CN118726306A

CN118726306A - 一种紫红链霉菌磷脂酶a2突变体及其制备方法

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Publication number: CN118726306A
Application number: CN202410871496.3A
Authority: CN
Inventors: 潘力; 刘钊远; 王斌
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2024-07-01
Filing date: 2024-07-01
Publication date: 2024-10-01
Anticipated expiration: 2044-07-01
Also published as: CN118726306B

Abstract

本发明公开一种紫红链霉菌磷脂酶A₂突变体及其制备方法，属于生物技术领域。本发明共获得了6个单位点突变的突变体及5个组合突变体；相较于野生型，突变体N21E，Q47K，F53H，Y68H，I84L，Q116M，N21E/I84L，Q47K/I84L，I84L/Q116M，N21E/I84L/Q116M和Q47K/I84L/Q116M的酶活力均有所提高，分别提升了32.3％，20.2％，27.9％，20.5％，69.7％，60.5％，106.6％，92.9％，213.2％，406.5％，304.3％。本发明获得的磷脂酶A₂突变体酶活力得到显著提高，具有较大的工业应用潜力和经济价值。

Description

一种紫红链霉菌磷脂酶A2突变体及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种酶活提高的紫红链霉菌磷脂酶A₂突变体及其制备方法。

背景技术

磷脂(phospholipids)是所有生物体生物膜的主要成分，在自然界中广泛存在，发挥着多种多样的作用，具有重要的生理意义。由于磷脂所具有的独特理化性质和营养价值，磷脂在食品、保健品、医药及饲料等行业己经被广泛的应用。然而，在大多数应用情况下，天然存在的磷脂要么缺乏结构多样性，要么数量不足；因此，必须开发新方法来合成新分子或修改磷脂的自然结构。

酶法修饰改性是制备功能性磷脂的一个重要方向。磷脂酶A₂(PLA₂，EC 3.1.1.4)是水解磷脂的sn-2位置的酯键，生成游离脂肪酸和相应的溶血磷脂。与天然卵磷脂相比，PLA₂制备的卵磷脂不仅表现出乳化性能增强，而且在各种工艺条件下都能形成稳定的乳剂。因此，溶血卵磷脂在食品、化妆品和制药等工业领域有着广泛的应用。特别是，PLA₂可广泛用于酶解脱胶，这是植物油和其他食用油精制的关键工艺。

目前磷脂酶A₂在工业应用中有时仍受到限制。诸如天然磷脂酶在活性、特异性和稳定性方面不满足实际应用的需求，天然生产菌的磷脂酶产量不高等。因此获得高产量且满足食品安全用于功能油脂加工应用的磷脂酶迫在眉睫。通过蛋白质工程对酶进行改造是解决该问题的主要策略。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种酶活提高的紫红链霉菌磷脂酶A₂突变体及其制备方法。其中，突变体N21E，Q47K，F53H，Y68H，I84L，Q116M，N21E/I84L，Q47K/I84L，I84L/Q116M，N21E/I84L/Q116M和Q47K/I84L/Q116M的酶活力均有所提高，分别提升了32.3％，20.2％，27.9％，20.5％，69.7％，60.5％，106.6％，92.9％，213.2％，406.5％，304.3％；本发明获得了高酶活的磷脂酶A₂突变体，具有较大的工业应用潜力和经济价值。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种紫红链霉菌磷脂酶A₂突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1经如下任意一种突变而得：

N21E、Q47K、F53H、Y68H、I84L和Q116M中的至少一个；其中，N21E即第21位氨基酸由N突变为E，其他同理；

进一步的，紫红链霉菌磷脂酶A₂突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1经如下任意一种突变而得：

N21E；或Q47K；或F53H；或Y68H；或I84L；或Q116M；或N21E/I84L；或Q47K/I84L；或I84L/Q116M；或N21E/I84L/Q116M；或Q47K/I84L/Q116M。

编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

一种所述紫红链霉菌磷脂酶A₂突变体的编码基因。

优选的，一种酶活提高的紫红链霉菌磷脂酶A₂突变体N21E/I84L/Q116M，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。所述突变体的第21位，84位氨基酸和第116位氨基酸分别由天冬酰胺N、异亮氨酸I和谷氨酰胺Q突变为谷氨酸E、亮氨酸L和甲硫氨酸M。

一种酶活提高的紫红链霉菌磷脂酶A₂突变体N21E/I84L/Q116M的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

上述突变体相关的生物材料，为下述生物材料中的任意一种或多种组合：

(a)含有上述编码基因的表达盒；

(b)含有上述编码基因的重组表达载体；

(c)含有(a)中所述表达盒的重组表达载体；

(d)含有上述编码基因的重组微生物；

(e)含有(a)中所述表达盒的重组微生物；

(f)含有(b)或(c)中所述重组表达载体的重组微生物。

进一步的，(a)中所述表达盒使用的表达元件是：P43和PgntK双启动子，AprE信号肽和Ter终止子。

所述PgntK启动子的序列如SEQ ID NO.5中的第1-182bp所示。

所述AprE信号肽来源于枯草芽孢杆菌，其氨基酸序列如GenBank号：WP_015383267.1中的1-29aa所示；编码AprE信号肽的基因序列如SEQ ID NO.5中的第183-269bp所示。

进一步的，(b)、(c)中所述重组表达载体的出发载体为pBE系列的载体等；优选为pBE2-R载体、含有P43和PgntK双启动子的pBE载体等。

进一步的，(d)、(e)、(f)中所述重组微生物对应的宿主微生物选自原核生物或酵母等；所述原核生物包括芽孢杆菌属(Bacillus)等细菌；所述酵母包括毕赤酵母等酵母。更具体而言，所述原核生物是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，具体可为枯草芽孢杆菌ATCC6051和解淀粉芽孢杆菌LB1ba02；所述酵母是毕赤酵母GS115。

上述突变体、编码基因或突变体相关的生物材料在制备高酶活的磷脂酶A₂突变体中的应用。

上述突变体、编码基因或突变体相关的生物材料在生产功能磷脂中的应用。

进一步的，上述突变体、编码基因或突变体相关的生物材料应用于保健品、食品、医药、日化等领域和油脂精炼中。

一种获得上述突变体的方法，包括如下步骤：通过设计含有突变位点的引物对编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的紫红链霉菌磷脂酶A₂的基因进行定点突变后表达，得到紫红链霉菌磷脂酶A₂突变体。

进一步的，设计含有突变位点的引物向编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的紫红链霉菌磷脂酶A₂的基因中引入突变，经测序正确后转化至枯草芽孢杆菌ATCC6051中进行表达，得到紫红链霉菌磷脂酶A₂突变体。

本发明具体实施步骤如下：

1.构建磷脂酶A₂突变体重组表达载体：1)将经密码子优化后合成的紫红链霉菌磷脂酶A₂野生型基因和来源于枯草芽孢杆菌的AprE信号肽连接至含有P43和PgntK双启动子的pBE载体上，构建表达质粒pBE-P43-PgntK-AprE-SvPLA₂WT；2)通过重叠PCR扩增定点突变野生磷脂酶A₂，获得相应的磷脂酶A₂突变体表达质粒。

2.构建磷脂酶A₂突变体重组工程菌及以此制备高酶活的磷脂酶A₂：将磷脂酶A₂突变体表达质粒转化至枯草芽孢杆菌ATCC6051中，得到重组工程菌；之后经发酵得到磷脂酶A₂突变体。

3.磷脂酶A₂突变体酶学性质的表征：以2-硫代十六酰乙基磷酸胆碱为底物，使用微孔比色法测定突变体的酶学性质。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明共获得了11个酶活力提高的突变体，包括6个单位点突变的突变体及5个组合突变体；相较于野生型，突变体N21E，Q47K，F53H，Y68H，I84L，Q116M，N21E/I84L，Q47K/I84L，I84L/Q116M，N21E/I84L/Q116M和Q47K/I84L/Q116M的酶活力均有所提高，分别提升了32.3％，20.2％，27.9％，20.5％，69.7％，60.5％，106.6％，92.9％，213.2％，406.5％，304.3％。本发明获得的突变体酶活力得到显著提高，磷脂酶A₂酶活力提升进一步提升了该酶的工业利用价值。

附图说明

图1为野生磷脂酶A₂及突变体表达载体菌落PCR电泳图；其中，M为DL5000 DNAMarker，泳道1-12依次为：WT，N21E，Q47K，F53H，Y68H，I84L，Q116M，N21E/I84L，Q47K/I84L，I84L/Q116M，N21E/I84L/Q116M和Q47K/I84L/Q116M。

图2为野生型磷脂酶A₂及突变体相对酶活力柱状图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中未特别注明的操作步骤或条件，可参照常规技术进行。

实施例中，所用磷脂酶A₂来源于紫红链霉菌(Streptomyces violaceoruber)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，对其进行密码子优化后得到的编码基因核苷酸序列如SEQID NO.2所示，同时还在3’端引入6*His标签序列(CACCACCACCACCACCAC)，由商业公司合成得到。

实施例1

野生磷脂酶A₂及突变体表达载体的构建

(1)构建野生磷脂酶A₂表达载体

以pBEP43-Pcd-SamyQ-SplB-Fc质粒为模板，将模板中的Pcd-SamyQ-SplB-Fc-Ter部分替换为PgntK-AprE-SvPLA₂WT-6*His-Ter(序列见SEQ ID NO.5，其中，1-182bp：PgntK、183-269bp：AprE信号肽、270-635bp：SvPLA₂WT、636-656bp：6*His、657-695bp：Ter终止子)，通过化学法转化至大肠杆菌Match1 T1感受态细胞中，挑取阳性转化子测序鉴定，最后得到野生磷脂酶A₂表达载体pBE-P43-PgntK-AprE-SvPLA₂WT。

其中，pBEP43-Pcd-SamyQ-SplB-Fc质粒在文献“CN113957071A、一种具有双重启动子和双重分泌信号功能的组合DNA片段及其应用”中公开。

AprE信号肽的氨基酸序列如GenBank号：WP_015383267.1中的1-29aa所示。

(2)构建磷脂酶A₂突变体表达载体

以构建好的野生磷脂酶A₂表达载体pBE-P43-PgntK-AprE-SvPLA₂WT为模板，通过含有相应突变位点的扩增引物，扩增得到含相应位点突变的线性载体片段。

具体扩增引物如下表所示(小写为替换的密码子)：

多位点突变的质粒构建需要多引物对来进行扩增，以N21E/I84L突变体为例，需要以引物对N21E-F/I84L-R扩增片段1，I84L-F/N21E-R扩增片段2。通过Gib-无缝克隆(多片段)试剂盒，将扩增得到的片段进行同源融合，将连接产物通过化学法转化至大肠杆菌Match1 T1感受态细胞中，挑取阳性转化子测序鉴定，最后得到磷脂酶A₂突变体表达载体。

实施例2

野生磷脂酶A₂及突变体重组表达菌株的构建，发酵及蛋白纯化

(1)野生磷脂酶A₂及突变体重组表达菌株的构建

将实施例1中构建完成的磷脂酶A₂及突变体的表达载体，通过电转化法(2500V，4.3-5.5ms)将质粒转化至枯草芽孢杆菌ATCC6051感受态细胞中，使用含卡那霉素的LB平板作为筛选平板，从筛选平板中挑取转化子做菌落PCR鉴定(磷脂酶A₂完整的表达盒)，得到的阳性鉴定子即为正确的重组表达菌株。鉴定结果如图1所示，扩增条带大小为847bp，鉴定正确得到相应的重组表达菌株。

(2)野生磷脂酶A₂及突变体重组表达菌株发酵及蛋白纯化

a)将(1)中鉴定正确的磷脂酶A₂及突变体重组表达菌株，接种至5mL液体LB培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，37℃，220rpm培养8-14h，作为种子液；

b)将a)中种子液接种至LB培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，接种量1％，装液量50mL/250mL，于37℃，220rpm发酵24-48h；

c)将b)中所得发酵液离心(8000g，5min)去除菌体，所得上清液即为磷脂酶A₂粗酶液。

d)将c)中所得磷脂酶A₂粗酶液，用0.22μm滤头过滤。滤液通过镍株亲和层析纯化，用1.5柱体积的缓冲液Buffer B(500mM NaCl，500mM咪唑，20mM Tris-HCl，PH 8.0)洗涤柱，用缓冲液Buffer A(500mM NaCl，Tris-HCl，PH 8.0)漂洗至紫外基线水平后，将上清液装入HisTRAPTM HP Ni-NTA预包装柱，用B相与A相进行梯度混合进行梯度洗脱，目标蛋白在30％的缓冲液Buffer B洗脱下来。将收集到的洗脱液通过超滤(500mM NaCl，20mM Tris-HCl，3mM DTT(二硫苏糖醇)，PH＝8.0)置换溶液除去咪唑及杂蛋白，获得目的蛋白。

实施例3

磷脂酶A₂及突变体酶学性质分析

本发明采用微孔比色法测定磷脂酶A₂酶活力。其原理是基于1976年Aarsman等建立的巯基显色法，即以一种磷脂类似物2-硫代十六酰乙基磷酸胆碱(2-hexadecanoylthio-l-ethyl-phosphorylcholine，HEPC)作底物，该底物中sn-2位以硫酯键替代，仍可受磷脂酶A₂水解，并释放出游离巯基，与5,5’-二硫代硝基苯甲酸(DTNB)，在414nm波长附近有最大吸收，测定吸收值，换算出巯基的量就可以求出酶活力。酶活定义：37℃下，每分钟释放出1nmol游离巯基的酶量为1个单位酶活。

反应体系如下：

(1)基础液：将200mM Tris-Hcl(pH8.0)，200mM CaCl₂，5mM DTNB，5mM脱氧胆酸钠，按4.5：1：1：1的体积比配制成基础液。

(2)工作液：5mM HEPC 1mL加基础液15mL，混匀。

(3)对照液：蒸馏水1mL，加基础液15mL，混匀。

37℃，温育30min，测定A410，空白调零。

酶活力计算：

a)测定每分钟吸光度的变化：ΔA410/min＝A测-A对/30，用空白孔的ΔA410/min调零。

b)使用以下公式计算酶活：410nm处的反应速率可以用DTNB的消光系数来确定，DTNB在414nm处的实际消光系数是13.6mM^-1cm^-1，在410nm处DTNB的消光系数约为13.5mM^- ¹cm^-1，体积为200μL的反应液在96孔酶标板中的深度为0.606cm。

测定结果如图2所示，相较于野生型，突变体N21E，Q47K，F53H，Y68H，I84L，Q116M，N21E/I84L，Q47K/I84L，I84L/Q116M，N21E/I84L/Q116M和Q47K/I84L/Q116M的酶活力均有所提高，分别提升了32.3％，20.2％，27.9％，20.5％，69.7％，60.5％，106.6％，92.9％，213.2％，406.5％，304.3％。本发明获得的突变体酶活力得到显著提高，进一步提升了该酶的工业利用价值。

综上，与野生型磷脂酶A₂相比，本发明获得的突变体显著提高了其自身酶活力，在食品、医药等工业领域中有较大的应用价值。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种紫红链霉菌磷脂酶A₂突变体，其特征在于：所述紫红链霉菌磷脂酶A₂突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1经如下任意一种突变而得：

N21E、Q47K、F53H、Y68H、I84L和Q116M中的至少一个。

2.根据权利要求1所述的紫红链霉菌磷脂酶A₂突变体，其特征在于：所述紫红链霉菌磷脂酶A₂突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1经如下任意一种突变而得：

N21E；或Q47K；或F53H；或Y68H；或I84L；或Q116M；或N21E/I84L；或Q47K/I84L；或I84L/Q116M；或N21E/I84L/Q116M；或Q47K/I84L/Q116M；

其中，所述突变体N21E/I84L/Q116M的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根据权利要求1或2所述的紫红链霉菌磷脂酶A₂突变体，其特征在于：

编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

4.编码权利要求1～3任一项所述的紫红链霉菌磷脂酶A₂突变体的基因。

5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于：编码突变体N21E/I84L/Q116M的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

6.权利要求1～3任一项所述的紫红链霉菌磷脂酶A₂突变体相关的生物材料，其特征在于：为下述生物材料中的任意一种或多种组合：

(a)含有权利要求4或5所述基因的表达盒；

(b)含有权利要求4或5所述基因的重组表达载体；

(c)含有(a)中所述表达盒的重组表达载体；

(d)含有权利要求4或5所述基因的重组微生物；

(e)含有(a)中所述表达盒的重组微生物；

(f)含有(b)或(c)中所述重组表达载体的重组微生物。

7.根据权利要求6所述的生物材料，其特征在于：

(a)中所述表达盒使用的表达元件是：P43和PgntK双启动子，AprE信号肽和Ter终止子；

(b)、(c)中所述重组表达载体的出发载体为pBE系列的载体；

(d)、(e)、(f)中所述重组微生物对应的宿主微生物选自原核生物或酵母。

8.权利要求1～3任一项所述的紫红链霉菌磷脂酶A₂突变体、权利要求4～5任一项所述基因或权利要求6～7任一项所述生物材料的应用，其特征在于：为下述应用之一：

1)在制备高酶活的磷脂酶A₂突变体中的应用；

2)在生产功能磷脂中的应用；

3)在保健品、食品、医药、日化领域或油脂精炼中的应用。

9.一种获得权利要求1～3任一项所述紫红链霉菌磷脂酶A₂突变体的方法，其特征在于：包括如下步骤：通过设计含有突变位点的引物对编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的紫红链霉菌磷脂酶A₂的基因进行定点突变后表达，得到权利要求1～3任一项所述的紫红链霉菌磷脂酶A₂突变体。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：设计含有突变位点的引物向编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的紫红链霉菌磷脂酶A₂的基因中引入突变，经测序正确后转化至枯草芽孢杆菌ATCC6051中进行表达，得到权利要求1～3任一项所述的紫红链霉菌磷脂酶A₂突变体。