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CN118726346B - Hla基因扩增引物、试剂盒以及测序文库构建方法 - Google Patents

Hla基因扩增引物、试剂盒以及测序文库构建方法 Download PDF

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CN118726346B
CN118726346B CN202411230049.6A CN202411230049A CN118726346B CN 118726346 B CN118726346 B CN 118726346B CN 202411230049 A CN202411230049 A CN 202411230049A CN 118726346 B CN118726346 B CN 118726346B
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hla
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Shanghai Dishuobeiken Gene Technology Co ltd
Shanghai Tissuebank Biotechnology Co ltd
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Abstract

本申请适用于基因检测技术领域，提供了HLA基因扩增引物、试剂盒以及测序文库构建方法，本申请提供的16组HLA基因多重扩增引物组，可以单独进行PCR扩增得到扩增基因，并且可以组合进行单管多重PCR扩增，从而简化了实验过程，提高了分型的灵敏度和准确度。利用本申请的引物组扩增产物制备文库，可应用于基于二代测序平台测序技术检测六个基因组的等位基因，并且具备检测周期短，能满足六分位分型精度的优势，解决了现有检测技术准确度低，检测周期长的问题。

Description

HLA基因扩增引物、试剂盒以及测序文库构建方法
技术领域
本申请属于基因检测技术领域，尤其涉及HLA基因多重扩增引物组、试剂盒以及测序文库构建方法。
背景技术
人类白细胞抗原（Human Leukocyte Antigen, HLA）是6号染色体上一类编码主要组织相容性复合体（Major Histocompatibility Complex, MHC）基因。HLA以高度的多态性成为人类重要的遗传标记，在免疫应答和调控中发挥着重要作用。
造血干细胞移植可用于多种血液病的治疗，包括血液系统恶性肿瘤，如急性白血病、慢性粒细胞白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征等；以及某些血液系统非恶性肿瘤，如重型再生障碍性贫血、地中海贫血等。全世界每年约6万名患者接受造血干细胞移植，而这些患者的命运取决于临床医生如何通过HLA检验为他们快速地找到匹配良好的供体。HLA-I型（HLA-A、B、C）和HLA-II型（HLA-DPA1、DPB1、DQA1、DQB1、DRA、DRB1、DRB3/4/5）在移植配型中均发挥重要功能。
随着测序技术的发展，基于DNA序列的HLA分型技术取代了传统血清学及细胞学分型方法，包括特异性引物法（SSP）、序列特异性寡核苷酸探针方法（SSO）、一代测序方法（SBT）及近二代测序方法（NGS）基因分型。SBT分型是WHO推荐的HLA分型的标准，已成为高分辨HLA检验的“黄金标准”。2017年德必碁生物科技股份有限公司生产的HLA（A、B、C、DQB1、DRB1）分型试剂盒（PCR-SBT法）获得CFDA认证。该产品不包含DPB1以及其他二类基因座分型试剂，无法对其他经典HLA基因进行分型，然而，已有研究证实DPB1错配会极大增加GVHD风险，降低患者无病生存率。
HLA-A、B、C、DPA1、DPB1、DQA1、DQB1、DRA、DRB1、DRB3/4/5十二个经典的HLA基因座与造血干细胞，器官移植排斥反应、预后密切相关。随着DNA分型发展，上述十二个抗原的已知等位基因的数量也急剧增加。2017年，国际IPD-IMGT/HLA数据库收录了17509个等位基因，到2024年1月增加到38909个。上述新增HLA型是已有SBT分型试剂盒不能覆盖的。另外，随着HLA等位基因数的增长，HLA SBT法分型结果的模棱两可的问题也随之增加，这对有效供受体配型提出了艰巨的挑战，并将SBT分型技术弊端显露出来。另外，一代测序技术存在实验流程复杂，分析人员技术要求高，检测周期长，成本高，未覆盖全部外显子区域等弊端，不适合医院开展该项检测项目。
NGS高通量测序技术可以大规模并行测序，并将每次处理的数据输出增加了1000倍，降低了成本，可同时处理许多样品。其次，NGS采用了处理杂合样品中相关多态性的克隆方法，无需额外的昂贵且耗时的流程或验证检验，以解决顺反模糊性。研发人员开发了多种基于二代测序技术的分型检测试剂盒，比如针对HLA三个基因座A,B,DRB1的主要外显子进行短片段扩增以及使用样本序列标签建库的方法；以及针对HLA三个基因座A,B,C的全长以及两个基因座DQB1,DRB1的部分外显子区域进行长片段扩增的方法，不同基因座需要使用不同的PCR扩增体系，构建好的文库在两种因美那平台做了测试对比；以及针对HLA十一个基因座A,B,C,DPA1,DPB1,DQA1,DQB1,DRB1,DRB3/4/5的全部外显子区域进行长片段扩增的方法，包含9组扩增引物，共计18条引物序列，扩增片段大小介于2800bp~11774bp之间，PCR扩增每个循环延伸时间需要12min~22min，共需要30个循环，换句话说每做一轮PCR反应需要花费8个小时，构建好的文库在三代测序平台上进行测序；以及针对HLA六个基因座A,B,C的全长以及三个基因座DPB1,DQB1,DRB1的部分外显子区域进行长片段扩增的方法，展示的大部分位点分型结果只能做到G组分型结果，未能做到六分位分型。
综上所述，现有HLA分型检测试剂盒存在以下不足：1、由于一代测序技术平台的缺陷，HLA分型结果模棱两可情况越来越多，做不到准确分型；2、现有基于二代测序技术平台的检测试剂盒外显子覆盖不全，做不到准确分型；3、现有基于三代测序技术平台的检测试剂盒检测周期长、未覆盖HLA-DRA基因座。
发明内容
本申请实施例的目的在于提供了HLA基因扩增引物、试剂盒以及测序文库构建方法，旨在解决现有HLA分型检测技术存在准确度低，检测周期长的问题。
本申请实施例的第一方面提供了HLA基因扩增引物，包括以下16组引物组：
引物组1：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；引物组2：SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；引物组3：SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；引物组4：SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；引物组5：SEQID NO.9和SEQ ID NO.10；引物组6：SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；引物组7：SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；引物组8：SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16；引物组9：SEQ ID NO.17和SEQID NO.18；引物组10：SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20；引物组11：SEQ ID NO.21和SEQ IDNO.22；引物组12：SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24；引物组13：SEQ ID NO.25和SEQ IDNO.26；引物组14：SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30和SEQ IDNO.31；引物组15：SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35和SEQ IDNO.36；引物组16：SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.38 SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40和SEQ IDNO.41。
优选地，所述HLA基因扩增引物，还包括以下引物组：
引物组17：SEQ ID NO.42和SEQ ID NO.43；引物组18：SEQ ID NO.44和SEQ IDNO.45；引物组19：SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.47；引物组20：SEQ ID NO.48和SEQ IDNO.49；引物组21：SEQ ID NO.50和SEQ ID NO.51；引物组22：SEQ ID NO.52和SEQ IDNO.53。
本申请实施例的第二方面提供了用于HLA基因测序的试剂盒，所述试剂盒包括上述第一方面提供的HLA基因扩增引物。
本申请实施例的第三方面提供了HLA基因测序文库构建方法，包括：
采用上述第一方面提供的HLA基因扩增引物对受试样品进行扩增反应，得到扩增产物；
对扩增产物片段化，磁珠纯化，接头连接富集扩增反应，构建得到HLA基因测序文库；
对所述HLA基因测序文库进行分选纯化、质检。
本申请实施例提供了16组HLA基因多重扩增引物组，可以单独进行PCR扩增得到扩增基因，并且可以组合进行单管多重PCR扩增，从而简化了实验过程，提高了分型的灵敏度和准确度。利用本申请的引物组扩增产物制备文库，可应用于基于二代测序平台测序技术检测六个基因组的等位基因，并且具备检测周期短，能满足六分位分型精度的优势，解决了现有检测技术准确度低，检测周期长的问题。
此外，本申请实施例还提供了22组HLA基因多重扩增引物组，可以进一步检测更全面的十二个HLA基因座的等位基因，解决了现有检测技术覆盖基因座少、外显子覆盖不全，做不到准确分型的问题。
附图说明
图1为本申请实施例提供的HLA基因扩增引物设计位置图；
图2为本申请实施例提供的六基因座多重扩增后的凝胶电泳图；
图3为本申请实施例提供的六基因座测序文库片段大小分布图；
图4为本申请实施例提供的六基因座测序文库下机数据量统计图；
图5为本申请实施例提供的六基因座测序文库数据利用率统计图；
图6为本申请实施例提供的六基因座测序文库片段分析长度统计图；
图7为本申请实施例提供的六基因座测序扩增子覆盖深度统计图；
图8为本申请实施例提供的六基因座测序扩增子均衡性统计图；
图9为本申请实施例提供的六基因座等位基因占比统计图；
图10为本申请实施例提供的六基因座不同分析数据量运行时间统计图；
图11为本申请实施例提供的六基因座不同分析数据量覆盖深度统计图；
图12为本申请实施例提供的十二基因座测序扩增子均衡性统计图。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
本申请实施例提供了HLA基因扩增引物，包括以下16组引物组：
引物组1：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；引物组2：SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；引物组3：SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；引物组4：SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；引物组5：SEQID NO.9和SEQ ID NO.10；引物组6：SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；引物组7：SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；引物组8：SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16；引物组9：SEQ ID NO.17和SEQID NO.18；引物组10：SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20；引物组11：SEQ ID NO.21和SEQ IDNO.22；引物组12：SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24；引物组13：SEQ ID NO.25和SEQ IDNO.26；引物组14：SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30和SEQ IDNO.31；引物组15：SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35和SEQ IDNO.36；引物组16：SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.38 SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40和SEQ IDNO.41。
在本申请实施例中，各引物组中引物的工作液浓度摩尔比的关系为：
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为1:2；SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4为1:1；SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6为1:4；SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8为3:8；SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10为5:4；SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12为4:5；SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14为1:1；SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16为1:1；SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18为2:3；SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20为1:2；SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22为1:1；SEQ ID NO.23和SEQ IDNO.24为38:63；SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26为5:4；SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ IDNO.29、SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.31为12:12:20:25:12；SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36为100:50:100:37:25；SEQ ID NO.37、SEQ IDNO.38、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.41为6:50:10:25:6。
在本申请实施例中，各引物组的工作液浓度摩尔配比为：
引物组1：引物组2：引物组3：引物组4：引物组5：引物组6：引物组7：引物组8：引物组9：引物组10：引物组11：引物组12：引物组13：引物组14：引物组15：引物组16=60：16：25：55：45：45：20：24：50：15：10：101：18：81：312：199。
本申请实施例还提供了另一种HLA基因扩增引物，包括22组引物组，即在上述实施例的基础上还包括以下引物组：
引物组17：SEQ ID NO.42和SEQ ID NO.43；引物组18：SEQ ID NO.44和SEQ IDNO.45；引物组19：SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.47；引物组20：SEQ ID NO.48和SEQ IDNO.49；引物组21：SEQ ID NO.50和SEQ ID NO.51；引物组22：SEQ ID NO.52和SEQ IDNO.53。
在本申请实施例中，各引物组中引物的工作液浓度摩尔比的关系为：
SEQ ID NO.42和SEQ ID NO.43为1:1；SEQ ID NO.44和SEQ ID NO.45为1:1；SEQID NO.46 和SEQ ID NO.47为1:1；SEQ ID NO.48和SEQ ID NO.49为2:1；SEQ ID NO.50和SEQ ID NO.51为1:1；SEQ ID NO.52和SEQ ID NO.53为1:1。
在本申请实施例中，各引物组的工作液浓度摩尔配比为：
引物组1：引物组2：引物组3：引物组4：引物组5：引物组6：引物组7：引物组8：引物组9：引物组10：引物组11：引物组12：引物组13：引物组14：引物组15：引物组16：引物组17：引物组18：引物组19：引物组20：引物组21：引物组22=60：16：25：55：45：45：20：24：50：15：10：101：18：81：312：199：30：200：80：60：80：60。
本申请实施例还提供了用于HLA基因测序的试剂盒，所述试剂盒包括上述的HLA基因扩增引物。
值得注意的是，对于HLA基因分型，需要做到六分位分型，才能确定HLA基因编码的氨基酸，从而才能确定编码的蛋白，也就是说至少需要将HLA基因所有外显子覆盖到，而现有检测试剂盒均因为长片段扩增的限制，未覆盖全部外显子区域，所以本申请考虑到短片段多重扩增的方式，尽管多对引物多重扩增体系技术上实现有难度，而且HLA基因家族表现出高度的多态性，这对引物序列设计的特异性提出了挑战。最终本申请创新设计的试剂盒既能满足六分位分型精度，又解决了长片段扩增的问题，同时也缩短了实验周期。
本申请实施例还提供了HLA基因测序文库构建方法，包括：
采用上述的HLA基因扩增引物对受试样品进行扩增反应，得到扩增产物；
对扩增产物片段化，磁珠纯化，接头连接富集扩增反应，构建得到HLA基因测序文库；
对所述HLA基因测序文库进行分选纯化、质检。
其中，扩增反应程序为：95℃×2min；95℃×30sec，58~66℃×30sec，68℃×2min，25个循环；68℃×10min。
其中，接头连接富集扩增程序为：72℃，180sec；98℃，30sec；98℃，15sec，65℃，30sec，72℃，30sec，6~9个循环；72℃，300sec。
其中，片段化程序为：55℃，10~20min。
为了使上述方案更加具体，提供如下具体实施例。
实施例1：HLA六个基因座检测实验方法与结果分析
本实施例采用14例细胞系参考品样本来研究本申请检测HLA六个基因座的技术可行性。具体检测方法包括以下步骤：
S1、基因组DNA提取；
14例细胞系参考品样本S1~S14来自上海荻硕贝肯生物科技有限公司标准品实验室，是人全血转化的永生化细胞，均已通过一代测序金标准方法获得HLA基因分型结果，结果如表1-2所示，可用于HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3/4/5分型检测试剂盒的准确性评价。
使用上海荻硕贝肯生物科技有限公司生产的核酸提取试剂盒进行提取，提取过程请严格按照其说明书进行。确保14例细胞系参考品样本基因组DNA浓度均＞10ng/μL，体积＞20μL，对浓度高于50ng/μL的基因组DNA进行稀释，最终14例细胞系参考品样本基因组DNA介于10ng/μL~50ng/μL。
S2、基因组DNA扩增；
采用本申请试剂盒对上述基因组DNA进行PCR扩增，所述试剂盒组分如表3所示。
其中多重扩增MIX为商品化试剂，供应商为宝生物（货号：RR062A），其他厂商例如诺唯赞生物（货号：PM201）、近岸生物（E086-01A）亦可；Primer Mix A为16组引物组（组合1~组合16）的混合物，用于六个基因座的基因分型检测；Primer Mix B为22组引物组（组合1~组合22）的混合物，用于十二个基因座的基因分型检测，根据IMGT/HLA数据库中的等位基因序列比对数据，在内含子保守区设计特异性引物序列，引物设计位置如图1所示，引物委托生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列、浓度、覆盖范围以及扩增片段大小如表4所示。
使用上述检测试剂盒配制扩增反应体系，总反应体系25μL，各组分加入量如表5所示。
盖紧反应管短暂离心后在ABI 9700上进行PCR扩增反应，扩增反应程序如表6所示，每批次实验需设置阴性对照（NTC）。
S3、多重扩增产物质检；
PCR反应结束后，使用琼脂糖凝胶电泳对PCR反应产物进行质检。建议使用0.8%w/v琼脂糖凝胶。扩增子核酸凝胶图如图2所示，扩增片段大小介于700bp~2500bp之间。
S4、测序文库构建；
使用TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina（诺唯赞，TD501-02）试剂盒并搭配TruePrep Index Kit V2 for Illumina（诺唯赞，TD202/TD203）对多重PCR扩增产物进行后续的文库构建操作，本申请对商品化建库试剂盒使用进行了优化，包括扩增产物片段化，磁珠纯化，接头连接富集，分选纯化，文库片段质检，具体操作步骤如下。该步骤亦可采用其他测序通用建库试剂盒代替，例如：IGT@ Enzyme Plus Library Prep Kit V3（艾吉泰康，C11112）试剂盒等类似原理建库试剂。
扩增产物片段化：
按照反应孔数计算各试剂量，可将5×TTBL提前十分钟取出解冻，试剂混匀后按照表7配制片段化MIX（MIX中不含模板）。MIX配制完成后，放置在冻存盒上待用。
将所需MIX加入新的八联管中，每孔加入23μL。加完MIX后，贴上封口膜，2000rpm短离心后检查是否满足要求。用移液器吸取2μLPCR产物模板至片段化八联管对应孔内。盖上白色硅胶垫，2000rpm短离心后检查是否满足要求。八联管置于PCR仪中，反应程序如表8所示。此步骤是为了将扩增子打断成二代测序可用的片段大小。
磁珠纯化：
此步骤是为了中断酶切反应过程、去除引物二聚体和一些短片段产物。
a) 提前取出磁珠（诺唯赞，N411-02）振荡混匀后放至回复室温，或直接将从冰箱取出的磁珠涡旋振荡5min后备用。
b) 取15μL磁珠（0.6×）加入上述八联管内片段化产物中，吹打混匀。然后室温静置5min后，短暂离心，再移至磁力架上静置4min，使磁珠与上清充分分离。
c) 用100μL移液器轻轻吸取八联管中上清并丢弃，尽量吸净上清并不要吸到磁珠。
d) 向磁力板中加入100μL新鲜配置的80%乙醇漂洗磁珠，静置30sec，吸弃乙醇。
e) 重复上述清洗步骤d)，盖白色硅胶垫，短暂离心，置于磁力架吸附，使用10μL枪头吸弃乙醇。
f) 保持八联管始终处于磁力架上，敞开盖子静置至磁珠完全干燥（磁珠表面哑光，一般5~10min，可缩短或延长时间，具体时间根据室内温湿度调整，避免磁珠干裂）。
g) 磁珠完全干燥后，向八联管中加入15μLTE（生工，B541019-100）。
h) 使用移液器吹打，检查磁珠是否与TE充分混匀。然后在桌面静置5min，短暂离心后，再移至磁力架上静置2~4min，使磁珠与上清充分分离。
接头连接富集：
按照反应孔数计算各试剂量，按照表9配制二次扩增MIX（MIX中不含模板）。MIX配制完成后，室温解冻所需Index Mix，放置于冻存盒上待用。
用移液器吸取12μL纯化后的片段化产物至二次扩增八联管对应孔内；分别吸取2.5μLIndex Mix至对应孔内（此步骤需反复核对）。2000rpm短离心后检查是否满足要求。八联管置于PCR仪中，扩增反应程序如表10所示。此步骤是为了给不同样本加上样本标签，可以使不同样本并行测序。
分选纯化：
此步骤是为了去除长片段扩增产物，分选出400bp~700bp区域内的片段。
a) 准备一个0.2mL或者1.5mL的离心管（看样本量），每个反应孔吸取二次扩增产物10μL（确保混合样本内每个样本Index Mix不同），充分混匀，短暂离心后，吸取100μL用于后续磁珠分选纯化（不足100μL时，无核酸酶水补至100μL）。
b) 取55μL磁珠（0.55×）加入上述100μL的混合液中，在混匀仪上涡旋混匀至少10s，然后室温静置5min，短暂离心再移至磁力架上静置5min，使磁珠与上清充分分离。
c) 用200μL移液器轻轻吸取上清，转移至新的EP管中，尽量吸净上清并不要吸到磁珠，丢弃磁珠。
d) 取10μL磁珠（0.1×）与上清充分混匀，然后室温静置5min，再移至磁力架上静置5min，使磁珠与上清充分分离。
e) 用200μL移液器轻轻吸取上清并丢弃，尽量吸净上清并不要吸到磁珠。
f) 沿EP管壁打旋加入200μL新鲜配置的80%乙醇漂洗磁珠，静置2min，吸弃乙醇。
g) 重复上述清洗步骤f)，盖白色硅胶垫，短暂离心，置于磁力架吸附，吸弃乙醇。
h) 保持EP管始终处于磁力架上，敞开管盖静置至磁珠完全干燥（磁珠表面哑光，一般5min左右，可缩短或延长时间，具体时间根据室内温湿度调整，磁珠完全干燥即可）。
i) 保持磁力板始终处于磁力架上，向磁力板中加入43μL1×TE，若样本数小于10例，所用TE按比例加入（例：5例样本所用TE为20μL）。
j) 使用混匀仪涡旋混匀至少10s或使用移液器吹打，检查磁珠是否与TE充分混匀。然后在桌面静置5min，再移至磁力架上静置2min，使磁珠与上清充分分离。
k) 使用移液器各吸取40μL上清至新的EP管中，若样本数小于10例，吸取0.8×洗脱体积的上清量。
文库片段质检：
使用Qubit dsDNA HS（赛默飞，Q32854）检测试剂盒和High Sensitivity D1000Reagents（安捷伦，5067-5585）对最终文库的核酸浓度以及片段大小进行测定，文库片段大小如图3所示。
S5、测序文库上机测序及结果分析；
将构建好的文库在二代测序平台Illumina Novaseq上机后，14例细胞系参考品样本下机数据量如图4所示；下机数据使用开源的分析流程HLA-HD（Version 1.7.0）以及自研分析方法进行分析，每个参考品样本的下机数据经过去重、去除低质量数据等处理后，每个样本的数据利用率如图5所示；本申请对每个文库可利用的数据进行了分析，包括文库片段分析长度（图6）、16组扩增子覆盖深度（图7）、16组扩增子均衡性（图8）以及等位基因占比（图9）。文库片段分析长度均值282bp，加上接头长度，与片段大小检测结果相当；16组扩增子覆盖深度均值介于1767~5743之间，扩增子均衡性均值介于0.4~1.3之间，等位基因占比介于20%~80%之间，最小等位基因占比大于20%。同时本申请比较了自研分析方法在不同分析数据量（100MB、50MB、20MB）前提下运行的时间和覆盖深度，发现数据量越低，分析时间越短（图10），覆盖深度越低（图11）。细胞系参考品样本二代测序六基因座分型结果如表11所示。结果显示14例细胞系参考品样本自研分析方法二代测序四分位分析结果与一代测序结果一致，正确率100%，且本申请方法检测结果可以得到六分位精度分型结果，相比一代结果更加精确。本申请后续又检测了1000余例的临床样本，检测结果与一代测序检测结果一致（具体检测比对结果由于数据量较大未展示），这些分析数据显示本申请建立的HLA分型试剂盒检测方法准确且可靠。
实施例2：HLA十二个基因座检测实验方法与结果分析
本实施例仍然采用上述14例细胞系参考品样本来研究本申请检测HLA十二个基因座的技术可行性。具体检测方法包括以下步骤：
检测流程与六基因座检测方法基本相同，从基因组的提取、PCR扩增、建库测序以及数据分析，区别点在于十二基因座PCR扩增反应体系，反应体系配制如下：
PCR反应结束后，使用琼脂糖凝胶电泳对PCR反应产物进行质检。建议使用0.8%w/v琼脂糖凝胶。扩增子片段大小介于700bp~2500bp之间。
二代测序数据下机后使用开源的分析流程HLA-HD（Version 1.7.0）以及自研分析方法进行分析，本申请对每个文库可利用的数据进行了分析，包括22组扩增子均衡性（图12），22组扩增子均衡性均值介于0.4~1.3之间，可通过调整多重扩增引物比例调整优化；等位基因占比介于20%~80%之间，最小等位基因占比大于20%。细胞系参考品样本二代测序另外十二基因座的分型结果如表13所示，其中六基因座分型结果与实施例一检测结果一致，所以未展示。结果显示14例细胞系参考品样本自研分析方法二代测序四分位分析结果与一代测序结果一致，正确率100%，且本申请方法检测结果可以得到六分位精度分型结果，相比一代结果更加精确。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.HLA基因扩增引物，其特征在于，包括以下16组引物组：
引物组1：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；引物组2：SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；引物组3：SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；引物组4：SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；引物组5：SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.10；引物组6：SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；引物组7：SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；引物组8：SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16；引物组9：SEQ ID NO.17和SEQ IDNO.18；引物组10：SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20；引物组11：SEQ ID NO.21和SEQ IDNO.22；引物组12：SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24；引物组13：SEQ ID NO.25和SEQ IDNO.26；引物组14：SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30和SEQ IDNO.31；引物组15：SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35和SEQ IDNO.36；引物组16：SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.38 SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40和SEQ IDNO.41。
2.根据权利要求1所述的HLA基因扩增引物，其特征在于，各引物组中引物的工作液浓度摩尔比的关系为：
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为1:2；SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4为1:1；SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6为1:4；SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8为3:8；SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10为5:4；SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12为4:5；SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14为1:1；SEQ IDNO.15和SEQ ID NO.16为1:1；SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18为2:3；SEQ ID NO.19和SEQ IDNO.20为1:2；SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22为1:1；SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24为38:63；SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26为5:4；SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQ IDNO.30和SEQ ID NO.31为12:12:20:25:12；SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36为100:50:100:37:25；SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.38、SEQ IDNO.39、SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.41为6:50:10:25:6。
3.根据权利要求1所述的HLA基因扩增引物，其特征在于，各引物组的工作液浓度摩尔配比为：
引物组1：引物组2：引物组3：引物组4：引物组5：引物组6：引物组7：引物组8：引物组9：引物组10：引物组11：引物组12：引物组13：引物组14：引物组15：引物组16=60：16：25：55：45：45：20：24：50：15：10：101：18：81：312：199。
4.根据权利要求1所述的HLA基因扩增引物，其特征在于，还包括以下引物组：
引物组17：SEQ ID NO.42和SEQ ID NO.43；引物组18：SEQ ID NO.44和SEQ ID NO.45；引物组19：SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.47；引物组20：SEQ ID NO.48和SEQ ID NO.49；引物组21：SEQ ID NO.50和SEQ ID NO.51；引物组22：SEQ ID NO.52和SEQ ID NO.53。
5.根据权利要求4所述的HLA基因扩增引物，其特征在于，各引物组中引物的工作液浓度摩尔比的关系为：
SEQ ID NO.42和SEQ ID NO.43为1:1；SEQ ID NO.44和SEQ ID NO.45为1:1；SEQ IDNO.46 和SEQ ID NO.47为1:1；SEQ ID NO.48和SEQ ID NO.49为2:1；SEQ ID NO.50和SEQID NO.51为1:1；SEQ ID NO.52和SEQ ID NO.53为1:1。
6.根据权利要求4所述的HLA基因扩增引物，其特征在于，各引物组的工作液浓度摩尔配比为：
引物组1：引物组2：引物组3：引物组4：引物组5：引物组6：引物组7：引物组8：引物组9：引物组10：引物组11：引物组12：引物组13：引物组14：引物组15：引物组16：引物组17：引物组18：引物组19：引物组20：引物组21：引物组22=60：16：25：55：45：45：20：24：50：15：10：101：18：81：312：199：30：200：80：60：80：60。
7.用于HLA基因测序的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-6任一所述的HLA基因扩增引物。
8.HLA基因测序文库构建方法，其特征在于，包括：
采用权利要求1-6任一所述的HLA基因扩增引物对受试样品进行扩增反应，得到扩增产物；
对扩增产物片段化，磁珠纯化，接头连接富集扩增反应，构建得到HLA基因测序文库；
对所述HLA基因测序文库进行分选纯化、质检。
9.根据权利要求8所述的HLA基因测序文库构建方法，其特征在于，扩增反应程序为：95℃×2min；95℃×30sec，58~66℃×30sec，68℃×2min，25个循环；68℃×10min。
10.根据权利要求8所述的HLA基因测序文库构建方法，其特征在于，接头连接富集扩增程序为：72℃，180sec；98℃，30sec；98℃，15sec，65℃，30sec，72℃，30sec，6~9个循环；72℃，300sec。
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Denomination of invention: HLA gene amplification primers, kits, and sequencing library construction methods

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Pledgee: Shanghai Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pudong branch

Pledgor: SHANGHAI TISSUEBANK BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

Registration number: Y2025310000270