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CN118766813A - 一种高活性成分保留的提取工艺 - Google Patents

一种高活性成分保留的提取工艺 Download PDF

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CN118766813A CN202411004232.4A CN202411004232A CN118766813A CN 118766813 A CN118766813 A CN 118766813A CN 202411004232 A CN202411004232 A CN 202411004232A CN 118766813 A CN118766813 A CN 118766813A
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Nord Traceability Guangzhou Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明公开了一种高活性成分保留的提取工艺，属于天然产物提取领域。其提取原料为马奇果，提取方式为，马奇果先进行酯提，而后对其残渣进行纤维素酶解，毕赤酵母菌一次发酵、米曲霉菌二次发酵。本发明提供的提取方法为马奇果提供再次利用的新途径。

Description

一种高活性成分保留的提取工艺
技术领域
本发明属于天然产物提取领域，具体涉及一种高活性成分保留的提取工艺。
背景技术
马奇果(Maqui Berry)，作为一种源自南美洲的独特超级水果，因其富含多种生物活性成分，如高浓度的类黄酮、维生素及矿物质等，近年来在营养学、医药及化妆品领域引起了广泛关注。这些生物活性成分不仅具有强大的抗氧化、抗炎及免疫调节功能，还对心血管健康、皮肤保养及抗衰老等方面展现出显著的益处。
然而，传统提取方法往往存在提取效率低、有效成分损失大、杂质含量高等问题，限制了马奇果提取物在各个领域的应用潜力。为了克服这些挑战，提高马奇果提取物的品质和利用价值，研究人员不断探索和优化提取工艺。
相较于传统提取方法，酯提-酶解-发酵三者联用的提取方法既可以最大限度的提高活性产物的保留率，又可以通过三者复合提取模式尽最大可能的保留提取物的天然活性。
发明内容
本发明提供了一种高活性成分保留的提取工艺，通过酶解、发酵技术，充分提取马奇果中的生物活性物质。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
首先，本发明对马奇果进行酯提。
S1：将马奇果清洗，除杂，冻干，研磨成粉，未使用前密封避光5-8℃保存。
S2：对马奇果粉使用乙酸乙酯对其进行酯提，而后过滤得到滤液A1，残渣B1。
S3：对酯提取产物A1进行冻干，得到冻干粉A2。
优选的，所述酯提中乙酸乙酯为水饱和乙酸乙酯，提取温度为40-65℃，提取回流次数为3-6次。
其次，本发明对于B1残渣进行酶解。
T1：将马奇果酯提残渣进行清洗，烘干，粉碎后得到残渣粉B2；
T2：使用纤维素酶，果胶酶，蛋白水解酶，葡聚糖酶对B2进行酶解，过滤得到酶解产物A3，其中添加顺序为先添加纤维素酶，果胶酶进行酶解3±0.5；而后添加葡聚糖酶酶解2±0.3h；而后添加蛋白水解酶酶解4±0.2h，而后得到酶解产物A3。
优选的，所述酶总添加量质量百分比占比为原料质量的8-10％；所述纤维素酶、果胶酶、蛋白水解酶与葡聚糖酶质量分数比为1:1-1.5:3:1。
再者：本发明对酶解产物A3进行一次发酵
V1：对酶解产物A3使用酵母菌进行发酵，得到发酵产物A4。
优选的，所使用的酵母菌菌种为毕赤酵母菌，所述V1发酵起始温度为28±2℃，发酵起始pH为5.5±0.5；发酵起始含氧量为18±2％；菌种质量百分比占比为原料质量8-10％；发酵时长为16±4h。
最后：本发明对发酵产物A4进行二次发酵
V2：对发酵产物A4，过滤，灭菌后，添加过滤后发酵产物A4质量百分比2-4％的马奇果提取物A2，而后使用曲霉菌发酵，过滤得到发酵产物A5，菌丝体B3。
优选的，所使用的曲霉菌菌种为米曲霉菌，所述2发酵起始温度为29±1℃，发酵起始pH为5.5±0.5；发酵起始相对湿度为92±2.5％；菌种质量百分比占比为原料质量6-10％，发酵时长为48±12h，发酵搅拌速度45r/min。
V3：对菌丝体B3酶解，使用蛋白水解酶，纤维素酶对其进行酶解，酶解后冻干得到产物A6。
V4混合A5、A6得到终产物A7。
优选的，所述蛋白水解酶、β-葡萄糖苷酶质量分数比为1:1.5-2；所述蛋白水解酶、β-葡萄糖苷酶，质量百分比占比为原料质量3-5％。
本发明中：本发明使用马奇果作为被提取物，对马奇果进行冻干粉碎后，首先对其进行酯提，而后对其酯提残渣进行酶解，进而对其酶解产物进行二次发酵，充分提取并保全马奇果中有效物质。本发明充分提取保全马奇果中有效物质，首先使用乙酸乙酯作为提取剂，对马奇果中易于溶于酯或溶于水的天然活性物质进行提取，保全其易于氧化的天然活性成分，其次对于提取后的残渣，其中还蕴含有丰富的多糖、杂环烃、蛋白质及多肽，因此使用纤维素酶、果胶酶、蛋白水解酶、葡聚糖酶对残渣进行酶解，首先使用纤维素酶，果胶酶将植物细胞中的细胞壁进行分解，将残渣中的纤维素、果胶等大分子进行分解，而后使用葡聚糖酶，将纤维素，果胶等分解得到的长链葡聚糖分解为糖苷，进而使用蛋白水解酶，将残渣中的蛋白质分解为氨基酸，为下一步发酵做准备。最后对酶解产物进行发酵，首先一次发酵，使用毕赤酵母作为发酵菌种通过毕赤酵母菌的代谢，得到相关的次级代谢产物，而后使用米曲霉菌进行二次发酵，在二次发酵前，一次发酵后，需要往发酵产物中加入先前制备所得到的马奇果提取物，利用提取物中的酚类、酮类刺激米曲霉，调控米曲霉代谢途径从而达到黄酮类产物的富集。
与现有技术相比本发明具有以下有益效果：
1：本发明所提供的提取方法可以有效地保全马奇果中的生物活性物质；
2：本发明所提供的提取方法可以有效地富集马奇果中黄酮类物质；
3：本发明所提供提取方法可有效提高马奇果传统提取物在美白、保湿、抗衰老、抑菌方面的功效。
附图说明
图1实施例1酯提马奇果提取物A1色谱图。
图2实施例1终产物马奇果提取物A7色谱图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合具体实施例对本发明作进一步的描述，其中实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，不构成对本发明保护范围的限制。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则依照百分比和份数按重量计算。
部分原料及来源如下：
马奇果：购自重庆洪九果品股份有限公司。
毕赤酵母菌：购自宁波泰斯拓生物技术有限责任公司。
米曲霉菌：购自宁波泰斯拓生物技术有限责任公司。
酿酒酵母菌：购自宁波泰斯拓生物技术有限责任公司。
黑霉菌：购自宁波泰斯拓生物技术有限责任公司。
制备，包括以下步骤：
实施例1：
S1：将马奇果清洗，除杂，冻干，研磨成粉，未使用前密封避光5-8℃保存。
S2：对马奇果粉使用乙酸乙酯对其进行酯提，而后过滤得到滤液A1，残渣B1。
S3：对酯提取产物A1进行冻干，得到冻干粉A2。
T1：将马奇果酯提残渣进行清洗，烘干，粉碎后得到残渣粉B2；
T2：使用纤维素酶，果胶酶，蛋白水解酶，葡聚糖酶对B2进行酶解，过滤得到酶解产物A3，其中添加顺序为先添加纤维素酶，果胶酶进行酶解3；而后添加葡聚糖酶酶解2；而后添加蛋白水解酶酶解4h，而后得到酶解产物A3。
V1：对酶解产物A3使用毕赤酵母菌进行发酵，得到发酵产物A4；所述V1发酵起始温度为28℃，发酵起始pH为5.5；发酵起始含氧量为18；菌种质量百分比占比为原料质量9％；发酵时长为16h。
V2：对发酵产物A4，过滤，灭菌后，添加过滤后发酵产物A4质量百分比3％的马奇果提取物A2，而后使用米曲霉菌发酵，过滤得到发酵产物A5，以发酵产物A5为终产物；发酵起始温度为29℃，发酵起始pH为5.5；发酵起始相对湿度为92％；菌种质量百分比占比为原料质量8％，发酵时长为48h，发酵搅拌速度45r/min。
V2：对发酵产物A4，过滤，灭菌后，添加过滤后发酵产物A4质量百分比2-4％的马奇果提取物A2，而后使用曲霉菌发酵，过滤得到发酵产物A5，菌丝体B3。
V3：对菌丝体B3酶解，使用蛋白水解酶，纤维素酶对其进行酶解，酶解后冻干得到产物A6。
V4：混合A5、A6得到终产物A7。
实施例2：
S1：将马奇果清洗，除杂，冻干，研磨成粉，未使用前密封避光5-8℃保存。
S2：对马奇果粉使用乙酸乙酯对其进行酯提，而后过滤得到滤液A1，残渣B1。
S3：对酯提取产物A1进行冻干，得到冻干粉A2。
T1：将马奇果酯提残渣进行清洗，烘干，粉碎后得到残渣粉B2；
T2：使用纤维素酶，果胶酶，蛋白水解酶，葡聚糖酶对B2进行酶解，过滤得到酶解产物A3，其中添加顺序为先添加纤维素酶，果胶酶进行酶解3.5；而后添加葡聚糖酶酶解2.3h；而后添加蛋白水解酶酶解4.2h，而后得到酶解产物A3。
V1：对酶解产物A3使用毕赤酵母菌进行发酵，得到发酵产物A4；所述V1发酵起始温度为30℃，发酵起始pH为6；发酵起始含氧量为20％；菌种质量百分比占比为原料质量10％；发酵时长为20h。
V2：对发酵产物A4，过滤，灭菌后，添加过滤后发酵产物A4质量百分比4％的马奇果提取物A2，而后使用米曲霉菌发酵，过滤得到发酵产物A5，菌丝体B3；发酵起始温度为30℃，发酵起始pH为6；发酵起始相对湿度为94.5％；菌种质量百分比占比为原料质量10％，发酵时长为60h，发酵搅拌速度45r/min。
V3：对菌丝体B3酶解，使用蛋白水解酶，纤维素酶对其进行酶解，酶解后冻干得到产物A6。
V4：混合A5、A6得到终产物A7。
实施例3：
S1：将马奇果清洗，除杂，冻干，研磨成粉，未使用前密封避光5-8℃保存。
S2：对马奇果粉使用乙酸乙酯对其进行酯提，而后过滤得到滤液A1，残渣B1。
S3：对酯提取产物A1进行冻干，得到冻干粉A2。
T1：将马奇果酯提残渣进行清洗，烘干，粉碎后得到残渣粉B2；
T2：使用纤维素酶，果胶酶，蛋白水解酶，葡聚糖酶对B2进行酶解，过滤得到酶解产物A3，其中添加顺序为先添加纤维素酶，果胶酶进行酶解2.5；而后添加葡聚糖酶酶解1.7h；而后添加蛋白水解酶酶解3.8h，而后得到酶解产物A3。
V1：对酶解产物A3使用毕赤酵母菌进行发酵，得到发酵产物A4；所述V1发酵起始温度为26℃，发酵起始pH为5；发酵起始含氧量为16％；菌种质量百分比占比为原料质量8％；发酵时长为12h。
V2：对发酵产物A4，过滤，灭菌后，添加过滤后发酵产物A4质量百分比2％的马奇果提取物A2，而后使用米曲霉菌发酵，过滤得到发酵产物A5，菌丝体B3；发酵起始温度为28℃，发酵起始pH为5.0；发酵起始相对湿度为90％；菌种质量百分比占比为原料质量6％，发酵时长为36h，发酵搅拌速度45r/min。
V3：对菌丝体B3酶解，使用蛋白水解酶，纤维素酶对其进行酶解，酶解后冻干得到产物A6。
V4：混合A5、A6得到终产物A7。
对比例1，遵从实施例1的S1-S3，以冻干粉A2为终产物。
对比例2，遵从实施例1的S1-S3、T1-T2，以酶解产物A3为终产物。
对比例3，遵从实施例1的S1-S3、T1-T2、V1，以一次发酵产物A4为终产物。
对比例4，遵从实施例1的S1-S3、T1-T2、V1-V2，以二次发酵产物A5为终产物。
对比例5，遵从实施例1的S1-S3、T1-T2、V1-V3，以菌丝体酶解产物A6为终产物。
对比例6，遵从实施例1的S1-S3、V1-V4，与实施例1不同的是，不对残渣B2进行酶解，直接对残渣进行发酵，其余步骤同实施例1而后得到发酵产物C1。
对比例7，遵从实施例1的S1-S3、T1-T2、V1-V4，与实施例1不同的是，V1使用酵母菌为酿酒酵母，其余步骤同实施例1而后得到发酵产物C2。
对比例8，遵从实施例1的S1-S3、T1-T2、V1-V4，与实施例1不同的是，V2使用曲霉菌为黑霉菌，其余步骤同实施例1得到发酵产物C3。
对比例9，遵从实施例1的S1-S3、T1-T2、V1-V1，与实施例1不同的是，V2不添加马奇果提取物A1，其余步骤同实施例1得到发酵产物C4。
细胞毒性试验
取生长状态稳定的人永生化表皮细胞系(HaCaT)，调整细胞浓度至1×105/mL，以每孔100μL.接种到96孔细胞培养板中(除最外周孔及空白对照孔)。在细胞培养板的最外周孔中加入PBS200μL，以减少培养基的蒸发。置二氧化碳培养箱中，在37℃±1℃，CO2浓度5.0％±1％条件下进行培养待细胞融合达到90％以上。加入样品，样品浓度为10mg/L，设置空白对照、样品组，每孔100μL。开始加样品(样品组)、PBS(空白对照)时计时，保持每两列加样时间间隔一致，保证每个受试物对细胞的干预时间是5min，5min后，依次吸去受试物，每孔加入PBS清洗受试物，清洗2次。用真空吸液泵或排枪吸去孔中液体时，小心操作，以免吸去存活细胞而影响实验结果。在每孔中分别加入100μL完全培养基和10μL CCK-8溶液，置于培养箱中培养2h左右。在450nm波长，测定吸光度(OD)值和计算细胞活力；结果如表1所示。
表1细胞毒性试验
试验组 HaCaT存活率
实施例1 98.34±0.22％
实施例2 97.27±0.47％
实施例3 98.15±0.17％
空白 100％
据实验结果可知，细胞存活率保持90％以上。本实验所提供的制备工艺所制备的提取物对细胞活力影响较小。
透明质酸酶抑制实验
透明质酸又名玻尿酸，是一种强效保湿剂。可以吸引并锁住水分，保持皮肤湿润度，改善干燥、粗糙和缺水的皮肤状况；且透明质酸也能够增强细胞的生物活性，对于修护，保护皮肤具有较强的增效作用。因此通过对透明质酸酶的抑制，使得皮肤中的透明质酸被分解速度降低，从而实现对皮肤的长效保水保湿及修护具有重要意义。
(1)取四组干净的试管，分别标号为A、B、C、D，在A、B试管中各加入待测样品10mg/L50μL，在C、D试管中各加入蒸馏水50μL，在A、C试管中各加入500U/mL透明质酸酶溶液50μL，在B、D试管中各加入pH＝5.6的醋酸缓冲液50μL，将试管放置于37℃保温箱保温20min。
(2)向四组试管中分别加入2.5mol/L的CaCl2溶液10μL，然后置于37℃保温箱保温20min。
(3)向A、C试管中加入0.5mg/mL的透明质酸钠溶液50μL，向B、D试管中加入pH＝5.6的醋酸缓冲液50μL，将试管置于37℃培养箱保温40min，然后取出室温放置10min。
(4)向四组试管里分别加入蒸馏水50μL、5mol/L的NaOH溶液10μL、乙酰丙酮溶液50μL，将试管置于水浴锅中沸水浴30min，然后冰浴10min，最后在室温放置10min。
(5)向各试管中加入P-DAB试剂100μL，然后用酶标仪在530nm处测定吸光值。
式中：A为试样溶液的OD值；B为试样空白的OD值；C为对照样品溶液的OD值；D为对照样品空白的OD值。
表2透明质酸酶抑制率
试验组 透明质酸酶抑制率
实施例1 94.5±0.79％
实施例2 92.4±0.17％
实施例3 91.4±0.41％
对比例1 37.28±1.14％
对比例2 26.52±0.92％
对比例3 38.17±0.47％
对比例4 42.15±1.44％
对比例5 37.26±0.93％
对比例6 23.27±0.42％
对比例7 19.27±2.54％
对比例8 14.24±0.75％
对比例9 35.52±0.47％
据结果分析：从实施例1-3结果可知，本发明实施例提供的制备工艺所制备的提取物具有较好的透明质酸酶抑制功效，尤其是实施例1的效果较好，表明本发明所限定的工艺能够有效地提高提取物对透明质酸酶的抑制作用。
从实施例1及对比例1-5结果来看，使用本工艺任意阶段的产物都无法达到本发明工艺所限定效果。
比较实施例1与对比例6-9的结果可知，更改本工艺所使用的菌种或更改本工艺所使用的步骤均无法达到本工艺所达到之效果。
斑马鱼尾保湿试验
斑马鱼表皮具有一定的渗透压耐受范围，超过耐受范围将产生失水现象。使用高渗透压溶液处理斑马鱼会导致其尾部因失水而皱缩、变小。因此，可以建立斑马鱼补水保湿的诱导模型，进而评估保湿产品的效果。
(1)配鱼繁殖：按雌雄比为2：1的比例配对斑马鱼繁殖，收集鱼卵孵育过夜(28℃培育箱)。
(2)实验分组：实验设置空白对照组与实验组，实验组包括模型组、阳性组和样品组，每组8尾2dpf的幼鱼。
(3)配液：精准称量1mg实施例及对比例样品并配置待测样品溶液，以尿素(0.05％)为阳性对照进行实验，每孔加样1mg。给药完成后将6孔板放置在28℃培育箱中避光孵育24h。
测试结果：如下表3所示。
表3斑马鱼保湿效果测试
试验组 斑马鱼尾面积缩小抑制率/％
阳性组 1
空白 0
实施例1 85.42
实施例2 86.51
实施例3 85.37
对比例1 16.42
对比例2 47.35
对比例3 45.73
对比例4 41.52
对比例5 53.52
对比例6 22.73
对比例7 54.17
对比例8 51.04
对比例9 47.34
据表3结果分析：从实施例1-3结果可知，本发明实施例提供的工艺具有较好的提取作用，尤其是实施例1的效果较好，表明本发明所限定的工艺及配方组合能够有效地提高提取物对斑马鱼尾面积缩小的抑制作用。
从实施例1及对比例1-5结果来看，使用本工艺任意阶段的产物都无法达到本发明工艺所限定效果。
比较实施例1与对比例6-9的结果可知，更改本工艺所使用的菌种或更改本工艺所使用的步骤均无法达到本工艺所达到之效果
痤疮杆菌抑菌
参考WS/T 650—2019，采用抑菌环试验，将痤疮杆菌24h新鲜斜面培养物用PBS洗下，稀释至5.0×105CFU/mL-5.0×106CFU/mL备用。
抑菌片的制备：剪切直径为5mm，厚度不超过4mm滤纸片，每4片为一组浸泡于10mL样品溶液中。
阴性对照样片的制备：取同种材质样本，制成与试验组大小相同的圆片(块)，浸泡于无菌水中。
用无菌棉拭子蘸取浓度为5.0×105CFU/mL-5.0×106CFU/mL痤疮杆菌悬液，在适宜的培养基平板表面均匀涂抹3次。每涂抹1次，平板应转动60°，最后将棉拭子绕平板边缘涂抹一周。盖好平皿，置室温干燥5min。每次试验贴放1个染菌平板，每个平板贴放4片试验样片，1片阴性对照样片，共5片。用无菌镊子取样片贴放于平板表面，阴性对照样片贴于平板中心位置，试验样片贴于四周，贴放好后，用无菌镊子轻压样片，使其紧贴于平板表面。各样片中心之间相距25mm以上，与平板的周缘相距15mm以上。盖好平板，置36℃±1℃培养16h～18h观察结果，试验重复3次。用游标卡尺测量抑菌环的直径(包括贴片)并记录，测量抑菌环时，应选均匀而完全无菌生长的抑菌环进行，测量其直径应以抑菌环外沿为界。
阴性对照样片应无抑菌环产生，试验样品抑菌环直径＞7mm者，判为有抑菌作用；抑菌环直径≤7mm者，判为无抑菌作用。3次重复试验均有抑菌作用，则判为合格。具体结果参见表4。
表4痤疮杆菌抑制试验
结果表明：通过实施例与对比例的对比表明在抑菌性能方面，实施例要优于对比例，因此以本发明所限定工艺配比进行制备，任何缺省均无法达到本发明所达到的效果。
炎症因子抑制试验
TNF-α是炎症反应中最常见的炎症因子，可诱发血管内皮细胞的表型变为炎症型，导致机体代谢和血液动力学改变，促进炎症介质生成。而炎症介质又能导致血管通透性增大，从而造成局部充血、水肿，同时可能刺激神经末梢导致皮肤瘙痒，疼痛。因此对TNF-α的抑制有助于舒缓，修护皮肤。
将生长至对数期的RAW264.7细胞以1.5×105个/mL的密度接种在24孔板，每孔800μL细胞悬浮液，在37℃、5％CO2培养箱培养24h，待细胞生长至将近融合时，以样品浓度10mg/L 50μL进行给药，每组设3个复孔，阳性对照为10μg/mL 50μL地塞米松，1h后用1μg/mL脂多糖(LPS)刺激。在细胞培养箱孵育24h后，将细胞培养液转入离心管，5000r/min离心10min收集细胞上清液，按小鼠TNF-α酶联免疫检测试剂盒说明书进行检测。
表5RAW分泌TNF-α结果
从表5结果分析：从实施例1-3结果可知，本发明实施例提供的工艺所制备的提取物具有较好的TNF-α抑制功效，尤其是实施例1的效果较好，说明以实施例1作为发酵工艺参数，能够有效地提高马奇果提取物对TNF-α的抑制作用。
从实施例1及对比例1-5结果来看，使用本工艺任意阶段的产物都无法达到本发明工艺所限定效果。
比较实施例1与对比例6-9的结果可知，更改本工艺所使用的菌种或更改本工艺所使用的步骤均无法达到本工艺所达到之效果。
细胞迁移率
细胞迁移率程度对伤口愈合和皮肤修复具有重要影响。在伤口愈合过程中，细胞迁移是表皮细胞覆盖伤口的重要步骤，因此细胞迁移率越高，伤口愈合的速度越快。同时，细胞迁移也参与了皮肤损伤后的修复过程，如果细胞迁移受损，会导致皮肤修复障碍，进而引发各种皮肤疾病。
按相应的接种密度接种细胞至12孔板中，37℃,CO2培养箱孵育过夜。待12孔板中细胞铺板率达到80％左右时，对样品组和溶剂对照组进行划痕。划痕结束后，用PBS清洗细胞，以去掉死细胞，再加入新鲜的无EGF角质形成细胞培养液，按照样品10mg/L 50μL加样，使用倒置显微镜拍照记录。37℃,5％CO2培养箱中孵育培养24h，再次拍照记录，用ImageJ软件统计分析。
表6Hacat细胞迁移率
从表6结果分析：从实施例1-3结果可知，本发明实施例提供的工艺制备的提取物具有显著地提高细胞迁移率的功效，尤其是实施例1的效果较好，说明以实施例1作为工艺参数，能够有效地提高细胞迁移率的功效。
从实施例1及对比例1-5结果来看，使用本工艺任意阶段的产物都无法达到本发明工艺所限定效果。
比较实施例1与对比例6-9的结果可知，更改本工艺所使用的菌种或更改本工艺所使用的步骤均无法达到本工艺所达到之效果
酪氨酸酶活性抑制试验
酪氨酸酶是黑色素合成过程中一个关键酶。抑制其能有效降低黑色素的合成，起到美白作用。
溶液配制：
配置浓度5U/L的酶溶液，分装至1.5mLEP管中，置于液氮保存。用前，以PBS稀释，配置为0.5U/L酪氨酸酶溶液，现用现配。精确称取L-酪氨酸、L-多巴，加入适量PBS溶液，室温超声溶解30分钟，制得浓度为3.0mmol/L的底物溶液；曲酸(阳性对照)溶液精确称取1g曲酸，DMSO溶解，加入适量PBS溶液稀释，配置为实验所需浓度，最终DMSO含量为0.5％；称取1mg提取物，10mLDMSO溶解，加适量PBS溶液稀释，最终DMSO含量为0.5％。
酪氨酸酶活力抑制率测定：
依次吸取样品40μL，PBS10μL，酶溶液10μL混合，37摄氏度孵育10分钟，加底物溶液50μL，孵育25分钟，于多功能酶标仪检测475nm吸光度值，依据其吸光度值计算抑制率。
表7酪氨酸酶抑制率
试验组 抑制率/％
实施例1 89.33％
实施例2 93.27％
实施例3 91.24％
对比例1 47.38％
对比例2 33.17％
对比例3 31.14％
对比例4 22.55％
对比例5 14.27％
对比例6 24.22％
对比例7 20.92％
对比例8 20.47％
对比例9 37.24％
曲酸 100％
据表7实施例1-3结果可知，本发明实施例提供的工艺所制备的提取物具有较好抑制酪氨酸酶作用，尤其是实施例1的效果较好。
从实施例1及对比例1-5结果来看，使用本工艺任意阶段的产物都无法达到本发明工艺所限定效果。
比较实施例1与对比例6-9的结果可知，更改本工艺所使用的菌种或更改本工艺所使用的步骤均无法达到本工艺所达到之效果。
以上所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

Claims (10)

1.一种高活性成分保留的提取工艺，其特征在于，对马奇果进行酯提得到提取物A2，残渣B1，而后对其残渣B1进行纤维素酶酶解得到酶解产物A3，对酶解产物A3进行二次发酵得到发酵产物A5及菌丝体B3，对菌丝体B3进行酶解得到酶解产物A6，混合A5、A6得到马奇果提取物A7。
2.根据权利要求1所述提取工艺，其特征在于，所述酯提具体步骤如下：
S1：将马奇果清洗，粉碎得到A1：
S2：使用乙酸乙酯对A1进行回流提取，得到提取物A2及残渣B1。
3.根据权利要求2所述提取工艺，其特征在于，所述乙酸乙酯为水饱和乙酸乙酯；所述回流提取次数为3-6次，所述提取温度为40-65℃。
4.根据权利要求1所述提取工艺，其特征在于，所述酶解具体步骤如下：
T1：将残渣B1清洗，烘干，粉碎得到残渣B2；
T2：使用纤维素酶、果胶酶、蛋白水解酶、葡聚糖酶对B2进行酶解，而后过滤得到酶解产物A3。
5.根据权利要求4所述提取工艺，其特征在于，所述酶解初始温度为35±3℃；所述酶质量百分比占比为原料质量8-10％；所述纤维素酶、果胶酶、蛋白水解酶、葡聚糖酶质量分数比为1:1-1.5:3:1；所述纤维素酶、果胶酶、蛋白水解酶、葡聚糖酶添加顺序为先添加纤维素酶、果胶酶酶解3±0.5h，而后添加葡聚糖酶解2±0.3h，而后添加蛋白水解酶酶解4±0.2h。
6.根据权利要求1所述提取工艺，其特征在于，所述二次发酵其具体步骤如下：
V1：对酶解产物A3使用酵母菌发酵，过滤得到发酵产物A4；
V2：对发酵产物A4使用曲霉菌，过滤对滤液进行冻干得到发酵产物A5、菌丝体B3；
V3：对菌丝体B3进行酶解，而后过滤，对滤液进行冻干得到酶解产物A6；
V4：混合A5、A6得到终产物A7。
7.根据权利要求6所述提取工艺，其特征在于，所述酵母菌为毕赤酵母菌；所述曲霉菌为米曲霉菌；所述V1发酵起始温度为28±2℃，发酵起始pH为5.5±0.5；发酵起始含氧量为18±2％；菌种质量百分比占比为原料质量8-10％；发酵时长为16±4h；所述V2发酵起始温度为29±1℃，发酵起始pH为5.5±0.5；发酵起始相对湿度为92±2.5％；菌种质量百分比占比为原料质量6-10％，发酵时长为48±12h，发酵搅拌速度45r/min。
8.根据权利要求6所述提取工艺，其特征在于，所述V2发酵过程中，还包括质量百分比为原料质量的2-4％马奇果酯提物A2。
9.根据权利要求6所述提取工艺，其特征在于，将发酵产物A5进行蛋白水解酶、β-葡萄糖苷酶酶解，所述蛋白水解酶、β-葡萄糖苷酶质量分数比为1:1.5-2；所述蛋白水解酶、β-葡萄糖苷酶，质量百分比占比为原料质量3-5％。
10.一种马奇果提取物的应用，其特征在于，包含权利要求1-8所述提取工艺所制备的马奇果提取物在化妆品，医药，保健品中的应用。
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