序列资料来与Kraken(https://github.com/nico-chung/loopseq)进行比较。使用Phyloseq(36)及VEGAN(https://rdrr.io/rforge/vegan/)(Callahan等人,F1000Res.2016；5:1492)程序包及微生物组分析师工具(Dhariwal等人,Nucleic Acids Res.2017；45(W1):W180-w8)藉由R软件来分析由CLC微生物基因体学模块产生之分类表。

大肠癌之AOM及DSS小鼠模型

在第0天，小鼠首先接受如上文所述之普通拟杆菌或PBS对照物经管喂给予及海藻膳食。在第21天，向小鼠腹膜内注射12mg/kg之氧化偶氮甲烷(AOM)(Sigma，目录号A2853)。在第20、39及57天向SPF(使用3％ DSS)及无菌(使用1％ DSS)动物提供聚葡萄糖硫酸钠盐(DSS，大肠炎级，36-50kDa，MP Biomedicals，目录号216011080)水持续5天。自第0天每隔一天量测各小鼠之体重。在第0天以及各DSS处理之前的第20、39及57天及在各动物实验结束时收集小鼠粪便样品。在第100天牺牲AS核心之SPF小鼠，且对于LAC组，在第90天牺牲SPF及无菌小鼠。收集血清样品及大肠组织，且将一半组织用于呈瑞士卷形式之组织石蜡包埋以进行H&E染色，同时提取另一半组织之RNA以用于RNA-Seq分析。

组织学及病理学检验

由病理学核心实验室(Pathology Core Laboratory)制备石蜡包埋之小鼠耳朵切片且用H&E染色。大肠组织中之低度异常增生之显微镜影像与人类结肠腺瘤类似。根据Boivin等人(Boivin等人,Gastroenterology.2003；124(3):762-77)描述之标准诊断肠肿瘤。记录大肠炎且由两名病理学家根据以下形态进行评分：0级，正常大肠黏膜；1级，现有腺窝之基部三分之一缩短及丧失且伴有黏膜之轻度炎症及水肿：2级，腺窝之基部三分之二丧失且伴有黏膜之中度炎症；3级，所有腺窝丧失且伴有黏膜之重度炎症，但表面上皮组织仍保留；以及4级，所有腺窝及表面上皮组织丧失且伴有黏膜、固有肌层及黏膜下层之重度炎症，如Suzuki等人,Carcinogenesis.2006；27(1):162-9中所描述。

RNA定序及资料分析

根据说明书手册使用试剂(Invitrogen,USA)自小鼠大肠组织提取总RNA。使用Agilent之SureSelect股-特异性RNA库制备套组进行库建构，随后选择AMPure XP珠粒(Beckman Coulter,USA)之大小。使用Illumina之合成定序(SBS)技术(Illumina,USA)测定序列。使用Illumina之正式碱基判读程序，即bcl2fastq转换软件v2.20将来自所有Illumina定序平台之BCL档案转换为FASTQ读段。在移除衔接子序列之后，进行质量微调以移除低质量读段/碱基。接着，吾人使用CLC基因体工作台(QIAGENE,USA)，一种RNA分析模块，使用默认映像参数进行针对参考小鼠基因体GRCm38之定序映射。两组工具中之差异性表现对一组表现径迹及对照物进行统计差异性表现测试。其使用基于负二项广义线性模型(GLM)之多因子统计。火山图显示统计测试之p值与样品间之倍数变化之间的关系。log倍数变化(FC)标注于x轴上，且-log10伪发现率(FDR)标注于y轴上。对于基因本体(GeneOntology；GO)以及京都基因与基因体百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomes；KEGG)路径分析，藉由R软件之clusterProfiler程序包(Yu等人,Omics.2012；16(5):284-7)分析差异性表现之基因清单。

代谢物提取

将粪便样品称重至试管中。在添加1000μL萃取溶剂(乙腈-甲醇-水，2:2:1，包含0.1％甲酸及50nmol/L之内标物)之后，将样品涡旋30秒，在35Hz下均质化4分钟，且在冰水浴中音波处理5分钟。重复均质化及音波处理循环3次，随后在-40℃下培育1小时且在11000rpm及4℃下离心15分钟。将所得上清液转移至LC-MS小瓶中且储存在-80℃下直至UHPLC-QE Orbitrap/MS分析。

用于胆汁酸定量之UHPLC-PRM-MS分析

使用配备有Waters ACQUITY UPLC BEH C18管柱(150×2.1mm，1.7μm，Waters)之Agilent 1290Infinity系列UHPLC系统(Agilent Technologies)进行UHPLC分离。移动相A为含1mmol/L之乙酸铵及1mmol/L之乙酸之水，且移动相B为乙腈。管柱温度设定为60℃。自动取样器温度设定为4℃且注射体积为1μL。使用Q Exactive Focus质谱仪(Thermo FisherScientific)进行分析法研究。典型离子源参数为：喷雾电压＝+3500/-3100V，外鞘气体(N2)流动速率＝40，辅助气体(N2)流动速率＝15，吹扫气体(N2)流动速率＝0，辅助气体(N2)温度＝350℃，毛细管温度＝320℃。

藉由将个别分析物(包括脱氢石胆酸、别石胆酸、异石胆酸、石胆酸、23-去甲脱氧胆酸、7-酮石胆酸、12-酮石胆酸、原胆酸、熊脱氧胆酸、猪脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、异脱氧胆酸、脱氢胆酸、7,12-二酮石胆酸、6,7-二酮石胆酸、7-酮脱氧胆酸、12-脱氢胆酸、3-脱氢胆酸、熊胆酸、α-鼠胆酸、β-鼠胆酸、λ-鼠胆酸、别胆酸、胆酸、葡糖石胆酸、甘胺熊脱氧胆酸、甘胺猪脱氧胆酸、甘胺鹅脱氧胆酸、甘胺脱氧胆酸、甘胺脱氢胆酸、甘胺-λ-鼠胆酸、甘胺胆酸、牛磺石胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺α-鼠胆酸、牛磺β-鼠胆酸及牛胆酸)之标准溶液注射至质谱仪之API源中来优化各目标分析物之平行反应监测(PRM)参数。由于大部分分析物不显示可接受用于定量之产物离子，因此选择高分辨率之前驱体离子进行定量。

藉由GC-MS进行之短链脂肪酸分析

使用与Agilent 5977B质谱仪耦合之Agilent 7890B气体层析系统进行GC-MS分析。系统利用HP-FFAP毛细管柱。以分流模式(5:1)注射分析物之1μL等分试样。使用氦气作为载气，前入口吹扫流率为3mL min^-1，且流经管柱之气流速率为1mL min^-1。初始温度保持在80℃维持1分钟；以5℃min^-1之速率升高至150℃，维持1分钟；以10℃min^-1之速率升高至180℃，维持0分钟；以40℃min^-1之速率升高至245℃，维持10分钟。注射、转移管线、四极杆及离子源温度为240℃、240℃、230℃及150℃。在电子冲击模式下能量为-70eV。在2.5分钟之溶剂延迟后，在33-150之m/z范围内以Scan/SIM模式获取质谱数据。分析法中所使用之标准酸为乙酸(CAS 64-19-7，SIGMA)、丙酸(CAS79-09-4，SIGMA)、异丁酸(CAS 79-31-2，SIGMA)、丁酸(CAS107-92-6，SIGMA)、异戊酸(CAS 503-74-2，SIGMA)、戊酸(CAS109-52-4,SIGMA)、己酸(CAS142-62-1，SIGMA)、庚酸(CAS111-14-8，SIGMA)、辛酸(CAS124-07-2，SIGMA)、壬酸(CAS112-05-0，SIGMA)及癸酸(CAS 334-48，SIGMA)。

统计资料

使用R程序包(包括phyloseq、vegan及MicrobiomeAnalystR)来计算细菌α及β多样性(Dhariwal等人,Nucleic Acids Res.2017；45(W1):W180-w8)。吾人对各组之间之香农α多样性指数进行ANOVA测试，且对布雷-柯蒂斯指数(Bray-Curtis indices)进行置换MANOVA(PERMANOVA)测试。藉由STAMP软件生成及计算样品对之分类概况及统计测试(Parks等人,Bioinformatics.2014；30(21):3123-4)。除非另外指示，否则代谢物定量数据呈现为平均值±SEM、SE或SD。吾人对两组样品应用双侧韦尔奇检验(Welch's test with two-sided)及韦尔奇倒置CI统计分析方法(Welch's inverted CI method of statisticalanalysis)，且P值(校正)小于0.05之差异视为统计显著。

实例1无菌小鼠中之普通拟杆菌定殖调节大肠组织mRNA概况

据报导，海藻膳食补充剂有助于活体内普通拟杆菌定殖及生长。在无此特定膳食之情况下，经管喂给予之普通拟杆菌无法在肠道中维持较长时段，且相对于肠道微生物之丰富度小于0.1％(Kearney等人,Cell Rep.2018；24(7):1842-51)。为了在小鼠中研究普通拟杆菌接种之作用，吾人进行10⁷CFU之普通拟杆菌之经管喂给予，且每4天用以脉冲方式使用之1％海藻膳食补充剂(SDP)喂养小鼠持续20天。在对照组中，在使用及未使用海藻膳食补充剂之无菌小鼠中均未藉由普通拟杆菌特异性PCR侦测到普通拟杆菌(图1)。海藻膳食补充剂及普通拟杆菌管饲成功地引起普通拟杆菌定殖(图1)。吾人藉由RNA-Seq分析来分析来自此三组小鼠之大肠组织之mRNA表现。火山图显示藉由比较海藻膳食组(n＝3)与海藻膳食+普通拟杆菌组(n＝3)获得之Log倍数变化(logFC)对比-log伪发现率(-logFDR)。在此比较中以FDR p<0.01差异性表现三十八种基因，且其基因名称列于表1中。

表1RNAseq火山图分析表

另外，经由热图分析，吾人检验来自个别小鼠之大肠组织之mRNA表现，且进行皮尔逊相关性集群分析(Pearson's correlation clustering analysis)且发现大量差异性表现之基因(与海藻膳食及海藻膳食+普通拟杆菌组相比)、CCAAT强化子结合蛋白δ(Cebpd)、2型含有锚蛋白重复及BTB域之基因(Abtb2)以及DNA接合酶1(Lig1)，其聚集在一起且在接受海藻膳食及普通拟杆菌治疗之小鼠中持续上调。应注意，已知所有差异性表现之基因均未调节发炎反应，表明普通拟杆菌定殖未引起发炎性细胞激素表现。因此，此系统适用作用于以下目的之模型：研究此细菌以除本身引起发炎反应以外之方式对人类中之大肠直肠癌之发展之作用。

实例2海藻膳食及普通拟杆菌定殖增加微生物多样性且在SPF小鼠中产生独特微生物生态学。

除无菌小鼠之定殖之外，吾人在SPF小鼠中进行普通拟杆菌之经管喂给予。藉由普通拟杆菌特异性PCR及16S rRNA全长定序(Loop Genomics Technology)，吾人发现本地SPF小鼠之粪便样品中不含普通拟杆菌(图2A)。藉由一次经管喂给予，普通拟杆菌在SPF小鼠中成功定殖，随后以四天之间隔在20天内使用3次海藻膳食(图2A)。α多样性分析指示20天海藻膳食治疗可增加使用香农指数计算之微生物多样性。另外，β多样性分析指示仅海藻膳食组及海藻膳食+普通拟杆菌组均具有不同微生物组成。在门层面，海藻膳食引起厚壁菌门之增加，然而普通拟杆菌组可在该组中之四只小鼠中的3只中逆转作用且维持类似的厚壁菌门含量。在海藻膳食加普通拟杆菌定殖之第20天，普通拟杆菌之相对丰富度可总共增加至多30％。在使用LEfSe(线性判别分析(LDA)效应大小)分析来比较海藻膳食与海藻膳食+普通拟杆菌微生物群落时，在门层面，发现海藻膳食+普通拟杆菌组中之小鼠富含类杆菌门(Bacteroidetes)(LDA评分>2)且呈现厚壁菌门之减少(LDA评分<-2)(图2B)。在属层面，除普通拟杆菌外，海藻膳食+普通拟杆菌组中富含类球布劳特氏菌。相比之下，阿克曼氏菌属及杜氏杆菌属在海藻膳食+普通拟杆菌组中之小鼠中减少(图2C)。结果表明，吾人可成功地使用海藻膳食促进普通拟杆菌特异性群落。因此，吾人准备评估此是否可用于改变有利于大肠癌发展之微生物群落。

实例3海藻膳食加普通拟杆菌定殖抑制AOM/DSS诱导之炎症及大肠癌发生。

前述研究设定用于研究普通拟杆菌对癌发生之作用之阶段，因为已知肠道微生物群落之改变可调节癌症发展。此又将使得能够更好地理解大肠癌中之改变之微生物相如何促进此等患者中之大肠癌发展。如图2A中所描述，吾人首先在保持于SPF设施中之小鼠中进行普通拟杆菌之定殖持续20天，且随后进行一次腹膜氧化偶氮甲烷(AOM)注射及三轮聚葡萄糖硫酸钠(DSS)处理(图3A)。每隔一天量测个别小鼠之体重。以平均值计，与对照组相比，AOM/DSS处理组之体重增加较少。吾人之结果表明，与经海藻膳食治疗之小鼠(n＝9)相比，来自经AOM/DSS处理之使用海藻膳食加普通拟杆菌之小鼠(n＝10)的大肠中之肿瘤负荷及大小显著减少(图3B及图3C)。呈现来自此两个组中之各者以及未经AOM/DSS处理之对照组之代表性大肠组织(图3B)。

在允许大肠癌发展10周后，吾人对来自四只小鼠之呈瑞士卷形式之大肠切片进行苏木素-伊红染色(H&E)染色。大肠组织之H&E染色指示与对照组相比，在AOM/DSS处理后之显著淋巴细胞聚集及腺瘤发展(图3D)。与在AOM/DSS处理之后仅使用海藻膳食之小鼠相比，来自经海藻膳食加普通拟杆菌治疗之小鼠之大肠组织具有显著减少之肿瘤数目及大小(图3B)。

实例4海藻膳食加普通拟杆菌定殖小鼠大肠组织之细胞激素-细胞激素受体基因表现之下调。

为探究海藻膳食加普通拟杆菌抑制AOM/DSS诱导之癌发生之机制，吾人使用来自使用海藻膳食之对照小鼠(n＝4)、使用海藻膳食+普通拟杆菌之对照小鼠(n＝3)、使用海藻膳食之AOM/DSS小鼠(n＝3)及使用海藻膳食+普通拟杆菌之AOM/DSS小鼠(n＝4)之大肠组织进行RNA-Seq分析。吾人首先藉由火山图分析来检验经AOM/DSS处理之组中之差异性表现之基因概况，对海藻膳食加普通拟杆菌组与海藻膳食组进行比较。吾人鉴别796种差异性表现之基因，其中FDR p<0.01且logFC>2。252种上调之基因及544种下调之基因分别用于KEGG及GO路径富集分析。吾人藉由p值将所有相关路径进一步分类。在KEGG路径分析中，呈现富含富集上调基因之路径的路径，且排名前5的路径包括神经活性配位体-受体相互作用、钙传讯路径、cGMP-PKG传讯路径、胆汁分泌及胆碱激导性突触。富含下调之基因的排名前5的路径为与细胞激素-细胞激素受体相互作用、金黄色葡萄球菌感染、肺结核、吞噬体及NOD样受体传讯路径有关之路径。在GO路径分析中，对于上调之基因，排名前5的富集路径为闸控性信道活性、信道活性、被动跨膜转运子活性、离子通道活性及UDP-醣苷基转移酶活性。对于下调之基因，排名前5的富集路径为免疫受体活性、肽酶抑制剂活性及内肽酶抑制剂活性。为检验在吾人之研究中，四个组中之个别小鼠中的差异性表现之基因之概况，吾人藉由阶层集群分析来进行热图分析。在热图分析中，发现包括Spda、Mard1、Six2及Ugy2b5之基因组在经AOM/DSS处理之海藻膳食加普通拟杆菌组中上调。发现包括Cxcr2、Clec4e、Cxcl3、Lgals7及Mmp8之若干基因在经AOM/DSS处理之海藻膳食对照组(n＝3)中上调，但在海藻膳食加普通拟杆菌组中下调。

实例5AOM/DSS小鼠中之海藻膳食加普通拟杆菌治疗形成独特微生物群落

藉由Loop-Seq技术，吾人解析微生物相群落。香农多样性结果表明，在AOM/DSS处理之后，微生物群落之丰富度及均匀度降低，然而海藻膳食加普通拟杆菌组与海藻膳食组相比不存在显著差异。使用布雷-柯蒂斯指数之β多样性分析表明，各组小鼠以彼此不同之群落结构存在。进行比较两个经AOM/DSS处理之组(海藻膳食对比海藻膳食+普通拟杆菌)之LEfSe分析。根据经AOM/DSS处理之海藻膳食加普通拟杆菌组(相较于海藻膳食对照组)之门组成，变形菌门(Proteobacteria)及类杆菌门增加，同时厚壁菌门减少(图4A)。在属层面，相较于AOM/DSS海藻膳食对照组，AOM/DSS海藻膳食加普通拟杆菌组中富含普通拟杆菌及穆瑞氏菌属(LDA评分>2，p<0.05)。嗜胆菌属、梭菌属及嗜胆菌属由于普通拟杆菌定殖而减少(LDA评分<-2，p<0.05)(图4A及图4B)。

实例6无菌小鼠中之普通拟杆菌定殖促进代谢物产生

为研究普通拟杆菌定殖如何减少小鼠中之大肠炎症及肿瘤形成之可能机制，吾人量测在海藻膳食补充剂促进之定殖之后，无菌小鼠中之由普通拟杆菌产生之代谢物。使用第20天之来自对照组、海藻膳食组及海藻膳食+普通拟杆菌组之粪便样品进行短链脂肪酸(SCFA)及胆汁酸代谢物之分析。藉由GC-MS定量粪便SCFA含量且吾人之结果指示乙酸、丙酸、异丁酸及异戊酸为无菌小鼠中之主要SCFA。相较于对照组(5.05±0.18μg/g)及仅海藻膳食组(1.780±0.22μg/g)，海藻膳食+普通拟杆菌组产生明显更多之丙酸(25.75±2.84μg/g)(图5)。另外，使用UHPLC-PRM-MS/MS方法分析粪便胆汁酸。侦测到41种所检验之目标胆汁酸中之十八种胆酸。超过定量位准下限(0.49nmol/L)之十四种胆酸呈现于热图中且显示于表2中。在热图皮尔逊相关性集群分析中，牛磺α-鼠胆酸、牛磺熊脱氧胆酸、牛胆酸及牛磺鹅脱氧胆酸聚集在一起且在海藻膳食+普通拟杆菌组之粪便样品中下调。α-鼠胆酸、β-鼠胆酸及熊脱氧胆酸在海藻膳食+普通拟杆菌组之粪便样品中上调。结果表明，普通拟杆菌可在活体内产生初级及次级代谢物。

表2粪便样品B代谢物分析(胆汁酸)

大肠癌发展为长期过程。吾人之研究报导海藻之膳食补充剂可调节持久之普通拟杆菌丰富度。肠道微生物之有效调节已成为具有挑战性之用于治疗病症之技术。在本文中，吾人证实活体内含有海藻之膳食促进之普通拟杆菌定殖可抑制AOM/DSS诱导之大肠癌形成。普通拟杆菌定殖之小鼠中的肿瘤数目及淋巴细胞聚集物显著减少。对粪便DNA及来自大肠组织之大肠组织RNA之进一步分析表明，高丰富度之普通拟杆菌产生独特的微生物相群落结构且与大肠癌形成期间之减少之发炎性细胞激素基因表现相关。

尽管吾人认为普通拟杆菌可藉由改变细菌群落以进行消炎来抑制大肠癌形成。吾人亦检验普通拟杆菌定殖在使用AOM/DSS之无菌小鼠中之作用。令人感兴趣地，吾人发现在用AOM/DSS处理之经海藻膳食加普通拟杆菌及仅普通拟杆菌定殖之无菌小鼠中，肿瘤数目亦减少。另外，吾人发现普通拟杆菌定殖对大肠长度无影响，但观测到经AOM/DSS处理之SPF小鼠具有较短之大肠长度。此等结果表明，普通拟杆菌所产生之代谢物及/或其自身具有癌症抑制功能。普通拟杆菌可在SPF及无菌小鼠之癌症抑制中发挥不同机制。进一步之挑战将为鉴别控制普通拟杆菌之抗肿瘤能力之关键因素。

类杆菌属为存在于人类粪便中之主要微生物；鉴别若干种新的种系型，但尚未针对其对人类健康之贡献进行全面表征。在吾人之当前研究中，吾人使用小鼠模型及全基因体定序进行普通拟杆菌JCM12973之功能及基因体表征。因此，吾人之研究提供适合应用于普通拟杆菌之其他新颖菌株之表征及比较性研究之平台。另外，与普通拟杆菌共有超过90％相似性之谱系学上最类似之属，即普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)可为良好的对照物，以帮助阐明普通拟杆菌染色物中之发挥抗肿瘤功能之基因。

代谢物为肠道微生物产生以促进宿主健康之关键生物产物。令人感兴趣的是，所有普通拟杆菌染色物均可在胆汁存在下生长。为此，吾人表征用普通拟杆菌JCM 12973定殖之无菌小鼠中之粪便代谢物组合物变化，诸如短链脂肪酸(SCFA)及胆汁酸组合物。乙酸为自无菌小鼠之粪便样品鉴别之最丰富的SCFA。然而，在海藻膳食+普通拟杆菌组中，粪便丙酸浓度可增加至与乙酸类似的约28mg/kg之含量。普通拟杆菌引起之大量丙酸产生可归因于此细菌可极有效地使用岩藻糖及鼠李糖且参与丙二醇路径之事实。普通拟杆菌具有若干种碳水化合物降解酶，包括α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶及α-岩藻糖苷酶。因此，在无菌小鼠中，普通拟杆菌本身可有效产生丙酸(经由丙二醇路径)，但对乙酸及其他SCFA无显著作用。在大肠癌中，通用岩藻糖以及(唾液酸)T、(唾液酸)Tn、Lewis X/A增加，且表明促进肿瘤生长。似乎可能的是，高丰富度之普通拟杆菌可降解岩藻糖且活体内抑制肿瘤形成。与吾人之结果一致，实际上，无菌小鼠中之普通拟杆菌定殖可抑制AOM/DSS诱导之大肠癌数目及负荷(图5)。

除SCFA之外，吾人观测到普通拟杆菌可代谢初级胆酸(TCA)且产生次级代谢物(UDCA)。此外，普通拟杆菌亦可刺激一些特异性初级胆汁酸，诸如CA、CDCA、α-MCA、β-MCA之产生。据报导，CDCA之含量与肝窦状内皮细胞(LSEC)CXCL16mRNA表现相关，该表现在肿瘤转移模型中可促进CXCR6+肝NKT细胞募集至肝脏且抑制肿瘤生长(Ma等人,Science.2018；360(6391))。次级胆汁酸，诸如DCA，对上皮细胞具有细胞毒性且促进大肠细胞之异常增生(Im等人,J Nutr.2004；134(2):483-6)。令人感兴趣地，报导UDCA直接抑制大肠癌发展及细胞生长(Wali等人,Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.2002；11(11):1316-21)，且为用于胆固醇结石溶解及原发性胆汁性胆管炎(PBC)之已知处方药物。实际上，吾人用UDCA处理HT-29且发现UDCA可抑制CXCR4表现。CXCL12/CXCR4轴为发炎引起之大肠直肠癌进程之重要目标，且大肠癌患者中之大量CXCR4表现增加复发风险及不良存活率。因此，吾人之结果表明，普通拟杆菌之细菌代谢物，诸如UDCA，可对抑制炎症及大肠癌起重要作用。

初步地，吾人亦用普通拟杆菌或肠道罗斯拜瑞氏菌(Roseburia intestinalis/R.intestinals)(已知的产生丁酸之细菌)之培养基处理Caco-2细胞。吾人之RNA-Seq资料指示，普通拟杆菌相较于肠道罗斯拜瑞氏菌诱导独特的趋化因子表现模式。已知趋化因子表现为G蛋白偶联受体(GPCR)之下流传讯(Lieu等人,Br J Pharmacol.2014；171(5):1156-66)。吾人之结果表明，普通拟杆菌代谢物可含有一些可活化G蛋白偶联受体(GPCR)之活性化合物，且可能具有作为抗癌药物研发之潜力(Insel等人,Front Pharmacol.2018；9:431)。可使用现有的基于细胞之药物筛选平台进行未来的针对鉴别活性化合物之研究(Colosimo等人,Cell Host Microbe.2019；26(2):273-82.e7)。为此，鉴别更多的抗肿瘤细菌及由此等细菌产生之活性代谢物将有助于发现用于大肠癌治疗之新药物。

虽然已结合上文所阐述之特定实施例来描述本揭示，但其许多替代方案及其修改及变化对于一般熟习此项技术者而言将显而易见。所有此类替代方案、修改及变化被视为属于本揭示之范畴内。

Claims (26)

1.一种组合物之用途，其用于制造用以预防、改善及/或治疗需要此类预防、改善及/或治疗之个体中之大肠癌及/或大肠之发炎疾病之药物，其中该组合物包含有效量之普通拟杆菌(Bacteroides plebeius)或其代谢物。

2.如权利要求1所述的用途，其中该大肠癌由大肠炎症诱导。

3.如权利要求1所述的用途，其中该药物用于减小肿瘤大小及/或抑制肿瘤形成。

4.如权利要求1所述的用途，其中该发炎疾病为大肠炎诱导之炎症。

5.如权利要求1所述的用途，其中该药物亦用于调节肠道中之细菌丰富度。

6.如权利要求5所述的用途，其中该药物用于增加类球布劳特氏菌(Blautiacoccoides)之丰富度及/或减少细菌丰富度，且该等细菌为阿克曼氏菌属(Akkermansia sp.)、杜氏杆菌属(Dubosiella sp.)、穆瑞氏菌属(Muribaculaceae sp.)、梭菌属(Closteridale sp.)、嗜胆菌属(Bilophila sp.)或厚壁菌门(Firmicutes)。

7.如权利要求1所述的用途，其中该药物亦用于调节细胞激素效应。

8.如权利要求7所述的用途，其中该药物用于调节细胞激素表现或细胞激素受体基因表现。

9.如权利要求7所述的用途，其中该药物用于上调与神经活性配位体-受体相互作用、钙传讯路径、cGMP-PKG传讯路径、胆汁分泌、胆碱激导性突触、闸控性信道活性、信道活性、被动跨膜转运子活性、离子通道活性及/或UDP-醣苷基转移酶活性有关之细胞激素。

10.如权利要求7所述的用途，其中该药物用于下调与金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)感染、肺结核、吞噬体、NOD样受体传讯路径、免疫受体活性、肽酶抑制剂活性及/或内肽酶抑制剂活性有关之细胞激素。

11.如权利要求1所述的用途，其中该药物亦用于增加CCAAT强化子结合蛋白δ(Cebpd)、2型含有锚蛋白重复及BTB域之基因(Abtb2)、DNA接合酶1(Lig1)、Spda、Mard1、Six2及/或Ugy2b5之表现。

12.如权利要求1所述的用途，其中该药物亦用于减少Cxcr2、Clec4e、Cxcl3、Lgals7及/或Mmp8之表现。

13.如权利要求1所述的用途，其中该药物亦用于刺激初级胆酸之产生。

14.如权利要求13所述的用途，其中该等初级胆酸为胆酸(CA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)、α-鼠胆酸(α-MCA)或β-鼠胆酸(β-MCA)。

15.如权利要求1所述的用途，其中该药物亦用于活化G蛋白偶联受体(GPCR)。

16.如权利要求1所述的用途，其中该普通拟杆菌为来自日本微生物保藏中心(JapanCollection of Microorganisms；JCM)之JCM 12973。

17.如权利要求1所述的用途，其中普通拟杆菌包含于培养物、溶胞产物或生物样品中。

18.如权利要求1所述的用途，其中该生物样品为大便样品。

19.如权利要求1所述的用途，其中该药物为与有效量之益生元一起投与。

20.如权利要求19所述的用途，其中该益生元包含膳食纤维。

21.如权利要求19所述的用途，其中该益生元包含海藻。

22.如权利要求21所述的用途，其中该海藻为紫菜。

23.如权利要求21所述的用途，其中该海藻为条斑紫菜(Porphyra yezoensis)。

24.如权利要求19所述的用途，其中该益生元呈粉末形式。

25.如权利要求19所述的用途，其中该组合物及该益生元为同时、分开或依序共同投与，或以共调配物形式组合共同投与。

26.如权利要求1所述的用途，其中该组合物呈适合于经口服之形式。