[go: up one dir, main page]

CN118772066A - 一种微酸环境响应aie荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

一种微酸环境响应aie荧光探针及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN118772066A
CN118772066A CN202410850451.8A CN202410850451A CN118772066A CN 118772066 A CN118772066 A CN 118772066A CN 202410850451 A CN202410850451 A CN 202410850451A CN 118772066 A CN118772066 A CN 118772066A
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
fluorescent probe
tpe
aie
solvent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202410850451.8A
Other languages
English (en)
Inventor
李军波
程秋丽
张盼盼
路斌中
包宇
张磊涛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henan University of Science and Technology
Original Assignee
Henan University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henan University of Science and Technology filed Critical Henan University of Science and Technology
Priority to CN202410850451.8A priority Critical patent/CN118772066A/zh
Publication of CN118772066A publication Critical patent/CN118772066A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings
    • C07D239/24—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D239/28—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D239/46—Two or more oxygen, sulphur or nitrogen atoms
    • C07D239/52—Two oxygen atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/50—Compounds containing any of the groups, X being a hetero atom, Y being any atom
    • C07C311/51—Y being a hydrogen or a carbon atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings
    • C07D239/24—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D239/28—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D239/32—One oxygen, sulfur or nitrogen atom
    • C07D239/42—One nitrogen atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D277/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings
    • C07D277/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings
    • C07D277/20—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D277/32—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D277/38—Nitrogen atoms
    • C07D277/50—Nitrogen atoms bound to hetero atoms
    • C07D277/52—Nitrogen atoms bound to hetero atoms to sulfur atoms, e.g. sulfonamides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1003—Carbocyclic compounds
    • C09K2211/1007—Non-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1029—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing one nitrogen atom as the heteroatom
    • C09K2211/1037—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing one nitrogen atom as the heteroatom with sulfur
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1044—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing two nitrogen atoms as heteroatoms

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明公开一种微酸环境响应AIE荧光探针及其制备方法和应用，包括如下步骤：步骤一：将苯磺酰胺、磺胺醋酰或磺胺多辛溶于一定量的溶剂中，并按照比例加入三乙胺，置于冰水浴搅拌，得到第一溶液；步骤二：将一定量的酰氯固体溶于一定量的溶剂中得到第二溶液，并滴加至步骤一的所述第一溶液中，得到混合溶液；步骤三：待第二溶液滴加完毕后，步骤二所得混合溶液在特定温度下搅拌48‑72 h后，蒸发溶剂后的残余物通过纯化干燥得到荧光探针化合物。本发明通过酰胺化反应将TPE与磺酰胺类化合物结合，成功合成了AIE荧光探针，该探针展现出灵敏的pH响应及优越的AIE效应，能够实现对肿瘤细胞安全有效的选择性荧光成像。

Description

一种微酸环境响应AIE荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种微酸环境响应AIE荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
生物成像是生物医学研究中的一个强有力的工具，在疾病的早期诊断和治疗以及基础药物的开发中具有重要意义。生物成像技术包括磁共振成像、X射线计算机层析成像、荧光成像、放射性核素成像和光声断层扫描等。荧光成像具有操作简单、响应速度快和高选择性等优点，已经成为不可或缺的生物成像工具。在过去的几十年里，各种光学试剂如荧光蛋白、量子点(QDs)、常规有机染料广泛应用于荧光成像领域。但存在着一些问题，例如量子点中存在重金属离子可能会造成一定的细胞毒性，以及复杂而耗时的荧光蛋白转染程序。
有机荧光材料因具有价格低廉、毒性小、操作简单、结构易调、高信噪比、光稳定性好、优异的荧光量子产率、更深的组织穿透力和更高的空间分辨率等优点，在光电子器件、检测、生物成像和生物治疗等领域具有良好的应用前景，已成为微观生物学和病理学研究的强大工具。然而，传统的有机荧光分子大多具有平面共轭结构，在聚集态时容易发生π-π堆积，在激发态时能量损失严重导致发光性能较差，会出现聚集诱导猝灭(ACQ)问题。尽管许多类型的荧光团已经商业化应用在生物成像方面，由于其光稳定性较差、聚集引起的猝灭效应(ACQ)以及复杂的荧光团合成阻碍了荧光团进一步发展。
近年来，具有酸响应的AIE荧光探针为避免ACQ问题提供了有效策略，一种新型的聚集诱导发光(AIE)特性的小分子荧光探针有效地克服了传统荧光染料的缺陷。AIE荧光探针具有众多优势，如在聚集状态下亮度优异、斯托克斯位移偏移大、良好的光稳定性和高信噪比等方面，可以灵敏地响应肿瘤微环境特征用于肿瘤组织成像。将酸性微环境与可电离的化学基团相结合，通过质子化或去质子化响应环境pH变化。但是常用的可电离基团，如羧酸和叔氨基团，在pH 5.0-6.5的范围内进行质子化或去质子化，低于酸性TME的pH(pH≈6.2-6.9)，无法应用于肿瘤微环境。荧光探针虽然有一定的优势，但存在响应范围宽、缺乏明确的pH转变点、无法利用肿瘤微酸环境的差异准确区分正常组织和肿瘤组织等问题。
现有技术一(CN117586205A)公开了一种靶向溶酶体pH荧光探针及其制备方法和应用，以1,4-环己二酮-2,5-二甲酸二甲酯为骨架，通过与吗啉基团之间的质子化，形成对酸碱敏感的pH荧光探针，该探针可实现固液双高效发光，具有较高的荧光量子产率，随着pH的增加荧光强度逐渐减弱，具有较好的抗干扰能力和抗光漂白性，细胞毒性较低，细胞成像实验证明，该探针能有效的定位于溶酶体中，并能检测溶酶体及斑马鱼内不同pH值的变化。但该pH荧光探针没有明确的pH转变点，虽然可以靶向溶酶体，但无法有效区分正常细胞和肿瘤细胞，应用前景受限。
现有技术二(CN117777018A)公开了一种双通道检测粘度和pH的荧光探针及其制备方法和应用，在生物细胞体系中粘度和pH选择性动态可视化检测以及制备肿瘤细胞成像检测制剂中的应用。本发明制备的荧光探针具有特异性强、选择性好、光稳定性好、线粒体和溶酶体双靶向能力优异等特点。但该双通道检测粘度和pH的荧光探针合成步骤较为繁琐且条件较为苛刻。
因此结合以上分析，相关现有技术中AIE荧光探针仍然存在如下缺陷有待改进：其一、对AIE分子进行基团修饰后的荧光探针，难以实现在肿瘤酸性部位响应聚集，而是表现出碱性聚集、酸性分散的特点，且在在正常生理环境pH 7.4时其荧光强度较弱且远达不到满足细胞成像需求。其原因是：单一的简便的基团修饰无法有效调控四苯乙烯(TPE)的分子内旋转过程，导致无法获得理想的pH转变点及转变区间。其二、利用近红外激发，超声，蛋白标记等条件开发的荧光探针，虽然能够实现肿瘤细胞成像的过程，但响应范围较宽，且缺乏明确的pH转变点，制备流程较为繁琐，对人体造成不可逆损伤。其原因是：同时引入多种性能使荧光探针的制备过程变得复杂，需借助外界较为强烈的刺激达到活体成像的目的。
因此，针对现有相关技术中荧光成像技术信噪比低、细胞毒性高和聚集诱导猝灭现象等不足，需要研发一种响应于肿瘤酸性微环境的AIE荧光探针，从而解决肿瘤部位成像灵敏度低等难题，以实现pH响应的荧光成像效果，为靶向肿瘤酸性微环境提供一种有效方法。
发明内容
为至少解决上述问题之一，本发明提供一种微酸环境响应AIE荧光探针及其制备方法和应用。本方案所制备的小分子荧光探针通过微酸pH响应基团设计，提升其在肿瘤成像中的检测灵敏度。当荧光探针到达肿瘤部位时，在肿瘤微酸环境中，导致酰胺键质子化，整体呈电中性。聚集状态下在细胞内发出明亮荧光，实现对肿瘤细胞安全有效的选择性荧光成像。
本发明的目的之一是提供一种微酸环境响应AIE荧光探针，其结构通式为：
其中，R选自 中的一种。
作为优选方案，所述荧光探针的结构式为：
本发明的目的之二是提供一种微酸环境响应AIE荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、将磺胺类化合物溶于一定量的溶剂中，并按照比例加入三乙胺，置于冰水浴搅拌10-30min，得到第一溶液；
步骤二、将一定量的酰氯固体溶于一定量的溶剂中得到第二溶液，并将第二溶液滴加至步骤一所配制得到的第一溶液中，从而制备混合溶液；
步骤三、待第二溶液滴加完毕后，步骤二所制备得到的混合溶液在一定反应温度下搅拌48-72h，并将反应完成的混合溶液蒸发溶剂后的残余物通过纯化干燥得到荧光探针化合物。
作为优选方案，步骤二中，所述酰氯固体的制备方法如下：将1,1,2,2-四(4-羧基苯)乙烯按照比例溶于二氯亚砜中；并将所得溶液在回流温度下反应24-48h；待反应结束后，将反应液冷却至室温，然后除去溶剂得到固体酰氯。
作为优选方案，每1g1,1,2,2-四(4-羧基苯)乙烯投加在70-100mL的二氯亚砜中。
作为优选方案，1,1,2,2-四(4-羧基苯)乙烯：磺胺类化合物：三乙胺的摩尔比范围为1:4-8:8-12，所述磺胺类化合物选自苯磺酰胺、磺胺醋酰或磺胺多辛中的一种；优选的，磺胺类化合物采用磺胺多辛，1,1,2,2-四(4-羧基苯)乙烯：磺胺多辛：三乙胺的摩尔比范围为1:4-8:8-12。
作为优选方案，所述步骤三中，所述反应温度为25-50℃。
作为优选方案，包括如下步骤：
步骤一、将磺胺多辛溶于一定量的四氢呋喃中，并按照比例加入三乙胺，置于冰水浴搅拌10-30min，得到第一溶液；
步骤二、将一定量的酰氯固体溶于一定量的四氢呋喃中得到第二溶液，并将第二溶液滴加至步骤一所配制得到的第一溶液中，从而制备混合溶液；
步骤三、待第二溶液滴加完毕后，步骤二所制备得到的混合溶液在50℃下搅拌48-72h，并将反应完成的混合溶液蒸发溶剂后的残余物通过硅胶柱层析进行纯化干燥得到荧光探针化合物TPE-SDOX。
本发明的目的之三是提供一种微酸环境响应AIE荧光探针的在肿瘤细胞成像中的应用。
作为优选方案，所述小分子荧光探针与肿瘤细胞采用共培养的方式，优选的，所述小分子荧光探针采用TPE-SDOX。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果之一：
其一、本方案的荧光探针展现出良好的生物安全性和较低毒副作用，能够靶向肿瘤酸性微环境进行细胞荧光成像，并具有优异的细胞渗透摄取能力，为靶向肿瘤酸性微环境提供了一种有效的荧光探针化合物。本方案的荧光探针化合物利用磺胺类衍生物在生理范围内的不同的pKa，通过小分子荧光探针化合物的酰胺基团在不同pH环境中质子化和去质子化的过程，实现荧光探针响应肿瘤酸性微环境进行活细胞荧光成像的过程，并成功将pH转变点调整至肿瘤酸性微环境。
其二、本方案优化了荧光探针化合物制备工艺，选择四苯乙烯作为AIE转子，制备了一种具有响应肿瘤酸性微环境的AIE荧光探针，以1,1,2,2-四(4-羧基苯)乙烯(H4TCPE)为代表的AIE分子，通过与磺胺类分子发生酰胺化反应，能够成功制备酸响应的AIE小分子荧光探针，四苯乙烯-苯磺酰胺(TPE-SA)、四苯乙烯-磺胺醋酰(TPE-SAC)和四苯乙烯-磺胺多辛(TPE-SDOX)，通过严格控制温度指标和反应时间，减压蒸除溶剂并对残余物进行纯化干燥得到本申请的小分子荧光探针化合物。本方案所制备出的小分子荧光探针通过微酸pH响应基团设计，提升其在肿瘤成像中的检测灵敏度。
其三、本发明制备得到的荧光探针展现出良好的生物安全性和较低毒副作用，能够靶向肿瘤酸性微环境进行细胞荧光成像，并具有优异的细胞渗透摄取能力，为靶向肿瘤酸性微环境提供了一种有效方法，通过荧光探针与肿瘤细胞共培养的方式，调整培养基pH值达到聚集诱导发光成像的效果，具体是在肿瘤微酸环境中，导致酰胺键质子化，整体呈电中性。聚集状态下在细胞内发出明亮荧光，实现对肿瘤细胞安全有效的选择性荧光成像。
附图说明
图1为本发明中H4TCPE的核磁氢谱图；
图2为本发明实施例所制备TPE-SA的核磁氢谱图；
图3为本发明实施例所制备TPE-SAC的核磁氢谱图；
图4为本发明实施例所制备TPE-SDOX的核磁氢谱图；
图5为H4TCPE在含不同体积分数水的DMSO/H2O混合物中的FL光谱图；
图6为H4TCPE在含不同体积分数水的DMSO/H2O混合物中的相对FL强度图；
图7为TPE-SA在含不同体积分数水的DMSO/H2O混合物中的FL光谱图；
图8为TPE-SA在含不同体积分数水的DMSO/H2O混合物中的相对FL强度图；
图9为TPE-SAC在含不同体积分数水的DMSO/H2O混合物中的FL光谱图；
图10为TPE-SAC在含不同体积分数水的DMSO/H2O混合物中的相对FL强度图；
图11为TPE-SDOX在含不同体积分数水的DMSO/H2O混合物中的FL光谱图；
图12为TPE-SDOX在含不同体积分数水的DMSO/H2O混合物中的相对FL强度图；
图13为不同pH值缓冲液的H4TCPE的荧光光谱；
图14为H4TCPE荧光强度随pH值变化图；
图15为H4TCPE在不同pH缓冲液中的荧光特性。
图16为不同pH值缓冲液的TPE-SA的荧光光谱；
图17为TPE-SA荧光强度随pH值变化图；
图18为TPE-SA在不同pH缓冲液中的荧光特性；
图19为不同pH值缓冲液的TPE-SAC的荧光光谱；
图20为TPE-SAC荧光强度随pH值变化图；
图21为TPE-SAC在不同pH缓冲液中的荧光特性；
图22为不同pH值缓冲液的TPE-SDOX的荧光光谱；
图23为TPE-SDOX荧光强度随pH值变化图；
图24为TPE-SDOX在不同pH缓冲液中的荧光特性；
图25为将H4TCPE母液与pH为4.96的PBS缓冲液、DMEM溶液分别混合配制成含水量98％的溶液；根据最大荧光发射强度所绘制的荧光强度与时间的关系图；
图26为将TPE-SA母液与pH为5.75的PBS缓冲液、DMEM溶液分别混合配制成含水量98％的溶液；根据最大荧光发射强度绘制荧光强度与时间的关系图；
图27为将TPE-SAC与pH为6.27的PBS缓冲液、DMEM溶液分别混合配制成含水量98％的溶液；根据最大荧光发射强度绘制荧光强度与时间的关系图；
图28为将TPE-SDOX与pH为6.7的PBS缓冲液、DMEM溶液分别混合配制成含水量98％的溶液；根据最大荧光发射强度绘制荧光强度与时间的关系图；
图29为H4TCPE母液在pH4.0和5.5之间根据最大荧光发射强度绘制荧光强度与循环次数的关系图；
图30为TPE-SA母液在pH5.0和6.0之间根据最大荧光发射强度绘制荧光强度与循环次数的关系图；
图31为TPE-SAC母液在pH5.5和6.5之间根据最大荧光发射强度绘制荧光强度与循环次数的关系图；
图32为TPE-SDOX母液在pH6.5和7.4之间根据最大荧光发射强度绘制荧光强度与循环次数的关系图；
图33为不同浓度小分子荧光探针对L02细胞毒性的影响图；
图34为不同浓度小分子荧光探针对HepG2细胞毒性的影响图；
图35为H4TCPE处理后HepG2和L02细胞的荧光图像；比例尺：20μm；
图36为TPE-SDOX处理后HepG2和L02细胞的荧光图像；比例尺：20μm。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的以及有益效果易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
另外，为了更好说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节，本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施，在另外一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
本发明提供一种AIE荧光探针及其微酸环境响应AIE荧光探针的制备方法，包括如下步骤：步骤一、将磺胺类化合物溶于一定量的无水四氢呋喃中，并按照比例加入三乙胺，置于冰水浴搅拌10-30min，得到第一溶液；步骤二、将一定量的酰氯固体溶于一定量的无水四氢呋喃中得到第二溶液，并将第二溶液滴加至步骤一所得的第一溶液中，从而制备混合溶液。本步骤二中所用的酰氯固体的制备方法如下：将1,1,2,2-四(4-羧基苯)乙烯溶于SOCl2，其中每1g1,1,2,2-四(4-羧基苯)乙烯投加在70-100mL的二氯亚砜(SOCl2)中，在回流温度下反应24-48h进行活化；待活化反应结束后，冷却至室温，减压蒸发除去溶剂得到固体酰氯；步骤三、待第二溶液滴加完毕后，将步骤二所制备得到的混合溶液在25-50℃下搅拌48-72h后，蒸发溶剂后的残余物通过硅胶柱层析进行纯化干燥得到对应的荧光探针化合物。
其中，上述步骤中的1,1,2,2-四(4-羧基苯)乙烯：磺胺类化合物：三乙胺的摩尔比范围为1:4-8:8-12，所述磺胺类化合物选自苯磺酰胺、磺胺醋酰或磺胺多辛中的一种；优选的，磺胺类化合物采用磺胺多辛。
本发明，磺胺类化合物采用苯磺酰胺，步骤三中所得产物，在减压蒸发溶剂后，残余物通过硅胶柱层析(DCM∶MeOH＝5∶1)进行纯化干燥得到TPE-SA。
本发明，磺胺类化合物为磺胺醋酰，步骤三中所得产物，在减压蒸发溶剂后，残余物通过硅胶柱层析(DCM∶MeOH＝5∶1)进行纯化干燥得到TPE-SAC。
优选的，磺胺类化合物为磺胺多辛，步骤三中所得产物，在减压蒸发溶剂后，残余物通过硅胶柱层析(EtOAc：DCM＝10:1)进行纯化干燥得到TPE-SDOX。
优选的，荧光探针溶液的工作浓度为：将TPE分子与磺胺类化合物合成的荧光探针，以20μM的浓度溶解在DMSO中。
实施例1
将1,1,2,2-四(4-羧基苯)乙烯(0.1g,0.196mmol)溶于SOCl2(8mL)在回流温度下反应48h，冷却至室温，减压蒸发除去溶剂得到固体酰氯。
实施例2
将1,1,2,2-四(4-羧基苯)乙烯(0.1g,0.196mmol)溶于SOCl2(10mL)在回流温度下反应24h，冷却至室温，减压蒸发除去溶剂得到固体酰氯。
实施例3
将1,1,2,2-四(4-羧基苯)乙烯(0.1g,0.196mmol)溶于SOCl2(7mL)在回流温度下反应48h，冷却至室温，减压蒸发除去溶剂得到固体酰氯。
其中，实施例1-3的反应方程式如下：
实施例4
将1,1,2,2-四(4-羧基苯)乙烯(0.1g,0.196mmol)溶于SOCl2(8mL)在回流温度(80℃)条件下反应48h。冷却至室温，减压蒸发除去溶剂得到固体酰氯。将磺胺多辛(0.366g,1.176mmol)溶于无水四氢呋喃(3mL)，并加入三乙胺(0.218mL,1.568mmol)得到第一溶液，将所得第一溶液置于冰水浴搅拌30min。将前述制备所得固体酰氯全部溶于3mL无水四氢呋喃后得到第二溶液，将所得到第二溶液逐滴滴加至上述所得第一溶液中得到混合溶液。混合溶液在50℃下搅拌72h后减压蒸发溶剂。随后，蒸除溶剂后的残余物通过硅胶柱层析(EtOAc：DCM＝10:1)进行纯化干燥得到TPE-SDOX，产物质量为0.257g，产物产率为77.85％，产物纯度为85.26％。
实施例5
将1,1,2,2-四(4-羧基苯)乙烯(0.1g,0.196mmol)溶于SOCl2(8mL)在回流温度(80℃)下反应48h。冷却至室温，减压蒸发除去溶剂得到固体酰氯。将磺胺多辛(0.244g,0.784mmol)溶于无水四氢呋喃(3mL)，并加入三乙胺(0.272mL,1.96mmol)得到第一溶液，将所得第一溶液置于冰水浴搅拌30min。将前述制备所得固体酰氯全部溶于3mL无水四氢呋喃后得到第二溶液，将所得到第二溶液逐滴滴加至上述所得第一溶液中得到混合溶液。混合溶液在50℃下搅拌60h后减压蒸发溶剂。随后，蒸除溶剂后的残余物通过硅胶柱层析(EtOAc：DCM＝10:1)进行纯化干燥得到TPE-SDOX，产物质量为0.2214g，产物产率为67.07％，产物纯度为80.26％。
实施例6
将1,1,2,2-四(4-羧基苯)乙烯(0.1g,0.196mmol)溶于SOCl2(8mL)在回流温度下反应48h。冷却至室温，减压蒸发除去溶剂得到固体酰氯。将磺胺多辛(0.366g,1.176mmol)溶于无水四氢呋喃(3mL)，并加入三乙胺(0.218mL,1.568mmol)得到第一溶液，将所得第一溶液置于冰水浴搅拌30min。将前述制备所得固体酰氯全部溶于3mL无水四氢呋喃后得到第二溶液，将所得到第二溶液逐滴滴加至上述所得第一溶液中得到混合溶液。混合溶液在50℃下搅拌48h后减压蒸发溶剂。随后，蒸除溶剂后的残余物通过硅胶柱层析(EtOAc：DCM＝10:1)进行纯化干燥得到TPE-SDOX，产物质量为0.269g，产物产率为81.49％，产物纯度为89.6％。
实施例7
将1,1,2,2-四(4-羧基苯)乙烯(0.1g,0.196mmol)溶于SOCl2(8mL)在回流温度下反应48h。冷却至室温，减压蒸发除去溶剂得到固体酰氯。将磺胺多辛(0.488g,1.568mmol)溶于无水四氢呋喃(3mL)，并加入三乙胺(0.327mL,2.352mmol)得到第一溶液，置于冰水浴搅拌30min。将所得固体酰氯全部溶于3mL无水四氢呋喃后得到第二溶液，将所得到第二溶液逐滴滴加至上述第一溶液中得到混合溶液。混合溶液在50℃下搅拌72h后减压蒸发溶剂。随后，蒸除溶剂后的残余物通过硅胶柱层析(EtOAc：DCM＝10:1)进行纯化干燥得到TPE-SDOX，产物质量为0.249g，产物产率为75.4％，产物纯度为87.9％。
其中，实施例4-7的反应式如下：
图4为实施例7中所制备TPE-SDOX(以氘代二甲基亚砜为溶剂)的核磁氢谱图。
实施例8
将1,1,2,2-四(4-羧基苯)乙烯(0.1g,0.196mmol)溶于SOCl2(8mL)在回流温度下反应48h。冷却至室温，减压蒸发除去溶剂得到固体酰氯。将苯磺酰胺(0.185g,1.176mmol)溶于无水四氢呋喃(3mL)，并加入三乙胺(0.218mL,1.568mmol)得到第一溶液，将所得第一溶液置于冰水浴搅拌30min。将前述制备所得的酰氯固体全部溶于3mL无水四氢呋喃后得到第二溶液，将所得到第二溶液逐滴滴加至上述第一溶液中得到混合溶液。将混合溶液在室温下搅拌72h后减压蒸发溶剂。随后，蒸除溶剂后的残余物通过硅胶柱层析(DCM∶MeOH＝5∶1)进行纯化干燥得到TPE-SA，产物质量为0.165g，产物产率为78.7％，产物纯度为91.6％，其反应方程式如下：
图2为实施例8所制备的TPE-SA(以氘代二甲基亚砜为溶剂)的核磁氢谱图。
实施例9
将1,1,2,2-四(4-羧基苯)乙烯(0.1g,0.196mmol)溶于SOCl2(8mL)在回流温度下反应48h。冷却至室温，减压蒸发除去溶剂得到固体酰氯。将磺胺醋酰(0.253g,1.176mmol)溶于无水四氢呋喃(3mL)，并加入三乙胺(0.218mL,1.568mmol)得到第一溶液，将所得第一溶液置于冰水浴搅拌30min。将上述制备所得固体酰氯全部溶于3mL无水四氢呋喃后得到第二溶液，将所得到第二溶液逐滴滴加至上述第一溶液中得到混合溶液。混合溶液在50℃下搅拌72h后减压蒸发溶剂。随后，蒸除溶剂后的残余物通过硅胶柱层析(DCM：MeOH＝5:1)进行纯化干燥得到TPE-SAC，产物质量0.179g，产物产率为70.3％，产物纯度为86.4％。其反应式如下:
图3为实施例9制备的TPE-SAC(以氘代二甲基亚砜为溶剂)的核磁氢谱图。
比较例1
将1,1,2,2-四(4-羧基苯)乙烯(0.1g,0.196mmol)溶于SOCl2(8mL)在回流温度下反应48h。冷却至室温，减压蒸发除去溶剂得到固体酰氯。将磺胺噻唑(0.301g,1.176mmol)溶于无水四氢呋喃(3mL)，并加入三乙胺(0.218mL,1.568mmol)得到第一溶液，将所得第一溶液置于冰水浴搅拌30min。将上述所得固体酰氯全部溶于3mL无水四氢呋喃后得到第二溶液，将所得到第二溶液逐滴滴加至上述第一溶液中得到混合溶液。混合溶液在50℃下搅拌72h后减压蒸发溶剂。随后，蒸除溶剂后的残余物通过硅胶柱层析进行纯化干燥得到TPE-STZ，产物质量0.207g，产物产率72％，产物纯度79.94％。其反应式如下：
比较例2
将1,1,2,2-四(4-羧基苯)乙烯(0.1g,0.196mmol)溶于SOCl2(8mL)在回流温度下反应48h。冷却至室温，减压蒸发除去溶剂得到固体酰氯。将磺胺二甲嘧啶(0.328g,1.176mmol)溶于无水四氢呋喃(3mL)，并加入三乙胺(0.218mL,1.568mmol)得到第一溶液，将所得第一溶液置于冰水浴搅拌30min。将上述所得固体酰氯全部溶于3mL无水四氢呋喃后得到第二溶液，将所得到第二溶液逐滴滴加至上述第一溶液中得到混合溶液。混合溶液在50℃下搅拌72h后减压蒸发溶剂。随后，残余物通过硅胶柱层析进行纯化干燥得到TPE-SMZ，产物质量0.235g，产物产率77.02％，产物纯度为67.63％。其反应方程式如下：
本方案，通过1H NMR和FTIR表征证实了荧光探针的成功制备；通过荧光分光光度计测得不同含水量溶液的荧光强度，证实了TPE-SA、TPE-SAC和TPE-SDOX具有优异的AIE效应；进一步在不同pH缓冲溶液中测量荧光强度，发现TPE-SA、TPE-SAC和TPE-SDOX的pH转变点分别在5.76±0.02、6.09±0.03和6.83±0.02，证明通过磺胺类基团对TPE分子进行修饰，将H4TCPE聚集发光响应的pH转变点调整至肿瘤微环境。
本方案中，上述实施例4-9通过酰胺化反应将TPE与磺酰胺类化合物结合，成功合成了TPE-SA、TPE-SAC和TPE-SDOX，其中实施例4-7中的TPE-SDOX通过将pH转变点调整至肿瘤微酸环境，使AIE现象发生在肿瘤部位，用于肿瘤细胞成像。将所得荧光探针化合物其溶解在溶剂中，注射到肿瘤部位，能够制备得到微酸响应性智能荧光成像探针，本方案是采用将小分子荧光探针与肿瘤细胞共孵育后，能够实现电荷快速转换，以增强细胞摄取和与癌细胞孵育时精确的荧光成像。小分子荧光探针到达肿瘤部位，在肿瘤微酸环境中，导致酰胺键质子化，形成CONH2+，引入正电荷，而C＝O和S＝O＝S为吸电子基团，整体呈现电中性。聚集状态下，分子内旋转受到限制，导致激发态的能量以发光形式释放，导致在细胞内可以发出明亮的荧光。TPE-SDOX探针展现出灵敏的pH响应及优越的AIE效应，实现对肿瘤细胞安全有效的选择性荧光成像。
生物相容性评价
本发明将小分子荧光探针与细胞采用共培养的方式，其培养方法为：将HepG2细胞和L02细胞分别在37℃、体积分数5％ CO2的培养箱中培养，DMEM培养基中含有10％ FBS和1％抗生素(含有100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)。本发明通过将小分子荧光探针与肿瘤细胞共培养的方式，调整培养基pH值达到聚集诱导发光成像的效果。
MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-2H-四唑溴化物)作为常用的细胞毒性测定方法，用于评估小分子荧光探针对细胞生存能力的影响。T75培养盒中的L02和HepG2细胞长至80％时，加入胰酶将贴壁细胞消化洗涤。加入新鲜培养基将细胞充分大散后，以8000个细胞/孔的浓度将其接种至96孔板，保持每孔最终培养基体积为200μL。培养24h后，观察到孔内细胞密度达到70％。随后将不同浓度的H4TCPE、TPE-SA、TPE-SAC和TPE-SDOX与细胞混合孵育24h，保持培养基最终浓度为10、20、40、60、80和100μM。随后，每孔加入10μLMTT(5mg/mL)。在CO2培养箱中，37℃孵育4h后，MTT试剂与细胞产生的代谢产物会形成蓝紫色结晶甲瓒散落在培养皿底部。然后，移除培养基，并使用180μL异丙醇将沉积底部的蓝紫色甲瓒晶体溶解。采用ELISA酶标仪测定570nm处的吸光度(OD)值。细胞活性(％)计算公式如下：
其中ODsample为经过荧光探针处理后的吸光度，ODcontrol为未经荧光探针处理后的吸光度。细胞毒性实验重复三次。
如图33、34所示，本实施例为体外生物相容性实验实施例，采用MTT法研究H4TCPE、实施例7、8、9的小分子荧光探针对L02和HepG2细胞株的生物相容性。由图分析可知，小分子荧光探针与HepG2和L02细胞共培养24小时后，即使在高达100μM的浓度下，细胞存活率仍保持在90％以上。结果表明，荧光探针对细胞具有较小的毒性。即使在高浓度下AIE荧光探针也能保持细胞活力，为细胞成像提供了良好的生物安全性。
细胞摄取情况的评价
为了评估H4TCPE和TPE-SDOX荧光探针的细胞摄取情况，本发明采用荧光倒置显微镜对L02和HepG2细胞进行观察。首先，将盖玻片用王水浸泡并进行高压蒸汽灭菌。然后将盖玻片置于孔板用PBS溶液进行润洗，避免双侧细胞生长影响封片和成像效果。随后每个孔中加入0.5mL培养基，保证细胞可以均匀分散在24孔板。每个孔接种2×105个细胞，孔板内细胞密度达到约70％，可将原始培养基替换为pH调整为6.5的DMEM培养基，加入20μLH4TCPE或TPE-SDOX的DMSO溶液(整个过程是：吸出原始培养基，加入980uL的pH6.5的培养基，加入20uL探针。使整体的总体积为1mL，荧光探针的最终浓度为20uM)。在替换培养基的过程中，使用无菌PBS清洗孔板以减少血清残留。细胞在CO2培养箱中孵育不同时间段后，将孔板中的培养基吸出，并用PBS洗涤三次。随后，加入可覆盖盖玻片的多聚甲醛溶液(4％,PFA)孵育10min，固定细胞。随后将PFA吸出后，用细胞级的PBS缓冲溶液(缓冲液型号为P1020)洗涤三次。在载玻片表面滴加20μL抗荧光猝灭封片液，使用细胞夹将盖玻片取出倒置载玻片上。随后，在盖玻片表面滴上无荧光显微镜镜油，采用荧光倒置显微镜观察细胞摄取情况。
如图35、36所示，本实施例为细胞摄取性能实验实施例，该实施例利用细胞摄取实验以评估实施例7中所制备小分子荧光探针TPE-SDOX对L02正常细胞和HepG2癌细胞的荧光成像效果。与处理后的L02细胞相比，经过TPE-SDOX处理后的HepG2细胞显示出明显增加的荧光亮度。而经过H4TCPE处理后的L02和HepG2细胞均未表现出明显的荧光信号。肿瘤微环境往往偏酸性(约为6.2-6.9)，当TPE-SDOX到达肿瘤部位时，更接近TPE-SDOX的pH转换点，因此能够产生更强大、更明显的荧光信号。
AIE特性评价
如图5-12所示，分别为H4TCPE(a,b)、实施例8制备的TPE-SA(c,d)、实施例9制备的TPE-SAC(e,f)和实施例7制备的TPE-SDOX(g,h)在含不同体积分数水的DMSO/H2O混合物中的FL光谱和相对FL强度图(fw)，其中图6、8、10和12的插图图片分别对应为H4TCPE、TPE-SA、TPE-SAC和TPE-SDOX在纯DMSO(水的体积分数为fw＝0％)和一定体积的DMSO/H2O混合物(水的体积分数为fw＝98％)中的荧光图。图5-12检测条件为：激发波长：365nm，探针在溶液中的浓度为：20μM。检测设备：F96Pro荧光分光光度计(上海棱光技术有限公司)。
由图可知，在良溶剂纯DMSO中，小分子荧光探针会产生微弱的荧光发射。然而，在引入不良溶剂水时，小分子荧光探针的荧光强度显著增强。当含水量不断增加时，H4TCPE、TPE-SA、TPE-SAC和TPE-SDOX的荧光强度呈现明显的上升趋势，水的体积分数为fw＝98％各个荧光探针溶液的荧光强度分别是含纯DMSO荧光探针溶液中对应荧光强度值的131、98、139和265倍。与纯DMSO溶剂(即水的体积分数为fw＝0％)荧光探针溶液相比，以DMSO/H2O混合物(水的体积分数为fw＝98％)作为溶剂的小分子荧光探针表现出更强的荧光强度且具有独特的AIE特征。通过365nm紫外灯照射观察H4TCPE、TPE-SA、TPE-SAC和TPE-SDOX溶液的AIE特性。如图6、8、10、12内的插图部分所示，在纯DMSO溶剂中，H4TCPE、TPE-SA、TPE-SAC和TPE-SDOX几乎没有肉眼可见的荧光，但在DMSO/H2O混合物(水的体积分数为fw＝98％)作为溶剂时有明显的荧光发射。结果表明通过将不同磺胺基团与TPE通过酰胺化反应合成的小分子荧光探针保持着TPE分子本身优异的AIE特性。
不同pH值溶液条件下荧光探针的荧光强度评价
如图13、16、19、22所示，为不同pH值缓冲液的H4TCPE、TPE-SA、TPE-SAC和TPE-SDOX的荧光光谱，在pH 8.98-1.06范围内，H4TCPE、TPE-SA、TPE-SAC和TPE-SDOX的荧光强度符合Sigmoid Boltzmann函数(如图14、17、20、23)。图13-24中，激发波长为365nm，如图14所示，H4TCPE的pH转变点在pH 4.91附近，超出了生理正常范围(肿瘤微环境pH 6.2-6.9)。
本方案检测母液配置方法如下：称取10.5mg TPE-SDOX溶于1mL DMSO，配制得6.25mM母液C1；称取5mg TPE-SA溶于0.6183mL DMSO，配制得6.25mM母液C1；称取3mg H4TCPE溶于0.944mL DMSO，配制得6.25mM母液C1。荧光光谱检测方法如下：首先取320uL 6.25mM的对应母液C1溶于1.68mL DMSO，稀释至母液C2浓度为1mM；然后取60uL浓度1mM母液C2，加入至2.94mL不同pH(4.96、5.75、6.27、6.7)的PBS溶液(DMSO/PBS＝2/98)。最终浓度为20uM，激发波长为365nm。本方案中，不同pH的PBS缓冲溶液是通过配置0.01M的pH7.2-7.4的标准PBS溶液，加入1M的HCl，调节pH值并通过pH计测得其pH值得到。本方案中，pH为4.96、5.75、6.27、6.7的PBS缓冲液或DMEM溶液配比配制方法如下：向外购的标准PBS溶液/DMEM中，加入不等量的1M的HCl使得溶液调节至达到上述对应的pH值，并通过pH计测得其pH值。
本发明，图14、17、20、23根据如下检测数据绘制，H4TCPE测得不同pH的荧光强度的pH值分别为1.06、1.56、2.06、2.55、3.07、3.5、4.04、4.57、4.96、5.49、6.08、6.52、7.02、7.4、8.0、8.49、8.98。TPE-SA测得不同pH的荧光强度的pH值分别为1.06、2.06、3.07、3.5、4.00、4.57、4.96、5.49、5.78、6.27、6.52、7.02、7.4、8.0、8.49、8.98。TPE-SAC测得不同pH的荧光强度的pH值分别为1.06、2.06、3.07、3.88、4.34、4.96、5.49、5.78、6.08、6.27、6.52、7.4、8.0、8.98。TPE-SDOX测得不同pH的荧光强度的pH值分别为1.06、2.06、3.07、3.43、3.88、4.34、4.77、5.26、5.8、5.95、6.27、6.58、6.77、6.95、7.4、7.6、8.0、8.49、8.98。检测条件为：激发波长：365nm，探针在溶液中的浓度为：20μM。本申请的吸光度检测设备为F96Pro荧光分光光度计(上海棱光技术有限公司)。
各荧光探针的pH转变点
本方案通过磺胺基团进行精确修饰，在分子水平成功地合成了TPE-SA、TPE-SAC和TPE-SDOX化合物。通过检测不同pH溶液中TPE-SA和TPE-SAC的FL，并分析FLmax与小分子荧光探针不同pH之间的关系，实施例8制备的TPE-SA和实施例9制备的TPE-SAC具有明显的pH转折点，分别为5.76±0.02和6.09±0.03。然而，这两种化合物仍未能达到预期的pH变化范围(肿瘤微环境pH 6.2-6.9)，因此无法应用于肿瘤微环境检测。相比之下，如图22、23和24所示，实施例4-7所制备的TPE-SDOX对pH显示出较高灵敏的响应，其pH转变点为6.83±0.02。TPE-SDOX表现出明显的AIE特性和灵敏的pH响应，能够应用于靶向肿瘤微环境，达到预期的pH变化范围(pH 6.2-6.9)。H4TCPE、TPE-SA、TPE-SAC和TPE-SDOX的pH响应区分别为4.59-5.24(ΔpHt＝0.65)、5.55-5.98(ΔpHt＝0.43)、5.78-6.43(ΔpHt＝0.65)和6.59-7.08(ΔpHt＝0.49)。这些结果表明H4TCPE、TPE-SA、TPE-SAC和TPE-SDOX在较宽的pH范围内都可以实现灵敏的pH检测。
前述比较例1所得的TPE-STZ，根据上述检测方法测得其pH转变点为6.99±0.03,前述比较例2所得的TPE-SMZ根据上述检测方法测得其pH转变点为7.24±0.03，因此比较例1所得的TPE-STZ和比较例2所得的TPE-SMZ均未达到预期的pH变化范围(pH 6.2-6.9)。
光稳定性评价
如图25、26、27、28所示，将H4TCPE、TPE-SA、TPE-SAC和TPE-SDOX母液C2与pH为4.96、5.75、6.27、6.7的PBS缓冲液或DMEM溶液混合配制成含水量98％的溶液。在不同时间点对上述溶液进行荧光强度测定，根据最大荧光发射强度绘制荧光强度与时间的关系图。
由于光稳定性是评估小分子荧光探针的一个重要参数。通过荧光分光光度计检测H4TCPE、TPE-SA、TPE-SAC和TPE-SDOX在DMEM和PBS溶液中72小时内的FL变化，考察小分子荧光探针的光稳定性。如图所示，根据图25-28所得表征图可知；通过观察到小分子荧光探针在72小时内荧光强度保持稳定，表明其具有良好的荧光稳定性。上述结果表明，TPE荧光探针呈现出良好稳定性。与传统的荧光分子不同，小分子荧光探针在溶液中表现出灵活性，聚集后转变为刚性状态。这种精心设计的构型增强了分子在聚集过程中的稳定性，并且使其能够长时间地保持较高水平的荧光强度。
光可逆性评价
如图29、30、31、32所示，将H4TCPE、TPE-SA、TPE-SAC和TPE-SDOX母液与不同pH PBS缓冲溶液混合配制含水量98％的溶液，并依次加入0.1M的HCl或NaOH调节小分子荧光探针溶液的pH值，重复5循环，并测得每次pH调整后的小分子荧光探针的荧光强度，根据最大荧光发射强度绘制荧光强度与循环次数的关系图。
本方案中，含水量98％的溶液配制方法如下：称取10.5mg TPE-SDOX溶于1mLDMSO，配制得6.25mM母液C1；称取5mg TPE-SA溶于0.751mL DMSO，称取5mg TPE-SAC溶于0.6185mL DMSO，配制得6.25mM母液C1，配制得6.25mM母液C1；称取3mg H4TCPE溶于0.944mLDMSO，配制得6.25mM母液C1；分别取320uL浓度为6.25mM的H4TCPE、TPE-SA、TPE-SAC和TPE-SDOX母液C1溶于1.68mL DMSO，稀释得到浓度为1mM母液C2；取60uL浓度为1mM的上述母液C2加入2.94mL不同pH的PBS溶液(DMSO/PBS＝2/98)【含水量98％】，最终浓度达到20uM，激发波长为365nm。
根据如图29、30、31、32分析，得到如下结论：基于光可逆性是评估小分子荧光探针的另一个重要参数，我们通过加入0.1M HCl或NaOH来调节溶液的pH值，研究了H4TCPE、TPE-SA、TPE-SAC和TPE-SDOX对不同pH值下的响应情况。结果显示，在不同pH值下，上述荧光探针均表现出明显的可逆转换过程，并保持有效的荧光响应转化能力。进一步观察发现，即使经过多次循环实验，上述小分子荧光探针仍然能够保持其特殊的可逆性和可重复响应性。无论是在酸性条件还是碱性条件下，它们都展示出稳定而高效地转换成相应荧光信号的能力，这种特殊可逆性和可重复响应性使得上述小分子荧光探针成为理想候选物质，能够在生物医学领域中用于监测和诊断癌症等相关疾病。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种微酸环境响应AIE荧光探针，其特征在于：其结构通式为：
其中，R选自
中的一种。
2.根据权利要求1所述的一种微酸环境响应AIE荧光探针，其特征在于：所述荧光探针的结构式为：
3.一种微酸环境响应AIE荧光探针的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤一、将磺胺类化合物溶于一定量的溶剂中，并按照比例加入三乙胺，置于冰水浴搅拌10-30min，得到第一溶液；
步骤二、将一定量的酰氯固体溶于一定量的溶剂中得到第二溶液，并将第二溶液滴加至步骤一所配制得到的第一溶液中，从而制备混合溶液；
步骤三、待第二溶液滴加完毕后，步骤二所制备得到的混合溶液在一定反应温度下搅拌48-72h，并将反应完成的混合溶液蒸发溶剂后的残余物通过纯化干燥得到荧光探针化合物。
4.根据权利要求3述的一种微酸环境响应AIE荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤二中，所述酰氯固体的制备方法如下：将1,1,2,2-四(4-羧基苯)乙烯按照比例溶于二氯亚砜中；并将所得溶液在回流温度下反应24-48h；待反应结束后，将反应液冷却至室温，然后除去溶剂得到固体酰氯。
5.根据权利要求4述的一种微酸环境响应AIE荧光探针的制备方法，其特征在于：每1g1,1,2,2-四(4-羧基苯)乙烯投加在70-100mL的二氯亚砜中。
6.根据权利要求3述的一种微酸环境响应AIE荧光探针的制备方法，其特征在于：1,1,2,2-四(4-羧基苯)乙烯：磺胺类化合物：三乙胺的摩尔比范围为1:4-8:8-12，所述磺胺类化合物选自苯磺酰胺、磺胺醋酰或磺胺多辛中的一种；优选的，磺胺类化合物采用磺胺多辛。
7.根据权利要求3述的一种微酸环境响应AIE荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤三中，反应温度为25-50℃。
8.根据权利要求6所述的一种微酸环境响应AIE荧光探针的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤一、将磺胺多辛溶于一定量的四氢呋喃中，并按照比例加入三乙胺，置于冰水浴搅拌10-30min，得到第一溶液；
步骤二、将一定量的酰氯固体溶于一定量的四氢呋喃中得到第二溶液，并将第二溶液滴加至步骤一所配制得到的第一溶液中，从而制备混合溶液；
步骤三、待第二溶液滴加完毕后，步骤二所制备得到的混合溶液在一定反应稳定下搅拌48-72h，并将反应完成的混合溶液蒸发溶剂后的残余物通过硅胶柱层析进行纯化干燥得到荧光探针化合物TPE-SDOX。
9.根据权利要求1或2所述的一种微酸环境响应AIE荧光探针的在肿瘤细胞成像中的应用。
10.根据权利要求9所述的一种微酸环境响应AIE荧光探针的在肿瘤细胞成像中的应用，其特征在于：所述小分子荧光探针与肿瘤细胞采用共培养的方式，优选的，所述小分子荧光探针为TPE-SDOX。
CN202410850451.8A 2024-06-27 2024-06-27 一种微酸环境响应aie荧光探针及其制备方法和应用 Pending CN118772066A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410850451.8A CN118772066A (zh) 2024-06-27 2024-06-27 一种微酸环境响应aie荧光探针及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410850451.8A CN118772066A (zh) 2024-06-27 2024-06-27 一种微酸环境响应aie荧光探针及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN118772066A true CN118772066A (zh) 2024-10-15

Family

ID=92980176

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202410850451.8A Pending CN118772066A (zh) 2024-06-27 2024-06-27 一种微酸环境响应aie荧光探针及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN118772066A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110283583B (zh) γ-谷氨酰转肽酶响应型分子探针及其应用
CN102146284B (zh) 一种比率型荧光探针及其应用
CN115650897B (zh) 一种同时检测Cys和线粒体粘度的荧光探针及其制备方法和应用
CN108484622A (zh) 多信号荧光探针的合成及其同时区分检测Hcy、Cys和GSH的应用
EP3798221A1 (en) Fluorescent probe and preparation method and use thereof
CN113461609B (zh) 一种硫酸酯酶响应的aie纳米探针及其制备方法与应用
CN108864056B (zh) 具有aie性能的近红外荧光化合物及其制备方法和应用
CN105524055A (zh) 一种能够区分半胱氨酸/同型半胱氨酸和谷胱甘肽荧光探针的制备与应用
Guo et al. A novel two-channel ratio fluorescent probe for monitoring intracellular pH fluctuations
CN113087703B (zh) 一种能特异性标记脂滴的光敏剂及其制备方法
CN115448928B (zh) 一种半花菁罗丹明荧光探针及其制备方法和应用
CN116023346B (zh) 一种具有脂滴和线粒体双色成像功能的单分子荧光探针及其制备方法和应用
CN113603701A (zh) 一种检测次氯酸根离子的比色/荧光探针及其制备方法与应用
CN110156688A (zh) 一种靶向内质网检测极性的荧光探针及其应用
CN106432312A (zh) 一种线粒体靶向荧光探针及其制备方法和应用
CN108912134A (zh) 一种高灵敏检测半胱氨酸的荧光探针及制备方法、应用
CN109422758B (zh) 一种近红外荧光比率荧光探针及其制备方法和应用
CN109456250A (zh) 热激活延迟荧光(tadf)纳米探针及其制备方法和在生物成像中的应用
CN114230495A (zh) 一种氢化亚硝酰供体及其制备方法
CN102633694A (zh) 一种检测巯基化合物的荧光探针及其制备方法与使用方法
CN118772066A (zh) 一种微酸环境响应aie荧光探针及其制备方法和应用
CN117946145A (zh) 一种bodipy衍生物近红外粘度荧光探针及其应用
CN117777152A (zh) 汞离子花青素荧光探针、制法及在中药植物检测中的应用
CN110437268A (zh) 一种钾离子探针及其制备方法和应用
CN114262333B (zh) 一类用于溶酶体超分辨成像的近红外荧光染料及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination