CN118725121A

CN118725121A - 一种单链抗体及其体外合成体系和应用

Info

Publication number: CN118725121A
Application number: CN202410378776.0A
Authority: CN
Inventors: 郭敏; 杨隆金; 徐丽琼; 胡家保; 朱亚军; 于雪
Original assignee: Kangma Healthcode Shanghai Biotech Co Ltd
Current assignee: Kangma Healthcode Shanghai Biotech Co Ltd
Priority date: 2023-03-31
Filing date: 2024-03-29
Publication date: 2024-10-01
Also published as: WO2024199476A1

Abstract

本发明提供了一种单链抗体及其体外合成体系和应用，该抗体同时具备高表达效率、高亲和力和高稳定性，在体外无细胞合成体系中一步高效表达，不需要分别分泌表达轻链和重链两个不同的蛋白片段，不易形成同源二聚体，具有较高的表达效率，可以大规模生产，具有较好的商业化前景。

Description

一种单链抗体及其体外合成体系和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种单链抗体及其体外合成体系和应用。

背景技术

随着人来对肿瘤发生发展机制认识的不断深入，肿瘤治疗已经开始进入个体化治疗的时代，而在个体化治疗的时代，而在个体化治疗的时代，而在个体化治疗中，最重要的一个治疗理念就是靶向治疗。肿瘤分子靶向治疗是利用肿瘤细胞表达而正常细胞很少或不表达的特定基因或基因的表达产物作为治疗靶点，最大限度地杀死肿瘤细胞。抗体对相应的抗原具有高度的特异性，针对特定的、与疾病发生发展相关的靶分子(抗原)，可以制备特异性的抗体。抗体用于治疗各种疾病特别在治疗癌症、自身免疫疾患和病毒感染中显示巨大的潜力和应用前景。

根据抗体分子的大小，将重组抗体可以分为小分子抗体、多价抗体、完整抗体、抗体基因组文库等。小分子抗体是利用原核表达系统或真核表达系统所制备的，以抗体轻链可变区和重链可变区为主，含有或不含有外源肽链的分子量较小的抗体片段。通常其大小只有完整IgG分子的1/3或1/2甚至更小，因此称为小分子抗体。其中小分子抗体较完整抗体而言，具有分子量小、易于体外表达和便于基因工程技术改造抗体性能等优点，具有更广阔的应用前景。小分子基因工程抗体主要包括单链抗体片段(single chain variablefragment，scFv)、双特异性抗体(bispecific antibody，BsAb)、三链抗体(triabody)、单域抗体(singledomain antibody，VHH)、二硫键抗体片段(single chain disulfide-bondvariable fragment，dsFv)、抗体Fab段(antigenbinding fragment，Fab)、抗体F(ab')2(Hoogenboom HR.Selecting and screening recombinant antibody libraries.NatBiotechnol.2005Sep；23(9):1105-16.)。目前小分子基因工程抗体家族研究报道较多的是单链抗体、抗体Fab段、二硫键抗体及单域抗体。

小分子抗体的优点有：(1)制备方法较其他基因工程抗体简单。(2)免疫原性要比原来的弱得多。如果将改形抗体构建成小分子抗体，更有可能消除其免疫原性。(3)由于分子量小，小分子抗体更容易通过血管壁(Bitencourt ALB,Campos RM,Cline EN,Klein WL,Sebollela A.Antibody Fragments as Tools for Elucidating Structure-ToxicityRelationships and for Diagnostic/Therapeutic Targeting of Neurotoxic AmyloidOligomers.Int J Mol Sci.2020Nov24；21(23):8920.)，穿透实体瘤，有利于肿瘤的治疗。(4)由于没有Fc段，不会产生由Fc介导的CDC和ADCC毒副作用，与全长的抗体相比，在体内半寿期短、周转快(Kholodenko RV,Kalinovsky DV,Doronin II,Ponomarev ED,KholodenkoIV.Antibody Fragments as Potential Biopharmaceuticals for Cancer Therapy:Success and Limitations.Curr Med Chem.2019；26(3):396-426.)，有利于放射免疫成像检查肿瘤；不能与非靶细胞的受体结合，更能集中到达肿瘤部位。(5)分子小，能与分布于病毒表面凹槽的抗原结合，有利于病毒性疾病的治疗。(6)在小分子抗体基因的端接上适当的酶基因或毒素蛋白基因，即可大量生产酶联抗体或免疫毒素。(7)可在微生物体系中表达，可发酵生产抗体，更快的生产，更高的产率，从而降低成本(Fernandes JC.Therapeuticapplication of antibody fragments in autoimmune diseases:current state andprospects.Drug DiscovToday.2018Dec；23(12):1996-2002.)，使抗体治疗得以普及。

传统的小分子重组抗体scFv及Fab存在一些问题：第一，由于scFv缺少了Fab的CH1和CL片段，造成大部分的scFv亲和力比同源的Fab亲和力低。此外，scFv容易形成二聚体结构，因此在长期储存的过程中，scFv的稳定性比相应的Fab的稳定差(Hust M,JostockT,Menzel C,Voedisch B,Mohr A,Brenneis M,Kirsch MI,Meier D,Dübel S.Single chainFab(scFab)fragment.BMC Biotechnol.2007Mar 8；7:14)。第二，由于Fab需要分别分泌表达两个不同的蛋白片段，其在大肠杆菌的周质腔加工折叠通过二硫键连接、Fab分子量较大约是scFv的2倍，Fab的轻链在表达后倾向于形成同源二聚体。因此，Fab在大肠杆菌系统分泌表达效率低于scFv。这些缺点限制抗体的商业化应用。为克服它们的缺点，期望可以制备新型的抗体，使其同时具备高表达效率、高亲和力和高稳定性。

近年来，报道的一种新型的抗体单链Fab(scFab)，由一条连接肽连接抗体重链Fd及轻链κ，以单链抗体的形式表达蛋白(KoerberJT,Hornsby MJ,WellsJA.An improvedsingle-chain Fab platform for efficient display and recombinant expression.JMol Biol.2015Jan30；427(2):576-86；Hanna R,Cardarelli L,Patel N,Blazer LL,AdamsJJ,Sidhu SS.A phage-displayed single-chain Fab library optimized for rapidproduction of single-chain IgGs.Protein Science.2020August；29(10):2075-2084；Koerber JT,Hornsby MJ,Wells JA.An improved single-chain Fab platform forefficient display and recombinant expression.J Mol Biol.2015Jan30；427(2):576-86)。

抗体单链Fab(scFab)其整合了Fab及scFv的优点，目前，已经报道的单链Fab具备以下特点：第一，展示了与Fab相同的抗原结合能力(Thie H,Binius S,Schirrmann T,HustM,Dübel S.Multimerization domains for antibody phage display and antibodyproduction.N Biotechnol.2009Dec 31；26(6):314-21.)；第二，具有比Fab更高的表达效率，可以包涵体的形式，大量制备抗体(Bird RE,Hardman KD,Jacobson JW,Johnson S,Kaufman BM,Lee SM,Lee T,Pope SH,Riordan GS,Whitlow M.Single-chain antigen-binding proteins.Science.1988Oct21；242(4877):423-6)；第三，抗体能在大肠杆菌表达系统或酵母真核表达系统大量制备抗体(Jordan E,Al-Halabi L,Schirrmann T,Hust M,Dübel S.Production of single chain Fab(scFab)fragments in Bacillusmegaterium.Microb Cell Fact.2007Nov 27；6:38.)，scFab可以代替scFv及Fab在噬菌体载体展示筛选高活性的抗体(Walker LM,Bowley DR,Burton DR.Efficient recovery ofhigh-affinity antibodies from a single-chain Fab yeast display library.J MolBiol.2009Jun5；389(2):365-75.)。第六，scFab由于具有抗体恒定区CH1及CL，分子量约是scFv的两倍，表现为抗体分子的相互作用的范德华力更强，表现为比scFv更为稳定(HannaR,Cardarelli L,Patel N,Blazer LL,Adams JJ,Sidhu SS.A phage-displayed single-chain Fab library optimized for rapid production ofsingle-chain IgGs.ProteinScience.2020August；29(10):2075-2084.)。

抗体大规模生产依赖于高水平的生产工艺开发，高水平的生产工艺需要同时具备高表达、高稳定性和可放大性等优点。抗体大规模生产是抗体药物产业化、商业化的重要环节，也是制约我国抗体产业发展的一个重大瓶颈。

发明内容

为克服小分子抗体稳定性差、传统市售单抗分泌表达效率低等限制抗体药物产业化、商业化应用的问题。本发明提供一种单链抗体及其体外合成方法和应用，其同时具备高表达效率、高亲和力和高稳定性，具有很好的产业化和商业化前景。

本发明第一方面提供一种单链抗体，其特征在于：其通过连接肽(linker)将抗体的轻链或轻链片段与抗体的重链或重链片段连接而成。

其中，单链全长抗体与对应抗原的结合活性与市售全长抗体具有相当的活性。

研究发现，不同组成和长度的linker所制备的单链抗体表现出不同的亲和活性和表达活性，因而本发明提供的单链抗体，对linker包含的氨基酸残基及其数量进行了优化改进，实现了单链抗体高效率表达的同时实现了单链抗体的高亲和性。

为了兼顾表达效率和特异性亲和活性，所述连接肽包含至少20个氨基酸残基，优选包含25～180个氨基酸残基，更优选30～120个氨基酸残基；

所述连接肽包含的氨基酸选自丝氨酸(S)、甘氨酸(G)、谷氨酸(E)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)、精氨酸(R)、酪氨酸(Y)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、谷氨酰胺(Q)、组氨酸(H)、苯丙氨酸(F)、缬氨酸(V)、脯氨酸(P)、天冬氨酸(D)、蛋氨酸(M)天冬酰胺(N)。

优选地，所述连接肽包含所述连接肽包含的氨基酸选自丝氨酸(S)、甘氨酸(G)、谷氨酸(E)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)。

在一种优选的实施方案中，所述的连接肽中包含的丝氨酸(S)、甘氨酸(G)、谷氨酸(E)、苏氨酸(T)与丙氨酸(A)的数量总和占所述的连接肽氨基酸总数量的百分比为100％、至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％以及至少50％。

在另一种优选的实施方案中，所述的连接肽中包含的丝氨酸(S)和甘氨酸(G)的数量的总和占所述的连接肽氨基酸总数量的百分比为100％、至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％以及至少50％。

所述单链抗体与对应抗原的结合活性与全长抗体具有相当的活性。进一步地，所述相当的活性是指生物学上的相当，如单链抗体与对应抗原的结合活性值达到全长抗体活性值的0.1％-10000％、1％-1000％，10％-100％，更加符合本发明是85％-115％，优选为90％-100％，更优选为95％-100％.；所述的活性值可以是本领域任意表达抗体活性的数值，比如EC50值等。

所述单链抗体可以在体外无细胞合成体系中一步合成，不需要分别分泌表达Fab轻链和重链两个不同的蛋白片段，不易形成同源二聚体，具有比Fab更高的表达效率以及亲和活性，且同时具有抗体恒定区CH1及CL，分子量约是ScFv的两倍，表现为抗体分子的相互作用的范德华力更强，表现为比Scfv等更为稳定。

进一步地，所述抗体选自IgM、IgG、IgA、IgD和/或IgE；

进一步优选的，所述的IgG抗体选自IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4；

在一优选的实施例中，所述的抗体选自IgG1抗体，优选地，所述的IgG1抗体为曲妥珠单抗(Trastuzumab)、贝伐单抗(Bevacizumab)、达雷妥尤单抗(Daratumumab)、奥马珠单抗(Omalizumab)、西妥昔单抗(Cetuximab)、阿达木单抗(Adalimumab)、乌司奴单抗(Ustekinumab)、奥瑞珠单抗(Ocrelizumab)、英夫利昔单抗(Infliximab)、恩沃利单抗(Envafolimab)、托西珠单抗(Atlizumab)和/或阿替利珠单抗(Atezolizumab)；

所述的IgG2抗体为地舒单抗(Denosumab)、厄瑞奴单抗(Erenumab)、替西木单抗(Tremelimumab)、依洛尤单抗(Evocumab)。

所述抗体轻链选自κ链/或λ链，所述抗体轻链片段选自κ链片段和λ链片段；所述重链选自μ链、γ链、α链、δ链和/或ε链；所述重链片段选自μ链片段、γ链片段、α链片段、δ链片段和/或ε链片段。

在一种优选的实施方案中，所述的抗体轻链来源于Tislelizumab轻链TisLC或其片段，所述的抗体重链来源于Tislelizumab重链TisHC或其片段TisFd。

在一种优选的实施方案中，所述的抗体轻链来源于Dupilumab轻链DupLC或其片段，所述的抗体重链来源于Dupilumab重链DupHC或其片段DupFd。

在一种优选的实施方案中，所述的抗体轻链来源于Adalimumab轻链AdaLC或其片段，所述的抗体重链来源于Adalimumab重链AdaHC或其片段AdaFd。

在一种优选的实施方案中，所述的抗体轻链来源于Bevacizumab轻链BevLC或其片段，所述的抗体重链来源于Bevacizumab重链BevHC或其片段BevFd。

在一种优选的实施方案中，所述的抗体轻链来源于Daratumumab轻链DarLC或其片段，所述的抗体重链来源于Daratumumab重链DarHC或其片段DarFd。

在一种优选的实施方案中，所述的抗体轻链来源于Omalizumab轻链OmaLC或其片段，所述的抗体重链来源于Omalizumab重链OmaHC或其片段OmaFd。

在一种优选的实施方案中，所述的抗体轻链来源于Cetuximab轻链CetLC或其片段，所述的抗体重链来源于Cetuximab重链CetHC或其片段CetFd。

在一种优选的实施方案中，所述的抗体轻链来源于Denosumab轻链DenLC或其片段，所述的抗体重链来源于Denosumab重链DenHC或其片段DenFd。

在一种优选的实施方案中，所述的抗体轻链来源于Trastuzumab轻链TraLC或其片段，所述的抗体重链来源于Trastuzumab重链TraHC或其片段；在另一种优选的实施方案中，所述的抗体轻链来源于曲Trastuzumab轻链TraLC，所述的抗体重链片段为Trastuzumab重链片段TraFd。

进一步地，所述单链抗体还包含荧光信号肽SP，优选地，所述单链抗体在轻链或轻链片段的N端连接有信号肽SP，用于提高单链抗体的表达效率和表达量。

进一步地，所述单链抗体还包含荧光蛋白标签，优选地，所述单链抗体在重链或重链片段的C端连接有荧光蛋白标签，进一步优选地，所述的荧光蛋白标签为EGFP。

进一步地，还包含tag标签，优选地，所述单链抗体在轻链或轻链片段的N端连接tag标签，优选地，在所述轻链或轻链片段的N端添加的tag标签为His tag。

进一步，优选地，所述的荧光蛋白标签、tag标签、信号肽通过单键或柔性连接肽与抗体的轻链、轻链片段或重链、重链片段相连，优选地，所述的柔性连接肽包含1-20个氨基酸残基。

本发明第二方面提供一种或多种分离的核酸，其编码第一方面提供的抗原结合配体蛋白。

进一步地，所述核酸为DNA序列和/或RNA序列。

在一种可行的实施方案中，所述核酸为线型DNA，且为PCR线型片段。

进一步地，所述PCR线型片段可以通过扩增技术获得，所述的扩增技术没有特别限制，包括但不限于PCR扩增技术、恒温开扩增技术、常温扩增技术、室温扩增技术等。其中，恒温扩增技术优选常温扩增技术。包括但不限于Biocompare、Neta Scientific Inc、ABM公司、Thermo Fisher Scientific公司、Expedeon公司、Vivantis公司等企业提供的商业化DNA扩增系统。

在另一种可行的实施方案中，所述核酸为RNA，其包含编码单链抗体的氨基酸序列。

进一步地，所述的RNA采用体外核酸扩增技术制备。所述可采用的体外核酸扩增技术没有特别显著，包括但不限于聚合酶链式反应技术(PCR扩增技术)、恒温扩增技术、常温扩增技术、室温扩增技术。具体地，可用于本发明技术手段的核酸恒温扩增方法包括但不限于：环介导恒温扩增法(LAMP)、链替代扩增法(SDA)、依赖核酸序列的扩增法(NASBA)、滚环扩增法(RCA)、切口酶核酸恒温扩增法、依赖解旋酶的恒温扩增法(HDA)、转录依赖的扩增法、杂交捕获法、转录介导的扩增法(TMA)、重组酶介导扩增法(RAA)、重组酶聚合酶扩增法(RPA)等，优选环介导恒温扩增法。

本发明第三方面提供一种或多种表达载体，其包含编码第一方面提供的单链抗体的核酸。

进一步地，所述表达载体包括但不限于，真核质粒载体、真核病毒载体、原核质粒、视具体载体、穿梭载体、微型染色体和各种载体。

优选地所述表达载体为真核质粒表达载体和原核质粒表达载体。

在一种可行的实施方案中，所述表达载体为环状DNA，进一步优选为质粒DNA，如pET系列质粒、pGEM系列质粒等。

本发明第四方面提供一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有本发明第三方面的载体，或其基因组中整合有第二方面的多核苷酸，或其表达第一方面所述的重组蛋白。

在一优选例中，所述的宿主细胞选自原核宿主细胞、真核宿主细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为原核细胞，如大肠杆菌。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为真核细胞，如酵母、源细胞、中国仓鼠、卵巢细胞、昆虫细胞、麦胚细胞、兔网织红细胞。

优选地，所述的酵母选自下组的一种或多种来源的酵母：酿酒酵母、克鲁维酵母属酵母中的一种或多种的组合，在另一优选例中，克鲁维酵母属酵母选自：乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母以及多布克鲁维酵母中的一种或多种的组合。

本发明第五方面提供一种体外无细胞蛋白合成体系，其包含第二方面提供的核酸分子或第三方面提供的表达载体，或本发明第四方面所述宿主细胞的裂解液或提取物。

所述体外无细胞蛋白合成体系，包括但不限于大肠杆菌体外蛋白合成体系、细菌体外蛋白合成体系、哺乳动物细胞(如HF9、Hela、CHO、HEK293)体外蛋白合成体系、植物细胞体外蛋白合成体系、酵母细胞体外蛋白合成体系、昆虫细胞体外蛋白合成体系。优选为酵母体外蛋白合成体系，更优选即为克鲁维酵母(Kluyveromyces)体外蛋白合成体系，最优选的为乳酸克鲁维(Kluyveromyceslactis，K.lactis)酵母体外蛋白合成体系。

进一步地，本发明提供的体外蛋白合成体系包括但不限于：(a)细胞提取物，(b)任选的聚乙二醇；(c)任选地外源蔗糖，(d)任选的溶剂。

进一步地，所述的反应体系还包括：三羟甲基氨基甲烷，醋酸钾，醋酸镁，核苷三磷酸混合物(NTPs)，氨基酸混合物等。

所述细胞提取物典型地用于提供核糖体、转运RNA(tRNA)、氨酰tRNA合成酶、蛋白质合成所需的起始因子和延伸因子以及终止释放因子等物质，还可以经菌株改造后内源性地提供聚合酶(RNA聚合酶和/或DNA聚合酶)等其他物质。

所述体外无细胞蛋白合成体系中需要的蛋白组分(举例如RNA聚合酶)，可以通过内源方式提供，也可以通过外源方式添加。通过内源方式提供时，可以参考包括但不限于文献CN108690139A、CN109423496A、CN106978439A、CN110408635A、CN110551700A、CN110093284A、CN110845622A、CN110938649A、CN111378708A、CN111484998 A、“MolecularandCellular Biology,1990,10(1):353-360”等现有文献及其引用文献提供的基因改造方法，可以列举的实例包括但不限于将编码序列插入到细胞内游离型质粒，将编码基因整合入细胞基因组，及其组合方式。通过外源方式提供时，用量可以根据体系所需进行控制和调节。

一些优选例中，所述酵母细胞提取物为克鲁维酵母(Kluyveromyces)细胞提取物、酿酒酵母或其组合。其中一些优选例中，所述克鲁维酵母为乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis，K.lactis)。

本发明的体外蛋白合成体系、模板、质粒、目标蛋白、体外蛋白合成反应(孵育反应)、各种制备方法、各种检测方法等技术要素，还可以各自独立地从下述文献中选择合适的实施方式或实施方法，包括但不限于CN111484998A、CN106978349A、CN108535489A、CN108690139A、CN108949801 A、CN108642076A、CN109022478A、CN109423496A、CN109423497A、CN109423509A、CN109837293A、CN109971783A、CN109988801A、CN109971775A、CN110093284A、CN110408635A、CN110408636A、CN110551745A、CN110551700A、CN110551785A、CN110819647A、CN110845622A、CN110938649A、CN110964736A等文献。除非和本发明目的相冲突，否则，这些文献及其引用文献以全部内容、全部目的被引用。

本发明第六方面提供一种检测单链抗体活性的方法，其特征在于：采用酶联免疫吸附测定法(ELISA法)检测本发明第一方面提供的单链抗体的活性，进一步地，所述的ELISA法为间接法测抗体或竞争法测抗体。

优选地，所述的ELISA法间接法测抗体包括线如下步骤：

具体检测步骤包括：⑴将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质；⑵加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他抗体及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去；⑶加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶；洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体；⑷加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。

本发明第七方面提供一种将本发明第一发面提供的单链抗体或第四方面提供的合成体系制备的单链抗体用于诊断、预防和治疗疾病或制备体用于疾病的诊断、预防和治疗中的用途。

进一步地，所述疾病为肿瘤和/或癌症，可以列举的肿瘤和/或癌症包括但不限于肺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、宫颈癌、结肠癌、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、骨肉瘤、淋巴瘤、白血病、肝癌、宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌等疾病。

优选的，所述疾病为HER2阳性乳腺癌和胃癌。

本发明的有益效果是：

1)本发明通过linker(连接肽)将抗体的轻链或轻链片段(如Trastuzumab轻链)及重链或重链片段(如Trastuzumab重链TraHC或重链片段TraFd)连接表达，提供了一种单链抗体，其在酵母无细胞体系(如：D2P体系)中能够高效表达，生产周期短。

2)本发明提供的一种单链抗体与ErbB2抗原结合活性，达到了市售的单抗Trastuzumab相当的活性，单链抗体相比市售单抗Trastuzumab(天然双链结构)具有无可比拟的易于表达的特点，因而本发明在提供的单链抗体在保证的抗体活性的基础上，解决了传统抗体表达效率低、限制抗体无法商业化的应用的缺陷。

3)本发明提供的单链抗体通过linker连接轻链和重链，抗体蛋白不易聚集且更稳定。

4)本发明提供的单链抗体，同时具备高表达效率、高亲和力和高稳定性，结合体外无细胞蛋白合成体系可以大规模生产，并特异性结合ErbB2胞外区域IV区，具有治疗HER2阳性乳腺癌和胃癌的良好应用前景，具有较好的商业化前景。

附图说明

图1是本发明实施例1中的质粒结构图。

Promoter为启动子，5-UTR为5’端非翻译区，SP为前导肽，5L为连接肽，SP与5L之间的部分为His标签，TrascFab为不同linker长度连接的TrascFab，EGFP为绿色荧光蛋白序列，3-UTR为3’短非翻译区和终止子。

图2是本发明实施例2和7制备的质粒电泳分析图，图中M代表marker，1～7分别代表TrascFab0、TrascFab6、TrascFab34、TrascFab60、TrascFab82、TrascFab120、TrascIgG60质粒。

图3是本发明实施例2和7的AMPI产物纯化分析图，图中M代表marker，1～7分别代表TrascFab0、TrascFab6、TrascFab34、TrascFab60、TrascFab82、TrascFab120、scIgG60的AMPI跑胶图。

图4是本发明实施例6纯化的TrascFab60蛋白分析图，M代表marker，1代表纯化的TrascFab60蛋白样品。

图5是实施例8中不同linker长度的TrascFab纯化蛋白TrascFab0、TrascFab6、TrascFab15、TrascFab25、TrascFab30、TrascFab34、TrascFab60、TrascFab82、TrascFab120、TrascFab180的亲和力检测结果图，图中Concentration表示浓度。

具体实施方式

本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

术语

本发明中“抗体”是指机体由于抗原的刺激而产生的具有保护作用的蛋白质，是一类能与抗原特异性结合的免疫球蛋白，其含有四条异源性多肽链，其中，分子量较大的两条链称为重链(heavy chain，H)，而分子量较小的两条链称为轻链(Light chain，L)，同一Ig分子中的两条H链和两条L链的氨基酸组成完全相同，重链分子量为50000～75000，由450～550个氨基酸残基组成，轻链分子量约为25000，由214个氨基酸残基构成。天然抗体分子的两条重链和两条轻链都可折叠成数个球形结构域(domain)，每个结构域行使其相应的功能。轻链有VL和CL两个结构域；IgG、IgA和IgD的重链有VH、CH1、CH2和CH3四个结构域；IgM和IgE的重链有五个结构域，即多一个CH4结构域。

本发明中“轻链片段”是指能够行使轻链相应功能的结构片段，比如包含CL结构域的结构片段。

本发明中“重链片段”则是指能够行使轻链相应功能的结构片段，比如包含CH1结构域的结构片段。

本发明中体外合成体系包括但不限于IVTT反应(体外转录翻译反应)。本发明中，优选IVTT反应。IVTT反应，对应IVTT体系，是在体外将DNA转录翻译为蛋白质(Protein)的过程，因此，我们还将这类的体外蛋白合成体系称为D2P体系、D-to-P体系、D_to_P体系、DNA-to-Protein体系；相应的体外蛋白合成方法，还称为D2P方法、D-to-P方法、D_to_P方法、DNA-to-Protein方法，其与“体外无细胞蛋白合成体系”、“体外表达系统”、“体外蛋白合成体系”、“体外蛋白质合成反应体系”、“无细胞蛋白合成体系”等表述具有相同的含义。蛋白质体外合成系统、体外蛋白合成体系、无细胞系统、无细胞蛋白合成体系、无细胞体外蛋白合成体系、体外无细胞蛋白合成体系、体外无细胞合成体系、CFS体系(cell-free system)、CFPS体系(cell-free protein synthesis system)等描述方式。包括体外翻译体系、体外转录翻译体系(IVTT体系)等。我们还将体外蛋白合成系统称为“蛋白质合成工厂”(ProteinFactory)。体外蛋白合成反应，是指在体外无细胞合成体系中合成蛋白的反应，至少包括翻译过程。

本发明第一方面提供一种单链抗体，其特征在于：其由linker(连接肽)连接抗体的轻链或轻链片段与抗体的重链或重链片段而成，在体外无细胞合成体系中一步高效表达，不需要分别分泌表达轻链和重链两个不同的蛋白片段，不易形成同源二聚体，具有较高的表达效率；且所述单链抗体与对应抗原的结合活性与抗体具有相当的活性。

所述相当的活性是指生物学上的相当，如单链抗体与对应抗原的结合活性值达到抗体活性值的85％-115％，优选为90％-100％，更优选为95％-100％.；所述的活性值可以是本领域任意表达抗体活性的数值，比如EC50值。

通过研究发现，不同长度的linker所制备的单链抗体表现出不同的亲和活性，本发明通过大量实验选取包含适量氨基酸残基数量的linker实现了单链抗体高效率表达的同时实现了单链抗体的高亲和性。

为了兼顾表达效率和特异性亲和活性，所述连接肽包含至少20个氨基酸残基，优选包含25～180个氨基酸残基，更优选34～120个氨基酸残基；

如包含25、26、27、28、29、30、31、32、33个氨基酸残基；

再比如包含55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70个氨基酸残基；

再比如包含115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125个氨基酸残基。

Linker的命名根据其中包含的氨基酸残基的数量进行命名，如当包含氨基酸残基数量为6时，则命名为linker6；当包含氨基酸残基数量为60时，则命名为linker60；当包含氨基酸残基数量为120时，则命名为linker120。

不同长度的linker所制备的单链抗体表现出不同的亲和活性，本发明通过大量实验选取包含适量氨基酸残基数量的linker实现了单链抗体高效率表达的同时实现了单链抗体的高亲和性。所述连接肽包含的氨基酸选自丝氨酸(S)、甘氨酸(G)、谷氨酸(E)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)、精氨酸(R)、酪氨酸(Y)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、谷氨酰胺(Q)、组氨酸(H)、苯丙氨酸(F)、缬氨酸(V)、脯氨酸(P)、天冬氨酸(D)、蛋氨酸(M)、天冬酰胺(N)。

在一种优选的实施方案中，所述的连接肽中包含的丝氨酸(S)、甘氨酸(G)、谷氨酸(E)、苏氨酸(T)与丙氨酸(A)的数量占所述的连接肽氨基酸数量的百分比为100％、至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％以及至少50％。

在另一种优选的实施方案中，所述的连接肽中包含的丝氨酸(S)、甘氨酸(G)、谷氨酸(E)的数量占所述的连接肽氨基酸数量的百分比为100％、至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％以及至少50％。

在一种优选的实施方案中，所述的linker为linker25，具有SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-10个，优选为1-5个。

SEQ ID NO.11:GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS

在一种优选的实施方案中，所述的linker为linker30，具有SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-10个，优选为1-5个。

SEQ ID NO.14:SGGGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSG

在一种优选的实施方案中，所述的linker为linker34，具有SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-10个，优选为1-5个。

SEQ ID NO.15:SGGGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGSG

在一种优选的实施方案中，所述的linker为linker34A，具有SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-10个，优选为1-5个。

SEQ ID NO.16:RRYEERRYEERRYEERRYEERRYEERRYEERRYE

在一种优选的实施方案中，所述的linker为linker34B，具有SEQ ID NO.17所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO.17所示的氨基酸序列具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-10个，优选为1-5个。

SEQ ID NO.17:YYEYYYYEYYYYEYYYYEYYYYEYYYYEYYEYYE

在一种优选的实施方案中，所述的linker为linker34C，具有SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-10个，优选为1-5个。

SEQ ID NO.18:IKYLEFISEAIIHVLHSRHPGDFGADAQGAMNKA

在另一种优选的实施方案中，所述的linker为linker60，具有SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-50个，优选为1-20个：

SEQ ID NO.19:GGSSGSGSGSTGTSSSGTGTSAGTTGTSASTSGSGSGGGGGSGGGGSAGGTATAGASSGS

在另一种优选的实施方案中，所述的linker为linker60A，具有SEQ ID NO.20所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO.20所示的氨基酸序列具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-50个，优选为1-20个：

SEQ ID NO.20:LAQSHATKHKIPIKYLEFISEAIIHVLHSRHPGDFGADAQGAMNKALELFRKDIAAKYKE

在另一种优选的实施方案中，所述的linker为linker82，具有SEQ ID NO.21所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO.21所示的氨基酸序列具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-50个，优选为1-20个；

SEQ ID NO.21:GGSSGSGSGSTGTSSSGTGTSAGTTGTSASTSGSGSGGGGGSGGGGSAGGTATAAGSTGGAGSTG GA GSTGGAGTGSGAGS

在另一种优选的实施方案中，所述的linker为linker120，具有SEQ ID NO.22所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO.22所示的氨基酸序列具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-50个，优选为1-20个。

SEQ ID NO.22:GGSSGSGSGSTGTSSSGTGTSAGTTGTSASTSGSGSGGGGGSGGGGSAGGTATGGSSGGSGGS SGSGSGSTGTSSSGTGTSAGTTGTSASTSGSGSGGGGGSGGGGSAGGTATAGASSGS

在另一种优选的实施方案中，所述的linker为linker180，具有SEQ ID NO.23所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO.23所示的氨基酸序列具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-50个，优选为1-20个。

SEQ ID NO.23:

GGSSGSGSGSTGTSSSGTGTSAGTTGTSASTSGSGSGGGGGSGGGGSAGGTATAGASSGSGGSSGSGSGSTGTSSSGTGTSAGTTGTSASTSGSGSGGGGGSGGGGSAGGTATAGASSGSGGSSGSGSGSTGTSSSGTGTSAGTTGTSASTSGSGSGGGGGSGGGGSAGGTATAGASSGS

在另一种优选的实施方案中，所述的linker为Linker36A，具有SEQ ID NO.24所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO.24所示的氨基酸序列具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-50个，优选为1-20个。

SEQ ID NO.24:GSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYSGS

在另一种优选的实施方案中，所述的linker为Linker36B，具有SEQ ID NO.25所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO.25所示的氨基酸序列具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-50个，优选为1-20个。

SEQ ID NO.25:GSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSSAASGFNIKGSG

在另一种优选的实施方案中，所述的linker为Linker36C，具有SEQ ID NO.26所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO.26所示的氨基酸序列具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-50个，优选为1-20个。

SEQ ID NO.26:GAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGS

本发明所述抗体选自IgM、IgG、IgA、IgD和/或IgE类抗体；

进一步优选的，所述的IgG抗体选自IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4；

在一优选的实施例中，所述的抗体选自IgG1抗体，优选地，所述的IgG1抗体为曲妥珠单抗(Trastuzumab)、贝伐单抗(Bevacizumab)、Daratumumab、奥马珠单抗(Omalizumab)、西妥昔单抗(Cetuximab)、阿达木单抗(Adalimumab)、乌司奴单抗(Ustekinumab)、奥瑞珠单抗(Ocrelizumab)、英夫利昔单抗(Infliximab)、恩沃利单抗(Envafolimab)、托西珠单抗(Atlizumab)和/或阿替利珠单抗(Atezolizumab)；

所述的IgG2抗体为地舒单抗(Denosumab)、厄瑞奴单抗(Erenumab)、替西木单抗(Tremelimumab)、依洛尤单抗(Evocumab)；

所述的IgG4抗体为Tislelizumab、Dupilumab、利妥昔单抗(Rituxima)、帕博利珠单抗(Pembrolizumab)、纳武利尤单抗(Nivolumab)、帕利珠单抗(Palizumab)。

在一种优选的实施方案中，所述的抗体轻链来源于Trastuzumab轻链TraLC，所述的抗体重链来源于Trastuzumab重链TraHC；在另一种优选的实施方案中，所述的抗体轻链来源于曲Trastuzumab轻链TraLC，所述的抗体重链片段为Trastuzumab重链片段TraFd。

进一步地，所述Trastuzumab轻链TraLC包含如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列,或与如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列所示的多肽具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-50个，优选为1-10个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。

SEQ ID NO.4:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGV PSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

优选地，所述Trastuzumab轻链TraLC与如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同源性。

进一步地，所述的Trastuzumab重链片段TraFd包含如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO.5所示的多肽具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-100个，优选为1-20个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。

SEQ ID NO.5:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYT RYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDK

优选地，所述Trastuzumab重链片段TraFd与如SEQ ID NO.5所示氨基酸序列具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同源性。

进一步地，所述的Trastuzumab重链TraHC包含如SEQ ID NO.6所述的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO.6所示的多肽具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-100个，优选为1-20个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。

SEQ ID NO.6:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYT RYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；

优选地，所述Trastuzumab重链片段TraHC与如SEQ ID NO.6所示氨基酸序列具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同源性。

进一步地，所述Tislelizumab轻链TisLC包含如SEQ ID NO.27所示的氨基酸序列,或与如SEQ ID NO.27所示氨基酸序列所示的多肽具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-50个，优选为1-10个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。

SEQ ID NO.27:

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVSNDVAWYQQKPGQPPKLLINYAFHRFTGVPDRFSGSGYGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCHQAYSSPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

优选地，所述Tislelizumab轻链TisLC与如SEQ ID NO.27所示氨基酸序列具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同源性。

进一步地，所述的Tislelizumab重链TisHC包含如SEQ ID NO.28所述的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO.28所示的多肽具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-100个，优选为1-20个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。

SEQ ID NO.28:

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVHWIRQPPGKGLEWIGVIYADGSTNYNPSLKSRVTISKDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCARAYGNYWYIDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPPVAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKTGGAGTGSGA；

优选地，所述Tislelizumab重链TisHC与如SEQ ID NO.28所示氨基酸序列具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同源性。

进一步地，所述的Tislelizumab重链片段TisFd包含如SEQ ID NO.29所示的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO.29所示的多肽具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-100个，优选为1-20个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。

SEQ ID NO.29:

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVHWIRQPPGKGLEWIGVIYADGSTNYNPSLKSRVTISKDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCARAYGNYWYIDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESK

进一步地，所述Dupilumab轻链DupLC包含如SEQ ID NO.30所示的氨基酸序列,或与如SEQ ID NO.30所示氨基酸序列所示的多肽具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-50个，优选为1-10个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。

SEQ ID NO.30:

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSIGYNYLDWYLQKSGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGFYYCMQALQTPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

优选地，所述Dupilumab轻链DupLC与如SEQ ID NO.30所示氨基酸序列具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同源性。

进一步地，所述的Dupilumab重链DupHC包含如SEQ ID NO.31所述的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO.31所示的多肽具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-100个，优选为1-20个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。

SEQ ID NO.31:

EVQLVESGGGLEQPGGSLRLSCAGSGFTFRDYAMTWVRQAPGKGLEWVSSISGSGGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRLSITIRPRYYGLDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG

优选地，所述Dupilumab重链DupHC与如SEQ ID NO.31所示氨基酸序列具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同源性。

进一步地，所述的Dupilumab重链片段DupFd包含如SEQ ID NO.32所示的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO.32所示的多肽具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-100个，优选为1-20个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。

SEQ ID NO.32:

EVQLVESGGGLEQPGGSLRLSCAGSGFTFRDYAMTWVRQAPGKGLEWVSSISGSGGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRLSITIRPRYYGLDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYG

优选地，所述Dupilumab重链片段DupFd与如SEQ ID NO.32所示氨基酸序列具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同源性。

进一步地，所述Adalimumab轻链AdaLC包含如SEQ ID NO.33所示的氨基酸序列,或与如SEQ ID NO.33所示氨基酸序列所示的多肽具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-50个，优选为1-10个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。

SEQ ID NO.33:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

优选地，所述Adalimumab轻链AdaLC与如SEQ ID NO.33所示氨基酸序列具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同源性。

进一步地，所述的Adalimumab重链AdaHC包含如SEQ ID NO.34所述的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO.34所示的多肽具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-100个，优选为1-20个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。

SEQ ID NO.34:

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTGGAGTGSGA

优选地，所述Adalimumab重链AdaHC与如SEQ ID NO.34所示氨基酸序列具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同源性。

进一步地，所述的Adalimumab重链片段AdaFd包含如SEQ ID NO.35所示的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO.35所示的多肽具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-100个，优选为1-20个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。

SEQ ID NO.35:

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDK

优选地，所述Adalimumab重链片段AdaFd与如SEQ ID NO.35所示氨基酸序列具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同源性。

进一步地，所述Bevacizumab轻链BevLC包含如SEQ ID NO.36所示的氨基酸序列,或与如SEQ ID NO.36所示氨基酸序列所示的多肽具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-50个，优选为1-10个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。

SEQ ID NO.36:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

优选地，所述Bevacizumab轻链BevLC与如SEQ ID NO.36所示氨基酸序列具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同源性。

进一步地，所述的Bevacizumab重链BevHC包含如SEQ ID NO.37所述的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO.37所示的多肽具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-100个，优选为1-20个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。

SEQ ID NO.37:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTGGAGTGSGA

优选地，所述Bevacizumab重链BevHC与如SEQ ID NO.37所示氨基酸序列具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同源性。

进一步地，所述的Bevacizumab重链片段BevFd包含如SEQ ID NO.38所示的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO.38所示的多肽具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-100个，优选为1-20个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。

SEQ ID NO.38:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDK

优选地，所述Bevacizumab重链片段BevFd与如SEQ ID NO.38所示氨基酸序列具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同源性。

进一步地，所述Daratumumab轻链DarLC包含如SEQ ID NO.39所示的氨基酸序列,或与如SEQ ID NO.39所示氨基酸序列所示的多肽具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-50个，优选为1-10个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。

SEQ ID NO.39:

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

优选地，所述Daratumumab轻链DarLC与如SEQ ID NO.39所示氨基酸序列具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同源性。

进一步地，所述的Daratumumab重链DarHC包含如SEQ ID NO.40所述的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO.40所示的多肽具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-100个，优选为1-20个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。

SEQ ID NO.40:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFNSFAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKDKILWFGEPVFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

优选地，所述Daratumumab重链DarHC与如SEQ ID NO.40所示氨基酸序列具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同源性。

进一步地，所述的Daratumumab重链片段DarFd包含如SEQ ID NO.41所示的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO.41所示的多肽具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-100个，优选为1-20个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。

SEQ ID NO.41:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFNSFAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKDKILWFGEPVFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDK

优选地，所述Daratumumab重链片段DarFd与如SEQ ID NO.41所示氨基酸序列具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同源性。

进一步地，所述Omalizumab轻链OmaLC包含如SEQ ID NO.42所示的氨基酸序列,或与如SEQ ID NO.42所示氨基酸序列所示的多肽具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-50个，优选为1-10个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。

SEQ ID NO.42:

DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSHEDPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR

优选地，所述Omalizumab轻链OmaLC与如SEQ ID NO.42所示氨基酸序列具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同源性。

进一步地，所述的Omalizumab重链OmaHC包含如SEQ ID NO.43所述的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO.43所示的多肽具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-100个，优选为1-20个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。

SEQ ID NO.43:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGYSITSGYSWNWIRQAPGKGLEWVASITYDGSTNYADSVKGRFTISRDDSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSHYFGHWHFAVWGQGTLVTVSSGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

优选地，所述Omalizumab重链OmaHC与如SEQ ID NO.43所示氨基酸序列具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同源性。

进一步地，所述的Omalizumab重链片段OmaFd包含如SEQ ID NO.44所示的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO.44所示的多肽具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-100个，优选为1-20个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。

SEQ ID NO.44:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGYSITSGYSWNWIRQAPGKGLEWVASITYDGSTNYADSVKGRFTISRDDSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSHYFGHWHFAVWGQGTLVTVSSGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCDK

优选地，所述Omalizumab重链片段OmaFd与如SEQ ID NO.44所示氨基酸序列具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同源性。

进一步地，所述Cetuximab轻链CetLC包含如SEQ ID NO.45所示的氨基酸序列,或与如SEQ ID NO.45所示氨基酸序列所示的多肽具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-50个，优选为1-10个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。

SEQ ID NO.45:

DVQVTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLANSYGNTFLSWYLHKPGKAPQLLIYGISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQGTHQPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

优选地，所述Cetuximab轻链CetLC与如SEQ ID NO.45所示氨基酸序列具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同源性。

进一步地，所述Cetuximab重链CetHC包含如SEQ ID NO.46所述的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO.46所示的多肽具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-100个，优选为1-20个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。

SEQ ID NO.46:

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYRFTNYWIHWVRQAPGQGLEWIGGINPGNNYATYRRKFQGRVTMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTREGYGNYGAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

优选地，所述Cetuximab重链CetHC与如SEQ ID NO.46所示氨基酸序列具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同源性。

进一步地，所述的Cetuximab重链片段CetFd包含如SEQ ID NO.47所示的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO.47所示的多肽具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-100个，优选为1-20个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。

SEQ ID NO.47:

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYRFTNYWIHWVRQAPGQGLEWIGGINPGNNYATYRRKFQGRVTMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTREGYGNYGAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVES

优选地，所述Cetuximab重链片段CetFd与如SEQ ID NO.47所示氨基酸序列具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同源性。

进一步地，所述Denosumab轻链DenLC包含如SEQ ID NO.48所示的氨基酸序列,或与如SEQ ID NO.48所示氨基酸序列所示的多肽具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-50个，优选为1-10个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。

SEQ ID NO.48:

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVRGRYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVFYCQQYGSSPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

优选地，所述Denosumab轻链DenLC与如SEQ ID NO.48所示氨基酸序列具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同源性。

进一步地，所述Denosumab重链DenHC包含如SEQ ID NO.49所述的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO.49所示的多肽具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-100个，优选为1-20个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。

SEQ ID NO.49:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

优选地，所述Denosumab重链DenHC与如SEQ ID NO.49所示氨基酸序列具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同源性。

进一步地，所述的Denosumab重链片段DenFd包含如SEQ ID NO.50所示的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO.50所示的多肽具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-100个，优选为1-20个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。

SEQ ID NO.50:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDK

优选地，所述Denosumab重链片段DenFd与如SEQ ID NO.50所示氨基酸序列具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同源性。

进一步地，所述单链抗体在轻链或轻链片段的N端连接有信号肽SP，用于提高单链抗体的表达效率和表达量。

优选的，所述的SP包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO.1所示序列具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-10个，优选为1-5个。

SEQ ID NO.1:MITETSSPFRSIFSHSGK

进一步地，所述单链抗体在重链或重链片段的C端连接有荧光蛋白标签，进一步优选地，所述的荧光蛋白标包含eGFP，或在eGFP基础上改进的蛋白标签如mTagBFP2、moxCerulean3、AmCyanl、MiCy、ZsGreen、Clover、mVenus、ZsYellow 1、mKO2、TurboRFP、tdTomato、eqFP611、mKate1.3、mNeptune2、miRFP670、mAme-trine、PAmCherry 2、mEos3.2等。

进一步地，所述的eGFP包含如SEQ ID NO.8所述的氨基酸序列，或与SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-20个，优选为1-10个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。

SEQ ID NO.8:VSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSKLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK

进一步地，所述单链抗体在轻链或轻链片段的N端连接tag标签，优选的，在所述轻链或轻链片段的N端添加的tag标签为His tag，所述的His tag的组氨酸残基数量为3-15，优选为5-10个，His tag标签的命名根据组氨酸的数量进行命名，如当组氨酸残基数量为8时，则命名为8His；当组氨酸残基数量为10时，则命名为10His。

进一步优选地，所述的荧光蛋白标签、tag标签、信号肽通过柔性连接肽与抗体的轻链、轻链片段或重链、重链片段相连，优选地，所述的柔性连接肽包含1-20个氨基酸残基。

可以列举的柔性连接肽可以为：5L(SEQ ID NO.3：GSGGS)、10L(SEQ ID NO.7：TGGAGTGSGA)等。

在一种优选的方案中，所述的单链抗体为TrascFab，其包含式(I)所述结构：

TraLC-linker-TraFd(I)

TraLC为Trastuzumab轻链TraLC，为SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列或与如SEQ IDNO.4所示的多肽具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，且具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同源性；优选地，所述Trastuzumab轻链TraLC与如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％的同源性；

TraFd为Trastuzumab重链片段TraFd，为SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列或与SEQID NO.5所示的氨基酸序列，具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-20个，优选为1-10个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10；优选地，所述TraFd与如SEQ ID NO.5所示序列具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％的同源性；

所述的linker为linker34、linker60、linker82、linker120或与上述任一序列具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同源性的序列。

在一种优选的方案中，所述的单链抗体为scIgG，其包含式(II)所示结构：

TraLC-linker-TraHC

TraHC为Trastuzumab重链，为SEQ ID NO.6所述的氨基酸序列，或与如SEQ IDNO.6所示的多肽具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-100个，优选为1-20个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10；所述TraHC与如SEQ ID NO.6所示序列具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％的同源性。

本发明通过linker(连接肽)轻链及重连接表达形成的单链抗体可以在体外无细胞合成体系中一步合成，相比Fab不需要分别分泌表达Fab轻链和重链两个不同的蛋白片段，不易形成同源二聚体，具有比Fab更高的表达效率以及亲和活性。

本发明第二方面提供一种或多种分离的核酸，其编码第一方面提供的单链抗体。

所述核酸为DNA序列和/或RNA序列。

在一种可行的实施方案中所述核酸为RNA，其包含编码单链抗体的氨基酸序列。

进一步地，所述的RNA采用体外核酸扩增技术制备。所述可采用的体外核酸扩增技术没有特别限制，包括但不限于聚合酶链式反应技术(PCR扩增技术)、恒温扩增技术、常温扩增技术、室温扩增技术。可以列举的实例包含环介导恒温扩增法(LAMP)、链替代扩增法(SDA)、依赖核酸序列的扩增法(NASBA)、滚环扩增法(RCA)、切口酶核酸恒温扩增法、依赖解旋酶的恒温扩增法(HDA)、转录依赖的扩增法、杂交捕获法、转录介导的扩增法(TMA)、重组酶介导扩增法(RAA)、重组酶聚合酶扩增法(RPA)等。

所述表达载体包括但不限于，真核质粒载体、真核病毒载体、原核质粒、视具体载体、穿梭载体、微型染色体和各种载体。

优选的，所述表达载体为真核质粒表达载体和原核质粒表达载体。

优选实施方式之一，所述表达载体为环状DNA，进一步优选为质粒DNA，如pET系列质粒、pGEM系列质粒等。

进一步地，所述体外无细胞蛋白合成体系，包括但不限于大肠杆菌体外蛋白合成体系、细菌体外蛋白合成体系、哺乳动物细胞(如HF9、Hela、CHO、HEK293)体外蛋白合成体系、植物细胞体外蛋白合成体系、酵母细胞体外蛋白合成体系、昆虫细胞体外蛋白合成体系。优选为酵母体外蛋白合成体系，更优选即为克鲁维酵母(Kluyveromyces)体外蛋白合成体系，最优选的为乳酸克鲁维(Kluyveromy ceslactis，K.lactis)或马克斯克鲁维酵母细胞酵母体外蛋白合成体系。

进一步地，本发明提供的体外蛋白合成体系包括但不限于：细胞提取物，三羟甲基氨基甲烷，醋酸钾，醋酸镁，核苷三磷酸混合物(NTPs)，氨基酸混合物等。

所述细胞提取物典型地用于提供核糖体、转运RNA(tRNA)、氨酰tRNA合成酶、蛋白质合成所需的起始因子和延伸因子以及终止释放因子等物质，还可以经菌株改造后内源性地提供聚合酶(RNA聚合酶和/或DNA聚合酶)等其它酶物质。

所述体外无细胞蛋白合成体系中需要的蛋白组分(举例如RNA聚合酶)，可以通过内源方式提供，也可以通过外源方式添加。通过内源方式提供时，可以参考包括但不限于文献CN108690139A、CN109423496A、CN106978439A、CN110408635A、CN110551700A、CN110093284A、CN110845622A、CN110938649A、CN111378708A、CN111484998 A、“Molecularand Cellular Biology,1990,10(1):353-360”等现有文献及其引用文献提供的基因改造方法，具体地，包括但不限于：将编码序列插入到细胞内游离型质粒，将编码基因整合入细胞基因组，及其组合方式。通过外源方式提供时，用量可以根据体系所需进行控制和调节。

一些优选例中，所述酵母细胞提取物为克鲁维酵母(Kluyveromyces)细胞提取物。其中一些优选例中，所述克鲁维酵母为乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis，K.lactis)。

本发明第六方面提供一种将本发明的单链抗体用于疾病的诊断、预防和治疗或制备体用于疾病的诊断、预防和治疗中的用途。

在一种优选的实施方案中，所述疾病为HER2、TNF-α、VEGF、PD-1、IL-4、IL-13或CD38异常引起的疾病。

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于阐述说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如“Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold SpringHarbor LaboratoryPress,1989)”、《无细胞蛋白合成实验手册》“Edited by AlexanderS.Spirin and James R.Swartz.Cell-free protein synthesis:methods and protocols[M].2008”等文献中所述的实验条件，或者按照制造厂商所建议的条件，或者按照、参考上文所述的具体实施方式指引的条件。除非另外说明，否则本发明中提及的百分比和份数是重量百分比和重量份数。

一、基于Trastuzumab构建的单链抗体实验

为验证本发明，本发明利用体外合成体系制备合成了TrascFab0、TrascFab6、TrascFab15、TrascFab25、TrascFab30、TrascFab34、TrascFab60、TrascFab82、TrascFab120、TrascFab180、TrascFab34A、TrascFab34B、TrascFab34C、TrascFab60A、TrascFab36A、TrascFab36B、TrascFab36B、TrascFab36BHL、TrascIgG60A、TrascIgG60B，具体质粒结构如表1所示：

实施例1质粒的构建

1、基因合成

其中TrascFab34、TrascFab60、TrascFab120、TrascIgG60B通过基因合成，TrascFab0、TrascFab6、TrascFab15、TrascFab25、TrascFab30、TrascFab180、TrascFab34A、TrascFab34B、TrascFab34C、TrascFab60A、TrascFab36A、TrascFab36B、TrascFab36B、TrascFab82是用引物从TrascFab60通过PCR构建获得，引物序列如下表2所示。

2、质粒的构建

用TrascFab60为模板，对应引物做PCR，PCR产物加DpnI于37℃培养箱酶切至少4h后做转化(DH5α)，最后挑单克隆测序验证序列正确，质粒结构如图1所示。

实施例2TrascFab60质粒的转化

将1μl目的质粒加入20μl的DH5α中，于冰上放置30min，42℃热激45s，冰上放置2min，加入500μl培养基，37℃振荡培养1h(200rpm)。吸取100μl到LB(含抗)平板，37℃倒置培养12～16h，拿出置于4℃冰箱保存。

实施例3TrascFab60质粒的抽提(以10ml菌液为例)

(1)收集菌体：将培养12～16h的菌液进行离心，4℃，4000rpm,离心10min,。弃上清，短暂离心后用移液枪吸走沉淀表面残余的液体。

(2)向沉淀中加入400μl P1并涡旋2min以上，使菌体沉淀完全分散在P1中

(3)向每份中加入500μl P2，轻轻倒置2ml EP管8次。

(4)向每份中加入700μl P3。轻轻倒置2ml EP管8次。

(5)4℃，12000rpm离心15min，去除产生的沉淀。

(6)取上清与100μl预先摇匀的磁珠混合，室温孵育5min，每隔1min倒置EP管以确保磁珠与上清充分混匀。

(7)用磁力架吸附磁珠，倒掉上清。(方法：磁吸时间为5-10秒左右，注意观察上清微黄即可倒掉上清，并及时离开磁力架，以免磁珠结合太紧密，下一步无法分散。由于质粒的构象易于被外力破坏，所以在洗涤的过程中尽量避免涡旋，质粒构象的好坏影响IVTT活性)。

(8)用1ml PR洗涤磁珠。由于上一步磁珠结合并不紧密，所以可以用手摇散磁珠，摇晃时间为1min。用磁力架去上清，方法同上。

(9)用1.2ml W洗涤磁珠。由于上一步磁珠结合并不紧密，所以可以用手摇散磁珠，摇晃时间为2min。用磁力架去上清，方法同上。

(10)重复step 9。

(11)将EP管置于磁力架上，用吹风机吹干(最小功率)磁珠。大约12分钟，完全干燥的磁珠应该是龟裂的，并且磁珠贴近EP管的一面目测无水迹。

(12)把吹干的磁珠用枪尖轻轻刮至EP管底部，加400μl洗脱液。涡旋15秒，在5分钟内间歇轻摇EP管以便充分洗脱。用磁力架留取上清。

(13)4℃，12000rpm，离心5min，去除残余磁珠。

(14)用移液枪取上清，4℃，12000rpm离心10min，去除残余磁珠。

(15)取上清，检测质粒浓度。

(16)进行琼脂糖凝胶(1％)电泳观察质粒形态，结果如图2所示。

实施例4TrascFab60的AMPI产物制备(10ml规模)

(1)准备AMPI buffer 10ml(其中AMPI buffer采用的是康码(上海)生物科技有限公司市售产品AMPiX(10x DNA Amplifier)，产品型号：PROTN_AMPiN10V03500)

(2)加入一定量的质粒使其终浓度为4ng/μl

(3)加入AMPI酶5μl

(4)充分混合，在37℃、30rpm条件下反应2小时，然后产物混合物通过跑胶(1％琼脂糖胶)进行鉴定分析，以TrascFab60为例，蛋白纯化结果如图3所示。

实施例5TrascFab60蛋白表达(250mL规模)

将8.3ml AMPI产物加入到250ml fast(AMPI产物的体积用量为fast的1/30)在30±2度恒温箱100rpm反应3～6h。(其中fast为源康码(上海)生物科技有限公司市售的体外无细胞合成体系产品，产品型号：profac_fast0510000，CoPure:FAST5+His-Monster Beads+General Magnetic Rack)反应结束后，在384孔黑板中加入10ul反应液，每种样品做3个重复，立即放置于Tecan infinite F200中，设定激发波长为488nm，发射波长为507nm，gain的manual参数为32，读数，检测表达活性，相对光单位值(Relative LightUnit,RLU)作为活性单位，经检测，TrascFab60的RFU为1279。

实施例6TrascFab60蛋白纯化

(1)确定磁珠用量，磁珠用量为fast体积用量的1％。

(2)磁珠清洗，使用前用水洗三次，每次涡旋15秒，用磁力架收集磁珠，每次水的用量为磁珠用量的5-10倍。

(3)目的蛋白与磁珠结合：把洗好的磁珠和IVTT产物在大烧杯中混合，4度100rpm结合1小时，收集磁珠至离心管中。

(4)洗杂：用10mM咪唑洗涤载有蛋白的磁珠3次每次180rpm 10分钟，洗涤液的用量为磁珠体积的3-5倍。

(5)用250mM咪唑洗脱液洗脱，第一次洗脱液的用量为磁珠用量的2倍，第二次洗脱液的用量为磁珠用量。

(6)离心去除残余的磁珠，第一次5分钟，12000rpm。第二次10分钟，12000rpm，进行SDS-PAGE凝胶纯化，结果如图4所示。

实施例7

重复实施例1-6的实验方法，分别制备TrascFab0、TrascFab6、TrascFab15、TrascFab25、TrascFab30、TrascFab180、TrascFab34A、TrascFab34B、TrascFab34C、TrascFab60A、TrascFab36A、TrascFab36B、TrascFab36B、TrascFab34、TrascFab82、TrascFab120、TrascFab180、TraFabHL、Tra2Fab、Tra3Fab、TrascIgG60A和TrascIgG60A蛋白，图2是本发明实施例2和7制备的质粒电泳分析图，图中M代表marker，1～7分别代表TrascFab0、TrascFab6、TrascFab34、TrascFab60、TrascFab82、TrascFab120、TrascIgG60质粒。图3是本发明实施例2和7的AMPI产物纯化分析图，图中M代表marker，1～7分别代表TrascFab0、TrascFab6、TrascFab34、TrascFab60、TrascFab82、TrascFab120、scIgG60的AMPI跑胶图。

反应结束后，检测表达活性，相对光单位值(Relative LightUnit,RLU)作为活性单位，经检测，RFU检测结果如表3所述。

结果表明，本发明的单链抗体在体外无细表达体系中都可以顺利地表达。

实施例8TrascFab或scIgG与ErbB2抗原结合活性的ELISA检测

一、ELISA检测方法的建立

1.用包被液将曲妥珠特异性抗原稀释至0.25μg/ml，加入酶标板，100μl/孔，4℃放置过夜；

2.洗板3次，每次300μl PBST，然后加入200μl封闭液，37℃封闭1h；

3.洗板3次，每次300μl PBST，样品和市售单抗用稀释液(PBST，含1％BSA)稀释至20μg/ml，再3倍系列稀释，共11个稀释度，加入酶标板，100μl/孔，并加入稀释液作为空白对照，37℃温育1h；

4.洗板3次，每次300μl PBST，加入HRP标记的兔抗人IgG(Fab specific)(1:5000稀释)，100μl/孔，37℃温育1h；

5.洗板3次，加入TMB显色液，100μl/孔，37℃显色10min；加入终止液(2M硫酸)，50μl/孔，于酶标仪波长450nm处测定吸光度值。

6.采用prism软件，选择4-Parameter绘制曲线，以样品浓度为横坐标，A450为纵坐标，并计算EC50值。

二、检测结果

1、按照本实施例建立的ELISA检测方法分别检测TrascFab0、TrascFab6、TrascFab15、TrascFab25、TrascFab30、TrascFab34、TrascFab60、TrascFab82、TrascFab120、TrascFab180纯化蛋白与ErbB2抗原结合活性，选择4-Parameter绘制曲线，结果如图5所示。

以样品浓度为横坐标，A450为纵坐标，并计算EC50值如表4所示：

结果表明，本发明的单链抗体的活性与linker的长短密切相关，当linker的氨基酸残基数量低于25时，对应的单链抗体的活性要明显低于linker的氨基酸残基数量高于25的单链抗体的活性。特别是单链抗体中linker的氨基酸残基数量为82时所对应的单链抗体活性相比TrascFab0和TrascFab6高达3倍以上，最高可达9倍以上。

2、不同长度和类型的TrascFab纯化蛋白的活性检测

按照本实施例建立的ELISA检测方法分别检测实施例7获得的TrascFab34A、TrascFab34B、TrascFab34C、TrascFab60A、TrascFab36A、TrascFab36B、TrascFab36B、TrascFab36BHL、TrascIgG60A、TrascIgG60B纯化蛋白以及市售单抗Trastuzumab与ErbB2抗原结合活性，选择4-Parameter绘制曲线，以样品浓度为横坐标，A450为纵坐标，并计算EC50值如表5所示：

实验结果表明，TrascFab34A、TrascFab34B、TrascFab34C和TrascFab34相比活性均有明显下降，表明单链抗体的活性不仅与linker的长短密切相关，也与Linker的氨基酸残基组成密切相关，当linker主要有G、S、E等氨基酸残基组成其对应的单链抗体活性明显要较主要包含R、Y、E、I、K等氨基酸残基的linker所对应的单链的抗体的活性。TrascFab60A与TrascFab60的亲和活性也证明了这一点。

我们还尝试了TrascFab36A、TrascFab36B、TrascFab36C的亲和活性也是令人满意的，其证实了在Linker只要主要包含主要有G、S、E、A等氨基酸残基外，包含少量的其他氨基酸残基，如V、P、L、R、Y、N等氨基酸也基本不会影响单链抗体的亲和活性。

TrascFabHL与TrascFab36C相比活性基本相当，证实了LC与Fd的连接顺序对单链抗体的活性影响较小，即本发明的单链抗体的轻链和重链的不同连接顺序皆可实现本发明。

Tra3Fab、Tra2Fab的亲和活性也是令人满意的。说明串联表达Scfab也可实现本发明也在本发明的保护范围内。

我们还尝试了类似全长抗体的单链抗体TrascIgG60A和TrascIgG60B，其活性明显提升，证明采用本发明的方案所得到的TrascIgG60A和TrascIgG60B具有与市售Trastuzumab抗体基本相当的亲和活性，证实了本发明的方案也适用于全长重链与轻链的连接制备的单链抗体。

实验结果表明，TrascIgG60A和TrascIgG60 B与ErbB2抗原具有较高的结合活性，达到了市售的单抗Trastuzumab相当的活性，单链抗体相比市售单抗Trastuzumab(天然双链结构)具有无可比拟的易于表达的特点，因而本发明在提供的单链抗体在保证的抗体活性的基础上，解决了传统抗体表达效率低、限制抗体无法商业化的应用的缺陷。本发明提供的单链抗体，同时具备高表达效率、高亲和力和高稳定性，结合体外无细胞蛋白合成体系可以大规模生产，具有较好的工业化和商业化前景。

需要说明地是，虽然Fab片段的单链抗体没有达到售的单抗Trastuzumab相当的活性，但是这是由于市售全长抗体的抗体活性大于Fab的抗体活性本身就是理所当然的：例如对于同样的linker60，Fab(TrascFab60)的抗体活性是0.49，而全长(TrascIgG60A和TrascIgG60B)的活性接近市售单抗Trastuzumab的活性(0.055)，由此可见我们用linker60的作为轻链和重链的连接是合理的，无论是对全长的连接还是Fab的连接。

由此，对于同样是Fab片段抗体的抗体活性比较接近的前提下，它们的全长抗体活性也会是比较接近的：例如表4中抗体活性接近或小于(TrascFab60)linker60的结果，可以知道它们的全长抗体活性也会至少与市售全长单抗Trastuzumab的活性相当。

二、基于其它类型抗体的构建的单链抗体实验

为验证本发明，本发明利用体外合成体系分别制备合成了基于Tislelizumab设计的单链抗体TisIgG60、TisscFab60；基于Dupilumab设计的单链抗体DupIgG60、DupscFab60；基于Adalimumab设计的单链抗体AdaIgG60、AdascFab60；基于Bevacizumab设计的单链抗体BevIgG60、BevscFab60；基于Daratumumab设计的单链抗体DarIgG60、DarscFab60；基于Omalizumab设计的单链抗体OmaIgG60、OmascFab60；基于Cetuximab设计的单链抗体CetIgG60、CetscFab60，基于Denosumab设计的单链抗体DenscFab36，具体质粒结构如表6所示：

实施例9

重复实施例1-6的制备方法，分别制备TisIgG60、TisscFab60、DupIgG60、DupscFab60、AdaIgG60、AdascFab60、BevIgG60、BevscFab60、DarIgG60、DarscFab60、OmaIgG60、OmascFab60、CetIgG60、CetscFab60。反应结束后，对反应液分别进行表达活性和亲和力检测。

表达活性以相对光单位值(Relative LightUnit,RLU)作为活性单位，经检测，RFU检测结果如表7所述。

结果表明，本发明构造的单链抗体的方案适用各种类型的抗体，IgG1、IgG2、和/或IgG4等类型的抗体均适用于本发明的单链抗体的构造方案，均具有较好地表达活性，在体外无细表达体系中都可以顺利地表达。

实施例10TisIgG60、TisscFab60与重组人PD-1蛋白结合活性的ELISA检测

一、ELISA检测方法

1.用包被液将重组人PD-1蛋白稀释至0.25μg/ml，加入酶标板，100μl/孔，4℃放置过夜；

二、检测结果

1、按照本实施例建立的ELISA检测方法分别检测TisIgG60、TisscFab60、Tislelizumab与ErbB2抗原结合活性，选择4-Parameter绘制曲线，以样品浓度为横坐标，A450为纵坐标，并计算EC50值如表8所示：

上述实验结果表明，本发明构造的单链抗体的方案适用各种类型的抗体，IgG1、IgG2、和/或IgG4等类型的抗体均适用于本发明的单链抗体的构造方案，均具有适当的亲和活性，且具有无可比拟的易于表达的特点，因而本发明在提供的单链抗体在保证的抗体活性的基础上，解决了传统抗体表达效率低、限制抗体无法商业化的应用的缺陷。本发明提供的单链抗体，同时具备高表达效率、高亲和力和高稳定性，结合体外无细胞蛋白合成体系可以大规模生产，具有较好的工业化和商业化前景。

本文前述提及的序列及其名称和序列号，汇总如表9所示：

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims

1.一种单链抗体，其特征在于：其通过连接肽(linker)将抗体的轻链或轻链片段与抗体的重链或重链片段连接而成；所述连接肽包含至少20个氨基酸残基，优选包含25～180个氨基酸残基，更优选34～120个氨基酸残基；

优选地，所述抗体选自IgM、IgG、IgA、IgD或IgE。

2.根据权利要求1所述的单链抗体，其特征在于所述连接肽包含的氨基酸选自丝氨酸(S)、甘氨酸(G)、谷氨酸(E)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)、精氨酸(R)、酪氨酸(Y)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、谷氨酰胺(Q)、组氨酸(H)、苯丙氨酸(F)、缬氨酸(V)、脯氨酸(P)、天冬氨酸(D)、蛋氨酸(M)、天冬酰胺(N)，优选地，所述连接肽包含所述连接肽包含的氨基酸选自丝氨酸(S)、甘氨酸(G)、谷氨酸(E)、苏氨酸(T)和丙氨酸(A)；

进一步优选地，所述的连接肽中包含的丝氨酸(S)、甘氨酸(G)、谷氨酸(E)、苏氨酸(T)和丙氨酸(A)的数量的总和占所述的连接肽氨基酸的总数量的百分比为100％、至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％以及至少50％；进一步优选地，所述的连接肽中包含的丝氨酸(S)、甘氨酸(G)、谷氨酸(E)的数量占所述的连接肽氨基酸数量的百分比为100％、至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％以及至少50％；更优选地，所述的连接肽中包含的丝氨酸(S)、甘氨酸(G)、谷氨酸(E)的数量总和占所述的连接肽氨基酸总数量的百分比为100％、至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％以及至少50％；

更优选地，所述连接肽选自以下中一种或多种：linker25(SEQ ID NO.11)、linker30(SEQ ID NO.14)、linker34(SEQ ID NO.15)、linker34A(SEQ ID NO.16)、Linker34B(SEQID NO.17)、Linker34C(SEQ ID NO.18)、Linker60(SEQ ID NO.19)、Linker60A(SEQ IDNO.20)、Linker82(SEQ ID NO.21)、Linker120(SEQ ID NO.22)、linker180(SEQ IDNO.23)、Linker36A(SEQ ID NO.24)、Linker36B(SEQ ID NO.25)、Linker36C(SEQ IDNO.26)和/或与上述任一所示的氨基酸序列具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量可以为1-10个，优选为1-5个。

3.根据权利要求1-2任一项所述的单链抗体，其特征在于：所述的IgG抗体选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4中的任意一种或多种；

所述的抗体选自IgG1抗体，优选地，所述的IgG1抗体为曲妥珠单抗(Trastuzumab)、贝伐单抗(Bevacizumab)、达雷妥尤单抗(Daratumumab)、奥马珠单抗(Omalizumab)、西妥昔单抗(Cetuximab)、阿达木单抗(Adalimumab)、乌司奴单抗(Ustekinumab)、奥瑞珠单抗(Ocrelizumab)、英夫利昔单抗(Infliximab)、恩沃利单抗(Envafolimab)、托西珠单抗(Atlizumab)和阿替利珠单抗(Atezolizumab)中的任意一种或多种；

所述的IgG2抗体为地舒单抗(Denosumab)、厄瑞奴单抗(Erenumab)、替西木单抗(Tremelimumab)和依洛尤单抗(Evocumab)中的任意一种或多种；

所述的IgG4抗体为替雷利珠单抗(Tislelizumab)、度匹鲁单抗(Dupilumab)、利妥昔单抗(Rituxima)、帕博利珠单抗(Pembrolizumab)、纳武利尤单抗(Nivolumab)和帕利珠单抗(Palizumab)中的任意一种或多种。

4.根据权利要求1-3任一项所述的单链抗体，其特征在于：所述抗体轻链选自κ链和/或λ链，所述抗体轻链片段选自κ链片段和/或λ链片段；所述重链选自μ链、γ链、α链、δ链和ε链中的任意一种或多种；所述重链片段选自μ链片段、γ链片段、α链片段、δ链片段和ε链片段中的任意一种或多种；

优选地，所述的抗体轻链来源于替雷利珠单抗(Tislelizumab)轻链TisLC或其片段，所述的抗体重链来源于替雷利珠单抗(Tislelizumab)重链TisHC或其片段TisFd；或，

所述的抗体轻链来源于度匹鲁单抗(Dupilumab)轻链DupLC或其片段，所述的抗体重链来源于度匹鲁单抗(Dupilumab)重链DupHC或其片段DupFd；或，

所述的抗体轻链来源于阿达木单抗(Adalimumab)轻链AdaLC或其片段，所述的抗体重链来源于阿达木单抗(Adalimumab)重链AdaHC或其片段AdaFd；或，

所述的抗体轻链来源于贝伐单抗(Bevacizumab)轻链BevLC或其片段，所述的抗体重链来源于贝伐单抗(Bevacizumab)重链BevHC或其片段BevFd；或，

所述的抗体轻链来源于达雷妥尤单抗(Daratumumab)轻链DarLC或其片段，所述的抗体重链来源于达雷妥尤单抗(Daratumumab)重链DarHC或其片段DarFd；或，

所述的抗体轻链来源于奥马珠单抗(Omalizumab)轻链OmaLC或其片段，所述的抗体重链来源于奥马珠单抗(Omalizumab)重链OmaHC或其片段OmaFd；或，

所述的抗体轻链来源于西妥昔单抗(Cetuximab)轻链CetLC或其片段，所述的抗体重链来源于西妥昔单抗(Cetuximab)重链CetHC或其片段CetFd；或，

所述的抗体轻链来源于地舒单抗(Denosumab)轻链DenLC或其片段，所述的抗体重链来源于地舒单抗(Denosumab)重链DenHC或其片段DenFd；

所述的抗体轻链来源于曲妥珠单抗(Trastuzumab)轻链TraLC或其片段，所述的抗体重链来源于曲妥珠单抗(Trastuzumab)重链TraHC或其片段；或

所述的抗体轻链为曲妥珠单抗(Trastuzumab)轻链TraLC，所述的抗体重链片段为曲妥珠单抗(Trastuzumab)重链片段TraFd。

5.根据权利要求1-4任一项所述的单链抗体，其特征在于：所述单链抗体还包含信号肽SP，优选地，所述单链抗体在轻链或轻链片段的N端连接有信号肽SP，用于提高单链抗体的表达效率和表达量，优选地，所述的SP包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或与如SEQ IDNO.1所示序列具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，更优选地，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量为1-10个。

6.根据权利要求1-5任一项所述的单链抗体，其特征在于：所述单链抗体还包含荧光蛋白标签，优选地，所述单链抗体在重链或重链片段的C端连接有荧光蛋白标签，更优选地，所述的荧光蛋白标包含eGFP，或在eGFP基础上改进的蛋白标签如mTagBFP2、moxCerulean3、AmCyanl、MiCy、ZsGreen、Clover、mVenus、ZsYellow 1、mKO2、TurboRFP、tdTomato、eqFP611、mKate1.3、mNeptune2、miRFP670、mAme-trine、PAmCherry 2、mEos3.2；更优选地，所述的eGFP包含如SEQ ID NO.8所述的氨基酸序列，或与SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，优选地，所述置换、缺失或添加的氨基酸的数量为1-20个。

7.根据权利要求1-6任一项所述的单链抗体，其特征在于：所述单链抗体还包含tag标签，优选地，在轻链或轻链片段的N端连接tag标签，更优选地，所述的tag标签为His tag，优选地，所述的His tag的组氨酸残基数量为3-15。

8.根据权利要求1-7任一项所述的单链抗体，其特征在于：所述的荧光蛋白标签、tag标签、信号肽通过单键或柔性连接肽与抗体的轻链、轻链片段或重链、重链片段相连，优选地，所述的柔性连接肽包含1-20个氨基酸残基，优选的，所述的柔性连接肽为5L(SEQ ID NO.3：GSGGS)和/或10L(SEQ ID NO.7：TGGAGTGSGA)。

9.一种或多种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1-12任一项所述的单链抗体，优选地，所述核酸为DNA序列和/或RNA序列。

10.一种或多种表达载体，其特征在于：所述载体包含编码权利要求1-12任一项所述的单链抗体的核酸，优选地，所述表达载体包括但不限于，真核质粒载体、真核病毒载体、原核质粒、视具体载体、穿梭载体、微型染色体和各种载体，优选地所述表达载体为真核质粒表达载体和原核质粒表达载体。

11.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求10所述的载体，或其基因组中整合有权利要求9所述的核酸，所述的宿主细胞选自原核宿主细胞和/或真核宿主细胞；优选地，所述的宿主细胞为真核细胞，如酵母、源细胞、中国仓鼠、卵巢细胞、昆虫细胞、麦胚细胞、兔网织红细胞；更优选地，所述的酵母选自下组的一种或多种来源的酵母：酿酒酵母、克鲁维酵母属酵母中的一种或多种的组合，在另一优选例中，克鲁维酵母属酵母选自：乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母以及多布克鲁维酵母中的一种或多种的组合。

12.一种体外无细胞蛋白质合成体系，其特征在于：其包含权利要求9所述的核酸，或权利要求10所述的表达载体，或包括权利要求17所述宿主细胞的裂解液或提取物；

所述体外无细胞蛋白质合成体系在适合表达的条件下，能够表达权利要求1-8任一项所述的单链抗体；

优选地，所述体外无细胞蛋白合成体系，包括但不限于大肠杆菌体外蛋白合成体系、细菌体外蛋白合成体系、哺乳动物细胞体外蛋白合成体系、植物细胞体外蛋白合成体系、酵母细胞体外蛋白合成体系、昆虫细胞体外蛋白合成体系；优选为酵母体外蛋白合成体系，更优选为克鲁维酵母体外蛋白合成体系，最优选的为乳酸克鲁维酵母或马克斯克鲁维酵母细胞体外蛋白合成体系。

13.根据权利要求12所述的体外无细胞蛋白质合成体系，其特征在于所述体外蛋白合成体系包括细胞提取物、三羟甲基氨基甲烷、醋酸钾、醋酸镁、核苷三磷酸混合物(NTPs)和氨基酸混合物。

14.权利要求1-8任一项所述的单链抗体或根据权利要求12-13任一项所述的体系制备的单链抗体用于诊断、预防和治疗疾病或制备用于疾病的诊断、预防和治疗药物中的用途；优选地，所述疾病为肿瘤和/或癌症，所述肿瘤和/或癌症包括肺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、宫颈癌、结肠癌、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、骨肉瘤、淋巴瘤、白血病、肝癌、宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌等疾病；优选的，所述疾病为HER2、TNF-α、VEGF、PD-1、IL-4、IL-13或CD38异常引起的疾病。