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CN118772251B - 番茄Tm-22抗病蛋白突变体及其在防治ToBRFV中的应用 - Google Patents

番茄Tm-22抗病蛋白突变体及其在防治ToBRFV中的应用 Download PDF

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CN118772251B
CN118772251B CN202310954762.4A CN202310954762A CN118772251B CN 118772251 B CN118772251 B CN 118772251B CN 202310954762 A CN202310954762 A CN 202310954762A CN 118772251 B CN118772251 B CN 118772251B
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Abstract

本发明公开了一种番茄Tm‑22抗病蛋白突变体及其在防治ToBRFV中的应用，属于病毒病生物防治技术领域。本发明首次发现，将番茄Tm‑22基因的编码区序列第1062位核苷酸由A突变为G；或者，将番茄Tm‑22基因编码蛋白的第354位氨基酸由异亮氨酸突变为甲硫氨酸，能够显著降低ToBRFV衣壳蛋白(CP)的积累，可作为新的ToBRFV抗性基因，对于ToBRFV的防治具有十分重要的意义。而且，本发明所获得的番茄Tm‑22抗病蛋白突变体在实现对ToBRFV抗性的同时，还能保持原有的对TMV、ToMV和ToMMV的抗性，对于植物抗病品种的选育提供了新的抗病基因来源。

Description

番茄Tm-22抗病蛋白突变体及其在防治ToBRFV中的应用
技术领域
本发明涉及病毒病生物防治技术领域，具体涉及一种番茄Tm-22抗病蛋白突变体及其在防治ToBRFV中的应用。
背景技术
番茄Tm-22基因属于NBS-LRR家族，它位于第九号染色体长臂上，可介导对烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，TMV)和番茄花叶病毒(tomato mosaic virus，ToMV)的抗性。Tm-22基因与Tm-2及其感病基因tm-2互为等位基因，其编码的蛋白分别在NBS结构域和LRR结构域内存在着氨基酸序列的差异，这种差异决定了Tm-22基因及其等位基因的抗病或者感病的性状特征。因此，研究Tm-22基因及其编码的蛋白的氨基酸序列能够在分子水平上了解番茄品种的抗病特性，加深理解抗病基因编码蛋白对病毒的识别和应答机制，为抗病基因的应用奠定基础。
番茄褐色皱果病毒(tomato brown rugose fruit virus，ToBRFV)属于烟草花叶病毒属(Tobamovirus)。2014年首次在以色列报道，目前该病毒已逐步扩散到包括我国在内的多个国家。2021年4月，ToBRFV被我国列为检疫性病毒。ToBRFV的传播能力和危害性强，严重威胁番茄的安全生产。
种植抗病品种是防治病毒病最有效的方式，但ToBRFV能侵染含有Tm-22抗病基因的番茄品种，因此，急需对Tm-22抗病基因进行改造，以培育能够抗番茄褐色皱果病毒的植物品种。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种番茄Tm-22抗病蛋白突变体及其在防治ToBRFV中的应用。本发明利用随机突变的方法对抗病基因Tm-22进行人工进化，从大量人工突变体中筛选出一个能够抗ToBRFV的番茄Tm-22抗病蛋白突变体，为抗ToBRFV的植物品种的培育提供新的抗病基因来源。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种番茄Tm-22抗病蛋白突变体，所述番茄Tm-22抗病蛋白突变体是将将番茄Tm-22基因编码蛋白的第354位氨基酸进行突变。
优选的，所述番茄Tm-22抗病蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的番茄Tm-22抗病蛋白突变体是将番茄Tm-22基因编码蛋白的第354位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为甲硫氨酸(M)。
进一步的，本发明的番茄Tm-22抗病蛋白突变体还包括将番茄Tm-22基因编码蛋白的第354位氨基酸突变为除甲硫氨酸(M)以外的其他突变方向，例如：将番茄Tm-22基因编码蛋白的第354位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、脯氨酸(P)、甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、酪氨酸(Y)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、色氨酸(W)、组氨酸(H)、苏氨酸(T)、苯丙氨酸(F)、半胱氨酸(C)、天冬酰胺(N)或谷氨酰胺(Q)，只要突变后的番茄Tm-22抗病蛋白突变体具有抗ToBRFV活性，均属于本发明的保护范围。
本发明的第二方面，提供上述番茄Tm-22抗病蛋白突变体的编码基因。
作为优选，所述编码基因为如下i)或ii)所示的核酸分子：
i)核苷酸序列是SEQ ID NO.1所示的核酸分子；
ii)除i)以外的编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核酸分子。
本发明的第三方面，提供包含上述编码基因的重组表达载体或工程菌。
本发明的第四方面，提供上述番茄Tm-22抗病蛋白突变体在如下(1)或(2)中的应用：
(1)防治番茄褐色皱果病毒；
(2)制备防治番茄褐色皱果病毒的产品。
本发明的第五方面，提供上述番茄Tm-22抗病蛋白突变体的编码基因或者包含上述编码基因的重组表达载体或工程菌在如下(1)或(2)中的应用：
(1)防治番茄褐色皱果病毒；
(2)培育抗番茄褐色皱果病毒的植物品种。
优选的，所述植物品种为番茄、烟草或辣椒。
本发明的第六方面，提供一种提高番茄植物对ToBRFV抗性的方法，包括以下步骤：
将番茄植物Tm-22基因的编码区序列中，第1062位核苷酸由A突变为G；
或者，向番茄植物中外源转入番茄Tm-22抗病蛋白突变体的编码基因。
本发明的第七方面，提供一种培育抗ToBRFV的番茄品种的方法，包括以下步骤：
(1)将含有番茄Tm-22抗病蛋白突变体编码基因的番茄植株进行自交或者与另一番茄植株进行杂交，以获得下一代种群；
(2)从下一代种群中选择含有番茄Tm-22抗病蛋白突变体编码基因的番茄植株，当所述番茄Tm-22抗病蛋白突变体编码基因纯合的存在时，所述番茄植株对ToBRFV具有抗性。
本发明的有益效果：
本发明首次发现，将番茄Tm-22基因的编码区序列中，第1062位核苷酸由A突变为G；或者，将番茄Tm-22基因编码蛋白的第354位氨基酸由异亮氨酸突变为甲硫氨酸，能够显著降低ToBRFV衣壳蛋白(CP)的积累，可作为新的ToBRFV抗性基因，对于ToBRFV的防治具有十分重要的意义。而且，本发明所获得的番茄Tm-22抗病蛋白突变体在实现对ToBRFV抗性的同时，还能保持原有的对TMV、ToMV和番茄斑驳花叶病毒(tomato mottle mosaic virus，ToMMV)的抗性，对于植物抗病品种的选育提供了新的抗病基因来源。
附图说明
图1：Tm-22与Tm-22-Mut2核苷酸序列比对图。
图2：Tm-22与Tm-22-Mut2氨基酸序列比对图。
图3：Tm-22-Mut2与ToBRFV MP以及TMV、ToMV和ToMMV MP反应引发细胞坏死；图中，A：与野生型Tm-22相比，Tm-22-Mut2可与ToBRFV MP产生过敏性坏死反应；B：Tm-22-Mut2也可以识别TMV、ToMV和ToMMV的MP。
图4：Tm-22-Mut2显著降低ToBRFV以及TMV、ToMV和ToMMV的积累。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如前所述，抗病基因Tm-22基可有效抵抗烟草花叶病毒属病毒TMV、ToMV和ToMMV的侵染，但不抗ToBRFV，因此发现新的抗性资源对于防控ToBRFV是十分紧急的。
Tm-22基因的ORF全长2586bp，编码有861个氨基酸，由于其编码蛋白的氨基酸序列长度较长，不同位点的氨基酸突变对Tm-22基因功能的影响具有不可预期性，因此，对Tm-22抗病基因进行改造的难度较大。
发明人长期致力于植物抗病毒的研究，在前期研究中，发明人通过易错PCR构建Tm-22基因突变体库，然后将构建的Tm-22突变体质粒与表达ToBRFV MP的pCamToBRFV-MP质粒共表达，筛选引发细胞坏死的突变体质粒，结果从1200个Tm-22突变体质粒中筛选到一个抗ToBRFV的突变体pFGCTm-22-Mut1，测序发现该突变体存在3个核苷酸突变。
为挖掘更多的能够抗ToBRFV的Tm-22基因突变体，本发明进一步通过易错PCR构建了新的Tm-22基因突变体库，然后从1800个Tm-22突变体质粒中筛选到一个抗ToBRFV的突变体质粒，将其命名为pFGCTm-22-Mut2。
对突变体质粒pFGCTm-22-Mut2进行了测序，pFGCTm-22-Mut2中Tm-22基因的编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：
atggctgaaattcttcttacatcagtaatcaataaatctgtagaaatagctggaaatttactgattcaagaaggaaagcgtttatattggttgaaagaggatatcgattggctccagagagaaatgagacacattcgatcttatgttgacaacgcaaaggccaaggaagctggaggtgattcaagggtcaaaaacttattgaaagatattcaagaattggcaggtgatgtggaggatctcttagatgacttccttccaaaaattcaacaatccaataagttcaattattgccttaagaggagttcttttgcagatgagtttgctatggagattgagaagataaagagaagggttgttgacattgaccgaataaggaaaacttacaacatcatagatacagataacaataatgatgattgtgttctgctggatcggagaagattattcctacatgctgatgaaacagagatcatcggtttggatgatgacttcaatatgctacaagccaaattacttaatcaagatttgcattatggagttgtttccatagttggcatgcccggtctggggaaaacaactcttgccaagaaactttataggctcattcgtgatcaatttgagtgttctggactggtctacgtttcacaacagccaagagcgagtgaaatcttacttgacattgccaaacaaattggactgacggaacagaaaatgaaggaaaatttggaggacaacctgcgatcactcttgaaaataaaaaggtatgttatcctcctagatgacatttgggatgtggaaatttgggatgatctgaaacttgtccttcctgaatgtgattcaaaagtcggcagtagaatgataatcacgtctcgaaatagtaatgtaggcagatacataggaggggaatcctccctccatgcattgcaacccctagaatccgagaaaagctttgaactctttaccaagaaaatctttaattttgatgataataatagttgggccaatgcttcacctgacttggtgaatattggtagaaatatagttgggagatgtggaggtatgccgctagccatagtggtgactgcaggcatgttaagggcaagagaaagaacagaacatgcgtggaacagagtacttgagagtatgggccataaagttcaagatggatgtgctaaggtattggctctcagttacaatgatttacctattgcctcaaggccatgtttcttgtactttggcctttaccccgaggaccatgaaattcgtgcttttgatttgataaatatgtggattgctgagaagtttatagtagtaaatagtggtaataggcgagaggctgaggatttggcggaggacgtcctaaatgatttggtttctagaaacttgattcaacttgccaaaaggacatataatggaagaatttcaagttgtcgcatacatgacttgttacatagtttgtgtgtggacttggctaaggaaagtaacttctttcacaccgcgcatgatgcatttggtgatcccggcaatgttgctaggctccgaaggattacattctactctgacaatgtcatgattgagttcttccgttcaaatcctaagcttgagaagcttcgtgtacttttctgtttcgcaaaagacccttccatattttctcatatggcttattttgacttcaaattgttgcacacattggttgtagtcatgtctcaaagttttcaagcatatgtcactatcccaagcaaatttgggaacatgacttgcttacgctatctgagattggaggggaatatttgtggaaaactgccaaatagtattgtcaagctcacacgtctagagaccatagacattgatcgacgtagcctcattcaacctccttctggtgtttgggagtctaaacatttgagacatctttgttatagagattatggacaagcatgtaacagttgcttttctataagctcattttacccaaatatttactcattgcatcctaacaatctacaaaccttgatgtggatacctgataaattttttgaaccgaggttgttgcaccgattgatcaatttaagaaaactgggtatactgggagtgtccaattctaccgttaagatgttatcaatatttagccctgtgcttaaggcgctggaggttctgaagctcagtttttccagtgacccgagtgaacaaataaagttgtcatcgtatccacatattgctaagttgcatttgaatgttaacagaacaatggccttgaactctcaatcatttcctccaaatctcatcaagcttactctagcctactttagtgtagaccgttatatactggcagtacttaagacatttcccaaattaagaaaacttaaaatgttcatctgcaagtataatgaagaaaagatggatctctcgggcgaggcaaatggttatagctttccgcaacttgaagttttgcatattcatagcccgaatgggttgtctgaagtaacgtgcacggatgatgtcagtatgcccaaattgaaaaagctgttacttacaggattccattgccgaatcagtttatcggaacggcttaaaaagctgagtaaatga。
其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体如下：
MAEILLTSVINKSVEIAGNLLIQEGKRLYWLKEDIDWLQREMRHIRSYVDNAKAKEAGGDSRVKNLL
KDIQELAGDVEDLLDDFLPKIQQSNKFNYCLKRSSFADEFAMEIEKIKRRVVDIDRIRKTYNIIDTDNN
NDDCVLLDRRRLFLHADETEIIGLDDDFNMLQAKLLNQDLHYGVVSIVGMPGLGKTTLAKKLYRLIR
DQFECSGLVYVSQQPRASEILLDIAKQIGLTEQKMKENLEDNLRSLLKIKRYVILLDDIWDVEIWDDLK
LVLPECDSKVGSRMIITSRNSNVGRYIGGESSLHALQPLESEKSFELFTKKIFNFDDNNSWANASPDLV
NIGRNIVGRCGGMPLAIVVTAGMLRARERTEHAWNRVLESMGHKVQDGCAKVLALSYNDLPIASRP
CFLYFGLYPEDHEIRAFDLINMWIAEKFIVVNSGNRREAEDLAEDVLNDLVSRNLIQLAKRTYNGRISS
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QSFPPNLIKLTLAYFSVDRYILAVLKTFPKLRKLKMFICKYNEEKMDLSGEANGYSFPQLEVLHIHSPNGLSEVTCTDDVSMPKLKKLLLTGFHCRISLSERLKKLSK*
与NCBI中登录号为：AF536201.1的Tm-22基因序列进行比较，发现Tm-22-Mut2的编码区发生1个核苷酸突变，突变分别为A1062G，对应的氨基酸突变为I354M。
将突变体质粒pFGCTm-22-Mut2与ToBRFV共表达，发现Tm-22-Mut2能够显著降低ToBRFV衣壳蛋白(CP)的积累，且不影响降低TMV、ToMV和ToMMV CP的积累。与前期研究筛选得到的突变体pFGCTm-22-Mut1相比，其对于ToBRFV、TMV、ToMV和ToMMV的抗性均有进一步的提高。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。本发明中所使用的Tm-22基因在NCBI中的登录号为：AF536201.1。本发明中所使用的ToBRFV-SD分离物在NCBI中登录号为MT018320；TMV在NCBI中登录号为MH595920；ToMMV在NCBI中登录号为MW37351；ToMV在GenBank中的登录号为KY967221.1。
实施例1：Tm-22基因突变体库的构建及筛选
1、Tm-22基因突变体库的构建：
利用易错PCR构建Tm-22基因突变体库，具体如下：
首先配置50μL的反应体系，其中包含：缓冲液15μL、易错专用2.5mM dNTP 5μL、10μM正向引物(5’-ttacaattaccatggatggctgaaattcttcttacatc-3’，SEQ ID NO.3)1μL、10μM反向引物(5’-actcacctaggatcctcatttactcagctttttaagccg-3’，SEQ ID NO.4)1μL、20mMMnCl22.5μL、5U/μL DNA聚合酶0.3μL、30ng/μL模板(野生型质粒pFGCTm-22)0.5μL、双蒸水24.7μL。
随后进行反应，反应程序：94℃预变性2min，94℃变性15s、55℃退火8s、72℃延伸2min 35s、35个循环，72℃后延伸2min。将扩增的片段通过同源重组的方法克隆到双元表达载体pFGC5941，随后转入大肠杆菌DH5α感受态，从中提取质粒，筛选质粒大小正确的质粒，共获得1800个Tm-22突变体质粒。
2、筛选与ToBRFV MP反应产生过敏性细胞坏死的Tm-22突变体
利用普通PCR在侵染性克隆pCBToBRFV(侵染性克隆pCBToBRFV的构建参考文献YanZY,Ma HY,Wang L,Tettey C,Zhao MS,Geng C,Tian YP,and Li XD.Identification ofgenetic determinants of tomato brown rugose fruit virus that enable infectionof plants harbouring the Tm-22resistance gene.Molecular Plant Pathology.2021,11,(22):1347–1357)中扩增MP，将扩增的产物通过同源重组的方法克隆到pCam-35S双元表达载体35S启动子和NOS终止子之间，获得pCamToBRFV-MP。MP的序列为ToBRFV-SD分离物(NCBI中登录号为MT018320)编码的序列。其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
将获得的1800个Tm-22突变体质粒和表达ToBRFV MP的pCamToBRFV-MP质粒分别转入农杆菌GV3101感受态。将携带Tm-22突变体质粒的农杆菌和pCamToBRFV-MP的农杆菌的OD600调整到0.5，然后将二者按照1：1体积比混合。将混合的农杆菌注射到本氏烟叶片中，接种2天后，观察接种区域叶片坏死情况。
结果发现，获得的1800个Tm-22突变体质粒中只有1个突变体Tm-22-Mut2可以与ToBRFV MP反应诱发细胞坏死。将引发细胞坏死的突变体质粒pFGCTm-22-Mut2进行测序。测序结果显示，pFGCTm-22-Mut2发生1个核苷酸突变，突变分别为A1062G(图1)，对应的氨基酸突变为I354M(图2)。
实施例2：Tm-22基因突变体对ToBRFV的抗性研究
1、Tm-22-Mut2突变体质粒的构建：
采用下述引物通过定向突变的方法扩增得到Tm-22基因第1062位核苷酸突变的扩增片段。
引物对1-Tm-22-A1062G-F:gccgctagccatagtggtgactgcaggcatgttaag；(SEQ IDNO.7)
引物对1-Tm-22-A1062G-R:actatggctagcggcatacctccacatctcccaactata。(SEQID NO.8)
首先配置50μL的突变PCR反应体系，其中包含：缓冲液25μL、10mM dNTP 1μL、10μM正向引物1μL、10μM反向引物1μL、1U/μL DNA高保真聚合酶1μL、30ng/μLpFGCTm-22 0.5μL、双蒸水20.5μL。
随后进行突变PCR反应，反应程序：95℃预变性3min，95℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸2min 35s、15个循环，48℃退火30s，72℃后延伸5min。将扩增的产物转入大肠杆菌DH5α感受态，从中提取质粒，筛选质粒大小正确的质粒，构建得到单位点突变质粒(Tm-22-Mut2突变体质粒)。
2、Tm-22-Mut2突变体质粒与ToBRFV MP共表达试验：
将pFGCTm-22和pFGCTm-22-Mut2分别与TMV和ToBRFV MP共表达。具体为：将携带Tm-22突变体质粒(或pFGCTm-22)的农杆菌和pCamToBRFV-MP的农杆菌的OD600调整到0.5，然后将二者按照1：1体积比混合。将混合的农杆菌注射到本氏烟叶片中，接种2天后，观察接种区域叶片坏死情况。
采用上述同样的方法，将获得的pFGCTm-22-Mut2分别和表达TMV MP、ToMV MP、ToMMV MP的质粒进行共表达。
表型观察结果显示Tm-22可与TMV MP反应诱导细胞坏死，但不与ToBRFV MP反应；Tm-22-Mut2不仅与TMV MP反应，还与ToBRFV MP反应诱导细胞坏死(图3A)。另外，共表达实验结果表明，Tm-22-Mut2也可与ToMV和ToMMV MP反应诱导细胞坏死(图3B)。以上结果说明，Tm-22-Mut2可以介导对ToBRFV的抗性，同时保留了对TMV、ToMV和ToMMV的抗性。
3、Tm-22-Mut2突变体质粒与ToBRFV共表达试验：
将获得的pFGCTm-22-Mut2、空载体pFGC5941和侵染性克隆pCBToBRFV分别转入农杆菌GV3101感受态。将携带pFGCTm-22-Mut2的农杆菌、pFGC5941的农杆菌和pCBToBRFV的农杆菌的OD600调整到0.5，然后将携带pFGCTm-22-Mut2的农杆菌和pFGC5941的农杆菌分别与携带pCBToBRFV的农杆菌按照1：1体积比混合。将混合的农杆菌注射到本氏烟叶片中，接种3天后，提取接种区域叶片总蛋白。利用Western blot检测衣壳蛋白(coat protein，CP)的积累量。
采用上述同样的方法，将pFGCTm-22-Mut2、空载体pFGC5941分别和TMV、ToMV、ToMMV的侵染性克隆进行共表达，其中，TMV侵染性克隆的构建参考文献Yan ZY,MaHY,WangL,Tettey C,Zhao MS,Geng C,Tian YP,and Li XD.Identification of ge neticdeterminants of tomato brown rugose fruit virus that enable infection ofplants har bouring the Tm-22resistance gene.Molecular Plant Pathology.2021,11,(22):1347–1357；ToMV侵染性克隆的构建是利用引物PCB301-ToMV-F：TTTCATTTGGAGAGGGTATT TATTATTACAACAATTACC(SEQ ID NO.9)，PCB301-ToMV-R：GATATAAGTACAG ACTGGGCCCCTACCGGGGGTTCCGG(SEQ ID NO.10)扩增ToMV全长，克隆到双元表达载体pCB301的35S启动子和NOS终止子之间；ToMMV侵染性克隆的构建是参考文献Tettey Carlos,Yan,ZY,Ma,HY,Zhao MS,Geng C,Tian YP,Li XD.Tomato mottlemosaicvirus:characterization,resistance gene effectiveness,and quintuplex RT-PCRdet ection system.Journal of Integrative Agriculture.2022,21,(9):2641-2651。利用Westernblot检测衣壳蛋白(coat protein，CP)的积累量。
结果如图4所示，结果表明：与对照(空载体pFGC5941)相比，Tm-22-Mut2能够显著降低ToBRFV衣壳蛋白(CP)的积累。另外，共表达实验结果表明，Tm-22-Mut2也可显著降低TMV、ToMV和ToMMV CP的积累。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种番茄Tm-22抗病蛋白突变体，其特征在于，所述番茄Tm-22抗病蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述的番茄Tm-22抗病蛋白突变体的编码基因。
3.包含权利要求2所述编码基因的重组表达载体或工程菌。
4.权利要求1所述的番茄Tm-22抗病蛋白突变体在如下(1)或(2)中的应用：
(1)防治植物番茄褐色皱果病毒病；
(2)制备防治植物番茄褐色皱果病毒病的产品；
所述植物为番茄或烟草。
5.权利要求2所述的番茄Tm-22抗病蛋白突变体的编码基因或者权利要求3所述的重组表达载体或工程菌在如下(1)或(2)中的应用：
(1)防治植物番茄褐色皱果病毒病；
(2)培育抗番茄褐色皱果病毒的植物品种；
所述植物为番茄或烟草。
6.一种提高番茄植物对ToBRFV抗性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将番茄Tm-22基因的编码区序列中第1062位核苷酸由A突变为G，从而编码如SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列；
或者，向番茄植物中外源转入权利要求2所述的番茄Tm-22抗病蛋白突变体的编码基因。
7.一种培育抗ToBRFV的番茄品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将含有权利要求2所述的番茄Tm-22抗病蛋白突变体编码基因的番茄植株进行自交或者与另一番茄植株进行杂交，以获得下一代种群；
(2)从下一代种群中选择含有权利要求2所述的番茄Tm-22抗病蛋白突变体编码基因的番茄植株，当所述番茄Tm-22抗病蛋白突变体编码基因纯合的存在时，所述番茄植株对ToBRFV具有抗性。
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