CN118715245A

CN118715245A - 包含b7-h4抗体药物缀合物的用于治疗癌症的组合疗法

Info

Publication number: CN118715245A
Application number: CN202380021702.5A
Authority: CN
Inventors: E·李奥; F·A·托斯托; K·L·金尼尔; K·库克; J·切斯布罗
Original assignee: MedImmune Ltd
Current assignee: MedImmune Ltd
Priority date: 2022-02-16
Filing date: 2023-02-15
Publication date: 2024-09-27

Abstract

提供了在受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向受试者施用：i)抗体‑药物缀合物(ADC)、ii)细胞毒性剂和iii)另外的药剂，其中该另外的药剂是PARP1抑制剂或ATR抑制剂或其药学上可接受的盐。本披露进一步提供了试剂盒，其包含i)抗体‑药物缀合物(ADC)、ii)细胞毒性剂和iii)另外的药剂，其中该另外的药剂是PARP1抑制剂或ATR抑制剂或其药学上可接受的盐。

Description

包含B7-H4抗体药物缀合物的用于治疗癌症的组合疗法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2022年2月16日提交的美国临时专利申请号63/310,967以及于2022年10月4日提交的美国临时专利申请号63/378,295的优先权权益，其出于所有目的通过引用以其全文并入本文。

以电子方式提交的材料通过引用而并入

通过引用以其全文并入本文的是计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表，该序列表在此同时提交，并确定如下：一个名为“B7H4-101-WO-PCT_SeqList.xml”、创建于2023年2月8日的54,907字节的XML文件。

技术领域

本披露提供了一种在人受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向受试者施用：i)抗体-药物缀合物(ADC)、ii)细胞毒性剂和iii)另外的药剂，其中该另外的药剂是PARP1抑制剂或ATR抑制剂或其药学上可接受的盐。本披露进一步提供了试剂盒，其包含i)抗体-药物缀合物(ADC)、ii)细胞毒性剂和iii)另外的药剂，其中该另外的药剂是PARP1抑制剂或ATR抑制剂或其药学上可接受的盐。

背景技术

单独或组合的手术、放射疗法和化学疗法是最传统和最广泛使用的癌症治疗方法。虽然这些治疗方法可有效去除或杀灭癌细胞，但它们通常会给受治疗的患者带来不希望的副作用，如脱发、贫血、严重恶心和健康细胞死亡。这些局限使得急需创新性的且危害较小的癌症治疗方法。

基于抗体的癌症疗法依赖于抗体-药物缀合物对癌细胞上特定蛋白的识别和结合。抗体药物缀合物(ADC)可以利用缀合物抗体部分的特异性将高毒性药剂直接递送至待杀灭的细胞。将抗体或ADC癌症疗法与其他基于小分子的癌症疗法组合使用可以通过以不止一种方式攻击恶性细胞和肿瘤来改善治疗结果。

发明内容

在一些方面，本披露涉及一种在有需要的人受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向该人受试者施用：

A)抗体-药物缀合物(ADC)，该抗体-药物缀合物包含：

i.结合B7-H4多肽的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含：

a)分别含有SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)、重链CDR3(HCDR3)、轻链CDR1(LCDR1)、轻链CDR2(LCDR2)和轻链CDR3(LCDR3)，或其功能变体；

b)分别含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体；

c)分别含有SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17和SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体；

d)分别含有SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23和SEQ ID NO:24的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体；或

e)分别含有SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29和SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体；

ii.可切割接头；和

iii.细胞毒性剂；以及

B)另外的药剂，其中该另外的药剂是PARP1抑制剂或ATR抑制剂或其药学上可接受的盐。在一些方面，另外的药剂是AZD5305。在一些方面，另外的药剂是AZD6738。

在方法的一些方面，癌症包含表达B7-H4的癌细胞。在一些方面，癌症进一步包含不表达B7-H4的癌细胞。在一些方面，癌症选自卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、血液癌、子宫内膜癌、胆管细胞癌、NSCLC(鳞状和/或腺癌)、胃肠癌如胃癌和结直肠癌、以及肺癌。在一些方面，癌症是乳腺癌，其选自激素受体阳性(HR+)乳腺癌、人表皮生长因子受体2阳性(HER2+)乳腺癌和三阴性乳腺癌(TNBC)。在一些方面，癌症是同源重组缺陷(HRD)癌症。在一些方面，癌症包含具有选自以下的HRD基因突变的一种或多种细胞：BRCA1、BRCA2、ATM、BRIP1、BARD1、CDK12、CHEK1、CHEK2、FANCL、PALB2、PPP2R2A、RAD51B、RAD51C、RAD51D和RAD54L。在一些方面，突变的HRD基因选自BRCA1、BRCA2和ATM。

在方法的一些方面，抗体或其抗原结合片段包含：

i.分别含有SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:34的氨基酸序列的可变重(VH)链和可变轻(VL)链，或其功能变体；

ii.分别含有SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34的氨基酸序列的可变重(VH)链和可变轻(VL)链，或其功能变体；

iii.分别含有SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:34的氨基酸序列的可变重(VH)链和可变轻(VL)链，或其功能变体；

iv.分别含有SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:34的氨基酸序列的可变重(VH)链和可变轻(VL)链，或其功能变体；

v.分别含有SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:34的氨基酸序列的可变重(VH)链和可变轻(VL)链，或其功能变体；

vi.分别含有SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VH链和VL链，或其功能变体；

vii.分别含有SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VH链和VL链，或其功能变体；

viii.分别含有SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH链和VL链，或其功能变体；或

ix.分别含有SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VH链和VL链，或其功能变体。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含：

i.分别含有SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含：

i.分别含有SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH链和VL链，或其功能变体。

在方法的一些方面，抗体或其抗原结合片段结合OVCAR4细胞系。

在方法的一些方面，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链恒定区。在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的重链恒定区。在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链恒定区。在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的重链、以及含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链。在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的重链、以及含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体。在一些方面，抗体或其抗原结合片段是人源化单克隆抗体。

在一些方面，可切割接头是mp-PEG8-val-ala接头。

在一些方面，细胞毒性剂是拓扑异构酶抑制剂。在一些方面，拓扑异构酶抑制剂是具有式A*的化合物：

在方法的一些方面，ii)接头和iii)细胞毒性剂一起选自以下化合物：

和/或

在方法的一些方面，ii)接头和iii)细胞毒性剂一起为化合物SG3932。

在方法的一些方面，ADC的药物抗体比(DAR)在约1与约8之间。在一些方面，ADC的DAR约为8。

在一些方面，本披露涉及一种试剂盒，其包含：

A)抗体-药物缀合物(ADC)，该抗体-药物缀合物包含：

ii.可切割接头；和

iii.细胞毒性剂；以及

在试剂盒的一些方面，抗体或其抗原结合片段包含：

在试剂盒的一些方面，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链恒定区。在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的重链恒定区。在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链恒定区。在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的重链、以及含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链。在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的重链、以及含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链。

在试剂盒的一些方面，可切割接头是mp-PEG8-val-ala接头。

在试剂盒的一些方面，细胞毒性剂是拓扑异构酶抑制剂。在一些方面，拓扑异构酶抑制剂是具有式A*的化合物：

在试剂盒的一些方面，ii)接头和iii)细胞毒性剂一起选自以下化合物：

和/或

在试剂盒的一些方面，ii)接头和iii)细胞毒性剂一起为化合物SG3932。

在试剂盒的一些方面，ADC的药物抗体比(DAR)在约1与约8之间。在一些方面，ADC的DAR约为8。

A)抗体-药物缀合物(ADC)，该抗体-药物缀合物包含：

e)分别含有SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29和SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体；和

ii.可切割接头和细胞毒性剂，该可切割接头和细胞毒性剂与具有下式的抗体或其抗原结合片段缀合：

以及B)AZD5305或其药学上可接受的盐。

A)抗体-药物缀合物(ADC)，该抗体-药物缀合物包含：

f)分别含有SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)、重链CDR3(HCDR3)、轻链CDR1(LCDR1)、轻链CDR2(LCDR2)和轻链CDR3(LCDR3)，或其功能变体；

g)分别含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体；

h)分别含有SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17和SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体；

i)分别含有SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23和SEQ ID NO:24的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体；或

j)分别含有SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29和SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体；以及

以及B)AZD6738或其药学上可接受的盐。

附图说明

以下附图形成本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步展示本披露的某些方面的示例性方面。

图1示出在经工程化以表达B7-H4的DLD-1-BRCA野生型细胞中使用E02-GL-SG3932和AZD5305处理的细胞毒活性测定的结果。

图2示出用E02-GL-SG3932和AZD5305组合疗法处理的DLD-1-BRCA野生型细胞的Bliss协同评分矩阵。

图3示出在经工程化以表达B7-H4的DLD-1-XMAN-BRCA2-/-细胞中使用E02-GL-SG3932和AZD5305处理的细胞毒活性测定的结果。

图4示出用E02-GL-SG3932和AZD5305组合疗法处理的DLD-1-XMAN-BRCA2-/-细胞的Bliss协同评分矩阵。

图5示出在MX-1细胞中使用E02-GL-SG3932和AZD5305处理的细胞毒活性测定的结果。

图6示出用E02-GL-SG3932和AZD5305组合疗法处理的MX-1细胞的Bliss协同评分矩阵。

图7展示小鼠模型中单独的E02-GL-SG3932和AZD5305处理的体内抗肿瘤功效。

图8示出小鼠模型中E02-GL-SG3932和AZD5305的组合疗法的体内抗肿瘤功效实验的结果。

图9展示小鼠模型中E02-GL-SG3932和AZD5305的单独疗法和组合疗法的体内抗肿瘤功效实验的平均肿瘤体积。

图10展示小鼠模型中E02-GL-SG3932和AZD6738的单独疗法和组合疗法的体内抗肿瘤功效实验的平均肿瘤体积。

图11A-11C示出在如实例6所述的人肿瘤中B7-H4表达的结果。图11A：IHC用于评估B7-H4在多种肿瘤类型中的表达。适应证中B7-H4表达的表达率(prevalence)由在任何强度下表达B7-H4阳性的细胞的比例表示。图11B：子宫内膜癌、胆管细胞癌、ER+乳腺癌或TNBC、和卵巢癌中B7-H4 IHC染色的代表性图像。图11C：定量图像分析，示出在TNBC的原发性肿瘤手术切除、福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)样品(n＝196)中每个肿瘤细胞膜中B7-H4表达的平均光密度(OD)的分布。每个截短的小提琴样图代表单个供体样品。线代表中值。

图12A-12F示出如实例6所述的TNBC PDX模型中与PARP1选择性抑制剂AZD5305组合的E02-GL-SG3932的抗肿瘤功效的结果。如实例6所述建立肿瘤，并且以每个小图中指示的剂量施用治疗。将ADC作为单次大剂量IV注射进行递送，并将AZD5305通过口服灌胃进行递送，每天一次，持续28天。图12A-12B：在B7-H4高表达的BRCA WT HBCx-39模型中，由(A)1.25mg/kg或(B)3.5mg/kg ADC治疗单独或与AZD5305组合产生的抗肿瘤功效。图12C-12D：由(C)B7-H4高表达的BRCA1突变型HBCx-24和(D)BRCA1亚等位基因(hypomorphic)HBCx-11模型的治疗产生的活性。图12E-12F：由(E)HBCx-8(BRCA1突变型模型)和(F)HBCx-2(具有低B7-H4表达的BRCA WT模型)的治疗产生的功效。数据指示肿瘤体积平均值±平均值的标准误差(n＝4或5只动物/组)。

具体实施方式

本文披露了包括将抗体-药物缀合物(ADC)与第二药剂(如小分子药物)一起施用的方法、组合和试剂盒。如本文所述，方法、组合和试剂盒可用于在受试者中治疗癌症。

在一些方面，本披露提供了一种在有需要的人受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向该人受试者施用：A)抗体-药物缀合物(ADC)，该抗体-药物缀合物包含：i.结合B7-H4多肽的抗体或其抗原结合片段，ii.可切割接头，和iii.细胞毒性剂；以及B)PARP1(聚(ADP-核糖)聚合酶1)抑制剂。在一些方面，本披露提供了一种在有需要的人受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向该人受试者施用：A)抗体-药物缀合物(ADC)，该抗体-药物缀合物包含：i.结合B7-H4多肽的抗体或其抗原结合片段，ii.可切割接头，和iii.细胞毒性剂；以及B)ATR(FRAP相关蛋白1、FRP1、MEC1、SCKL、SECKL1R)抑制剂。

在一些方面，本披露提供了一种在有需要的人受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向该人受试者施用：A)ADC，该ADC包含：i.结合B7-H4多肽的抗体或其抗原结合片段，ii.可切割接头，和iii.细胞毒性剂；以及B)AZD5305或其药学上可接受的盐。在一些方面，本披露提供了一种在有需要的人受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向该人受试者施用：A)ADC，该ADC包含：i.结合B7-H4多肽的抗体或其抗原结合片段，ii.可切割接头，和iii.细胞毒性剂；以及B)AZD6738或其药学上可接受的盐。

在一些方面，本披露提供了一种在有需要的人受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向该人受试者施用：A)ADC，该ADC包含：i.结合B7-H4多肽的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含：a)分别含有SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)、重链CDR3(HCDR3)、轻链CDR1(LCDR1)、轻链CDR2(LCDR2)和轻链CDR3(LCDR3)，或其功能变体；b)分别含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体；c)分别含有SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体；d)分别含有SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体；或e)分别含有SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体；ii.可切割接头；和iii.细胞毒性剂；以及B)AZD5305或其药学上可接受的盐。

在一些方面，本披露提供了一种在有需要的人受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向该人受试者施用：A)ADC，该ADC包含：i.结合B7-H4多肽的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含：a)分别含有SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)、重链CDR3(HCDR3)、轻链CDR1(LCDR1)、轻链CDR2(LCDR2)和轻链CDR3(LCDR3)，或其功能变体；b)分别含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体；c)分别含有SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体；d)分别含有SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体；或e)分别含有SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体；ii.可切割接头；和iii.细胞毒性剂；以及B)AZD6738或其药学上可接受的盐。

癌症的治疗

在一些方面，本文披露了一种治疗与B7-H4的表达相关的癌症的方法。在一些方面，癌症包含表达B7-H4的癌细胞。在一些方面，癌症是肿瘤或包含表达B7-H4的癌细胞的其他恶性细胞团。在一些方面，癌症进一步包含不表达B7-H4的癌细胞。

B7-H4(也称为含V-set结构域T细胞激活抑制剂1，由VTCN1基因编码)是共刺激蛋白B7家族的跨膜多肽。B7-H4被理解为在抗原呈递细胞的表面上表达，用于与免疫细胞(例如，T淋巴细胞，CD28为潜在的配体)的配体相互作用。已观察到B7-H4在各种癌症类型的细胞上高度表达，并被认为是肿瘤相关抗原。此外，B7-H4的表达不限于特定的癌症类型，因此它代表了用于治疗广谱癌症类型的靶抗原。

在优选的方面，本文提及的癌症是以B7-H4分子的表达(优选过表达)为特征的癌症。换言之，本文提及的癌症可包含表达B7-H4的癌性细胞。所述癌性细胞可包含在肿瘤内。在另一方面，B7-H4分子在癌细胞中以与在非癌细胞中的表达水平相似的水平表达。在另一方面，B7-H4分子在癌细胞中以低于在非癌细胞中的表达水平的水平表达。

“治疗”是指治愈、减慢已诊断的病理性病症或障碍、减轻已诊断的病理性病症或障碍的症状和/或停止已诊断的病理性病症或障碍的进展的治疗性措施。因此，需要治疗的那些包括已患有障碍的那些。在一些方面，如果患者显示例如全部、部分或者瞬时减轻或消除了与疾病或障碍(优选癌症)相关的症状，则根据本文提供的方法成功地“治疗”了受试者疾病或障碍(优选癌症)。

在一些方面，本披露的方法可用于预防包含表达B7-H4的癌细胞的癌症的发作。“预防”是指预防和/或减缓靶向的病理性病症或障碍发展的预防性或预防措施。因此，需要预防的那些包括倾向于患有或易患障碍的那些。在一些方面，如果相比于未经本披露方法治疗的患者，患者瞬时或永久地表现出例如与疾病或障碍相关的更少或严重程度更低的症状、或与该疾病或障碍相关的症状的更迟的发作，则根据本文提供的方法成功地预防了该疾病或障碍(优选癌症)。

术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用以指哺乳动物受试者。在一些方面，“受试者”是人、家畜、农场动物、竞赛动物和动物园动物，例如人、非人灵长类动物、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛等。在一些方面，受试者是食蟹猴(cynomolgus monkey)(食蟹猕猴(Macaca fascicularis))。在优选的方面，受试者是人。在本披露的方法中，受试者先前可能未被诊断为患有癌症。可替代地，受试者可能先前已被诊断为患有癌症。受试者也可以是表现出疾病风险因素的人、或没有癌症症状的人。受试者也可以是患有癌症或有患癌症的风险的人。因此，在一些方面，本披露的方法可用于确认受试者中癌症的存在。例如，受试者可能先前已通过可替代的手段被诊断出患有癌症。在一些方面，受试者先前已经施用癌症疗法。

在一些方面，本文披露了治疗癌症的方法，该癌症选自卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、血液癌、子宫内膜癌、胆管细胞癌、NSCLC(鳞状和/或腺癌)、胃肠癌如胃癌和结直肠癌、以及肺癌。在一些方面，癌症是卵巢癌。在用于治疗乳腺癌的方法的一些方面，乳腺癌是激素受体阳性(HR+)乳腺癌、人表皮生长因子受体2阳性(HER2+)乳腺癌或三阴性乳腺癌(TNBC)。在一些方面，乳腺癌是TNBC。

在方法的一些方面，癌症是同源重组缺陷(HRD)癌症。在一些方面，癌症包含具有选自以下的HRD基因突变的一种或多种细胞：BRCA1、BRCA2、ATM、BRIP1、BARD1、CDK12、CHEK1、CHEK2、FANCL、PALB2、PPP2R2A、RAD51B、RAD51C、RAD51D和RAD54L。在一些方面，突变的HRD基因选自BRCA1、BRCA2和ATM。在一些方面，突变的HRD基因是BRCA1。在一些方面，突变的HRD基因是BRCA2。在一些方面，突变的HRD基因是ATM。

抗体和抗原结合片段

本文提供的抗体药物缀合物包含结合B7-H4多肽的抗体或其抗原结合片段。B7-H4的RNA、DNA和氨基酸序列是本领域技术人员已知的，并且可以在许多数据库中(例如，在美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(NCBI)和UniProt的数据库中)找到。在UniProt找到的这些序列的实例是人B7-H4的Q7Z7D3(VTCN1_HUMAN)、和小鼠B7-H4的Q7TSP5(VTCN1_MOUSE)。编码人B7-H4的核苷酸序列可以是SEQ IDNO:53，更优选地是SEQ ID NO:54。人B7-H4的多肽序列优选地是SEQ ID NO:55。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含分别含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体。包含所述序列的抗体或其抗原结合片段在本文中可称为“ZY0EPQ-E02”或“EPQ-E02”。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含分别含有SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体。包含所述序列的抗体或其抗原结合片段在本文中可称为“ZY0EOB-F05”或“EOB-F05”。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含分别含有SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体。包含所述序列的抗体或其抗原结合片段在本文中可称为“ZY0EO5-E07”或“EO5-E07”。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含分别含有SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体。包含所述序列的抗体或其抗原结合片段在本文中可称为“ZY0EP0-C07”或“EP0-C07”。

在特定的方面，抗体或其抗原结合片段包含分别含有SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体。

换言之，抗体或其抗原结合片段可优选地包含：

i.含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCDR1，或其功能变体；

ii.含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HCDR2，或其功能变体；

iii.含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HCDR3，或其功能变体；

iv.含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LCDR1，或其功能变体；

v.含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的LCDR2，或其功能变体；以及

vi.含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的LCDR3，或其功能变体。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含：

i.含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HCDR1，或其功能变体；

ii.含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HCDR2，或其功能变体；

iii.含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3，或其功能变体；

iv.含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCDR1，或其功能变体；

v.含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2，或其功能变体；以及

vi.含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3，或其功能变体。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含：

i.含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HCDR1，或其功能变体；

ii.含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HCDR2，或其功能变体；

iii.含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HCDR3，或其功能变体；

iv.含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的LCDR1，或其功能变体；

v.含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的LCDR2，或其功能变体；以及

vi.含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LCDR3，或其功能变体。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含：

i.含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的HCDR1，或其功能变体；

ii.含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HCDR2，或其功能变体；

iii.含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HCDR3，或其功能变体；

iv.含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的LCDR1，或其功能变体；

v.含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的LCDR2，或其功能变体；以及

vi.含有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的LCDR3，或其功能变体。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含：

i.含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的HCDR1，或其功能变体；

ii.含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的HCDR2，或其功能变体；

iii.含有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的HCDR3，或其功能变体；

iv.含有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的LCDR1，或其功能变体；

v.含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的LCDR2，或其功能变体；以及

vi.含有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的LCDR3，或其功能变体。

另外或可替代地，本文所述的抗体或其抗原结合片段可以通过其可变重(VH)链和可变轻(VL)链来描述。

合适的可变重(VH)链序列(抗体或其抗原结合片段可包含)以个体化的方式概述如下：

-SEQ ID NO:31，或其功能变体；

-SEQ ID NO:33，或其功能变体

-SEQ ID NO:43，或其功能变体

-SEQ ID NO:45，或其功能变体

-SEQ ID NO:46，或其功能变体

-SEQ ID NO:47，或其功能变体

-SEQ ID NO:35，或其功能变体

-SEQ ID NO:37，或其功能变体

-SEQ ID NO:39，或其功能变体

特别合适的可变重(VH)链序列(抗体或其抗原结合片段可包含)以个体化的方式概述如下：

-SEQ ID NO:45，或其功能变体

-SEQ ID NO:33，或其功能变体

-SEQ ID NO:43，或其功能变体

-SEQ ID NO:46，或其功能变体

-SEQ ID NO:47，或其功能变体

合适的可变轻(VL)链序列(抗体或其抗原结合片段可包含)以个体化的方式概述如下：

-SEQ ID NO:32，或其功能变体

-SEQ ID NO:34，或其功能变体

-SEQ ID NO:36，或其功能变体

-SEQ ID NO:38，或其功能变体

-SEQ ID NO:40，或其功能变体

优选的可变轻(VL)链序列(抗体或其抗原结合片段可包含)可包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列(或其功能变体)。

例如，在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含：

i.含有与SEQ ID NO:31、33、35、37或39的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的可变重链，或其功能变体；以及

ii.含有与SEQ ID NO:32、34、36、38或40的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的可变轻链，或其功能变体。

例如，在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含：

i.含有与SEQ ID NO:31、33、35、37、39、43、45、46或47的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的可变重链，或其功能变体；以及

合适地，抗体或其抗原结合片段可包含：

i.含有与SEQ ID NO:33的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的可变重链，或其功能变体；以及

ii.含有与SEQ ID NO:34的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的可变轻链，或其功能变体。

更合适地，抗体或其抗原结合片段可包含：

i.含有与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的可变重链，或其功能变体；以及

在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含：

-分别含有SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32的氨基酸序列的可变重(VH)链和可变轻(VL)链，或其功能变体；

-分别含有SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH链和VL链，或其功能变体；

-分别含有SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH链和VL链，或其功能变体；

-分别含有SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH链和VL链，或其功能变体；

-分别含有SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH链和VL链，或其功能变体；

-分别含有SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH链和VL链，或其功能变体；

-分别含有SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VH链和VL链，或其功能变体；

-分别含有SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH链和VL链，或其功能变体；或

-分别含有SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VH链和VL链，或其功能变体。

在优选的方面，抗体或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO:45、33、43、46或47的氨基酸序列的可变重(VH)链(或其功能变体)，以及含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的可变轻(VL)链(或其功能变体)。例如，SEQ ID NO:33、45、46和/47的VH可以对应于SEQ ID NO:33的VH的“种系化”版本(例如，全部都具有相同的CDR序列，但具有框架变异)。有利地，每个变体保留等同的结合特性。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的可变重链，或其功能变体；以及含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的可变轻链，或其功能变体。包含所述序列的抗体或其抗原结合片段可称为“ZY0EPD-E02”或“EPD-E02”。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的可变重链，或其功能变体；以及含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的可变轻链，或其功能变体。包含所述序列的抗体或其抗原结合片段可称为“ZY0EOB-F05”或“EOB-F05”。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的可变重链，或其功能变体；以及含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的可变轻链，或其功能变体。包含所述序列的抗体或其抗原结合片段可称为“ZY0EO5-E07”或“EO5-E07”。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的可变重链，或其功能变体；以及含有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的可变轻链，或其功能变体。包含所述序列的抗体或其抗原结合片段可称为“ZY0EP0-C07”或“EP0-C07”。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的可变重链，或其功能变体；以及含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的可变轻链，或其功能变体。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的可变重链，或其功能变体；以及含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的可变轻链，或其功能变体。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的可变重链，或其功能变体；以及含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的可变轻链，或其功能变体。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的可变重链，或其功能变体；以及含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的可变轻链，或其功能变体。

在优选的方面，抗体或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的可变重链，或其功能变体；以及含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的可变轻链，或其功能变体。包含所述序列的抗体或其抗原结合片段可称为“EQD-E02_GL”。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含含有与参考氨基酸序列SEQ ID NO:43具有至少70％、75％、80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的可变重链。在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的可变重链。例如，抗体或其抗原结合片段可包含含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的可变重链以及含有SEQ IDNO:34的氨基酸序列的可变轻链。

另外或可替代地，本文所述的抗体或其抗原结合片段可以通过其重链和/或轻链来描述。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO:44的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的轻链(例如，包含VL和恒定轻链)。在优选的方面，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链(例如，包含VL和恒定轻链)。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含含有与参考氨基酸序列SEQ ID NO:48具有至少70％、75％、80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的重链(例如，包含VH和恒定重链)。例如，抗体或其抗原结合片段可包含含有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的重链(例如，包含VH和恒定重链)。这样的重链可称为“E02-GL-Maia-重链”。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含含有与参考氨基酸序列SEQ ID NO:49具有至少70％、75％、80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的重链(例如，包含VH和恒定重链)。例如，抗体或其抗原结合片段可包含含有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的重链(例如，包含VH和恒定重链)。这样的重链可称为“E02-GLY-Maia-重链”。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含含有与参考氨基酸序列SEQ ID NO:50具有至少70％、75％、80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的重链(例如，包含VH和恒定重链)。例如，抗体或其抗原结合片段可包含含有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的重链(例如，包含VH和恒定重链)。这样的重链可称为“E02-GLQ-Maia-重链”。

在优选的方面，抗体或其抗原结合片段包含含有与参考氨基酸序列SEQ ID NO:51具有至少70％、75％、80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的重链(例如，包含VH和恒定重链)。在更优选的方面，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的重链(例如，包含VH和恒定重链)。这样的重链可称为“E02-GL-WT-重链”。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含含有与参考氨基酸序列SEQ ID NO:42具有至少70％、75％、80％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的轻链恒定区。在优选的方面，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链恒定区。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链恒定区。更优选地，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的重链恒定区。

在优选的方面，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链(例如，包含VL和恒定轻链)以及含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的重链(例如，包含VH和恒定重链)。

有利地，已经证明与报告的靶向B7-H4的现有(商业上)可获得的抗体相比，权利要求书中的抗体或抗原结合片段可以靶向更广谱的表达B7-H4的细胞。因此，不仅已经证明本文揭露的抗体(或其抗原结合片段)对临床相关靶标具有亲和力和特异性，而且还证明了与其相关的独特优势(例如，意想不到的技术效果)。

优选地，本文所述的抗体或其抗原结合片段能够结合作为癌细胞的不可或缺的组分的B7-H4(例如，B7-H4作为癌细胞的细胞膜的不可或缺的组分)。

本文所述的抗体或其抗原结合片段可结合OVCAR4细胞系和/或CHO细胞系(例如，其可缺乏编码B7-H4的外源核酸)。例如，抗体或其抗原结合片段结合OVCAR4细胞系和/或CHO细胞系(例如，其可缺乏编码B7-H4的外源核酸)的B7-H4(例如，B7-H4表位)。合适地，本文所述的抗体或其抗原结合片段可结合OVCAR4细胞系和CHO细胞系(例如，其可缺乏编码B7-H4的外源核酸)。

术语“表位”是指能够结合(例如，被结合)本披露的抗体或抗原结合片段的靶蛋白区域(例如，多肽)。

在一些方面，与一种或多种选自E Biosciences 14-5949抗人B7H4小鼠IgG、USbiological B0000-35B抗人B7H4小鼠IgG、R and Dsystems AF2514抗小鼠B7H4山羊IgG1、Sigma SAB2500141抗B7H4山羊IgG1、同种型1CAT004 SP06-003、同种型2R and D正常山羊IgG对照(AB-108C)、AdD serotec MCA2632、Epitomics 2516-1、eBiosciences 145972-82、eBioscience 145970-85的抗体、或其组合相比，该抗体或其抗原结合片段以更高的亲和力结合OVCAR4细胞系和/或CHO细胞系(例如，其可缺乏编码B7-H4的外源核酸)。例如，与一种或多种选自E Biosciences 14-5949抗人B7H4小鼠IgG、US biological B0000-35B抗人B7H4小鼠IgG、R and D systems AF2514抗小鼠B7H4山羊IgG1和Sigma SAB2500141抗B7H4山羊IgG1的抗体、或其组合相比，该抗体或其抗原结合片段可以以更高的亲和力结合OVCAR4细胞系和/或CHO细胞系(例如，其可缺乏编码B7-H4的外源核酸)。

在优选的方面，与E Biosciences 14-5949抗人B7H4小鼠IgG相比，该抗体或其抗原结合片段以更高的亲和力结合OVCAR4细胞系。

提及“E Biosciences 14-5949抗人B7H4小鼠IgG”可与本文的术语“B7-H4单克隆抗体(H74)，eBioscience”互换使用。所述抗体可从赛默飞世尔科技公司(ThermoFisherScientific)(目录号14-5949-82)获得。

在另一个优选的方面，与US biological B0000-35B抗人B7H4小鼠IgG相比，该抗体或其抗原结合片段以更高的亲和力结合OVCAR4细胞系。

所述亲和力(例如，结合亲和力)可以通过本文所述的任何合适的测量结合亲和力的方法来测量。

OVCAR4细胞系是人卵巢癌细胞系。OVCAR4细胞系可从美国国家癌症研究所(National Cancer Institute)获得，从癌症治疗和诊断部肿瘤库(Division of CancerTreatment and Diagnosis Tumor Repository)转移细胞系。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系是源自中国仓鼠的卵巢的上皮细胞系，可广泛获得。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体。

“单克隆抗体”(mAb)是指涉及单一抗原决定簇或表位的高度特异性识别和结合的均质抗体群体。这与典型地包括针对不同抗原决定簇的不同抗体的多克隆抗体相反。术语“单克隆抗体”涵盖完整和全长单克隆抗体以及抗体片段(如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)突变体、包含抗体部分的融合蛋白和包含抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子。此外，“单克隆抗体”是指以任何数目的方式制备的这样的抗体，这些方式包括但不限于杂交瘤、噬菌体选择、重组表达和转基因动物。

在优选的方面，本披露的抗体或其抗原结合片段(例如，mAb)是人源化抗体或其抗原结合片段。合适地，所述人源化抗体或其抗原结合片段是IgG。

术语“人源化抗体”是指源自非人(例如鼠)免疫球蛋白的抗体，其被工程化成含有最小的非人(例如鼠)序列。典型地，人源化抗体是人免疫球蛋白，其中来自互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(例如，小鼠、大鼠、兔、或仓鼠)的CDR的残基替代，该来自非人物种的CDR的残基具有希望的特异性、亲和力和能力(Jones等人,1986,Nature[自然],321:522-525；Riechmann等人,1988,Nature[自然],332:323-327；Verhoeyen等人,1988,Science[科学],239:1534-1536)。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FW)残基被来自非人物种的具有所希望特异性、亲和力和能力的抗体中的对应残基替代。

人源化抗体可以通过在Fv框架区和/或替代的非人残基内的另外残基的取代来进一步修饰，以改善和优化抗体特异性、亲和力和/或能力。通常，人源化抗体将包含基本上所有至少一个(并且典型地两个或三个)可变结构域，这些可变结构域含有对应于非人免疫球蛋白的所有或基本上所有CDR区，而所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列的FR区。人源化抗体还可以包含免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区或结构域的至少一部分。用于产生人源化抗体的方法的实例描述于美国专利号5,225,539或5,639,641中。

抗体的“可变区”是指单独的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区或它们的组合。重链和轻链的这些可变区各自由通过三个互补决定区(CDR)(也称为高变区)连接的四个框架区(FW)组成。每条链中的CDR由FW区紧密靠近地保持在一起，并且与来自另一条链的CDR促成了抗体的抗原结合位点的形成。存在至少两种用于确定CDR的技术：(1)基于跨物种序列变异性的方法(即，Kabat等人Sequences of Proteins of Immunological Interest[免疫学感兴趣的蛋白质序列](第5版,1991,National Institutes of Health[美国国立卫生研究院],Bethesda Md.[马里兰州贝塞斯达]))；和(2)基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(Al-lazikani等人(1997)J.Molec.Biol.[分子生物学杂志]273:927-948)。另外，本领域有时使用这两种方法的组合来确定CDR。

当提及可变结构域中的残基(大约轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时，通常使用“Kabat编号系统”(例如，Kabat等人,Sequences of Immunological Interest[免疫学感兴趣的序列],第5版Public Health Service[美国公共卫生服务部],NationalInstitutes of Health[美国国立卫生研究院],Bethesda Md.[马里兰州贝塞斯达](1991))。

在Kabat中的氨基酸位置编号是指在Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest[免疫学感兴趣的蛋白质序列],第5版Public Health Service[美国公共卫生服务部],National Institutes of Health[美国国立卫生研究院],Bethesda,Md.[马里兰州贝塞斯达](1991)中用于汇编抗体的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可以含有对应于可变结构域的FW或CDR的缩短或向其中的插入的较少或另外的氨基酸。例如，重链可变结构域可以包括在H2的残基52之后的单个氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)以及在重链FW残基82之后的插入的残基(例如，根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。

可以通过在抗体序列与“标准”Kabat编号序列的同源性区域进行比对来确定给定抗体的残基的Kabat编号。相反，Chothia是指结构环的位置(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901-917(1987))。Chothia CDR-H1环的末端在利用Kabat编号惯例编号时在H32与H34之间变化，这取决于环的长度(这是因为Kabat编号方案将插入放在H35A和H35B处；如果35A和35B都不存在，那么环在32处结束；如果只存在35A，那么环在33处结束；如果35A和35B都存在，那么环在34处结束)。AbM高变区表示Kabat CDR和Chothia结构环之间的折衷，并且被牛津分子公司(Oxford Molecular)的AbM抗体建模软件使用。下表列出了构成每个系统中的抗体可变区的氨基酸的位置。

区域	Kabat	AbM	Chothia
				LCDR1	L24-L34	L24-L34	L24-L34
LCDR2	L50-L56	L50-L56	L50-L56
				LCDR3	L89-L97	L89-L97	L89-L97
HCDR1¹	H31-H35B	H26-H35B	H26-H32..34
				HCDR1²	H31-H35	H26-H35	H26-H32
HCDR2	H50-H65	H50-H58	H52-H56
				HCDR3	H95-H102	H95-H102	H95-H102

¹Kabat编号

²Chothia编号

免疫遗传学(IMGT)还提供了一种用于免疫球蛋白可变区(包括CDR)的编号系统。参见例如，Lefranc,M.P.等人,Dev.Comp.Immunol.[发育与比较免疫学]27:55-77(2003)。IMGT编号系统是基于高变环的多于5,000个序列的比对、结构数据和表征，并且允许容易地比较所有物种的可变区和CDR区。根据IMGT编号方案，VH-CDR1在位置26至35处，VH-CDR2在位置51至57处，VH-CDR3在位置93至102处，VL-CDR1在位置27至32处，VL-CDR2在位置50至52处，并且VL-CDR3在位置89至97处。

如贯穿说明书使用的，所述VH CDR序列对应于经典的Kabat编号位置，即KabatVH-CDR1在位置31-35处，VH-CDR2在位置50-65处，并且VH-CDR3在位置95-102处。VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3也对应于经典的Kabat编号位置，即分别对应于位置24-34、50-56和89-97。

在一些方面，本披露的抗体是人抗体。

术语“人抗体”意指在人体中产生的抗体或具有与使用本领域已知的任何技术制备的在人体中产生的抗体对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义包括完整或全长抗体、其片段和/或包含至少一个人重链和/或轻链多肽的抗体，例如像包含鼠轻链和人重链多肽的抗体。

在一些方面，本披露的抗体是嵌合抗体。

术语“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列源自两种或更多种物种的抗体。典型地，轻链和重链两者的可变区对应于源自具有所希望的特异性、亲和力和能力的一种哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔等)物种的抗体的可变区，而恒定区与源自另一种(通常为人)的抗体中的序列同源，以避免在该物种中引起免疫响应。

术语“YTE”或“YTE突变体”是指IgG1 Fc中的突变，这导致与人FcRn的结合增加，且改善具有该突变的抗体的血清半衰期。YTE突变体包含引入IgG1的重链中的三个突变M252Y/S254T/T256E的组合(EU编号，Kabat等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest[免疫学感兴趣的蛋白序列],U.S.Public Health Service[美国公共卫生服务部],National Institutes of Health[美国国立卫生研究院],Washington,D.C.[华盛顿特区])。参见美国专利号7,658,921，其通过引用并入本文。与相同抗体的野生型版本相比，YTE突变体显示出使抗体的血清半衰期增加了大约四倍(Dall'Acqua等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]281:23514-24(2006)；Robbie等人,(2013)Antimicrob.Agents Chemother.[抗微生物药剂与化学疗法]57,6147-6153)。还参见美国专利号7,083,784，其通过引用以其全文特此并入。

合适地，本披露的抗体或抗原结合片段以足够的亲和力结合B7-H4分子，使得该抗体可用作靶向B7-H4的治疗剂或诊断试剂。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段以如下解离常数(KD)结合B7-H4(优选人B7-H4)：≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤10pM、≤1pM、或≤0.1pM。在一些方面，抗体或其抗原结合片段以如下KD结合B7-H4(优选人B7-H4)：约0.1nM至约40nM之间、约0.5nM至约30nM之间、约1nM至约20nM之间、或约1.5nM至约20nM之间。

在优选的方面，抗体或其抗原结合片段以约23nM至约27nM之间的KD结合B7-H4(优选人B7-H4)。在更优选的方面，抗体或其抗原结合片段以约1nM至约1.5nM之间的KD结合B7-H4(优选人B7-H4)。

KD测量(结合亲和力)可以通过本领域已知的任何合适的测定法进行。合适的测定法包括可经由KinExA系统(例如，KinExA 3100、KinExA 3200或KinExA 4000)(赛必因仪器公司(Sapidyne Instruments)，爱达荷州(Idaho))或ForteBio Octet系统进行的亲和力测定法。

在一些方面，本披露的抗体或其抗原结合片段与无关的非B7-H4蛋白的结合程度比该抗体(或其抗原结合片段)与B7-H4(优选人B7-H4)的结合少约10％、5％、2％或1％(优选少约10％)。所述结合可以例如通过放射免疫测定法(RIA)、(使用重组B7-H4作为分析物并且抗体作为配体，或反之亦然)、ForteBio Octet系统或本领域已知的其他结合测定法来测量。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段不结合选自人B7-H1分子、人B7-H2分子、人B7-H3分子、人BTN1A1分子、人HHLA2分子、人BTN3A2分子、或其组合中的一种或多种。在优选的方面，抗体或其抗原结合片段不结合选自人B7-H1分子、人B7-H2分子、人B7-H3分子、或其组合中的一种或多种。

术语“不结合”意指本文所述的抗体或其抗原结合片段基本上不结合一种或多种所述分子(例如，人B7-H1分子、人B7-H2分子、人B7-H3分子、人BTN1A1分子、人HHLA2分子、人BTN3A2分子、或其组合)。当在本文的结合背景下使用时，术语“基本上没有”可意指细胞培养物中表达一种或多种所述分子的细胞的少于5％、2％、1％、0.5％或0.1％被本文所述的抗体或其抗原结合片段结合(在与其接触时)。合适地，当在本文的结合背景下使用时，术语“基本上没有”可意指没有这样的细胞被结合。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段不结合人B7-H1分子、人B7-H2分子、人B7-H3分子、人BTN1A1分子、人HHLA2分子或人BTN3A2分子。在优选的方面，抗体或其抗原结合片段不结合人B7-H1分子、人B7-H2分子或人B7-H3分子。

在一些方面，B7-H4多肽包含在B7-H4多肽序列或其片段内。

“B7-H4多肽”可包含B7-H4的全长多肽序列(例如，SEQ ID NO.:55)，或可包含B7-H4的全长多肽序列的任何长度的B7-H4片段(例如，包含B7-H4的全长多肽序列的5％、15％、25％、35％、45％、55％、65％、75％、85％或95％的多肽序列)，该片段包含可以结合(例如，被结合)本披露的抗体或抗原结合片段的表位。B7-H4多肽可包含与SEQ ID NO.:55的序列具有75％、80％、85％、90％或90％序列同一性的序列。优选地，B7-H4多肽包含SEQ ID NO.:55的序列。

抗体和抗原结合片段的特征

该抗体或抗原结合片段在体外和体内均对B7-H4具有高亲和力，因此可有利地用于检测B7-H4表位的方法和相关的诊断方法中。

术语“抗体”涵盖单克隆抗体及其片段(例如表现出所希望的生物活性的片段)。在优选的方面，本披露的抗体是单克隆抗体。在更优选的方面，抗体是完全人单克隆抗体。在一些方面，本披露的方法可以使用多克隆抗体。

特别地，抗体是包括至少一个或两个重(H)链可变区(本文缩写为VHC)以及至少一个或两个轻(L)链可变区(本文缩写为VLC)的蛋白质。VHC和VLC区可以进一步细分为被称为“互补决定区”(“CDR”)的高变区，其间插有被称为“框架区”(FR)的更保守的区域。框架区和CDR的范围已经被精确定义(参见，Kabat,E.A.等人Sequences of Proteins ofImmunological Interest[免疫学感兴趣的蛋白质序列],第五版,U.S.DepartmentofHealth and Human Services[美国卫生与公众服务部],NIH公开号91-3242,1991，以及Chothia,C等人,J.MoI.Biol.[分子生物学杂志]196:901-917,1987)。优选地，每个VHC和VLC由三个CDR和四个FR构成，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FRl、CDRl、FR2、DR2、FR3、CDR3、FR4。抗体的VHC或VLC链可以进一步包括所有的或部分的重链或轻链恒定区。在一些方面，抗体是两个重免疫球蛋白链和两个轻免疫球蛋白链的四聚体，其中重和轻免疫球蛋白链由例如二硫键相互连接。重链恒定区包括三个结构域，即CH1、CH2和CH3。轻链恒定区由一个结构域CL构成。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。术语“抗体”包括类型IgA、IgG、IgE、IgD、IgM(及其亚型)的完整免疫球蛋白，其中免疫球蛋白的轻链可以是κ或λ类型。如本文所使用的，术语抗体还指与上述标志物之一结合的抗体的一部分，例如，其中一个或多个免疫球蛋白链不是全长但与标志物结合的分子。涵盖在术语抗体中的结合部分的实例包括(i)Fab片段：由VLC、VHC、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段：包含两个在铰链区由二硫桥连接的Fab片段的二价片段；(iii)由VHC和CH1结构域组成的Fc片段；(iv)由抗体单臂的VLC和VHC结构域组成的Fv片段；(v)由VHC结构域组成的dAb片段(Ward等人,Nature[自然]341:544-546,1989)；以及(vi)具有足以发生结合的框架的分离的互补决定区(CDR)，例如，可变区的抗原结合部分。轻链可变区的抗原结合部分和重链可变区的抗原结合部分(例如Fv片段的两个结构域VLC和VHC)可以使用重组方法通过合成接头连接，该合成接头允许它们成为单个蛋白链，其中VLC和VHC区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人(1988)Science[科学]lAl-ATi-Alβ；以及Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.ScL USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883)。这样的单链抗体也涵盖在术语抗体内。这些可使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且以与完整抗体相同的方式针对实用性来筛选这些部分。

在一些方面，抗体或抗原结合片段是选自以下中的一种或多种：鼠抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、多特异性抗体、或其组合。

在一些方面，抗原结合片段是选自以下中的一种或多种：Fv片段、Fab片段、F(ab')2片段、Fab'片段、dsFv片段、scFv片段、sc(Fv)2片段、或其组合。

在一些方面，本披露的抗体或其抗原结合片段(例如，mAb)是scFV。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段可以跨物种结合B7-H4分子，例如，该抗体或片段可以结合小鼠B7-H4、大鼠B7-H4、兔、人B7-H4和/或食蟹猴B7-H4。在一些方面，抗体或片段可以结合人B7-H4和食蟹猴B7-H4。在一些方面，抗体或抗原结合片段还可以结合小鼠B7-H4。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段可以特异性结合B7-H4，例如人B7-H4和食蟹猴B7-H4，但不特异性结合人B7-H1、B7-H2和/或B7-H3。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段除了VH和VL之外还可以包括重链恒定区或其片段。在一些方面，重链恒定区是人重链恒定区，例如人IgG恒定区，例如人IgG1恒定区。在一些方面(优选地在抗体或其抗原结合片段与药剂(如细胞毒性剂)缀合的情况下)，将半胱氨酸残基插入到IgG1的CH2区中的氨基酸S239与V240之间。该半胱氨酸被称为“239插入”或“239i”。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段可以包含含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链恒定区。优选地，抗体或其抗原结合片段可以包含含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的重链恒定区。

“E02-GL”抗体具有ZY0EQD-E02的CDR序列(例如与其对应)(“GL”意指抗体已被种系化)。例如，E02-GL可以包含SEQ ID NO:45的VH链序列(例如SEQ ID NO:43的种系化版本)以及SEQ ID NO:34的VL链序列。E02-GL还可以包含SEQ ID NO:51的重链序列和SEQ ID NO:44的轻链序列。因此，如本文所述，与拓扑异构酶I有效负载SG3932缀合的“E02-GL”被称为“E02-GL-SG3932”。在一个方面，克隆E02-GL以8的平均药物抗体比(DAR)与拓扑异构酶I有效负载SG3932缀合。

在一些方面，重链恒定区或其片段(例如，人IgG恒定区或其片段)可相对于野生型IgG恒定结构域包括一个或多个氨基酸取代，其中与具有野生型IgG恒定结构域的IgG的半衰期相比，经修饰的IgG具有增加的半衰期。例如，IgG恒定结构域可以含有在位置251-257、285-290、308-314、385-389和428-436处的氨基酸残基的一个或多个氨基酸取代，其中根据如Kabat中所阐述的EU索引进行氨基酸位置编号。在一些方面，IgG恒定结构域可以含有以下中的一个或多个取代：Kabat位置252处的氨基酸被酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、或苏氨酸(T)取代，Kabat位置254处的氨基酸被苏氨酸(T)取代，Kabat位置256处的氨基酸被丝氨酸(S)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、或苏氨酸(T)取代，Kabat位置257处的氨基酸被亮氨酸(L)取代，Kabat位置309处的氨基酸被脯氨酸(P)取代，Kabat位置311处的氨基酸被丝氨酸(S)取代，Kabat位置428处的氨基酸被苏氨酸(T)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)、或丝氨酸(S)取代，Kabat位置433处的氨基酸被精氨酸(R)、丝氨酸(S)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、或谷氨酰胺(Q)取代，或Kabat位置434处的氨基酸被色氨酸(W)、甲硫氨酸(M)、丝氨酸(S)、组氨酸(H)、苯丙氨酸(F)、或酪氨酸取代。在优选的方面，IgG恒定结构域可相对于野生型人IgG恒定结构域含有氨基酸取代，包括Kabat位置252处的氨基酸被酪氨酸(Y)取代、Kabat位置254处的氨基酸被苏氨酸(T)取代、以及Kabat位置256处的氨基酸被谷氨酸(E)取代。在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含重链，其中该重链是人IgG1YTE突变体。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段除了VH和VL以外还可以任选地包括重链恒定区或其片段、轻链恒定区或其片段。在一些方面，轻链恒定区是κλ轻链恒定区，例如，人κ恒定区或人λ恒定区。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链恒定区。

在一些方面，VH和/或VL氨基酸序列可以与本文所阐述的序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的相似性。在一些方面，VH和/或VL氨基酸序列可相对于本文所阐述的序列包含1、2、3、4、5或更多个取代，例如保守取代。含有与VH区或VL区具有一定百分比相似性或具有一个或多个取代(例如，保守取代)的VH和VL区的B7-H4抗体可以通过编码本文所述的VH和/或VL区的核酸分子的诱变(例如，定点诱变或PCR介导的诱变)获得，随后测试所编码的改变的抗体对B7-H4的结合，并且任选地使用本文所述的功能测定测试保留的功能。

抗体或其抗原结合片段对抗原的亲和力或亲合力可以使用本领域熟知的任何合适的方法(例如，流式细胞术、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、或放射免疫测定法(RIA)、或动力学(例如或BIACORE^TM分析))经实验确定。可以容易地采用直接结合测定以及竞争性结合测定形式。(参见例如,Berzofsky等人,Antibody-Antigen Interactions[抗体-抗原相互作用],于Fundamental Immunology[基础免疫学],Paul,W.E.,编辑,RavenPress[雷文出版社]:New York,N.Y.[纽约州纽约](1984)；Kuby,Immunology[免疫学],W.H.Freeman和Company出版商:New York,N.Y.[纽约州纽约](1992)；以及本文所述的方法。)如果在不同条件(例如，盐浓度、pH、温度)下测量，特定抗体-抗原相互作用的所测量的亲和力可以变化。因此，用如本领域中已知的抗体和抗原的标准化溶液和标准化缓冲液进行亲和力和其他抗原结合参数(例如，KD或Kd、Kon、Koff)的测量。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段能以以下IC50结合表达B7-H4的细胞：低于约500nM、低于约350nM、低于约250nM、低于约150nM、低于约100nM、低于约75nM、低于约60nM、低于约50nM、低于约40nM、低于约30nM、低于约20nM、低于约15nM、低于约10nM、低于约5nM、低于约1nM、低于约500pM、低于约350pM、低于约250pM、低于约150pM、低于约100pM、低于约75pM、低于约60pM、低于约50pM、低于约40pM、低于约30pM、低于约20pM、低于约15pM、低于约10pM、或低于约5pM。优选地，通过流式细胞术测量所述IC50。

可切割接头和细胞毒性剂

在本文披露的抗体-药物缀合物的一些方面，抗体或其抗原结合片段通过接头与细胞毒性剂连接。在一些方面，抗体或其抗原结合片段通过接头与细胞毒性剂缀合。如本文所使用的，“缀合”意指经由共价键或离子键连接。细胞毒性剂在本文中可称为“药剂”或“活性剂”。在一些方面，细胞毒性剂是药物。

在一些方面，ADC上的细胞毒性剂(有时也称为“弹头”)是公开的国际申请WO2020/200880中披露的细胞毒性剂之一，该申请通过引用以其全文并入本文。

细胞毒性剂或细胞毒素可以是本领域中已知的任何分子，该分子抑制或阻止细胞的功能和/或造成细胞破坏(细胞死亡)和/或发挥抗肿瘤/抗增殖作用。已知许多类别的细胞毒性剂在ADC分子中具有潜在效用。这些包括但不限于：拓扑异构酶I抑制剂、鹅膏蕈碱、奥瑞斯他汀(auristatin)、柔红霉素、多柔比星、多卡米星、尾海兔素、烯二炔、来红霉素(lexitropsin)、紫杉烷类、嘌呤霉素、美登木素生物碱、长春花生物碱、微管溶素以及吡咯并苯并二氮杂(PBD)。这样的细胞毒性剂的实例是AFP、MMAF、MMAE、AEB、AEVB、奥瑞斯他汀E、紫杉醇、多西他赛、CC-1065、SN-38、拓扑替康、吗啉代多柔比星、根霉素、氰基吗啉代多柔比星、尾海兔素-10、棘霉素、康普瑞汀、杯形生长抑制素(chalicheamicin)、美登素、DM-1、长春碱、氨甲蝶呤和纺锤菌素、以及其衍生物和类似物。关于适合在ADC中使用的细胞毒素的另外的披露可以例如在国际专利申请公开号WO 2015/155345和WO 2015/157592中找到，其通过引用以其全文并入本文。

在一些方面，抗体或抗原结合片段与一种或多种异源药剂缀合，该一种或多种异源药剂选自由以下组成的组：拓扑异构酶I抑制剂、微管溶素衍生物、吡咯并苯并二氮杂抗微生物剂、治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、脂质、生物响应调节剂、药学药剂、淋巴因子、异源抗体、异源抗体的片段、可检测标记、聚乙二醇(PEG)、放射性同位素、或其组合。

在一些方面，抗体抗原结合片段与一种或多种细胞毒素缀合，该一种或多种细胞毒素选自拓扑异构酶I抑制剂、微管溶素衍生物、吡咯并苯并二氮杂或其组合。例如，抗体或其抗原结合片段与一种或多种细胞毒素缀合，该一种或多种细胞毒素选自由以下组成的组：拓扑异构酶I抑制剂SG3932、SG4010、SG4057或SG4052(其结构如下提供)；微管溶素AZ1508；吡咯并苯并二氮杂SG3315；吡咯并苯并二氮杂SG3249；或其组合。

在优选的方面，抗体或其抗原结合片段与拓扑异构酶I抑制剂缀合。拓扑异构酶抑制剂是阻断拓扑异构酶(拓扑异构酶I和II)的作用的化学化合物，拓扑异构酶是在正常的细胞周期中通过催化DNA链的磷酸二酯骨架的断裂和重新连接来控制DNA结构的变化的一种类型的酶。

合适的拓扑异构酶I抑制剂的一般实例由以下化合物A*表示：

其在本文中可以被称为“药物单元”。

该化合物(例如，A*)优选提供有用于连接(优选缀合)至本文所述的抗体或抗原结合片段(其可称为“配体单元”)的接头。合适地，该接头以可切割的方式附接(例如，缀合)至氨基残基，例如，本文所述的抗体或抗原结合片段的氨基酸。

更特别地，合适的拓扑异构酶I抑制剂的实例由具有式“I”的以下化合物：

及其盐和溶剂化物表示，其中R^L是用于连接至本文所述的抗体或其抗原结合片段(例如，配体单元)的接头，其中所述接头优选地选自：

(ia)：

其中

Q是：

其中Q^X使得Q为氨基酸残基、二肽残基、三肽残基或四肽残基；

X是：

其中a＝0至5，b1＝0至16，b2＝0至16，c1＝0或1，c2＝0或1，d＝0至5，其中至少b1或b2＝0(即，b1和b2中只有一个可以不是0)并且至少c1或c2＝0(即c1和c2中只有一个可以不是0)；

G^L是用于连接至本文所述的抗体或其抗原结合片段(例如，配体单元)的接头；或

(ib)：

其中R^L1和R^L2独立地选自H和甲基，或与它们所结合的碳原子一起形成环丙烯或环丁烯基团；并且

e是0或1。

本领域技术人员将理解，所述一种或多种药剂(例如，拓扑异构酶I抑制剂)中的多于一种可以与该抗体或其抗原结合片段缀合。

例如，本披露的缀合物(例如，抗体-药物缀合物)可以具有通式IV：

L–(D^L)_p(IV)

或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中L是本文所述的抗体或其抗原结合片段(例如，配体单元)，D^L是具有接头的拓扑异构酶I抑制剂(例如，药物接头单元)并且具有式III：

R^LL是连接至本文所述的抗体或其抗原结合片段(例如，配体单元)的接头，其中该接头优选地选自

(ia')：

其中Q和X如以上所定义，并且G^LL是连接至本文所述的抗体或其抗原结合片段(例如，配体单元)的接头；以及

(ib')：

其中R^L1和R^L2如以上所定义；并且

p是1至20的整数。

载药量由p表示，即每个抗体或其抗原结合片段(例如，配体单元)上的一种或多种拓扑异构酶I抑制剂(例如，药物单元)的数量。载药量可以在1至20个药物单元(D)/配体单元的范围内。对于组合物，p表示组合物中缀合物的平均载药量，并且p的范围为1至20。

因此，本文披露的ADC的方面涵盖缀合物，该缀合物包含共价连接至至少一种拓扑异构酶I抑制剂(例如，药物单元，如以上说明的A*)的本文所述的抗体或其抗原结合片段(例如，配体单元)。所述抑制剂优选通过接头(例如，接头单元，如以上描述为R^L和/或R^LL的接头)连接至该抗体或其抗原结合片段。换言之，本文披露的ADC的方面涵盖附接有(优选经由接头)一种或多种拓扑异构酶I抑制剂(例如，药物-接头单元)的本文所述的抗体或其抗原结合片段(例如，配体单元)。以上更全面描述的抗体或其抗原结合片段(表示配体单元)是结合靶标部分的靶向剂。更特别地，该配体单元可以例如特异性结合靶细胞上的B7-H4，由此将药物单元递送至该靶细胞。因此，本文所述的方法可用于使用ADC治疗例如各种癌症和其他障碍(例如，与表达B7-H4的细胞、优选癌性细胞的存在相关的癌症/障碍)，如本文其他地方所讨论。

上述拓扑异构酶I抑制剂的某些特征是特别优选的并且可以如下所阐述更详细地定义。举例来说，将概述特征Q^X(例如在上述1a的接头内)的优选方面。

以下偏好可以应用于本文所述的方法、组合和试剂盒的所有方面，或者可以涉及单个方面。这些偏好能以任何组合被组合在一起。

Q^X

在一些方面，Q是氨基酸残基。氨基酸可以是天然氨基酸或非天然氨基酸。例如，Q可以选自：Phe、Lys、Val、Ala、Cit、Leu、Ile、Arg和Trp，其中Cit是瓜氨酸。

在一些方面，Q包含二肽残基。二肽中的氨基酸可以是天然氨基酸和非天然氨基酸的任何组合。在一些方面，二肽包含天然氨基酸。当接头是组织蛋白酶不稳定接头时，二肽是组织蛋白酶介导的切割的作用位点。然后，二肽是组织蛋白酶的识别位点。

在一些方面，Q选自：

^NH-Phe-Lys-^C＝O、

^NH-Val-Ala-^C＝O、

^NH-Val-Lys-^C＝O、

^NH-Ala-Lys-^C＝O、

^NH-Val-Cit-^C＝O、

^NH-Phe-Cit-^C＝O、

^NH-Leu-Cit-^C＝O、

^NH-Ile-Cit-^C＝O、

^NH-Phe-Arg-^C＝O、

^NH-Trp-Cit-^C＝O和

^NH-Gly-Val-^C＝O；

其中Cit是瓜氨酸。

优选地，Q选自：

^NH-Phe-Lys-^C＝O、

^NH-Val-Ala-^C＝O、

^NH-Val-Lys-^C＝O、

^NH-Ala-Lys-^C＝O和

^NH-Val-Cit-^C＝O。

更优选地，Q选自^NH-Phe-Lys-^C＝O、^NH-Val-Cit-^C＝O或^NH-Val-Ala-C＝O。

其他合适的二肽组合包括：

^NH-Gly-Gly-^C＝O、

^NH-Gly-Val-^C＝O

^NH-Pro-Pro-^C＝O和

^NH-Val-Glu-^C＝O。

可以使用其他二肽组合，包括由Dubowchik等人,Bioconjugate Chemistry[生物缀合化学],2002,13,855-869描述的那些，其通过引用并入本文。

在一些方面，Q是三肽残基。三肽中的氨基酸可以是天然氨基酸和非天然氨基酸的任何组合。在一些方面，三肽包含天然氨基酸。当接头是组织蛋白酶不稳定接头时，三肽是组织蛋白酶介导的切割的作用位点。然后，三肽是组织蛋白酶的识别位点。特别感兴趣的三肽接头是：

^NH-Glu-Val-Ala-^C＝O

^NH-Glu-Val-Cit-^C＝O

^NH-αGlu-Val-Ala-^C＝O

^NH-αGlu-Val-Cit-^C＝O

在一些方面，Q是四肽残基。四肽中的氨基酸可以是天然氨基酸和非天然氨基酸的任何组合。在一些方面，四肽包含天然氨基酸。当接头是组织蛋白酶不稳定接头时，四肽是组织蛋白酶介导的切割的作用位点。然后，四肽是组织蛋白酶的识别位点。特别感兴趣的四肽接头是：

^NH-Gly-Gly-Phe-Gly ^C＝O；和

^NH-Gly-Phe-Gly-Gly ^C＝O。

在一些方面，四肽是：

^NH-Gly-Gly-Phe-Gly ^C＝O。

在上述肽残基的表示中，^NH-表示残基的N末端，并且-^C＝O表示残基的C末端。C末端结合至A*的NH。

Glu表示谷氨酸的残基，即：

αGlu表示当经由α链结合时的谷氨酸的残基，即：

在一些方面，在适当的情况下，氨基酸侧链被化学保护。侧链保护基团可以是如上所讨论的基团。被保护的氨基酸序列可被酶切割。例如，包含Boc侧链保护的Lys残基的二肽序列可被组织蛋白酶切割。

氨基酸侧链的保护基团是本领域熟知的，并且描述于Novabiochem公司目录中，并且如上所述。

G^L

G^L可以选自：

其中Ar表示C_5-6亚芳基基团，例如亚苯基，并且X表示C_1-4烷基。

在一些方面，G^L选自G^L1-1和G^L1-2。在这些方面中的一些中，G^L是G^L1-1。

G^LL

G^LL可以选自：

在一些方面，G^LL选自G^LL1-1和G^LL1-2。在这些方面中的一些中，G^LL是G^LL1-1。

X

X优选为：

其中a＝0至5，b1＝0至16，b2＝0至16，c＝0或1，d＝0至5，其中至少b1或b2＝0并且至少c1或c2＝0。

a可以是0、1、2、3、4或5。在一些方面，a是0至3。在这些方面中的一些中，a是0或1。在另外的方面，a是0。

b1可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在一些方面，b1是0至12。在这些方面中的一些中，b1是0至8，并且可以是0、2、3、4、5或8。

b2可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在一些方面，b2是0至12。在这些方面中的一些中，b2是0至8，并且可以是0、2、3、4、5或8。优选地，b1和b2中只有一个可以不是0。

c1可以是0或1。c2可以是0或1。优选地，c1和c2中只有一个可以不是0。

d可以是0、1、2、3、4或5。在一些方面，d是0至3。在这些方面中的一些中，d是1或2。在另外的方面，d是2。在另外的方面，d是5。

在X的一些方面，a是0，b1是0，c1是1，c2是0并且d是2，并且b2可以是0至8。在这些方面中的一些中，b2是0、2、3、4、5或8。在X的一些方面，a是1，b2是0，c1是0，c2是0并且d是0，并且b1可以是0至8。在这些方面中的一些中，b1是0、2、3、4、5或8。在X的一些方面，a是0，b1是0，c1是0，c2是0并且d是1，并且b2可以是0至8。在这些方面中的一些中，b2是0、2、3、4、5或8。在X的一些方面，b1是0，b2是0，c1是0，c2是0并且a和d中的一个是0。a和d中的另一个是1至5。在这些方面中的一些中，a和d中的另一个是1。在这些方面中的其他方面中，a和d中的另一个是5。在X的一些方面，a是1，b2是0，c1是0，c2是1，d是2，并且b1可以是0至8。在这些方面中的一些中，b2是0、2、3、4、5或8。

在一些方面，R^L具有式Ib。在一些方面，R^LL具有式Ib’。

R^L1和R^L2可以独立地选自H和甲基，或与它们所结合的碳原子一起形成环丙烯或环丁烯基团。

在一些方面，R^L1和R^L2均是H。在一些方面，R^L1是H并且R^L2是甲基。在一些方面，R^L1和R^L2均是甲基。

在一些方面，R^L1和R^L2与它们所结合的碳原子一起形成环丙烯基团。在一些方面，R^L1和R^L2与它们所结合的碳原子一起形成环丁烯基团。

在基团Ib中，在一些方面，e是0。在其他方面，e是1并且硝基基团可以在环的任何可用位置。在这些方面中的一些中，它在邻位。在这些方面中的其他方面中，它在对位。

在其中以单一对映异构体或以对映异构富集的形式提供本文所述的化合物的一些方面，对映异构富集的形式具有大于60:40、70:30、80:20或90:10的对映异构体比率。在另外的方面，对映异构比率大于95:5、97:3或99:1。

在一些方面，R^L选自：

在一些方面，R^LL是源自上述R^L基团的基团。

已经概述了上述偏好，现在描述某些优选的拓扑异构酶I-接头(例如，药物接头单元)的式。

在一些方面，具有式I的化合物具有式I^P：

及其盐和溶剂化物，其中R^LP是用于连接至本文所述的抗体或其抗原结合片段的接头，其中所述接头选自：

(ia)：

其中

Q^P是：

其中Q^XP使得Q^P为氨基酸残基、二肽残基或三肽残基；

X^P是：

其中aP＝0至5，bP＝0至16，cP＝0或1，dP＝0至5；

G^L是用于连接至本文所述的抗体或其抗原结合片段(例如，配体单元)的接头；

(ib)：

e是0或1。

aP可以是0、1、2、3、4或5。在一些方面，aP是0至3。在这些方面中的一些中，aP是0或1。在另外的方面，aP是0。

bP可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在一些方面，b是0至12。在这些方面中的一些中，bP是0至8，并且可以是0、2、4或8。

cP可以是0或1。

dP可以是0、1、2、3、4或5。在一些方面，dP是0至3。在这些方面中的一些中，dP是1或2。在另外的方面，dP是2。

在X^P的一些方面，aP是0，cP是1并且dP是2，并且bP可以是0至8。在这些方面中的一些中，bP是0、4或8。

上述对于具有式I的化合物的Q^X的偏好可以适用于Q^XP(例如，在适当的情况下)。

上述对于具有式I的化合物的G^L、R^L1、R^L2和e的偏好可以适用于具有式I^P的化合物。

在一些方面，具有式IV的缀合物具有式IV^P：

L–(D^LP)_p(IV^P)

或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中L是本文所述的抗体或其抗原结合片段(例如，配体单元)，D^LP是拓扑异构酶I抑制剂(例如，药物接头单元)并且具有式III^P：

R^LLP是连接至该抗体或其抗原结合片段(例如，配体单元)的接头，其中所述接头选自

(ia')：

其中Q^P和X^P如以上所定义，并且G^LL是连接至本文所述的抗体或其抗原结合片段(例如，配体单元)的接头；和

(ib')：

其中R^L1和R^L2如以上所定义；并且

p是1至20的整数。

在一些方面，具有式I的化合物具有式I^P2：

及其盐和溶剂化物，其中R^LP2是用于连接至本文所述的抗体或其抗原结合片段的接头，其中所述接头选自：

(ia)：

其中

Q是：

X^P2是：

其中aP2＝0至5，b1P2＝0至16，b2P2＝0至16，cP2＝0或1，dP2＝0至5，其中至少b1P2或b2P2＝0(即b1和b2中只有一个可以不是0)；

(ib)：

e是0或1。

aP2可以是0、1、2、3、4或5。在一些方面，aP2是0至3。在这些方面中的一些中，aP2是0或1。在另外的方面，aP2是0。

b1P2可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在一些方面，b1P2是0至12。在这些方面中的一些中，b1P2是0至8，并且可以是0、2、3、4、5或8。

b2P2可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在一些方面，b2P2是0至12。在这些方面中的一些中，b2P2是0至8，并且可以是0、2、3、4、5或8。

优选地，b1P2和b2P2中只有一个可以不是0。

cP2可以是0或1。

dP2可以是0、1、2、3、4或5。在一些方面，dP2是0至3。在这些方面中的一些中，dP2是1或2。在另外的方面，dP2是2。在另外的方面，dP2是5。

在X^P2的一些方面，aP2是0，b1P2是0，cP2是1并且dP2是2，并且b2P2可以是0至8。在这些方面中的一些中，b2P2是0、2、3、4、5或8。在X^P2的一些方面，aP2是1，b2P2是0，cP2是0并且dP2是0，并且b1P2可以是0至8。在这些方面中的一些中，b1P2是0、2、3、4、5或8。在X^P2的一些方面，aP2是0，b1P2是0，cP2是0并且dP2是1，并且b2P2可以是0至8。在这些方面中的一些中，b2P2是0、2、3、4、5或8。在X^P2的一些方面，b1P2是0，b2P2是0，cP2是0并且aP2和dP2中的一个是0。aP2和d中的另一个是1至5。在这些方面中的一些中，aP2和d中的另一个是1。在这些方面中的其他方面中，aP2和dP2中的另一个是5。

上述对于具有式I的化合物的Q^X的偏好可以适用于式Ia^P2中的Q^X(例如，在适当的情况下)。

上述对于具有式I的化合物的G^L、R^L1、R^L2和e的偏好可以适用于具有式I^P2的化合物。

在一些方面，具有式IV的缀合物具有式IV^P2：

L–(D^LP2)_p(IV^P2)

或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中L是本文所述的抗体或其抗原结合片段(例如，配体单元)，D^LP2是拓扑异构酶I抑制剂(例如，药物接头单元)并且具有式III^P2：

R^LLP2是连接至该抗体或其抗原结合片段(例如，配体单元)的接头，其中所述接头选自

(ia')：

其中Q和X^P2如以上所定义，并且G^LL是连接至该抗体或其抗原结合片段的接头；和

(ib')：

其中R^L1和R^L2如以上所定义；并且

p是1至20的整数。

在一些方面，接头是mp-PEG8-val-ala接头。如名称所指示，mp-PEG8-val-ala接头具有8个连续的聚乙二醇单元，随后是附接到细胞毒性剂的缬氨酸-丙氨酸(val-ala)二肽。

在一些方面，接头和细胞毒性剂一起包含以下化合物中的一个：

和/或

在一些方面，接头和细胞毒性剂一起包含SG3932：

药物抗体比

药剂典型地连接至该抗体或抗原结合片段或“加载到”该抗体或抗原结合片段上。药剂加载量(p)是每个抗体或抗原结合片段(例如，配体单元)上的一种或多种药剂的平均数量。

来自缀合反应的ADC制剂中每个抗体(或抗原结合片段)上的平均药剂数量可以通过常规方式进行表征，这些方式如UV、反相HPLC、HIC、质谱、ELISA测定和电泳。也可以确定依据p的ADC的定量分布。通过ELISA，可以确定特定ADC制剂中p的平均值(Hamblett等人(2004)Clin.Cancer Res.[临床癌症研究]10:7063-7070；Sanderson等人(2005)Clin.Cancer Res.[临床癌症研究]11:843-852)。在一些情况下，均质ADC(其中p是来自具有其他载药量的ADC的某个值)的分离、纯化和表征可以通过如反相HPLC或电泳来实现。这样的技术也适用于其他类型的缀合物。

半胱氨酸氨基酸可在抗体(或其抗原结合片段)中的反应性位点处被工程化，并且优选地不形成链内或分子间二硫键(Junutula等人,2008b Nature Biotech.[自然生物技术],26(8):925-932；Dornan等人(2009)Blood[血液]114(13):2721-2729；US 7521541；US7723485；WO 2009/052249)。工程化的半胱氨酸硫醇可以与药剂(例如，具有以下式I)内的接头反应以形成具有半胱氨酸工程化的抗体的ADC，该接头可以具有硫醇反应性亲电基团(如马来酰亚胺或α-卤代酰胺)。因此，可以设计、控制和知道药物单元的位置。由于工程化的半胱氨酸硫醇基团通常以高产率与药物接头试剂反应，因此可以控制载药量。通过在重链或轻链上的单个位点进行取代，对IgG抗体进行工程化以引入半胱氨酸氨基酸，在对称抗体上给出两个新的半胱氨酸。可以达到接近2的载药量，其中缀合产物ADC接近均质性。

当抗体或其抗原结合片段的一个以上的亲核或亲电基团与药剂反应，则所得产物可以是ADC化合物的混合物，其中附接至抗体的药剂单元分布为例如1、2、3等。液相色谱法(如聚合反相(PLRP)和疏水相互作用(HIC))可以通过药剂加载值来分离混合物中的化合物。可以分离具有单一药剂加载值(p)的ADC制剂。

因此，本披露的抗体-药物缀合物组合物可以包括抗体-药物缀合物的混合物，其中该抗体或其抗原结合片段具有一个或多个药剂部分，并且其中这些药剂部分可以在各个氨基酸残基处附接至该抗体或其抗原结合片段。

在一些方面，每个抗体(或其抗原结合片段)上的平均药剂数量在1至20的范围内。在一些方面，该范围选自1至10、2至10、2至8、2至6、以及4至10。在一些方面，每个抗体(或其抗原结合片段)上存在一个药剂。在一些方面，每个抗体(或其抗原结合片段)上的药剂数量可以表示为药剂(即，药物)与抗体的比率。这个比率被称为药物抗体比(DAR)。”DAR是连接至每个抗体的药物(即，药剂)的平均数量。在本披露的一些方面，DAR的范围在1至20。在一些方面，DAR的范围选自1至10、2至10、2至8、2至6、以及4至10。在一些方面，DAR在约1与约8之间。在本披露的特定方面，DAR约为8。在本披露的特定方面，DAR为8。

ADC的施用和药学上可接受的化合物

在一些方面，将ADC直接递送至有害细胞群体的位点处(例如从而增加患病组织对治疗剂的暴露)。在一些方面，直接施用至气道，例如通过吸入或鼻内施用。

本文所述的ADC可以包含在药物组合物中。该药物组合物可以包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。在一些方面，本披露药物组合物可以包含药学上可接受的无毒的无菌载剂，如生理盐水、无毒缓冲液、防腐剂等。在本文披露的治疗方法中使用的适合的配制品描述于Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学],第22版,LloydV.Allen,Jr.编辑(2012)中。

在一些方面，本披露的ADC药物组合物可以包含在一种或多种配制品中，该一种或多种配制品选自胶囊、片剂、水性悬浮液、溶液、鼻气雾剂、或其组合。

在一些方面，ADC药物组合物包含多于一种类型的ADC。例如，药物组合物可包含具有不同抗体、抗原结合片段、接头或细胞毒性剂、或其不同组合的两种或更多种ADC。

术语抗体或抗原结合片段的“药学上有效的量”意指足以实现与靶标的有效结合并实现益处(例如，改善疾病或病症的症状，或者检测物质或细胞)的量。

在一些方面，药物组合物可以包含缓冲液(例如，乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、表面活性剂(例如，聚山梨醇酯)、任选的稳定剂试剂(例如，人白蛋白)等。

抗体制备

本披露的抗体可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且它们的效用通过常规结合研究来证实——示例性方法描述于实例2中。举例来说，简单的结合测定是用抗体孵育表达抗原的细胞。如果将抗体用荧光团标记，则可以通过FACS分析来检测抗体与抗原的结合。

本披露的抗体可以在多种动物中产生，包括小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、猴或马。可以在用单独荚膜多糖或用多种荚膜多糖进行免疫后产生抗体。从这些动物中分离出的血液含有多克隆抗体——与相同抗原结合的多种抗体。也可以将抗原注射至鸡中以在蛋黄中产生多克隆抗体。为了获得对抗原的单一表位具有特异性的单克隆抗体，从动物中分离出分泌抗体的淋巴细胞，并且通过将它们与癌细胞系融合而使其永生化。融合的细胞被称为杂交瘤，并且在培养中会不断生长并分泌抗体。通过稀释克隆法分离单一杂交瘤细胞以生成全部都产生相同抗体的细胞克隆；这些抗体被称为单克隆抗体。用于产生单克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的常规技术(参见例如，Making and Using Antibodies:APractical Handbook.[制备和使用抗体：实用手册]GC Howard.CRC Books.[CRC书籍]2006.ISBN 0849335280)。通常使用蛋白A/G或抗原亲和色谱法纯化多克隆和单克隆抗体。

本披露的抗体或其抗原结合片段可制备为单克隆抗B7-H4抗体，其可使用杂交瘤方法制备，这些方法如Kohler和Milstein,Nature[自然]256:495(1975)描述的那些。使用杂交瘤方法，如上所述对小鼠、仓鼠、或其他适当的宿主动物进行免疫，以引发淋巴细胞产生会特异性结合免疫抗原的抗体。淋巴细胞也可以在体外被免疫。免疫后，分离淋巴细胞，并且利用例如聚乙二醇与适合的骨髓瘤细胞系融合，以形成然后可以从未融合的淋巴细胞和骨髓瘤细胞选择出的杂交瘤细胞。然后可以在体外培养物中使用标准方法(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice[单克隆抗体：原理和实践],AcademicPress[学术出版社],1986)或在体内作为动物的腹水肿瘤繁殖杂交瘤，这些杂交瘤产生特异性针对选定的抗原的单克隆抗体，如通过免疫沉淀、免疫印迹、或体外结合测定(例如，放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))所确定的。然后可以使用已知的方法从培养基或腹水流体中纯化单克隆抗体。

可替代地，抗体或其抗原结合片段(例如，作为单克隆抗体)还可以使用如在美国专利号4,816,567中所述的重组DNA方法制备。如通过使用寡核苷酸引物(其特异性扩增编码抗体的重链和轻链的基因)的RT-PCR从成熟B细胞或杂交瘤细胞分离编码单克隆抗体的多核苷酸，并且使用常规程序确定它们的序列。然后将编码重链和轻链的分离的多核苷酸克隆到适合的表达载体中，这些表达载体在转染到不产生免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞(如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)中时，由这些宿主细胞产生单克隆抗体。此外，所希望物种的重组单克隆抗体或其抗原结合片段可以从表达所希望物种的CDR的噬菌体展示文库中分离，如以下文献所述：McCafferty等人,Nature[自然]348:552-554(1990)；Clackson等人,Nature[自然],352:624-628(1991)；以及Marks等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]222:581-597(1991)。

编码本披露的抗体或其抗原结合片段的一种或多种多核苷酸可进一步使用重组DNA技术以多种不同的方式修饰以产生可替代的抗体。在一些方面，例如，小鼠单克隆抗体的轻链和重链的恒定结构域可以被(1)例如人抗体的那些区域取代以便产生嵌合抗体或被(2)非免疫球蛋白多肽取代以便产生融合抗体。在一些方面，截短或去除这些恒定区以便产生单克隆抗体的所希望的抗体片段。定点诱变或高密度诱变可变区可以用于优化单克隆抗体的特异性、亲和力等。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段是人抗体或其抗原结合片段。可以使用本领域已知的各种技术来直接制备人抗体。可以产生在体外免疫的或从产生针对靶抗原的抗体的免疫个体分离的永生化人B淋巴细胞。参见例如，Cole等人,Monoclonal Antibodies andCancer Therapy[单克隆抗体和癌症疗法],Alan R.Liss[奥兰李斯公司],第77页(1985)；Boemer等人,J.Immunol.[免疫学杂志]147(1):86-95(1991)；美国专利5,750,373。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段可以选自噬菌体文库，其中该噬菌体文库表达人抗体，如例如在以下文献中所述的：Vaughan等人,Nat.Biotech.[自然生物技术]14:309-314(1996)；Sheets等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],95:6157-6162(1998)；Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]227:381(1991)；以及Marks等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]222:581(1991)。用于产生和使用抗体噬菌体文库的技术还描述在美国专利号5,969,108、6,172,197、5,885,793、6,521,404、6,544,731、6,555,313、6,582,915、6,593,081、6,300,064、6,653,068、6,706,484、和7,264,963，以及Rothe等人,J.Molec.Biol.[分子生物学杂志]376:1182-1200(2008)中，将这些文献中的每一篇通过引用以其全文并入。

亲和力成熟策略和链改组策略是本领域已知的，并且可用于产生高亲和力人抗体或其抗原结合片段。参见Marks等人,BioTechnology[生物技术]10:779-783(1992)，将其通过引用以其全文并入。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段(例如，单克隆抗体)可以是人源化抗体。用于工程化、人源化或表面重修非人抗体或人抗体的方法也可以使用并且是本领域熟知的。人源化、表面重修或类似工程化的抗体可以具有来自非人来源的一个或多个氨基酸残基，该来源例如但不限于小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物或其他哺乳动物。这些非人氨基酸残基被经常称为“输入”残基的残基替代，这些残基典型地取自已知人序列的“输入”可变结构域、恒定结构域或其他结构域。这样的输入序列可以用于降低免疫原性或减小、增强或修饰结合、亲和力、结合速率、解离速率、亲合力、特异性、半衰期、或如本领域已知的任何其他合适的特征。合适地，CDR残基可直接且最实质性地参与影响B7-H4结合。因此，优选地维持非人或人CDR序列的一部分或全部，同时可变区和恒定区的非人序列可以被人氨基酸或其他氨基酸替代。

抗体还可以任选地被人源化、表面重修、工程化或人抗体工程化，其中保留对抗原B7-H4的高亲和力以及其他有利的生物特性。为实现这个目标，人源化(或人)或工程化的抗B7-H4抗体以及表面重修的抗体可任选地通过使用亲本、工程化和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化和工程化产物的方法来制备。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的并且对于本领域技术人员而言是熟悉的。说明并展示所选定的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序是可获得的。检查这些展示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原如B7-H4的能力的残基。以这种方式，可以从共有序列和输入序列中选择并且组合FW残基，使得所希望的抗体特征(如增加对一种或多种靶抗原的亲和力)得以实现。

本披露的抗B7-H4抗体或其抗原结合片段的人源化、表面重修或工程化可以使用任何已知方法进行，该已知方法如但不限于以下文献中所述的那些：Jones等人,Nature[自然]321:522(1986)；Riechmann等人,Nature[自然]332:323(1988)；Verhoeyen等人,Science[科学]239:1534(1988)；Sims等人,J.Immunol.[免疫学杂志]151:2296(1993)；Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901(1987)；Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89:4285(1992)；Presta等人,J.Immunol.[免疫学杂志]151:2623(1993)；美国专利号5,639,641、5,723,323、5,976,862、5,824,514、5,817,483、5,814,476、5,763,192、5,723,323、5,766,886、5,714,352、6,204,023、6,180,370、5,693,762、5,530,101、5,585,089、5,225,539、4,816,567，7,557,189、7,538,195、和7,342,110；国际申请号PCT/US98/16280、PCT/US96/18978、PCT/US91/09630、PCT/US91/05939、PCT/US94/01234、PCT/GB89/01334、PCT/GB91/01134、PCT/GB92/01755；国际专利申请公开号WO 90/14443、WO 90/14424、WO 90/14430；以及欧洲专利公开号EP 229246；将这些文献中的每一篇通过引用全文并入本文，包括其中引用的参考文献。

抗B7-H4人源化抗体及其抗原结合片段还可以在含有人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中制备，这些基因座在免疫时能够在内源性免疫球蛋白的产生不存在的情况下产生全套人抗体。该方法描述于美国专利号5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、以及5,661,016中。

在一些方面，提供了抗体(例如，抗B7-H4抗体)的片段(例如抗体片段)。已知各种用于产生抗体片段的技术。传统上，这些片段经由完整抗体的蛋白水解消化获得，如例如由Morimoto等人,J.Biochem.Biophys.Meth.[生物化学和生物物理方法杂志]24:107-117(1993)以及Brennan等人,Science[科学]229:81(1985)所描述的。在一些方面，重组产生抗B7-H4抗体片段。Fab、Fv和scFv抗体片段都可以在大肠杆菌或其他宿主细胞中表达并且从其分泌，因而允许产生大量的这些片段。这样的抗B7-H4抗体片段也可以从以上论述的抗体噬菌体文库分离。这些抗B7-H4抗体片段还可以是如美国专利号5,641,870中所述的线性抗体。用于产生抗体片段的其他技术对于熟练的从业人员将是清楚的。

根据本披露，技术可经改编以产生对B7-H4具有特异性的单链抗体。参见例如，美国专利号4,946,778)。此外，方法可经改编以构建Fab表达文库，以允许快速且有效地鉴定对B7-H4具有所希望特异性的单克隆Fab片段或其衍生物、片段、类似物或同源物。参见例如，Huse等人,Science[科学]246:1275-1281(1989)。通过本领域已知的技术可以生产抗体片段，包括但不限于：由抗体分子的胃蛋白酶消化产生的F(ab')2片段；通过还原F(ab')2片段的二硫桥产生的Fab片段；通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生的Fab片段；或Fv片段。

在一些方面，可以对本披露的抗体或其抗原结合片段进行修饰以增加其血清半衰期。这可以例如通过将补救受体结合表位并入抗体或抗体片段中、通过使抗体或抗体片段中的适当的区域突变、或通过将表位并入随后融合至抗体或抗体片段的末端或中间的肽标签(例如，通过DNA或肽合成)、或通过YTE突变来实现。本领域中已知其他增加抗体或其抗原结合片段的血清半衰期的方法，例如，缀合至异源分子如PEG。

如本文所提供的经修饰的抗体或其抗原结合片段可以包含任何类型的提供该抗体或多肽与B7-H4的缔合的可变区。在这点上，可变区可包含或源自可诱导增加体液响应并生成针对所希望抗原的免疫球蛋白的任何类型的哺乳动物。正因如此，抗B7-H4抗体或其抗原结合片段的可变区可以是例如人、鼠、非人灵长类动物(例如，食蟹猴、猕猴等)或狼来源的。在一些方面，经修饰的抗体或其抗原结合片段的可变区和恒定区两者均是人的。在一些方面，相容性抗体的可变区(通常源自非人来源)可以经工程化或专门定制来改善结合特性或减少分子的免疫原性。在这点上，在本披露中有用的可变区可经人源化或另外通过纳入输入的氨基酸序列改变。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段的重链和轻链两者中的可变结构域通过至少部分替代一个或多个CDR和/或通过部分框架区替代和序列改变而被改变。虽然CDR可源自与框架区所源自的抗体相同的类别或甚至亚类的抗体，但是设想CDR将源自不同类别的抗体并且在某些方面源自不同物种的抗体。不必用来自供体可变区的完整CDR来替代所有CDR以将一个可变结构域的抗原结合能力转移至另一个。而是，只需要转移维持抗原结合位点的活性所必需的那些残基。考虑到在美国专利号5,585,089、5,693,761和5,693,762中所阐述的解释，本领域技术人员完全有能力开展常规实验以获得具有减少的免疫原性的功能抗体。

尽管对可变区进行改变，本领域技术人员将理解，本披露的经修饰的抗体或其抗原结合片段将包含抗体(例如，全长抗体或其抗原结合片段)，其中至少一个或多个恒定区结构域的一部分已被缺失或以其他方式改变，以便提供所希望的生物化学特征，如当与包含天然或未改变的恒定区的具有大约相同免疫原性的抗体相比时增加的肿瘤定位或减少的血清半衰期。在一些方面，经修饰的抗体的恒定区包含人恒定区。对与本披露相容的恒定区的修饰包括在一个或多个结构域中的一个或多个氨基酸的添加、缺失或取代。即，本文披露的经修饰的抗体可包含对三个重链恒定结构域(CH1、CH2或CH3)中的一个或多个和/或对轻链恒定结构域(CL)的改变或修饰。在一些方面，考虑了经修饰的恒定区，其中一个或多个结构域部分或全部缺失。在一些方面，经修饰的抗体将包含缺失结构域的构建体或变体，其中整个CH2结构域被去除(ΔCH2构建体)。在一些方面，省略的恒定区结构域可以被短氨基酸间隔子(例如，10个残基)替代，该间隔子提供典型地由不存在的恒定区所赋予的一些分子柔性。

除它们的构型以外，本领域中已知恒定区介导几种效应子功能。例如，抗体经由Fc区与细胞结合，其中抗体Fc区上的Fc受体位点与细胞上的Fc受体(FcR)结合。许多Fc受体对不同类别的抗体(包括IgG(γ受体)、IgE(η受体)、IgA(α受体)和IgM(μ受体))具有特异性。抗体与细胞表面上的Fc受体的结合触发许多多样的生物学响应，包括抗体包覆的颗粒的吞噬和破环、免疫复合物的清除、杀灭细胞溶解抗体包覆的靶细胞(称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，或ADCC)、炎症介质的释放、胎盘转移、以及对免疫球蛋白产生的控制。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段提供改变的效应子功能，进而影响施用的抗体或其抗原结合片段的生物学特性。例如，恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其他手段)可以减少循环的经修饰的抗体的Fc受体结合。在其他情况下，与本披露一致的，恒定区修饰可以缓和补体结合并且因而减少缀合的细胞毒素的血清半衰期和非特异性缔合。恒定区的其他修饰可以用于消除二硫键或寡糖部分，从而允许由于抗原特异性或抗体柔性增加而增强定位。类似地，根据本披露对恒定区的修饰可容易地利用技术人员认知范围内的熟知的生物化学或分子工程技术进行。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段不具有一种或多种效应子功能。例如，在一些方面，抗体或其抗原结合片段无抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性和/或无补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。在一些方面，抗体或其抗原结合片段不结合Fc受体和/或补体因子。在一些方面，抗体或其抗原结合片段无效应子功能。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段可以被工程化以将CH3结构域直接融合到相应的经修饰的抗体或其片段的铰链区。在其他构建体中，可以将肽间隔子插在铰链区与经修饰的CH2和/或CH3结构域之间。例如，可表达相容性构建体，其中CH2结构域已经缺失，且剩余的CH3结构域(经修饰的或未修饰的)与具有5-20个氨基酸的间隔子的铰链区连接。可添加这样的间隔子，例如以确保恒定结构域的调节元件保持游离且可接触，或者铰链区保持柔性。在一些情况下，氨基酸间隔子可被证明具有免疫原性，并引发针对构建体的非所需免疫响应。在一些方面，添加至构建体的任何间隔子都可以是相对无免疫原性的，或甚至被完全省略，以便维持经修饰的抗体的所希望的生物化学性质。

除了缺失整个恒定区结构域之外，本文提供的抗体或其抗原结合片段可通过恒定区中的几个或甚至单个氨基酸的部分缺失或取代来修饰。例如，CH2结构域中的选定区域中的单个氨基酸的突变可足以实质性地减少Fc结合，并且从而增加肿瘤定位。类似地，控制效应子功能(例如，补体C1Q结合)的一个或多个恒定区结构域可以完全或部分缺失。恒定区的这样的部分缺失可以改善抗体或其抗原结合片段的选定特征(例如，血清半衰期)，同时使与受试者恒定区结构域相关的其他所希望的功能保持完整。此外，抗体及其抗原结合片段的恒定区可通过增强所得构建体特性的一个或多个氨基酸的突变或取代来修饰。在这个方面，可以干扰由保守结合位点所提供的活性(例如，Fc结合)，同时基本上维持经修饰的抗体或其抗原结合片段的构型和免疫原性特性。在一些方面，可以向恒定区添加一个或多个氨基酸以增强所希望的特征，如减少或增加效应子功能，或提供更多细胞毒素或碳水化合物附接。在一些方面，可以希望插入或复制源自选定的恒定区结构域的特定序列。

本文所述的方法、组合和试剂盒包括与本披露的抗体或抗原结合片段(例如，鼠、嵌合、人源化或人抗体、或其抗原结合片段)基本同源的变体和等同物。这些可以含有例如保守取代突变，即通过相似的氨基酸取代一个或多个氨基酸。例如，保守取代是指用相同通用类别内的另一个氨基酸取代一个氨基酸，例如像用另一个酸性氨基酸取代一个酸性氨基酸、用另一个碱性氨基酸取代一个碱性氨基酸或用另一个中性氨基酸取代一个中性氨基酸。保守氨基酸取代所指的内容在本领域是熟知的。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段可以被进一步修饰为含有正常情况下不是蛋白质的一部分的另外的化学部分。那些衍生的部分可以改善蛋白质的溶解性、生物半衰期或吸收。这些部分还可以减少或消除蛋白质的任何所希望的副作用等。对那些部分的综述可以在Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学],第22版,LloydV.Allen,Jr.编辑,(2012)中找到。

定义

以下定义特别涉及对以上拓扑异构酶I抑制剂的描述，并且甚至可能更特别地涉及标题为“另外的偏好”的部分。

C_5-6亚芳基：如本文所使用的，术语“C_5-6亚芳基”涉及通过从芳香族化合物的芳香族环原子上去除两个氢原子而获得的二价部分。

在该背景下，前缀(例如，C_5-6)表示环原子的数量或环原子的数量的范围，无论是碳原子还是杂原子。

环原子可以全部都是碳原子，如在“碳亚芳基基团”中那样，在该情况下，该基团是亚苯基(C₆)。

可替代地，环原子可以包括一个或多个杂原子，如在“杂亚芳基基团”中那样。杂亚芳基基团的实例包括但不限于源自如下的那些：

N₁：吡咯(氮杂茂(azole))(C₅)、吡啶(吖嗪(azine))(C₆)；

O₁：呋喃(氧杂环戊二烯(oxole))(C₅)；

S₁：噻吩(硫杂环戊二烯(thiole))(C₅)；

N₁O₁：噁唑(C₅)、异噁唑(C₅)、异噁嗪(isoxazine)(C₆)；

N₂O₁：噁二唑(呋咱)(C₅)；

N₃O₁：噁三唑(C₅)；

N₁S₁：噻唑(C₅)、异噻唑(C₅)；

N₂：咪唑(1,3-二唑)(C₅)、吡唑(1,2-二唑)(C₅)、哒嗪(1,2-二嗪)(C₆)、嘧啶(1,3-二嗪)(C₆)(例如胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶)、吡嗪(1,4-二嗪)(C₆)；和

N₃：三唑(C₅)、三嗪(C₆)。

C_1-4烷基：如本文所使用的，术语“C_1-4烷基”涉及通过从具有从1至4个碳原子的烃化合物的碳原子上去除氢原子而获得的单价部分，该烃化合物可以是脂肪族或脂环族，并且可以是饱和或不饱和的(例如，部分不饱和、完全不饱和)。如本文所使用的，术语“C_1-n烷基”涉及通过从具有1至n个碳原子的烃化合物的碳原子上去除氢原子而获得的单价部分，该烃化合物可以是脂肪族或脂环族，并且可以是饱和或不饱和的(例如，部分不饱和、完全不饱和)。因此，术语“烷基”包括以下讨论的亚类：烯基、炔基、环烷基等。

饱和烷基基团的实例包括但不限于甲基(C₁)、乙基(C₂)、丙基(C₃)和丁基(C₄)。

饱和线性烷基基团的实例包括但不限于甲基(C₁)、乙基(C₂)、正丙基(C₃)和正丁基(C₄)。

饱和支链烷基基团的实例包括异丙基(C₃)、异丁基(C₄)、仲丁基(C₄)和叔丁基(C₄)。

C_2-4烯基；如本文所使用的，术语“C_2-4烯基”涉及具有一个或多个碳-碳双键的烷基基团。

不饱和烯基基团的实例包括但不限于乙烯基(ethenyl、vinyl)(-CH＝CH₂)、1-丙烯基(-CH＝CH-CH₃)、2-丙烯基(烯丙基，-CH-CH＝CH₂)、异丙烯基(1-甲基乙烯基，-C(CH₃)＝CH₂)和丁烯基(C₄)。

C_2-4炔基：如本文所使用的，术语“C_2-4炔基”涉及具有一个或多个碳-碳三键的烷基基团。

不饱和炔基基团的实例包括但不限于乙炔基(-C≡CH)和2-丙炔基(炔丙基，-CH₂-C≡CH)。

C_3-4环烷基：如本文所使用的，术语“C_3-4环烷基”涉及还是环基基团的烷基基团；即，通过从环状烃(碳环)化合物的脂环族环原子上去除氢原子而获得的单价部分，该部分具有3至7个碳原子，包括3至7个环原子。

环烷基基团的实例包括但不限于源自如下的那些：

饱和单环烃化合物：

环丙烷(C₃)和环丁烷(C₄)；和

不饱和单环烃化合物：

环丙烯(C₃)和环丁烯(C₄)。

连接标记：在式中，上标^C(＝O)和^NH表示原子所结合的基团。例如，NH基团显示为与羰基(其不是所展示部分的一部分)结合，并且羰基显示为与NH基团(其不是所展示部分的一部分)结合。

盐

可以方便地或令人希望地制备、纯化和/或处理活性化合物/药剂的对应的盐，例如药学上可接受的盐。药学上可接受的盐的实例在Berge等人,J.Pharm.Sci.[药物科学杂志],66,1-19(1977)中讨论。

例如，如果化合物是阴离子的、或具有可以是阴离子的官能团(例如，-COOH可以是-COO^-)，则可以与合适的阳离子形成盐。合适的无机阳离子的实例包括但不限于碱金属离子如Na⁺和K⁺、碱土金属阳离子如Ca²⁺和Mg²⁺、以及其他阳离子如Al⁺³。合适的有机阳离子的实例包括但不限于铵离子(即，NH₄ ⁺)和经取代的铵离子(例如，NH₃R⁺、NH₂R₂ ⁺、NHR₃ ⁺、NR₄ ⁺)。一些合适的经取代的铵离子的实例是源自以下的那些：乙胺、二乙胺、二环己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、苄胺、苯基苄胺、胆碱、葡甲胺和氨丁三醇、以及氨基酸(如赖氨酸和精氨酸)。常见的季铵离子的实例是N(CH₃)₄ ⁺。

如果化合物是阳离子的、或具有可以是阳离子的官能团(例如，-NH₂可以是-NH₃ ⁺)，则可以与合适的阴离子形成盐。合适的无机阴离子的实例包括但不限于源自以下无机酸的那些：盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、亚硫酸、硝酸、亚硝酸、磷酸和亚磷酸。

合适的有机阴离子的实例包括但不限于源自以下有机酸的那些：2-乙酰氧基苯甲酸、乙酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯甲酸、樟脑磺酸、肉桂酸、柠檬酸、依地酸(edetic)、乙二磺酸(ethanedisulfonic)、乙磺酸、富马酸、葡庚糖酸(glucheptonic)、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、羟基马来酸、羟基萘甲酸、羟基乙磺酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、甲磺酸、粘液酸、油酸、草酸、棕榈酸、扑酸、泛酸、苯乙酸、苯磺酸、丙酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、对氨基苯磺酸、酒石酸、甲苯磺酸、三氟乙酸和戊酸。合适的聚合有机阴离子的实例包括但不限于源自以下聚合酸的那些：单宁酸、羧甲基纤维素。

溶剂化物

可以方便地或令人希望地制备、纯化和/或处理活性化合物的对应的溶剂化物。术语“溶剂化物”在本文中以常规意义使用，是指溶质(例如，活性化合物、活性化合物的盐)和溶剂的复合物。如果溶剂是水，则溶剂化物可以方便地称为水合物，例如一水合物、二水合物、三水合物等。

异构体

本披露的某些化合物/药剂能以一种或多种特定的几何、光学、对映异构、非对映异构、差向异构、阻转异构、立体异构、互变异构、构象或异头形式(anomeric form)存在，包括但不限于顺式和反式形式；E-和Z-形式；c-、t-和r-形式；内-和外-形式；R-、S-和内消旋-形式；D-和L-形式；d-和l-形式；(+)和(-)形式；酮-、烯醇-和烯醇酯-形式；顺式-和反式-形式；向斜-和背斜-形式；α-和β-形式；轴向和赤道形式；船型-、椅型-、扭曲-、信封型-和半椅型-形式；及其组合，在下文中统称为“异构体”(或“异构形式”)。

术语“手性”是指具有镜像配偶体的不可重叠性特性的分子，而术语“非手性”是指可重叠在其镜像配偶体上的分子。

术语“立体异构体”是指具有相同化学组成、但关于原子或基团在空间中的排列上不同的化合物。

“非对映异构体”是指具有两个或更多个手性中心并且其分子不是彼此镜像的立体异构体。非对映异构体具有不同的物理特性，例如熔点、沸点、光谱特性和反应性。非对映异构体的混合物可以在高分辨率分析程序(例如电泳和色谱)下分离。

“对映异构体”是指化合物的两种立体异构体，它们是彼此不可重叠的镜像。

本文所用的立体化学定义和惯例通常遵循S.P.Parker,编辑,McGraw-HillDictionary of Chemical Terms[麦格劳-希尔化学术语词典](1984)McGraw-Hill BookCompany[麦格劳-希尔出版社],纽约；以及Eliel,E.和Wilen,S.,"Stereochemistry ofOrganic Compound[有机化合物的立体化学]",John Wiley&Sons,Inc.[约翰威利父子公司],纽约,1994。本披露的化合物可以含有不对称或手性中心，并因此以不同的立体异构形式存在。意图是本披露的化合物的所有立体异构形式(包括但不限于非对映异构体、对映异构体和阻转异构体、及其混合物，如外消旋混合物)均形成本披露的一部分。许多有机化合物以光学活性形式存在，即它们具有旋转平面偏振光的平面的能力。在描述光学活性化合物时，前缀D和L、或R和S用于表示分子围绕其一个或多个手性中心的绝对构型。前缀d和l或(+)和(-)用来表示该化合物使平面偏振光旋转的符号，其中(-)或l表示该化合物是左旋的。带有(+)或d前缀的化合物是右旋的。对于给定的化学结构，这些立体异构体是相同的，只是它们是彼此的镜像。特定的立体异构体也可以被称为对映异构体，并且这样的异构体的混合物通常被称为对映异构混合物。对映异构体的50:50混合物称为外消旋混合物或外消旋体，其可以发生在化学反应或过程中没有立体选择或立体特异性的地方。术语“外消旋混合物”和“外消旋体”是指两种对映异构种类的等摩尔混合物，没有光学活性。

“对映异构富集的形式”是指手性物质的样品，其对映异构比率大于50:50但小于100:0。

注意，除下文关于互变异构形式的讨论外，如本文所使用的，术语“异构体”特别排除的是结构(或构成)异构体(即，在原子之间的连接而不仅仅是原子在空间上的位置不同的异构体)。例如，对甲氧基基团(-OCH₃)的引用不应被解释为对其结构异构体羟甲基基团-CH₂OH的引用。类似地，对邻氯苯基的引用不应被解释为对其结构异构体间氯苯基的引用。但是，对一类结构的引用很可能包括属于该类的结构异构形式(例如，C_1-7烷基包括正丙基和异丙基；丁基包括正、异、仲和叔丁基；甲氧基苯基包括邻、间和对甲氧基苯基)。

上面的排除不涉及互变异构形式，例如酮、烯醇和烯醇酯形式，如在例如以下互变异构对中：酮/烯醇(如下所展示)、亚胺/烯胺、酰胺/亚胺醇(imino alcohol)、脒/烯二胺(enediamine)、亚硝基/肟、硫酮/烯硫醇(enethiol)、N-亚硝基/羟基偶氮(hyroxyazo)和硝基/酸硝基(aci-nitro)。

术语“互变异构体”或“互变异构形式”是指经由低能障可相互转化的不同能量的结构异构体。例如，质子互变异构体(也称为质子异变互变异构体)包括经由质子迁移的相互转化，如酮-烯醇和亚胺-烯胺异构化。价互变异构体包括通过成键电子中的一些的重新组织而进行的相互转化。

注意，术语“异构体”中特别包括的是具有一个或多个同位素取代的化合物。例如，H可以为任何同位素形式，包括¹H、²H(D)和³H(T)；C可以为任何同位素形式，包括¹²C、¹³C和¹⁴C；O可以为任何同位素形式，包括¹⁶O和¹⁸O；等等。

可以掺入本披露化合物的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、氟、氯和碘的同位素，例如但不限于²H(氘，D)、³H(氚)、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁸F、³¹P、³²P、³⁵S、³⁶Cl和¹²⁵I。本披露的各种同位素标记的化合物，例如其中掺入了放射性同位素如3H、13C和14C的那些。这样的同位素标记的化合物可用于代谢研究、反应动力学研究、检测或成像技术(如正电子发射断层扫描(PET)或单光子发射计算机断层扫描(SPECT)，包括药物或基质组织分布测定)，或用于患者的放射治疗。与分布、代谢和排泄(ADME)有关，本披露的氘标记的或经取代的治疗性化合物可以具有改善的DMPK(药物代谢和药代动力学)特性。用较重同位素(如氘)取代可能会提供某些治疗优势(由更高的代谢稳定性导致)，例如增加的体内半衰期或降低的剂量要求。18F标记的化合物可用于PET或SPECT研究。本披露的同位素标记的化合物及其前药通常可以通过进行以下描述的方案中或实例和制备中披露的程序来制备，该程序是用容易获得的同位素标记的试剂取代非同位素标记的试剂。此外，用较重的同位素(特别是氘(即2H或D))取代可以提供某些治疗优势(由于更高的代谢稳定性导致)，例如增加的体内半衰期或降低的剂量要求或治疗指数的改善。应当理解，在该背景下，氘被视为取代基。这样的较重同位素(特别是氘)的浓度可以由同位素富集因子定义。在本披露的化合物中，未特别指定为特定同位素的任何原子均旨在表示该原子的任何稳定同位素。

除非另有说明，否则对特定化合物的引用包括所有这样的异构形式，包括其(全部或部分)外消旋及其他混合物。这样的异构形式的制备(例如，不对称合成)和分离(例如，分级结晶和色谱方式)的方法在本领域中是已知的，或者通过以已知方式改编本文教导的方法或已知方法是容易地获得的。

PARP1抑制剂

在一些方面，本文所述的ADC与PARP1((聚(ADP-核糖)聚合酶1)的抑制剂组合施用。在一些方面，PARP1的抑制剂是AZD5305。语言“抑制”(“inhibit”、“inhibition”或“inhibiting”)包括生物活性或过程的基线活性的降低。

术语“AZD5305”是指以下化合物：其具有化学名5-[4-[(7-乙基-6-氧代-5H-1,5-萘啶-3-基)甲基]哌嗪-1-基]-N-甲基-吡啶-2-甲酰胺，

并且具有以下显示的结构：

AZD5305的制备披露于美国公开号US2021/0040084 A1中，其披露通过引用以其全文并入。在一些方面，将AZD5305的游离碱向受试者施用。在一些方面，将AZD5305的药学上可接受的盐向受试者施用。在一些方面，将结晶AZD5305向受试者施用。在一些方面，将晶型A的AZD5305向受试者施用。

包含AZD5305的“药物组合物”包括含有活性成分和药学上可接受的赋形剂、载剂或稀释剂的组合物，其中该活性成分是AZD5305或其药学上可接受的盐。

ATR抑制剂

在一些方面，本文所述的ADC与ATR(也称为FRAP相关蛋白1、FRP1、MEC1、SCKL、SECKL1R)的抑制剂组合施用。在一些方面，ATR的抑制剂是AZD6738。语言“抑制”(“inhibit”、“inhibition”或“inhibiting”)包括生物活性或过程的基线活性的降低。

术语“AZD6738”是指ATR(也称为FRAP相关蛋白1、FRP1、MEC1、SCKL、SECKL1R)抑制剂，4-{4-[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]-6-[1-((R)-S-甲磺酰亚胺基)环丙基]嘧啶-2-基}-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶，由下式表示：

或其药学上可接受的盐。ATR抑制剂的另外的实例可以在美国专利8,252,802中找到，其出于所有目的特此通过引用以其全文并入。

包含AZD6738的“药物组合物”包括含有活性成分和药学上可接受的赋形剂、载剂或稀释剂的组合物，其中该活性成分是AZD6738或其药学上可接受的盐。

组合

本披露进一步提供了用于治疗癌症的ADC和PARP1抑制剂的组合。或者用于治疗癌症的ADC和ATR抑制剂。

在一些方面，本披露提供了以下组合：A)抗体-药物缀合物(ADC)，该抗体-药物缀合物包含：i.结合B7-H4多肽的抗体或其抗原结合片段，ii.可切割接头，和iii.细胞毒性剂；以及B)PARP1(聚(ADP-核糖)聚合酶1)抑制剂，用于在有需要的人受试者中治疗癌症。在一些方面，本披露提供了以下组合：A)抗体-药物缀合物(ADC)，该抗体-药物缀合物包含：i.结合B7-H4多肽的抗体或其抗原结合片段，ii.可切割接头，和iii.细胞毒性剂；以及B)ATR抑制剂，用于在有需要的人受试者中治疗癌症。

在一些方面，本披露提供了以下组合：A)ADC，该ADC包含：i.结合B7-H4多肽的抗体或其抗原结合片段，ii.可切割接头，和iii.细胞毒性剂；以及B)AZD5305或其药学上可接受的盐，用于在有需要的人受试者中治疗癌症。

在一些方面，本披露提供了以下组合：A)ADC，该ADC包含：i.结合B7-H4多肽的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含：a)分别含有SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)、重链CDR3(HCDR3)、轻链CDR1(LCDR1)、轻链CDR2(LCDR2)和轻链CDR3(LCDR3)，或其功能变体；b)分别含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体；c)分别含有SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体；d)分别含有SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体；或e)分别含有SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体；ii.可切割接头；和iii.细胞毒性剂；以及B)AZD5305或其药学上可接受的盐，用于在有需要的人受试者中治疗癌症。

在一些方面，本披露提供了以下组合：A)ADC，该ADC包含：i.结合B7-H4多肽的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含：a)分别含有SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)、重链CDR3(HCDR3)、轻链CDR1(LCDR1)、轻链CDR2(LCDR2)和轻链CDR3(LCDR3)，或其功能变体；b)分别含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体；c)分别含有SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体；d)分别含有SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体；或e)分别含有SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体；ii.可切割接头；和iii.细胞毒性剂；以及B)AZD6738或其药学上可接受的盐，用于在有需要的人受试者中治疗癌症。

在本文提供的组合的一些方面，待治疗的癌症是如本文所述的癌症。在一些方面，癌症选自卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、血液癌、子宫内膜癌、胆管细胞癌、NSCLC(鳞状和/或腺癌)、胃肠癌如胃癌和结直肠癌、以及肺癌。在一些方面，癌症是卵巢癌。在用于治疗乳腺癌的方法的一些方面，乳腺癌是激素受体阳性(HR+)乳腺癌、人表皮生长因子受体2阳性(HER2+)乳腺癌或三阴性乳腺癌(TNBC)。在一些方面，乳腺癌是TNBC。

在一些方面，癌症是同源重组缺陷(HRD)癌症。在一些方面，癌症包含具有选自以下的HRD基因突变的一种或多种细胞：BRCA1、BRCA2、ATM、BRIP1、BARD1、CDK12、CHEK1、CHEK2、FANCL、PALB2、PPP2R2A、RAD51B、RAD51C、RAD51D和RAD54L。在一些方面，突变的HRD基因选自BRCA1、BRCA2和ATM。在一些方面，突变的HRD基因是BRCA1。在一些方面，突变的HRD基因是BRCA2。在一些方面，突变的HRD基因是ATM。

在本文提供的组合的一些方面，ADC可以具有如本文所述的任何抗体或其抗原结合片段。在本文提供的组合的一些方面，ADC可以具有如本文所述的任何接头。在本文提供的组合的一些方面，ADC可以具有如本文所述的任何细胞毒性剂。

在本文提供的组合的一些方面，ADC包含与SG3932、SG4010、SG4057、SG4052、或其组合缀合的如本文所述的抗体或其抗原结合片段。在本文提供的组合的一些方面，ADC包含与SG3932缀合的如本文所述的抗体或其抗原结合片段。接头-细胞毒性剂分子SG3932、SG4010、SG4057和SG4052在本文别处描述。

试剂盒

在一个方面，提供了一种试剂盒，其包含如本文所述的ADC和如本文所述的PARP1抑制剂。在一个方面，提供了一种药盒，其包含如本文所述的ADC和如本文所述的ATR抑制剂。进一步涵盖所述试剂盒在本披露方法中的用途。

在一些方面，本披露提供了一种试剂盒，其包含：A)抗体-药物缀合物(ADC)，该抗体-药物缀合物包含：i.结合B7-H4多肽的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含：a)分别含有SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)、重链CDR3(HCDR3)、轻链CDR1(LCDR1)、轻链CDR2(LCDR2)和轻链CDR3(LCDR3)，或其功能变体；b)分别含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体；c)分别含有SEQID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体；d)分别含有SEQID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体；或e)分别含有SEQID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体；ii.可切割接头；和iii.细胞毒性剂；以及B)AZD5305或其药学上可接受的盐。

在一些方面，本披露提供了一种试剂盒，其包含：A)抗体-药物缀合物(ADC)，该抗体-药物缀合物包含：i.结合B7-H4多肽的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含：a)分别含有SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)、重链CDR3(HCDR3)、轻链CDR1(LCDR1)、轻链CDR2(LCDR2)和轻链CDR3(LCDR3)，或其功能变体；b)分别含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体；c)分别含有SEQID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体；d)分别含有SEQID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体；或e)分别含有SEQID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体；ii.可切割接头；和iii.细胞毒性剂；以及B)AZD6738或其药学上可接受的盐。

在本文提供的试剂盒的一些方面，ADC可以具有如本文所述的任何抗体或其抗原结合片段。在本文提供的组合的一些方面，ADC可以具有如本文所述的任何接头。在本文提供的组合的一些方面，ADC可以具有如本文所述的任何细胞毒性剂。

在本文提供的试剂盒的一些方面，ADC包含与SG3932、SG4010、SG4057、SG4052、或其组合缀合的如本文所述的抗体或其抗原结合片段。在本文提供的组合的一些方面，ADC包含与SG3932缀合的如本文所述的抗体或其抗原结合片段。接头-细胞毒性剂分子SG3932、SG4010、SG4057和SG4052在本文别处描述。

在一些方面，试剂盒包含如本文所述的分离的(例如，纯化的)抗原或抗体结合片段。在一些方面，试剂盒包含如本文所述的分离的(例如，纯化的)ADC。在一些方面，试剂盒包含一个或多个容器。试剂盒可单独提供抗原或抗体结合片段以及接头和/或细胞毒性剂(例如，药剂未与该抗原或抗体结合片段缀合，而是呈适合与其缀合的形式)；任选地，其中该试剂盒进一步提供了用于将该药剂与该抗原或抗体结合片段缀合的说明书和/或试剂。在一些方面，试剂盒包含向受试者施用ADC和PARP1抑制剂的组合所必需和/或足以向受试者施用ADC和PARP1抑制剂的组合的所有组分。在一些方面，试剂盒包含向受试者施用ADC和PARP1抑制剂的组合所必需和/或足以向受试者施用ADC和PARP1抑制剂的组合的所有说明。

实例

现在将通过参考以下非限制性实例来进一步解释本文披露的组合疗法。

实例1-使用经工程化以表达B7-H4的DLD-1-BRCA WT细胞的细胞毒性测定

为了确定组合的B7-H4-TOP1i ADC(E02-GL-SG3932)和PARP1选择性抑制剂(AZD5305)疗法杀灭表达B7-H4的DLD-1-BRCA野生型(WT)细胞的功效，进行了细胞毒性测定。将经工程化以表达B7-H4的DLD-1-BRCA WT细胞(Horizon Discovery公司)在含有10％热灭活的FBS的RPMI培养基中以1,000个细胞/孔的接种密度铺板在96孔板中。第二天，将细胞用浓度增加的E02-GL-SG3932、同种型匹配的对照ADC(0.003052-200nM)或AZD5305(0.4-10μM)单独或组合处理。处理后将细胞孵育7天，并使用CellTiter-Glo测定(普洛麦格公司(Promega))测量细胞活力，该测定基于存在的三磷酸腺苷(ATP)的量对细胞活力进行量化。结果表明，与以下的其他处理相比，在每个增加的浓度下，E02-GL-SG3932和AZD5305的组合处理以更快的速率杀灭更多表达B7-H4的WT细胞：单独E02-GL-SG3932、单独AZD5305、同种型匹配的对照ADC以及同种型匹配的对照ADC和AZD5305(图1)。

Bliss协同模型用于评估AZD5305与E02-GL-SG3932 ADC组合的双药组合效应和药理学协同(Bliss评分>0)或拮抗(Bliss评分<0)响应，使用Combenefit软件(英国剑桥大学癌症研究所(Cancer Research UK Cambridge Institute))确定。Veroli等人Bioinformatics.[生物信息学]2016年9月15日；32(18):2866–2868。如图2所示，组合处理中增加的剂量导致Bliss能量评分大于10(蓝色)，这表明在增加的剂量下在E02-GL-SG3932与AZD5305之间的治疗协同。

实例2-使用经工程化以表达B7-H4的DLD-1-XMAN-BRCA2-/-细胞的细胞毒性测定

经工程化以表达B7-H4的DLD-1-XMAN-BRCA2-/-细胞用于评估E02-GL-SG3932和AZD5305的组合处理在杀灭靶细胞中的功效。DLD-1-XMAN-BRCA2-/-细胞缺乏BRCA2基因，该基因为制造充当肿瘤抑制因子的蛋白质提供指示。将经工程化以表达B7-H4的DLD-1-XMAN-BRCA2-/-细胞(Horizon Discovery公司)在含有10％热灭活的FBS的RPMI培养基中以1,000个细胞/孔的接种密度铺板在96孔板中。第二天，将细胞用浓度增加的E02-GL-SG3932、同种型匹配的对照ADC(0.0001-6.7nM)或AZD5305(0.04-1nM)单独或组合处理。处理后将细胞孵育7天，并使用CellTiter-Glo测定(普洛麦格公司)测量细胞活力。如图3所示，与单独E02-GL-SG3932、单独AZD5305、同种型匹配的对照ADC、以及同种型匹配的对照ADC和AZD5305的其他处理相比，1nM组合处理以更快的速率杀灭更多表达B7-H4的DLD-1-XMAN-BRCA2-/-细胞。

Bliss协同模型用于评估AZD5305与E02-GL-SG3932 ADC组合的双药组合效应和药理学协同(Bliss评分>0)或拮抗(Bliss评分<0)响应，使用Combenefit软件(英国剑桥大学癌症研究所)确定。如图4所示，E02-GL-SG3932(0.02nM)与AZD5305(0.04nM、0.2nM和1nM)的组合剂量导致Bliss能量评分大于10(蓝色)，这表明在E02-GL-SG3932与AZD5305之间的治疗协同。

实例3-使用经工程化以表达B7-H4的MX-1细胞的细胞毒性测定

从乳腺癌组织的MX-1肿瘤异种移植模型建立为体外培养物的MX-1细胞用于评估E02-GL-SG3932和AZD5305组合处理杀灭靶细胞的功效。将MX-1细胞在含有10％热灭活的FBS的DMEM培养基中以1,500个细胞/孔的接种密度铺板在96孔板中。第二天，将细胞用浓度增加的E02-GL-SG3932、同种型匹配的对照ADC(0.001-400nM)或AZD5305(0.2或1nM)单独或组合处理。处理后将细胞孵育7天，并使用CellTiter-Glo测定(普洛麦格公司)测量细胞活力。图5示出了与单独E02-GL-SG3932、单独AZD5305、同种型匹配的对照ADC、以及同种型匹配的对照ADC和AZD5305的其他处理相比，在0.2nM和1nM浓度下，E02-GL-SG3932和AZD5305的组合处理杀灭更大的量的MX-1细胞的能力。

Bliss协同模型用于评估AZD5305与E02-GL-SG3932 ADC组合的双药组合效应和药理学协同(Bliss评分>0)或拮抗(Bliss评分<0)响应，使用Combenefit软件(英国剑桥大学癌症研究所)确定。图6示出了E02-GL-SG3932(0.128-3.2nM和400nM)与AZD5305(1nM)的组合剂量导致Bliss能量评分≤16且大于10(蓝色)，这表明在这些组合中E02-GL-SG3932与AZD5305之间的治疗协同。

实例4-MDA-MB-468乳腺癌异种移植模型

进行体内实验以测量E02-GL-SG3932和AZD5305治疗在具有人雌激素非依赖性MDA-MB-468乳腺癌异种移植物的小鼠中的抗肿瘤功效。将MDA-MB-468细胞以5x 10⁶个/小鼠注射到雌性CB-17SCID小鼠的乳腺脂肪垫中。当肿瘤达到150-200mm³的平均值时，启动同种型ADC、E02-GL-SG3932、AZD5305或组合的给药。同种型对照ADC和E02-GL-SG3932仅在第1天以单次IV尾静脉注射方式给药，对于组合研究，该注射之后每天一次口服给药AZD5305，持续28天。在研究期间每周两次记录肿瘤和体重测量值。在用媒介物(对照)、单独AZD5305(0.1mg/kg和1mg/kg)、同种型匹配的对照ADC(0.5mg/kg)、同种型匹配的对照ADC和AZD5305(1mg/kg)以及单独E02-GL-SG3932(0.1mg/kg和1mg/kg)治疗的小鼠中，随时间测量的肿瘤大小增加或维持不变，这表明这些治疗方法在体内几乎没有抗肿瘤活性(图7)。

E02-GL-SG3932(0.5mg/kg)和AZD5305(0.1mg/kg)、以及E02-GL-SG3932(0.5mg/kg)和AZD5305(1mg/kg)治疗展示出高抗肿瘤活性。如图8所示，E02-GL-SG3932和AZD5305的组合治疗在小鼠中有效抑制大约67％的肿瘤的生长。图9中示出了小鼠中各种治疗组合的功效的进一步比较分析。在用E02-GL-SG3932(0.5mg/kg)和AZD5305(0.1mg/kg)、以及E02-GL-SG3932(0.5mg/kg)和AZD5305(1mg/kg)治疗的小鼠中，平均肿瘤体积显著小于其他治疗方法的平均肿瘤体积。

实例5-MDA-MB-468乳腺癌异种移植模型

进行体内实验以测量E02-GL-SG3932和AZD6738治疗在具有人雌激素非依赖性MDA-MB-468乳腺癌异种移植物的小鼠中的抗肿瘤功效。将MDA-MB-468细胞以5x 10⁶个/小鼠注射到雌性CB-17SCID小鼠的乳腺脂肪垫中。同种型对照ADC和E02-GL-SG3932仅在第1天以单次IV尾静脉注射方式给药，对于组合研究，该注射之后每天两次(BID)口服给药AZD6738，持续14天。在研究期间每周两次记录肿瘤和体重测量值。图10中示出了在未治疗(对照)，以及用单独AZD6738(25mg/kg)、同种型匹配的对照ADC(0.5mg/kg)、单独E02-GL-SG3932(0.5mg/kg)、以及E02-GL-SG3932(0.5mg/kg)和AZD6738(25mg/kg)治疗的小鼠中随时间测量的肿瘤。

如图10所示，E02-GL-SG3932和AZD6738的组合治疗在小鼠中有效进一步抑制肿瘤的生长。用E02-GL-SG3932(0.5mg/kg)和AZD6738(25mg/kg)治疗的小鼠中，平均肿瘤体积显著小于其他治疗方法的平均肿瘤体积。

实例6-针对B7-H4的抗体-药物缀合物与PARP1选择性抑制剂的组合的临床前评估

本研究在临床前模型中评价了E02-GL-SG3932(一种针对B7-H4的抗体-药物缀合物(ADC)，具有新颖的拓扑异构酶I抑制剂(TOP1i)有效负载)与聚ADP核糖聚合酶1(PARP1)选择性抑制剂AZD5305的组合的活性。对B7-H4表达率进行了综合分析，并对人肿瘤中的瘤内异质性进行了评估。将下一代PARP1选择性抑制剂AZD5305添加到E02-GL-SG3932治疗中使低表达B7-H4的PDX肿瘤(包括代表对PARP抑制具有抗性的获得性或内在机制的同源成熟模型)敏化。这些发现支持抗B7H4 ADC和PARP抑制剂的组合的实施，即使是在已经用PARP抑制剂治疗的受试者中和对PARP抑制剂治疗具有抗性的受试者中。

材料与方法

抗体

在VelocImmune V2小鼠中通过使用SKBR3细胞和化学缀合至钥孔虫戚血蓝蛋白的小鼠B7-H4细胞外结构域交替免疫而生成靶向人B7-H4的抗体。基于对人和食蟹猴B7-H4的特异性和交叉反应性选择先导抗体，并将抗体框架突变为最接近的人种系。

细胞系

HT29和MDA-MB-468细胞分别获自德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen,GmbH)(德国布伦瑞克(Braunschweig))和美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(美国马里兰州罗克维尔市(Rockville,MD))，并在含有10％热灭活的胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基(赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham,MA))中培养。MX-1细胞获自美国国家癌症研究所(美国马里兰州贝塞斯达)，并在含有10％ FBS和2mM L-谷氨酰胺的杜尔贝科(Dulbecco)改良必需/F12培养基(赛默飞世尔科技公司)中培养。稳定表达人B7-H4的HT29克隆细胞系(HT29-huB7-H4)通过使用用pPACK H1 HIV Lentivector包装试剂盒(SystemBiosciences公司，美国加利福尼亚州帕洛阿尔托(Palo Alto,CA))制备的慢病毒表达载体生成，随后进行转导、遗传霉素的选择，并通过使用抗B7-H4-PE抗体(USBiological公司，美国马萨诸塞州塞勒姆(Salem,MA))直接染色进行荧光激活细胞分选来分离。所有细胞系均在37℃的温度下在5％ CO₂的潮湿气氛中培养，通过短串联重复DNA分析(IDEXX生物研究实验室(IDEXX BioResearch Laboratories)，美国密苏里州哥伦比亚(Columbia,MO))进行验证，并通过聚合酶链反应和MycoSEQ支原体(Mycoplasma)检测试剂盒(赛默飞世尔科技公司)发现其为支原体阴性。

免疫组织化学

在4-μm福尔马林固定的、石蜡包埋的肿瘤或组织切片上使用自动化Leica BondRX IHC染色平台(徕卡生物系统公司(Leica Biosystems)，德国努斯洛赫(Nussloch))进行B7-H4的免疫组织化学(IHC)检测。将人正常和肿瘤组织切片用抗人B7-H4小鼠免疫球蛋白G1(IgG1)(克隆ZY0EYT-D11；阿斯利康公司(AstraZeneca)，英国剑桥)染色，并将来自患者来源肿瘤异种移植物(PDX)的肿瘤组织切片用抗人B7-H4兔IgG1染色。使用一系列已知的表达B7-H4的细胞系、B7-H4转染的细胞系(HT29-huB7H4)和人乳腺肿瘤组织(MX-1和MDA-MB-468)对两种抗体在IHC中的使用进行彻底验证以确保特异性和敏感性(表1)。B7-H4阴性HT29细胞用作阴性对照。从相同的细胞制备福尔马林固定的、石蜡包埋的细胞团块，用于通过IHC对B7-H4表达进行正交分析。盖上盖玻片并装好后，用Leica Aperio Scanscope AT2载玻片扫描仪扫描载玻片，然后由病理学家进行审查和评分。通过定量流式细胞术使用来自Bangs实验室(Bangs Laboratories)(费希尔公司(Fisher)，美国印第安纳州(IN))的Quantum Simply Cellular试剂盒测量抗体结合能力(B7-H4受体密度的测量值)。

表1-不同细胞类型中的B7H4表达

ADC的制备

将各种TOP1i弹头通过带有或不带有PEG₈间隔子的val-ala(VA)或Gly-Gly-Phe-Gly(GGFG)肽接头与抗体中的天然半胱氨酸共价结合，从而产生药物抗体比(DAR)大约为8的四种不同的ADC：SG3932、SG4057、SG4010和SG4052。这些ADC的制备也在WO 2022053650中进行了描述，其特此通过引用以其全文并入。通过使用同种型匹配的抗体以相同的方式合成DAR相当的非靶向同种型对照ADC(Iso-ADC)。E02-GL-SG3932抗体药物缀合物为E02-GL抗体与SG3932弹头缀合。

向在含有PBS和1mM乙二胺四乙酸并且最终抗体浓度为10mg/mL的还原缓冲液中的E02-GL抗体(3.6g，24.0微摩尔)中添加100mM TCEP[三(2-羧乙基)膦]的PBS溶液(12.5摩尔当量/抗体，0.3mmol)。使还原混合物在定轨振荡器中于37℃下轻微(60rpm)振荡下加热2小时(或直到通过超高效液相色谱[UPLC]观察到完全还原)。将还原的抗体从孵育中移除并允许其冷却至室温。向该混合物中添加作为二甲亚砜(DMSO)溶液的SG3932、SG4057、SG4010或SG4052接头-有效负载(11–14摩尔当量/抗体，26.4–33.6微摩尔)，最终DMSO浓度为10％(v/v)。将溶液在25℃下振荡1小时，然后用N-乙酰半胱氨酸(作为100mM储备溶液，与有效负载相比过量5倍)淬灭缀合。使用表面积为375cm²的mPES、MidiKros 30-kDa纤维过滤器经由切向流过滤单元将过量的游离药物去除到含有30mM组氨酸、30mM精氨酸的缓冲液(pH 6.8)中。使用纯缀合物通过UPLC-RP监测游离药物去除的程度。完全去除游离药物(11-16DV)后，将抗体-药物缀合物(ADC)配制到20mM组氨酸、240mM蔗糖(pH 6.0)(5DV)中，并在无菌气氛下用0.22μm过滤器过滤所得ADC。药物抗体比(DAR)通过UPLC-RP用还原缀合物计算，并通过UPLC-尺寸排阻色谱(SEC)用纯缀合物测量单体纯度。

体内功效研究

所有动物实验均在实验室动物护理评估和认证协会(Association forAssessment and Accreditation of Laboratory Animal Care)认证的设施中依据阿斯利康公司的机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)的指南和适当的动物研究批准进行。通过在雌性CB-17小鼠(恩维格公司(Envigo)，美国马里兰州弗雷德里克(Frederick))的右乳腺脂肪垫(MX-1，MDA-MB-468)或左胁腹(HT29，HT29-huB7-H4)中皮下植入在50％基质胶(康宁公司(Corning)，美国纽约州康宁市)中的细胞建立了细胞系异种移植模型。当肿瘤体积达到150-200mm³时，将小鼠随机分组并给予媒介物对照(20mM组氨酸，pH 6；240mM蔗糖；0.02％ PS-80)或ADC的单次静脉内(IV)注射。每周一次或两次确定体重和肿瘤测量值，并使用以下公式计算肿瘤体积

通过将肿瘤碎片皮下植入无胸腺裸鼠(恩维格公司，法国里永(Riom))的胁腹建立了人TNBC的PDX模型，并在Xentech公司(法国埃夫里(Evry))进行了测试。将动物按肿瘤体积进行匹配，然后将媒介物对照或ADC作为单次IV注射施用。使用时，将PARP1选择性抑制剂AZD5305(阿斯利康公司)配制在水/HCl(pH 3.5-4)中，并通过以10mL/kg的最终剂量体积口服灌胃施用，每天一次，持续28天。在最后一天确定抗肿瘤活性，此时未处理的对照组中的所有小鼠都留在研究中。如果治疗组中的最终肿瘤体积(ETV)小于初始肿瘤体积(ITV)，则通过使用以下公式从组平均值计算较基线的抗肿瘤响应

否则，将抗肿瘤响应表示为治疗组中的肿瘤体积相对于未治疗对照组中的肿瘤体积变化的百分比，通过以下公式计算：

对于药效学和药代动力学研究，对具有HT29或HT29-huB7-H4肿瘤(250-300mm³)的小鼠施用媒介物对照或ADC的单次IV注射。在指示的时间点采集血浆和肿瘤样品，将肿瘤的一部分固定在福尔马林中并包埋到石蜡块中用于IHC分析，并将剩余部分快速冷冻用于通过液相色谱-质谱法分析总单克隆抗体、ADC和游离弹头。

统计分析

数据呈现为平均值±标准偏差或平均值±平均值的标准误差。为了评价PDX模型中响应相比于无响应的关联，在R统计编程环境(版本4.1)中进行了用于组比较的Wilcoxon检验。认为P<0.05具有统计学显著性。

肿瘤组织中的B7-H4表达和表达率

B7-H4在几种肿瘤类型中表达，并且在子宫内膜癌(94％)、胆管细胞癌(89％)、乳腺癌(HER2+78％、TNBC 74％、ER+74％)和卵巢癌(77％)中的盛行率最高(图11A、11B)。相比之下，B7-H4在有限数量的正常人组织(如输卵管、肺、乳腺和前列腺)中检测到，并且通常在样品中<10％的总细胞中发现，限于导管或管状上皮，并且主要位于顶端腔膜上(表2)。

为了了解单个肿瘤内的B7-H4瘤内异质性(影响ADC活性的关键因素)，对分开采集的TNBC的组织学注释样品(n＝196)进行染色，并利用基于深度学习的图像分析算法进行数字化分析以检测并分隔单个肿瘤上皮细胞并对每个细胞的膜上的B7-H4表达水平进行量化。该方法允许在每个细胞的基础上研究B7-H4表达的分布，示出整个队列中每个患者样品中的一系列异质B7-H4表达(图11C)。B7-H4表达与表达的异质性为弱相关(r＝-0.84，P<0.01)。

表2-人正常组织中的B7-H4表达

E02-GL-SG3932与下一代PARP1选择性抑制剂AZD5305的组合

PARP1通过增强TOP1切割复合物的切除和修复限制了TOP1i的细胞毒性。因此，将E02-GL-SG3932与下一代PARP1选择性抑制剂AZD5305的组合在HRP PDX模型的集合(包括BRCA WT肿瘤和代表PARP后抗性机制的模型)中进行了测试。在B7-H4高表达的BRCA WTHBCx-39模型中，AZD5305使肿瘤对1.25mg/kg E02-GL-SG3932的单次、次优剂量敏感，最终五只小鼠中有五只肿瘤消退，相比之下，在E02-GL-SG3932单一疗法组中观察到24.5％ TGI(图12A)。用更高剂量(3.5mg/kg)的E02-GL-SG3932也观察到组合治疗的更大活性，相对于E02-GL-SG3932单一疗法的响应持续时间延长了响应持续时间(图12B)。在其他B7-H4高表达的模型中获得了类似的结果，这些模型包括BRCA1突变型HBCx-24模型(图12C)(其中PARPi抗性可能是通过BRCA1启动子甲基化驱动的)以及HBCx-11模型(图12D)，其为BRCA1亚等位基因的并对PARPi具有抗性。在HBCx-39和HBCx-11中观察到的组合益处很有趣，因为这些模型不仅代表BRCA WT(HBCx-39)或PARPi抗性情况(HBCx-11)，而且也是SLFN11阴性的。因为SLFN11损失是提出的TOP1i和PARPi两者的抗性生物标志物，所以在这些模型中观察到的稳健组合活性是出乎意料的。同样令人惊讶的是，组合益处延伸至HBCx-8，该模型具有非常低的B7-H4表达并且是对PARPi具有抗性的BRCA1突变型HRP模型(图12E)。在该模型中，1.25mg/kg E02-GL-SG3932的单次剂量提供了适度的抗肿瘤活性(32.9％ TGI)，而与AZD5305的组合在五只小鼠中的五只中提供了肿瘤消退。在B7-H4低表达的BRCA WT模型HBCx-2(图12F)中观察到类似的组合益处，因为随着ADC剂量的增加观察到活性改善。

DNA损伤响应通路的药理学抑制是最大化对TOP1i-ADC的响应并提供更大的抗肿瘤活性的有吸引力的方法。该研究评价了E02-GL-SG3932和AZD5305的组合，AZD5305是一种高效的PARP1选择性抑制剂，与非选择性PARPi相比，在临床前模型中展现出降低的血液学毒性。E02-GL-SG3932和AZD5305的组合提供了比单一疗法更大的抗肿瘤活性，即使在B7-H4低表达的模型中也实现更大的肿瘤消退或改善的响应持续时间。在代表PARPi抗性机制的HRP BRCA1 WT或BRCA1突变型模型中使用低、次优剂量的E02-GL-SG3932观察到该组合益处。这些发现表明，该组合在具有PARPi抗性的情况中可以是有效的，并且不需要达到最大ADC活性即可利用该机制。

序列

SEQ ID NO:31(ZY0EPQ-E02，可变重链)

QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWNWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTNYNPSLKSRVTILVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARNLYNWNLDSWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:32(ZY0EPQ-E02，可变轻链)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGRAPKRLIYVASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPRTFGQGTKVEIK

SEQ ID NO:33(ZY0EQD-E02，可变重链，例如种系化前)QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWNWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTSYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARVLYNWNVDSWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:34(ZY0EQD-E02，可变轻链)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNDVGWYQQKPGKAPKRLIYAASRLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPRTFGQGTKVEIK

SEQ ID NO:35(ZY0EOB-F05，可变重链)

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSDGSISSGGYYWSWIRQHPGKGLEWIGNIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLNSVTAADTAVYYCATEKALATVTPSGYENYYTVDVWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO:36(ZY0EOB-F05，可变轻链)

DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCWASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQHLNSYPLTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO:37(ZY0EO5-E07，可变重链)

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGGYYWSWIRQHPGKGLEWIGNIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREKALASVIPSGYENYYVVDVWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO:38(ZY0EO5-E07，可变轻链)

DIQLTQSPSFLSASVGGRVTITCWASQGIAGYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQHLNSYPLTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO:39：(ZY0EP0-C07，可变重链)

QVQLVESGGVLVKPGGSLRLSCAASGFTLSDYYMSWIRQAPGMGLEWVSYISSSGSTIYYTDSVKGRFTISRDSAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGVGFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:40(ZY0EP0-C07，可变轻链)

EIVLTQSPGTLSLFPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQSPRLLIYAASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLYTFGQGTKLEIK

SEQ ID NO:41(Maia重链恒定区，半胱氨酸插入带下划线)：ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSCVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:42(轻链恒定区)

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:43(ZY0EQD-E02，可变重链，例如种系化前，例如SEQ ID NO:33/SEQ IDNO:45的变体)

QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCTVYGGSFSGYYWNWIRQPPGRGLEWIGEINHSGSTSYNPSLKSRITISIDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARVLYNWNVDSWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:44(ZY0EQD-E02，轻链)：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNDVGWYQQKPGKAPKRLIYAASRLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:45(EQD-E02_GL，可变重链，GL＝种系化的)

QVQLQQWGAGLLKPSETLSLACTVYGGSFSGYYWNWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTSYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARVLYNWNVDSWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:46(EQD-E02-GLY，可变重链，GLY＝具有Y取代的种系化的)

QVQLQQWGAGLLKPSETLSLACTVYGGSFSGYYWNWIRQPPGKGLEWIGEIYHSGSTSYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARVLYNWNVDSWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:47(EQD-E02-GLQ，可变重链，GLQ＝具有Q取代的种系化的)

QVQLQQWGAGLLKPSETLSLACTVYGGSFSGYYWNWIRQPPGKGLEWIGEIQHSGSTSYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARVLYNWNVDSWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:48(E02-GL-Maia-重链，半胱氨酸插入带下划线)

QVQLQQWGAGLLKPSETLSLACTVYGGSFSGYYWNWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTSYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARVLYNWNVDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSCVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:49(E02-GLY-Maia-重链，GLY＝具有Y取代的种系化的)

QVQLQQWGAGLLKPSETLSLACTVYGGSFSGYYWNWIRQPPGKGLEWIGEIYHSGSTSYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARVLYNWNVDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSCVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:50(E02-GLQ-Maia-重链，GLQ＝具有Q取代的种系化的)

QVQLQQWGAGLLKPSETLSLACTVYGGSFSGYYWNWIRQPPGKGLEWIGEIQHSGSTSYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARVLYNWNVDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSCVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:51(E02-GL-WT-重链)

QVQLQQWGAGLLKPSETLSLACTVYGGSFSGYYWNWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTSYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARVLYNWNVDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:52(重链恒定区)

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSCVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:53(人B7H4核酸序列，包括5’和3’UTR)

GCCACCatggcttccctggggcagatcctcttctggagcataattagcatcatcattattctggctggagcaattgcactcatcattggctttggtatttcagggagacactccatcacagtcactactgtcgcctcagctgggaacattggggaggatggaatcctgagctgcacttttgaacctgacatcaaactttctgatatcgtgatacaatggctgaaggaaggtgttttaggcttggtccatgagttcaaagaaggcaaagatgagctgtcggagcaggatgaaatgttcagaggccggacagcagtgtttgctgatcaagtgatagttggcaatgcctctttgcggctgaaaaacgtgcaactcacagatgctggcacctacaaatgttatatcatcacttctaaaggcaaggggaatgctaaccttgagtataaaactggagccttcagcatgccggaagtgaatgtggactataatgccagctcagagaccttgcggtgtgaggctccccgatggttcccccagcccacagtggtctgggcatcccaagttgaccagggagccaacttctcggaagtctccaataccagctttgagctgaactctgagaatgtgaccatgaaggttgtgtctgtgctctacaatgttacgatcaacaacacatactcctgtatgattgaaaatgacattgccaaagcaacaggggatatcaaagtgacagaatcggagatcaaaaggcggagtcacctacagctgctaaactcaaaggcttctctgtgtgtctcttctttctttgccatcagctgggcacttctgcctctcagcccttacctgatgctaaaaTAATAA

SEQ ID NO:54(人B7H4核酸序列，编码序列)

atggcttccctggggcagatcctcttctggagcataattagcatcatcattattctggctggagcaattgcactcatcattggctttggtatttcagggagacactccatcacagtcactactgtcgcctcagctgggaacattggggaggatggaatcctgagctgcacttttgaacctgacatcaaactttctgatatcgtgatacaatggctgaaggaaggtgttttaggcttggtccatgagttcaaagaaggcaaagatgagctgtcggagcaggatgaaatgttcagaggccggacagcagtgtttgctgatcaagtgatagttggcaatgcctctttgcggctgaaaaacgtgcaactcacagatgctggcacctacaaatgttatatcatcacttctaaaggcaaggggaatgctaaccttgagtataaaactggagccttcagcatgccggaagtgaatgtggactataatgccagctcagagaccttgcggtgtgaggctccccgatggttcccccagcccacagtggtctgggcatcccaagttgaccagggagccaacttctcggaagtctccaataccagctttgagctgaactctgagaatgtgaccatgaaggttgtgtctgtgctctacaatgttacgatcaacaacacatactcctgtatgattgaaaatgacattgccaaagcaacaggggatatcaaagtgacagaatcggagatcaaaaggcggagtcacctacagctgctaaactcaaaggcttctctgtgtgtctcttctttctttgccatcagctgggcacttctgcctctcagcccttacctgatgctaaaa

SEQ ID NO:55(人B7H4多肽序列；UniProt登录号：Q7Z7D3)

MASLGQILFWSIISIIIILAGAIALIIGFGISGRHSITVTTVASAGNIGEDGILSCTFEPDIKLSDIVIQWLKEGVLGLVHEFKEGKDELSEQDEMFRGRTAVFADQVIVGNASLRLKNVQLTDAGTYKCYIITSKGKGNANLEYKTGAFSMPEVNVDYNASSETLRCEAPRWFPQPTVVWASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKVTESEIKRRSHLQLLNSKASLCVSSFFAISWALLPLSPYLMLK

Claims

1.一种在有需要的人受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向该人受试者施用：

A)抗体-药物缀合物(ADC)，该抗体-药物缀合物包含：

h)分别含有SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体；

i)分别含有SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体；或

j)分别含有SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体；

ii.可切割接头；

iii.细胞毒性剂；以及

B)另外的药剂，其中该另外的药剂是PARP1抑制剂或ATR抑制剂。

2.如权利要求1所述的方法，其中该另外的药剂是AZD5305或其药学上可接受的盐。

3.如权利要求1所述的方法，其中该另外的药剂是AZD6738或其药学上可接受的盐。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中该癌症包含表达B7-H4的癌细胞。

5.如权利要求4所述的方法，其中该癌症进一步包含不表达B7-H4的癌细胞。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中该癌症选自卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、血液癌、子宫内膜癌、胆管细胞癌、NSCLC(鳞状和/或腺癌)、胃肠癌如胃癌和结直肠癌、以及肺癌。

7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中该癌症是乳腺癌，其选自激素受体阳性(HR+)乳腺癌、人表皮生长因子受体2阳性(HER2+)乳腺癌和三阴性乳腺癌(TNBC)。

8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中该癌症是同源重组缺陷(HRD)癌症。

9.如权利要求8所述的方法，其中该癌症包含具有选自以下的HRD基因突变的一种或多种细胞：BRCA1、BRCA2、ATM、BRIP1、BARD1、CDK12、CHEK1、CHEK2、FANCL、PALB2、PPP2R2A、RAD51B、RAD51C、RAD51D和RAD54L。

10.如权利要求9所述的方法，其中该HRD基因突变选自BRCA1、BRCA2和ATM。

11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中该抗体或其抗原结合片段结合OVCAR4细胞系。

15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中该抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链恒定区。

16.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中该抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的重链恒定区。

17.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中该抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链恒定区。

18.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中该抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的重链、以及含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链。

19.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中该抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的重链、以及含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链。

20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中该抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体。

21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中该抗体或其抗原结合片段是人源化单克隆抗体。

22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中该可切割接头是mp-PEG8-val-ala接头。

23.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中该细胞毒性剂是拓扑异构酶抑制剂。

24.如权利要求23所述的方法，其中该拓扑异构酶抑制剂是具有式A*的化合物：

25.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中该ii)可切割接头和iii)细胞毒性剂一起选自以下化合物：

以及

26.如权利要求25所述的方法，其中该ii)接头和iii)细胞毒性剂一起为化合物SG3932。

27.如权利要求1至26中任一项所述的方法，其中该ADC的药物抗体比(DAR)在约1与约8之间。

28.如权利要求1至26中任一项所述的方法，其中该ADC的DAR约为8。

29.一种试剂盒，其包含：

A)抗体-药物缀合物(ADC)，该抗体-药物缀合物包含：

c)分别含有SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体；

d)分别含有SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体；或

e)分别含有SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体；

ii.可切割接头；

iii.细胞毒性剂；以及

B)另外的药剂，其中该另外的药剂是PARP1抑制剂或ATR抑制剂。

30.如权利要求29所述的试剂盒，其中该另外的药剂是AZD5305或其药学上可接受的盐。

31.如权利要求29所述的试剂盒，其中该另外的药剂是AZD6738或其药学上可接受的盐。

32.如权利要求29-31中任一项所述的试剂盒，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

33.如权利要求29-32中任一项所述的试剂盒，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

34.如权利要求29至33中任一项所述的试剂盒，其中该抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链恒定区。

35.如权利要求29至33中任一项所述的试剂盒，其中该抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的重链恒定区。

36.如权利要求29至33中任一项所述的试剂盒，其中该抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链恒定区。

37.如权利要求29至33中任一项所述的试剂盒，其中该抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的重链、以及含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链。

38.如权利要求29至33中任一项所述的试剂盒，其中该抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的重链、以及含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链。

39.如权利要求29至38中任一项所述的试剂盒，其中该可切割接头是mp-PEG8-val-ala接头。

40.如权利要求29至39中任一项所述的试剂盒，其中该细胞毒性剂是拓扑异构酶抑制剂。

41.如权利要求40所述的试剂盒，其中该拓扑异构酶抑制剂是具有式A*的化合物：

42.如权利要求29至41中任一项所述的试剂盒，其中该ii)可切割接头和iii)细胞毒性剂一起选自以下化合物：

以及

43.如权利要求42所述的试剂盒，其中该ii)接头和iii)细胞毒性剂一起为化合物SG3932。

44.如权利要求29至43中任一项所述的试剂盒，其中该ADC的药物抗体比(DAR)在约1与约8之间。

45.如权利要求29至43中任一项所述的试剂盒，其中该ADC的DAR约为8。

46.一种在有需要的人受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向该人受试者施用：

A)抗体-药物缀合物(ADC)，该抗体-药物缀合物包含：

e)分别含有SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能变体；以及

以及B)AZD5305或其药学上可接受的盐。

47.一种在有需要的人受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向该人受试者施用：

A)抗体-药物缀合物(ADC)，该抗体-药物缀合物包含：

以及B)AZD6738或其药学上可接受的盐。

48.如权利要求46或权利要求47所述的方法，其中该癌症包含表达B7-H4的癌细胞。

49.如权利要求48所述的方法，其中该癌症进一步包含不表达B7-H4的癌细胞。

50.如权利要求46至49中任一项所述的方法，其中该癌症选自卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、血液癌、子宫内膜癌、胆管细胞癌、NSCLC(鳞状和/或腺癌)、胃肠癌如胃癌和结直肠癌、以及肺癌。

51.如权利要求46至50中任一项所述的方法，其中该癌症是乳腺癌，其选自激素受体阳性(HR+)乳腺癌、人表皮生长因子受体2阳性(HER2+)乳腺癌和三阴性乳腺癌(TNBC)。

52.如权利要求46至51中任一项所述的方法，其中该癌症是同源重组缺陷(HRD)癌症。

53.如权利要求52所述的方法，其中该癌症包含具有选自以下的HRD基因突变的一种或多种细胞：BRCA1、BRCA2、ATM、BRIP1、BARD1、CDK12、CHEK1、CHEK2、FANCL、PALB2、PPP2R2A、RAD51B、RAD51C、RAD51D和RAD54L。

54.如权利要求53所述的方法，其中该HRD基因突变选自BRCA1、BRCA2和ATM。