CN1187356C - 高获得率提取替曲朵辛的系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高获得率提取替曲朵辛的系统，其包括浸取过滤装置，离子交换柱，硅藻土-活性炭柱，真空浓缩器等。以河豚鱼卵巢为例，每次可以投料20-100公斤。

Description

高获得率提取替曲朵辛的系统

本发明涉及一种高获得率提取替曲朵辛(也称为河豚毒素TTX)的系统。

按照“高获得率提取替曲朵辛的方法”(中国专利申请号00123416.3，2000年9月18日)，从河豚鱼卵巢中提取替曲朵辛的方法包括以下5个步骤：

第一步：用水和加入卵巢重量0.1％-1％的乙酸浸泡河豚鱼卵巢数小时，然后加压快速过滤。

第二步：加热浸取液70-95℃除去可溶蛋白。

第三步：用有机碱的水溶液(例如氨水)调节过滤出蛋白的清液pH值在6.0-7.5之间，过阳离子交换树脂富集″替曲朵辛″。

第四步：调节含替曲朵辛溶液的pH值并在一定时间内通过活性炭与硅藻土柱，去除碱性氨基酸。

第五步：真空浓缩纯化”替曲朵辛″结晶。

按照该提取方法，可将替曲朵辛的提取率提高到现有技术的3倍，即以100公斤河豚鱼有毒卵巢计算，可以提取出纯度为80-88％的″替曲朵辛″4-6克。

本发明是基于以上方法的规模化生产的应用。采用本发明的提取系统，生产流程可以连续进行。如果一次投料在20-100公斤之间，每天24小时进行，6-7天可以完成一个生产周期。如果一次投料20公斤，可获替曲朵辛0.8-1.2克，如果一次投料100公斤，可获替曲朵辛4-6克。

本发明提供从生物组织中提取替曲朵辛的系统由如下部分组成：浸取过滤装置(M108)，加热器，离子交换柱(V106)，硅藻土—活性炭柱(V104)，旋转干燥器、真空浓缩器(M101)。

以下将参考附图进一步描述本发明，在附图中：

图1是高获得率提取替曲朵辛系统的流程图。

图2是浸取过滤装置的示意图。

图3是实施例1中用HPLC测定的替曲朵辛含量的图。

图4是实施例2中用HPLC测定的替曲朵辛含量的图。

本发明的提取系统命名为IWT-112(见说明书附图图1)，主要由如下部分组成：浸取过滤装置IWT-113(M108)，加热器，离子交换柱IWT-312(V106)，硅藻土-活性炭柱IWT-412(V104)，真空浓缩器(M101)等。

图1所示系统还可以包括其他部件，如高位槽(V102，M107，V105)和输液泵(P103)。

浸取过滤装置IWT-113(M108)：

如图2所示，其中各部件编号如下：

1： 减速机连接轴  2： 压力表    3： 进水阀   4： 投料口

5： 封头          6： 密封垫    7： 筒体     8： 搅拌器

9： 过滤布        10：过滤纸    11：垫圈     12：孔板

3： 真空阀        14：安全阀    15：进气阀   16：放空阀

17：真空表        18：排液口    19：支架×4

浸取过滤装置IWT-113(M108)起浸泡和过滤两个作用，由金属制造，最好是不锈钢等耐腐蚀材料，由上、中、下三部分组成(见说明书附图1)，分别称为“封头(5)”，“浸取桶”和“减压舱”，每部分可以拆开。

封头(5)上设置有减速机连接轴(1)、压力表(2)、进水阀(3)、投料口(4)、安全阀(14)、进气阀(15)和放空阀(16)。减速机连接轴(1)可以接减速机为螺旋桨形搅拌器(8)提供动力，搅拌速度在60-120转/分钟左右，搅拌的作用在于增加浸取和过滤速度，同时还可以帮助清除废渣时使用。进水阀(3)供给第二次、第三次以至第四次浸取所用的水。进水阀(3)还可以用于在浸取完成后，在搅拌下注入水，用泵从投料口(4)抽出浸取后的废渣。

安全阀(14)保证过滤时，浸取桶内气压可控制在0.5-1.5公斤/平方厘米之间，视情况需要可以提高到6公斤/平方厘米。进气阀(15)可连接空气压缩机保证供给浸取桶的压力。放空阀(16)用于解除浸取桶中的气压。

“封头(5)”使用密封垫(6)封头和“浸取桶”通过螺丝上紧相连。“减压舱”与“浸取桶”之间设置有过滤材料，在浸取过程中，通过“减压舱”中减压或“浸取桶”中加压，使过滤能较快进行。过滤材料可以是加在不锈钢之间的过滤纸(10)、过滤布(9)或其它多孔过滤材料，其中，所述尼龙滤网的规格可以是100-200目；不锈钢网的规格可以是30-100目，最好为40-60目；金属孔板(12)的孔径可以是2-10毫米，最好是3-4毫米。例如由100-200目尼龙滤网，40-60目不锈钢网，孔径3毫米的金属孔板(12)组合而成。还可以是下列组合：100-200目尼龙滤网，中-快速滤纸，40-60目不锈钢网，孔径3毫米的金属孔板(12)。

在“减压舱”侧装有真空阀(13)，在底部装有排液口(18)。

加热器可以是工业标准用的油浴加热器或者是蒸汽加热器。

在加热器的下游串联有另外一个IWT-113装置(M108)，用于过滤除去加热滤液后凝固的蛋白质等。

IWT-312离子交换柱(V106)：

为了富集与纯化替曲朵辛时更好的除去蛋白质和多肽以及它们转化产生的物质，我们设计了IWT-312离子交换柱(V106)，可以很充分地洗去离子交换柱中存在的蛋白质和多肽以及它们转化产生的物质。这些物质如果不除去，在洗脱离子交换柱时，它们和替曲朵辛一起被洗脱下来，始终和替曲朵辛保留在一起，以后很难使替曲朵辛从含有它们的很稠的溶液中沉淀出来。

IWT-412硅藻土-活性炭柱(V104)：

为了除去经过离子交换柱后洗脱液中残存的碱性氨基酸，我们设计了在活性炭中加入硅藻土填充的IWT-412柱子(V104)。洗脱液通过IWT-412可以再一次使替曲朵辛纯化。硅藻土-活性炭柱(V104)上层为硅藻土，下层为活性炭，硅藻土层的厚度为活性炭层厚度的1/10到1/2，最好是1/10-1/5。

使用本发明的系统提取流程如下：

1.水浸取过程

取河豚鱼有毒性的卵巢20-100公斤，绞碎为小于1厘米的碎块，放置于浸取过滤装置IWT-113(M108)中，加入1∶1.5的去离子水，为了使TTX更好地从卵巢中浸取出，加入卵巢重量0.1-1％的乙酸。开动搅拌机，在室温搅拌数小时，停止搅拌，然后开动真空泵减压过滤，数分钟后，开动压缩机，让浸取一过滤装置上部压力达到0.5-1.5公斤/平方厘米。收集滤液，快速加热至70-95℃，加热时间3-25分钟，冷却后过滤出析出的蛋白，得黄色透明液体，称为第一次浸取清液。

向第一次浸取过滤后的滤渣加入去离子水，搅拌数小时，如第一次浸取一样，过滤，加热，过滤，收集第二次浸取液。用类似的方法，收集第三次、第四次浸取清液。如果使用猛毒性和强毒性卵巢，仍需收集第四次浸取清液，如果使用弱毒性卵巢，只需收集第三次浸取清液。

将第一、第二、第三和第四次浸取液合并在一起，叫做浸取清液，用生物法或HPLC法测定浸取清液毒素含量。

2.离子交换富集和分离毒素过程

将浸取清液用氨水调节溶液pH值达6.0-7.5，如果有沉淀产生，过滤出沉淀，将过滤所得浸取清液通过阳离子交换树脂柱IWT-312(V106)，流出速度为2000-3750毫升/小时，流出液用硅胶薄版监控有没有毒素泄露。如果发现有TTX泄漏立即换新的树脂柱。

浸出清液全部通过柱子后，用去离子水洗柱子直到洗到交换柱不再保留蛋白为止。再用5-12％的乙酸溶液洗交换柱IWT-312，洗脱流出速度500-2500毫升/小时，按每份1500毫升收集洗脱液，每份用TLC检测、收集含有毒素的洗脱液。

3.活性炭纯化过程

合并从离子交换柱IWT-312(V106)上用乙酸洗脱出含有毒素的溶液，用浓氨水调节溶液pH值为8-9，该条件下的时间应控制在2-4小时。然后通过由硅藻土活性炭填充的柱子IWT-412(V104)，去离子水洗柱子后，用含有酸的醇溶液(酸和醇浓度在0.5-40％之间)洗柱，尽可能洗下所吸附的毒素(用TLC检测)。

4.浓缩结晶过程

将全部从IWT-412(V104)柱上洗脱下来的含有毒素的溶液在减压下浓缩，冷却后，用氨水调节溶液pH值为8-9，放置后让TTX沉淀。然后过滤出沉淀，用去离子水洗沉淀数次，然后抽干将沉淀溶于稀乙酸，再加氨水让TTX沉淀再沉淀，如此操作再重复一次，将获得的TTX结晶放在真空干燥器中干燥24小时，干燥至恒重后，得到TTX结晶。用HPLC方法测定其含量。

实施例：

实施例1：

取河豚鱼有毒性的卵巢20公斤，绞碎为一厘米大小的碎块，放置于浸取过滤装置IWT-113中，加入30公斤去离子水，和30毫升乙酸。开动搅拌机，搅拌10小时，再开动真空抽气机使过滤装置中的滤液流出。然后开动空气压缩机使滤液快速流出，过滤完毕后，重新加入30公斤去离子水进行第二次浸取。浸取10小时后，再过滤。如此进行四次，直到过滤出的滤液(注射小白鼠检查清液)中TTX每升中含量低于0.5毫克为止。

然后，将上述滤液合并，滤液被加热到80℃5分钟，冷却后，进入下一个IWT-113(M108)装置过滤出凝固的蛋白。用氨水调节过滤出蛋白后的清液pH值达7.5。将pH值达7.5的清液通过阳离子交换树脂柱IWT-312(V106)(直径6cm，填充D-152树脂(中国天津南开大学化工厂生产)铵型的1米高弱酸性阳离子交换树脂柱)。所有清液通过IWT-312(V106)后，用去离子水洗柱子，柱子被洗清后用10％乙酸水溶液淋洗出TTX。收集含TTX洗脱液，用浓氨水中和至pH8.5。将pH8.5含TTX溶液通过硅藻土-活性炭柱IWT-412(V104)，让TTX吸附在柱上，然后用含0.2％乙酸的20％乙醇水溶液洗出TTX，洗出的含TTX溶液在旋转蒸发器中浓缩到10-20毫升，冷却后用浓氨水调节浓缩液至pH等于9，放置冰箱中冷却析出TTX结晶，将结晶过滤出，溶于5％乙酸，再用浓氨水调节溶液pH等于9，再一次沉淀出TTX。过滤出TTX，获得TTX结晶后放在真空干燥器中干燥24小时，干燥至恒重后，TTX结晶经HPLC测定，其含量为85.4.％(见图3)，从20公斤卵巢获得TTX结晶1210mg，如按100公斤算，可得TTX结晶6.05克。

实施例2

捣碎100公斤河豚鱼卵巢，加水150升和150ml0.5％的乙酸，以下步骤按实施例1中的方法实施。最后得到TTX结晶5.82克，纯度按HPLC测定为80.0％(见图4)。

Claims (24)

1.从生物组织中提取替曲朵辛的系统，包括：浸取过滤装置(M108)，加热器，离子交换柱(V106)，硅藻土-活性炭柱(V104)，旋转干燥器、真空浓缩器(M101)。

2.如权利要求1所述的系统，其中，所述浸取过滤装置(M108)，由上、中、下三部分组成分别称为封头(5)，浸取桶和减压舱，每部分可以拆开。

3.如权利要求2所述的系统，其中，所述封头上设置有减速机连接轴(1)、压力表(2)、进水阀(3)、投料口(4)、安全阀(14)、进气阀(15)和放空阀(16)。

4.如权利要求3所述的系统，其中，所述减速机连接轴(1)可以接减速机为螺旋桨形搅拌器(8)提供动力。

5.如权利要求4所述的系统，其中，所述搅拌器(8)的搅拌速度在10-200转/分钟范围内。

6.如权利要求5所述的系统，其中，所述搅拌器(8)的搅拌速度在60-120转/分钟的范围内。

7.如权利要求3所述的系统，其中，所述安全阀(14)保证过滤时，浸取桶内气压可控制在0.5-6公斤/平方厘米之间。

8.如权利要求7所述的系统，其中，所述安全阀(14)保证过滤时，浸取桶内气压可控制在0.5-1.5公斤/平方厘米之间。

9.如权利要求3，7或8所述的系统，其中，所述进气阀(15)连接空气压缩机保证供给浸取桶的压力。

10.如权利要求2所述的系统，所述减压舱与浸取桶之间设置有过滤材料。

11.如权利要求10所述的系统，其中，所述过滤材料是过滤纸(10)、过滤布(9)或其它多孔过滤材料。

12.如权利要求11所述的系统，其中，所述过滤材料可以是以下材料其中的一种或组合：尼龙滤网，不锈钢网，过滤纸(10)，以及金属孔板(12)。

13.如权利要求12所述的系统，其中，所述尼龙滤网的规格为100-200目。

14.如权利要求12所述的系统，其中，所述不锈钢网的规格为30-100目。

15.如权利要求14所述的系统，其中，所述不锈钢网的规格为40-60目。

16.如权利要求12所述的系统，其中，所述金属孔板(12)的孔径为2-10毫米。

17.如权利要求16所述的系统，其中，所述金属孔板(12)的孔径为3-4毫米。

18.如权利要求12所述的系统，其中，所述过滤材料由上到下为下列组合：100-200目尼龙滤网，40-60目不锈钢网，孔径3毫米的金属孔板(12)。

19.如权利要求12所述的系统，其中，所述过滤材料由上到下为下列组合：100-200目尼龙滤网，中-快速滤纸，40-60目不锈钢网，孔径3毫米的金属孔板(12)。

20.如权利要求2所述的系统，其中，所述减压舱的侧壁装有真空阀(13)，在底部装有排液口(18)。

21.如权利要求1所述的系统，其中，所述硅藻土-活性炭柱(V104)由活性炭中加入硅藻土填充上下两层组成。

22.如权利要求1所述的系统，其中，所述硅藻土-活性炭柱(V104)上层为硅藻土，下层为活性炭。

23.如权利要求22所述的系统，其中，所述硅藻土层的厚度为活性炭层厚度的1/10到1/2。

24.如权利要求23所述的系统，其中，所述的硅藻土层的厚度为活性炭层厚度的1/10-1/5。

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