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CN118715025A - 用于增强基因表达的构建体 - Google Patents

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CN118715025A
CN118715025A CN202380022169.4A CN202380022169A CN118715025A CN 118715025 A CN118715025 A CN 118715025A CN 202380022169 A CN202380022169 A CN 202380022169A CN 118715025 A CN118715025 A CN 118715025A
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CN
China
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aav
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group
seq
enhancer
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Application number
CN202380022169.4A
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林卿
陈意雄
盛晓菁
蒋天祺
吴强
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Shanghai Lingyi Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Shanghai Lingyi Biotechnology Co ltd
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Abstract

本公开提供表达构建体、载体、病毒颗粒或组合物。所述表达构建体包含与感兴趣的多核苷酸序列可操作连接的转录调控元件，其中所述表达构建体包含启动子、增强子和任选的内含子，所述增强子位于所述启动子的上游。本发明还提供表达构建体、载体、病毒颗粒或组合物的用途。

Description

用于增强基因表达的构建体
优先权
本申请要求2022年10月8日提交的PCT申请PCT/CN2022/123892的权益和优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开涉及一种核酸构建体。本发明还涉及所述核酸构建体、表达载体及其用途。
背景技术
在本领域中对用于调控转录本的转录和任选地调控感兴趣的蛋白质或多肽的表达的替代方法和优选改进的方法，仍存在着未满足的需求。
发明内容
本公开提供了一种表达构建体，其包含与感兴趣的多核苷酸序列可操作连接的转录调控元件，其中所述表达构建体包含启动子和增强子，所述增强子位于所述启动子的上游，
其中所述表达构建体以5’至3’方向包含下述元件：
a)增强子3，所述增强子3是任选的；
b)增强子2；
c)增强子1；和
d)启动子；
所述增强子1包含含有选自SEQ ID NO：13和15以及与SEQ ID NO：13和15具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％同一性的序列中的至少一个的序列的全部或部分，所述序列的全部或部分保留了增强子的功能，并且
所述增强子2包含含有选自SEQ ID NO：8-11和13以及与SEQ ID NO：8-11和13具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％同一性的序列中的至少一个的序列的全部或部分，所述序列的全部或部分保留了增强子的功能。
在某些实施方式中，所述增强子3包含含有选自SEQ ID NO：8-11以及与SEQ IDNO：8-11具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％同一性的序列中的至少一个的序列的全部或部分，所述序列的全部或部分保留了增强子的功能。
在某些实施方式中，所述启动子包含选自由SEQ ID NO：2-6以及与SEQ ID NO：2-6具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％同一性的序列组成的组中的序列的全部或部分，所述序列的全部或部分保留了启动子的功能。
在某些实施方式中，所述启动子包含选自由SEQ ID NO：3-6以及与SEQ ID NO：3-6具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％同一性的序列组成的组中的序列的全部或部分，所述序列的全部或部分保留了启动子的功能。
在某些实施方式中，所述增强子1包含含有选自由SEQ ID NO：13和15以及与SEQID NO：13和15具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％同一性的序列组成的组中的至少一个的序列的全部或部分，所述序列的全部或部分保留了增强子的功能；所述增强子2包含含有选自由SEQ ID NO：8-9以及与SEQ ID NO：8-9具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％同一性的序列组成的组中的至少一个的序列的全部或部分，所述序列的全部或部分保留了增强子的功能。
在某些实施方式中，所述增强子1包含含有选自由SEQ ID NO：13和15以及与SEQID NO：13和15具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％同一性的序列组成的组中的至少一个的序列的全部或部分，所述序列的全部或部分保留了增强子的功能；所述增强子2包含含有SEQ ID NO：8以及与SEQ ID NO：8具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％同一性的序列的全部或部分，所述序列的全部或部分保留了增强子的功能。
在某些实施方式中，所述表达构建体进一步包含非翻译内含子区。
在某些实施方式中，所述非翻译内含子区包含选自由SEQ ID NO：24-43以及与SEQID NO：24-43具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％同一性的序列组成的组中的序列的全部或部分。
在某些实施方式中，所述非翻译内含子区可操作连接到所述感兴趣的多核苷酸序列的5’端。
在某些实施方式中，所述非翻译内含子区位于所述感兴趣的多核苷酸序列的5’与3’端之间。
另一方面，本公开提供了一种载体，其包含本公开的表达构建体。所述载体是病毒载体，优选为AAV载体。所述载体进一步包含位于所述表达构建体侧翼的两个腺相关病毒反向末端重复(ITR)序列，优选地进一步包含多聚A序列。
另一方面，本公开提供了一种腺相关病毒(AAV)，其包含本公开的载体和衣壳蛋白。
在某些实施方式中，所述AAV选自由血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAVrh10、AAVhu37或从人类或非人哺乳动物分离的AAV血清型中的任一者或其变体组成的组。
另一方面，本公开提供了一种组合物，其包含本公开的表达构建体、载体或AAV以及药学上可接受的赋形剂。
另一方面，本公开提供了本公开的表达构建体、载体或AAV，其用于治疗方法中。
在某些实施方式中，本公开提供了本公开的表达构建体、载体或AAV在制备用于在受试者中治疗疾病或病症的药物中的用途。
在某些实施方式中，本公开提供了本公开的表达构建体、载体或AAV，其用于在受试者中治疗疾病或病症的方法中。
在某些实施方式中，本公开提供了一种在受试者中治疗疾病或病症的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的本公开的表达构建体、载体或AAV。
另一方面，本公开提供了本公开的表达构建体、载体或AAV，其用于在受试者中表达所述感兴趣的核苷酸序列的方法中。
另一方面，本公开提供了本公开的表达构建体、载体或AAV，其用于在受试者中表达所述感兴趣的核苷酸序列的方法中。
附图说明
图1示出了嵌合HSREs构建体在HepG2细胞中的荧光素酶和GCase活性。(A)基于启动子HSRE002的不同CHSRE的荧光素酶活性比较。PG135组与PG130组相比P<0.05，并且PG139、PG140、PG131、PG132、PG141、PG142、PG143组与PG130组相比P<0.01。(B)基于启动子HSRE005的不同CHSRE的荧光素酶活性比较。PG148和PG151组与PG145组相比P<0.05，并且PG146、PG149、PG147和PG150组与PG145组相比P<0.01。(C)基于启动子HSRE004的不同CHSRE的荧光素酶活性比较。所有组与PG152组相比P<0.01。(D)基于启动子HSRE003的不同CHSRE的荧光素酶活性比较。PG165组与PG159组相比P<0.01，并且PG163、PG160、PG161、PG162、PG164组与PG159组相比P<0.01。(E)基于启动子HSRE002的不同CHSRE的GCase酶活性比较。PG025组与PG022组相比P<0.05，并且PG023、PG026、PG028、PG029、PG030、PG031组与PG022组相比P<0.01。(F)基于启动子HSRE005的不同CHSRE的GCase酶活性比较。PG035组与PG032组相比P<0.05，并且其他组与PG032组相比P<0.01。(G)基于启动子HSRE004的不同CHSRE的GCase酶活性比较。PG042组与PG039组相比P<0.05，并且PG040、PG041、PG043、PG044和PG045组与PG039组相比P<0.01。(H)基于启动子HSRE003的不同CHSRE的GCase酶活性比较。PG049和PG052组与PG046组相比P<0.05，PG047、PG048和PG051组与PG046组相比P<0.01。数值以平均值±SEM表示。每个实验组N＝3。
图2示出了HSRE012构建体在HepG2中的荧光素酶和GCase活性。(A)基于启动子HSRE002的HSRE012不同位置的构建体的荧光素酶活性比较。观察到显著差异：PG133相比于PG131(P<0.01)，PG134相比于PG132(P<0.01)。(B)基于启动子HSRE002的HSRE012不同拷贝数的构建体的荧光素酶活性比较。无显著差异：PG136相比于PG131，PG137相比于PG132，PG138相比于PG135(值：平均值±SEM，每个组N＝3)。(C)基于启动子HSRE002的HSRE012不同位置的构建体的GCase酶活性。发现显著差异：PG053相比于PG025(P<0.01)，PG054相比于PG026(P<0.01)。(D)基于启动子HSRE002的HSRE012不同拷贝数的构建体的GCase酶活性比较。无显著差异：PG055相比于PG025，PG056相比于PG026，PG057相比于PG027(值：平均值±SEM，每个组N＝3)。
图3示出了HSREs结合不同外源内含子构建体的体外GCase酶活性。(A)在Huh7细胞中具有内源内含子的构建体的GCase酶活性。PG059组与PG058组相比P<0.05。(B)在HepG2细胞中不同构建体的体外GCase酶活性。PG076、PG078和PG081组与PG074组相比P<0.01。PG090组与PG082组相比P<0.01，并且PG091组与PG082组相比P<0.05。组PG093、PG094、PG095、PG097、PG098、PG099、PG100和PG101组与PG092组相比P<0.01。(C)在HEK293T细胞中不同构建体的GCase酶活性。误差条表示平均值±SEM。每个实验组N＝3。
图4示出了嵌合HSREs结合不同内含子的构建体的GCase酶活性。(A)在HepG2细胞中不同构建体的GCase酶活性。G107和PG108组与PG168组相比P<0.05。PG114和PG115组与PG169组相比P<0.01。(B)在HEK293T细胞中不同构建体的GCase酶活性。误差条表示平均值±SEM。每个实验组N＝3。
图5示出了在野生型小鼠中以2E12 vg/kg的剂量注射AAV8载体后2周血清和组织裂解物中的GCase酶活性。(A)在血清中测量的GCase酶活性。PG026、PG037、PG051和PG105组与PG127组相比P<0.05，并且PG103、PG104和PG105组与PG127组相比P<0.01。PG103和PG104组与PG102组相比P<0.01。PG103和PG104组与PG026组相比P<0.01。(B)在肝脏裂解物中测量的GCase酶活性。PG026组与PG127组相比P<0.05，并且PG103、PG104和PG105组与PG127组相比P<0.01。PG103和PG104组与PG102组相比P<0.01。PG103和PG104组与PG026组相比P<0.01。PG105组与PG051组相比P<0.01。(C)在肺裂解物中测量的GCase酶活性。PG105和PG026组与PG127组相比P<0.05，并且PG103和PG104组与PG127组相比P<0.01。PG104组与PG102组相比P<0.05，并且PG103组与PG102组相比的P<0.01。PG103组与PG026组相比P<0.05。(D)在脾裂解物中测量的GCase酶活性。PG026、PG103、PG104和PG105组与PG127组相比P<0.01。PG103和PG104组与PG102组相比P<0.01。PG103组与PG026组相比P<0.01。数值以平均值±SEM表示。每个实验组N＝4。
图6示出了在戈谢病小鼠中由嵌合HSREs调控的AAV8基因疗法候选物的显著疗效。(A)在以2E12 vg/kg的剂量注射AAV8候选物后8周测量的血清中的GCase酶活性。PG118、PG119、PG120和PG122组与缓冲液对照或伊米苷酶组相比P<0.05。PG118和PG122组与PG127组相比P<0.05，并且G119和PG120组与PG127组相比P<0.01。(B)在以2E12 vg/kg的剂量注射AAV8候选物后8周测量的血清中的底物积累。所有组与缓冲液对照或伊米苷酶组相比P<0.01。PG119组与PG127组相比P<0.05，并且PG118、PG120和PG122组与PG127组相比P<0.01。PG119中的血清葡萄糖鞘氨醇水平低于检测极限。组代表相应的野生型小鼠。数值以平均值±SEM表示。每个实验组N＝5。
图7示出了在戈谢病小鼠中以2E12 vg/kg的剂量注射AAV8候选物12周后的组织裂解物中的GCase酶活性。(A)在肝脏裂解物中测量的GCase酶活性。PG118-PG122组与缓冲液对照或伊米苷酶组相比P<0.01。PG120和PG122组与PG127组相比P<0.05，并且PG118和PG119组与PG127组相比P<0.01。(B)在肺裂解物中测量的GCase酶活性。PG118-PG122组与缓冲液对照或伊米苷酶组相比P<0.05。PG118和PG122组与PG127组相比P<0.05，并且PG119和PG120组与PG127组相比P<0.01。(C)在脾裂解物中测量的GCase酶活性。PG118-PG122组与缓冲液对照组相比P<0.01。PG120组与伊米苷酶组相比P<0.05，并且PG118、PG119和PG122组与伊米苷酶组相比P<0.01。PG118和PG122组与PG127组相比P<0.05，并且PG119和PG120组与PG127组相比P<0.01。组代表野生型小鼠。数值以平均值±SEM表示。每个实验组N＝5。
图8示出了在戈谢病小鼠中以2E12 vg/kg的剂量注射AAV8候选物12周后组织裂解物中的葡萄糖鞘氨醇底物的积累。(A)在肝脏裂解物中测量的底物积累。PG001、PG011、PG119和PG120组与缓冲液对照或伊米苷酶组相比P<0.01。PG119和PG120组与PG127组相比P<0.01。(B)在肺裂解物中测量的底物积累。PG001组与缓冲液对照或伊米苷酶组相比P<0.05，并且PG011、PG119和PG120组与缓冲液对照或伊米苷酶组相比P<0.01。PG119和PG120组与PG127组相比P<0.05。(C)在脾裂解物中测量的底物积累。PG001、PG011、PG119和PG120组与缓冲液对照或伊米苷酶组相比P<0.01。PG119和PG120组与PG127组相比P<0.01。代表野生型小鼠。误差条表示平均值±SEM。每个实验组N＝5。使用LC-MS/MS分析不同组织裂解物中的葡萄糖鞘氨醇水平。
图9示出了在野生型小鼠中以2E12 vg/kg的剂量注射AAV9候选物2周后血清和组织裂解物中的GCase酶活性。(A)在血清中测量的GCase酶活性。PG124组与缓冲液对照组相比P<0.05，并且PG123、PG125和PG126组与缓冲液对照组相比P<0.01。PG124和PG125组与PG001组相比P<0.05，并且PG123和PG126组与PG001组相比P<0.01。PG125组与PG128组相比P<0.05，并且PG123和PG126组与PG128组相比P<0.01。(B)在肝脏裂解物中测量的GCase酶活性。PG123-PG126组与缓冲液对照组相比P<0.01。PG124和PG125组与PG001组相比P<0.05，并且PG123和PG126组与PG001组相比P<0.01。PG124和PG125组与PG128组相比P<0.05，并且PG123和PG126组与PG128组相比P<0.01。(C)在肺裂解物中测量的GCase酶活性。PG124组与缓冲液对照组相比P<0.05，并且PG123、PG125和PG126组与缓冲液对照组相比P<0.01。PG124组与PG001相比P<0.05，并且PG123、PG125和PG126组与PG001相比P<0.01。PG123和PG125组与PG128组相比P<0.05，并且PG126组与PG128组相比P<0.01。(D)在脾裂解物中测量的GCase酶活性。PG123-PG126组与缓冲液对照组相比P<0.01。PG124组与PG001组相比P<0.05，并且PG123、PG125和PG126组与PG001组相比P<0.01。PG124组与PG128组相比P<0.05，并且PG123、PG125和PG126组与PG128组相比P<0.01。数值以平均值±SEM表示。每个实验组N＝4。
具体实施方式
下面将更全面地描述根据本公开的实施方式。然而，本公开的各方面可以以不同形式体现，并且不应被解释为限于本文列出的实施方式。相反，提供这些实施方式是为了使本公开全面且完整，并将本发明的范围完全传达给本领域技术人员。在本文的描述中使用的术语仅用于描述实施方式的目的，而不旨在进行限制。
除非另有定义，否则本文中使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。还应当理解，术语例如在常用词典中定义的术语，应被解释为具有与其在本申请和相关技术的上下文中的含义一致的含义，并且不应以理想化或过于正式的意义来解释，除非在本文中明确地如此定义。
定义
当在本发明的说明书和所附的权利要求书中使用时，单数形式也意指包括复数形式，除非上下文另有明确说明。
本文所使用的术语“包含”意指组合物和方法包括所叙述的要素，但是不排除其他要素。
本文所使用的术语“核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合物形式，可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合体，或聚合物，所述聚合物包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、化学或生物化学修饰、非天然或衍生的核苷酸碱基，或者基本上由或由其组成。
本文所使用的“表达”是指将多核苷酸转录成mRNA和/或将转录的mRNA随后翻译成肽、多肽或蛋白质的过程的两步过程。如果多核苷酸源自基因组DNA，则在真核细胞中表达可能包括mRNA的剪接。
在应用于多核苷酸时术语“编码”是指，如果多核苷酸可以被转录以产生多肽和/或其片段的mRNA，则所述多核苷酸被称为“编码”所述多肽。反义链是这样的核酸的互补体，并且可以从其推断出编码序列。
本文所使用的术语“启动子”意指一种控制序列，其是多核苷酸序列的控制编码序列例如基因或转基因的转录起始和速率的区域。启动子可以是组成型、诱导型、阻遏型或组织特异性的。在实施方式中，启动子与增强子一起用于提高转录效率。增强子是提高靶序列的表达的调控元件。
术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可互换使用，并且在最广泛的意义上是指两个或更多个氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物的亚基的化合物。所述亚基可以通过肽键相连。另一方面，所述亚基可以通过其他键例如酯、醚等连接。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对蛋白质或肽序列包含、基本上由其组成或由其组成的氨基酸的最大数量没有限制。本文所使用的术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸和D和L光学异构体、氨基酸类似物和肽模拟物。
“同一性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。同一性百分数可以通过将可能为比较目的而对齐的每个序列中的位置进行比较来确定。当所比较序列中的位置被相同碱基或氨基酸占据时，分子在该位置处是同一的。序列之间的同一性程度是所述序列共有的匹配位置数目的函数。
本文所使用的术语“载体”是指包含完整复制子、或者基本上由或由完整复制子组成的核酸，使得当所述载体通过例如转染、感染或转化过程置于细胞内时可以被复制。在本领域中应该理解，一旦进入细胞内，载体可以作为染色体外(附加体)元件复制，或者可以整合到宿主细胞染色体中。载体可以包括源自反转录病毒、腺病毒、疱疹病毒、杆状病毒、修饰的杆状病毒、乳头状病毒、AAV病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、甲病毒载体等的核酸。甲病毒载体例如基于塞姆利基森林(Semliki Forest)病毒的载体和基于辛德毕斯(Sindbis)病毒的载体也已被开发用于基因治疗和免疫治疗。参见例如Schlesinger和Dubensky(1999)Curr.Opin.Biotechnol.5:434-439和Ying等(1999)Nat.Med.5(7):823-827。
本文所使用的术语“腺相关病毒”或“AAV”是指与该名称相关并属于细小病毒(Parvoviridae)科依赖性细小病毒(Dependoparvovirus)属的病毒类别的成员。腺相关病毒是一种单链DNA病毒，仅在其中某些功能由共同感染的辅助病毒提供的细胞中生长。所有AAV血清型均明显表现出由同源rep基因介导的非常相似的复制特性；并且都带有三种相关的衣壳蛋白。在本领域中已知至少13种顺序编号的天然存在的AAV血清型。用于本文公开的方法中非限制性示例性血清型包括这13种血清型中的任一者，例如AAV2、AAV8、AAV9，或变体血清型例如AAV-DJ和AAV PHP.B。AAV颗粒包含三种主要病毒蛋白VP1、VP2和VP3，基本上由所述蛋白组成或由所述蛋白组成。在实施方式中，AAV是指血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或AAV13。在实施方式中，AAV颗粒包含选自由AAVPHP.B、AAVrh74、AAV 110、AAV 204、AAV 214、AAV 214A、AAV 214e、AAV 214e8、AAV214e9、AAV 214el0、AAV ITB102_45和AAV 214AB组成的组的AAV衣壳蛋白。在实施方式中，AAV是指血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或AAV13、AAVrh10、AAVhu37或从人类和非人哺乳动物分离的AAV血清型中的任一者或其变体。在实施方式中，AAV颗粒包含选自由AAV1、AAV2、AAV2G9、AAV3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-1b、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAV1-7/rh.48、AAV1-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-11/rh.53、AAV4-8/r11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAVA3.3、AAVA3.4、AAVA3.5、AAVA3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5R1、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5R1、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44R1、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48R1、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t 19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.10、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64R1、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh8R、AAVrh8R A586R突变体、AAVrh8R R533A突变体、AAAV、BAAV、山羊AAV、牛AAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVhER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、AAVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr3.1、AAV2.5T、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC12、AAV-2-pre-miRNA-101、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAV SM 10-2、AAV Shuffle 100-1、AAV Shuffle 100-3、AAV Shuffle 100-7、AAV Shuffle 10-2、AAV Shuffle 10-6、AAV Shuffle 10-8、AAVShuffle 100-2、AAV SM 10-1、AAV SM 10-8、AAV SM 100-3、AAV SM 100-10、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、AAVrh.50、AAVrh.43、AAVrh.62、AAVrh.48、AAVhu.19、AAVhu.11、AAVhu.53、AAV4-8/rh.64、AAVLG-9/hu.39、AAV54.5/hu.23、AAV54.2/hu.22、AAV54.7/hu.24、AAV54.1/hu.21、AAV54.4R/hu.27、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV128.1/hu.43、真型(true type)AAV(ttAAV)、UPENN AAV 10、日本AAV 10血清型、AAV CBr-7.1、AAVCBr-7.10、AAV CBr-7.2、AAV CBr-7.3、AAV CBr-7.4、AAV CBr-7.5、AAV CBr-7.7、AAV CBr-7.8、AAV CBr-B7.3、AAV CBr-B7.4、AAV CBr-E1、AAV CBr-E2、AAV CBr-E3、AAV CBr-E4、AAVCBr-E5、AAV CBr-e5、AAV CBr-E6、AAV CBr-E7、AAV CBr-E8、AAV CHt-1、AAV CHt-2、AAVCHt-3、AAV CHt-6.1、AAV CHt-6.10、AAV CHt-6.5、AAV CHt-6.6、AAV CHt-6.7、AAV CHt-6.8、AAV CHt-P1、AAV CHt-P2、AAV CHt-P5、AAV CHt-P6、AAV CHt-P8、AAV CHt-P9、AAVCKd-1、AAV CKd-10、AAV CKd-2、AAV CKd-3、AAV CKd-4、AAV CKd-6、AAV CKd-7、AAV CKd-8、AAV CKd-B1、AAV CKd-B2、AAV CKd-B3、AAV CKd-B4、AAV CKd-B5、AAV CKd-B6、AAV CKd-B7、AAV CKd-B8、AAV CKd-H1、AAV CKd-H2、AAV CKd-H3、AAV CKd-H4、AAV CKd-H5、AAV CKd-H6、AAV CKd-N3、AAV CKd-N4、AAV CKd-N9、AAV CLg-F1、AAV CLg-F2、AAV CLg-F3、AAV CLg-F4、AAV CLg-F5、AAV CLg-F6、AAV CLg-F7、AAV CLg-F8、AAV CLv-1、AAV CLv1-1、AAV Clv1-10、AAV CLv1-2、AAV CLv-12、AAV CLv1-3、AAV CLv-13、AAV CLv1-4、AAV Clv1-7、AAV Clv1-8、AAV Clv1-9、AAV CLv-2、AAV CLv-3、AAV CLv-4、AAV CLv-6、AAV CLv-8、AAV CLv-D1、AAVCLv-D2、AAV CLv-D3、AAV CLv-D4、AAV CLv-D5、AAV CLv-D6、AAV CLv-D7、AAV CLv-D8、AAVCLv-E1、AAV CLv-K1、AAV CLv-K3、AAV CLv-K6、AAV CLv-L4、AAV CLv-L5、AAV CLv-L6、AAVCLv-M1、AAV CLv-M11、AAV CLv-M2、AAV CLv-M5、AAV CLv-M6、AAV CLv-M7、AAV CLv-M8、AAVCLv-M9、AAV CLv-R1、AAV CLv-R2、AAV CLv-R3、AAV CLv-R4、AAV CLv-R5、AAV CLv-R6、AAVCLv-R7、AAV CLv-R8、AAV CLv-R9、AAV CSp-1、AAV CSp-10、AAV CSp-11、AAV CSp-2、AAVCSp-3、AAV CSp-4、AAV CSp-6、AAV CSp-7、AAV CSp-8、AAV CSp-8.10、AAV CSp-8.2、AAVCSp-8.4、AAV CSp-8.5、AAV CSp-8.6、AAV CSp-8.7、AAV CSp-8.8、AAV CSp-8.9、AAV CSp-9、AAV.hu.48R3、AAV.VR-355、AAV3B、AAV4、AAV5、AAVF1/HSC1、AAVF11/HSC11、AAVF12/HSC12、AAVF13/HSC13、AAVF14/HSC14、AAVF15/HSC15、AAVF16/HSC16、AAVF17/HSC17、AAVF2/HSC2、AAVF3/HSC3、AAVF4/HSC4、AAVF5/HSC5、AAVF6/HSC6、AAVF7/HSC7、AAVF8/HSC8、AAVF9/HSC9、AAV-PHP.B(PHP.B)、AAV-PHP.A(PHP.A)、G2B-26、G2B-13、TH1.1-32、TH1.1-35、AAVPHP.B2、AAVPHP.B3、AAVPHP.N/PHP.B-DGT、AAVPHP.B-EST、AAVPHP.B-GGT、AAVPHP.B-ATP、AAVPHP.B-ATT-T、AAVPHP.B-DGT-T、AAVPHP.B-GGT-T、AAVPHP.B-SGS、AAVPHP.B-AQP、AAVPHP.B-QQP、AAVPHP.B-SNP(3)、AAVPHP.B-SNP、AAVPHP.B-QGT、AAVPHP.B-NQT、AAVPHP.B-EGS、AAVPHP.B-SGN、AAVPHP.B-EGT、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-STP、AAVPHP.B-PQP、AAVPHP.B-SQP、AAVPHP.B-QLP、AAVPHP.B-TMP、AAVPHP.B-TTP、AAVPHP.S/G2A12、AAVG2A15/G2A3、AAVG2B4、AAVG2B5及其变体组成的组的AAV衣壳蛋白。
本文所使用的“AAV载体”是指包含一个或多个异源核酸(HNA)序列和一个或多个AAV反向末端重复序列(ITR)的载体。此类AAV载体可以在提供rep和cap基因产物的功能的宿主细胞中复制，并允许将ITR和ITR之间的核酸包装在感染性病毒颗粒中。在实施方式中，在被包装在感染性AAV颗粒中侧翼的ITR内，AAV载体包含启动子、可以编码至少一种蛋白质或RNA的至少一个核酸和/或增强子和/或终止子。ITR和ITR之间的核酸可以被包裹在AAV衣壳中，并且这种衣壳化核酸可以被称为“AAV载体基因组”。除了所述衣壳化部分之外，AAV载体可以含有其他元件例如抗生素抗性基因或本领域中已知的其他元件，它们被包含在质粒中用于制造目的，但不被包装到AAV颗粒中。
本文所使用的术语“病毒衣壳”或“衣壳”是指病毒颗粒的蛋白质外壳或衣壳。衣壳具有包裹、保护、运输病毒基因组和/或将其释放到宿主细胞内的功能。衣壳通常由蛋白质(“衣壳蛋白”)的寡聚结构亚基组成。AAV的病毒衣壳由三种病毒衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的混合物组成。
“AAV毒粒”或“AAV病毒颗粒”或“AAV颗粒”是指由至少一种AAV衣壳蛋白和来自AAV载体(在本文中被称为AAV载体基因组)的衣壳化多核苷酸组成的病毒颗粒。
诊断或治疗的“受试者”是动物例如哺乳动物或人。受试者不限于特定物种，并且包括接受诊断或治疗的非人动物以及进行感染的非人动物或动物模型，包括但不限于猿猴、小鼠、大鼠、犬类或兔类物种，以及其他牲畜、运动动物或宠物。在实施方式中，受试者是人。
当在本文中使用时，在受试者中疾病的“治疗”是指：(1)在对疾病易感或尚未表现出疾病症状的受试者中防止症状或疾病发生；(2)抑制疾病或阻止其发展；或(3)改善疾病或疾病症状或引起它们的消退。正如本领域中理解的，“治疗”是获得有益或所需结果(包括临床结果)的方法。出于本技术的目的，有益或所需结果可以包括但不限于下述一者或多者：一种或多种症状的减轻或改善，减轻病症(包括疾病)的程度，使病症(包括疾病)的状态稳定(即不恶化)，延迟或减缓病症(包括疾病)的进展，改善或缓解病症(包括疾病)的状态，以及缓解(不论是部分还是全部)，不论是可检测还是不可检测的。
本文所使用的术语“有效量”意指足以实现所需效果的量。在治疗性或预防性应用的情况下，有效量可能取决于所讨论的疾病的类型和严重程度，以及个体受试者的特征如总体健康、年龄、性别、体重和对药物组合物的耐受性。在基因治疗的情况下，在实施方式中，有效量是足以使受试者中缺陷的基因获得部分或全部功能的量。在其他实施方式中，AAV病毒颗粒的有效量是足以导致基因在受试者中表达的量。本领域技术人员将能够根据这些和其他因素来确定适合的量。
在实施方式中，有效量将取决于所讨论的应用的规模和性质。它还取决于目标受试者的特点和敏感性以及使用的方法。专业技术人员将能够在这些和其他考虑因素的基础上确定有效量。有效量可以包括取决于实施方式的组合物的一次或多次施用、基本上由其组成或由其组成。
本文所使用的术语“施用”意指将物质递送到受试者例如动物或人。在整个治疗过程中，施用可以一次性、连续或间歇地进行。确定施用的最有效方式和剂量的方法对于本领域技术人员来说是已知的，并且随着用于治疗的组合物、治疗的目的以及所治疗的受试者的年龄、健康或性别而变。可以进行单次或多次施用，剂量水平和模式由治疗医生选择，或者在宠物和其他动物的情况下由治疗兽医选择。
实施例
除非另有规定，否则在下文描述的实施例中遵循下述通用方法。
rAAV生产
AAV8和AAV9病毒颗粒为通过用编码AAV Rep和Cap基因的质粒、腺病毒辅助基因的质粒以及含有GBA1基因的构建体质粒对HEK293T细胞或HEK293悬浮细胞进行三质粒瞬时转染产生。rAAV颗粒使用基于碘克沙醇的密度梯度超速离心法进行纯化。随后，通过基于探针的ddPCR(Biorad)测定法对rAAV进行定量，并通过银染色进行纯度表征。
体外转染和rAAV效力测定
在转染前一天，将HEK293T或肝细胞系HepG2和Huh7以1.5E5个细胞/孔的细胞密度加入到24孔板中。每个孔加入500μl完全细胞培养基。转染使用基于PEI的转染试剂。具体而言，将0.15μg含有转基因序列的质粒以及0.15μg含有荧光素酶报告基因的质粒共转染到每个孔中。转染后48h，向每个孔添加300μl新鲜的完全细胞培养基，并将细胞继续温育24小时。
对于双荧光素酶报告物测定，使用细胞裂解缓冲液(TransGen)将细胞裂解，并使用荧光素酶检测系统(TransGen)进行萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶检测。将含有细胞裂解物和检测试剂的96孔板在Varioskan LUX读板器(ThermoFisher)上读数。首先用海肾荧光素酶强度归一化后再用对照组进行归一化的萤火虫荧光素酶强度。
对于GCase活性测定，按照下面描述的方法对细胞培养上清液进行酶活性测定。使用细胞裂解缓冲液(Promega)将细胞裂解，并使用Steady-Glo荧光素酶检测系统(Promega)进行荧光素酶检测。将含有细胞裂解物和检测试剂的96孔板在Varioskan LUX读板器(ThermoFisher)上读数。图示数据为用萤火虫荧光素酶强度归一化再用对照组进行归一化后的酶活性。rAAV生物效力测定使用HEK293T、Huh7或HepG2细胞通过细胞转导来进行。在转导前24小时，将细胞以1.5E5个细胞/孔的密度铺于24孔板中。以1E5或1E6的感染复数(MOI)进行rAAV转导。在感染后48h，向每个孔添加300μl新鲜的完全细胞培养基，并将细胞继续温育24小时。感染后72h，按照下文描述的方法对细胞培养上清液进行酶活性测试。
野生型小鼠研究设计
将含有GBA1转基因的AAV载体通过尾静脉注射施用到8-9周龄的野生型(C57BL/6)雄性小鼠。AAV注射剂量为1E12 vg/ml。为了评估转基因表达的动力学和持久性，在注射后各个时间间隔(1、2或4周)测量血清GCase水平。在AAV治疗后跟踪小鼠长达4周，然后处死，用于生物化学和病理学分析。
戈谢病小鼠研究设计
将含有GBA1转基因的AAV载体通过尾静脉注射施用到7-12周龄的戈谢病(两种不同类型的GBA1突变的组合)小鼠中。所有小鼠均饲养在无病原体的特定环境下和单独通风的笼子中。所有笼子、玉米芯垫料和水均在使用前灭菌。笼子、玉米芯垫料、食物和水每周更换两次。
AAV注射剂量为2E11至5E13 vg/mL。为了评估转基因表达的动力学和持久性，在注射后的各个时间间隔测量血清GCase水平和底物积累。跟踪小鼠直至终点研究并处死，用于生物化学和病理学分析。
AAV/伊米苷酶的制备和施用
将rAAV的等分试样储存在-80℃下。在注射前，将等分试样在冰上解冻并用AAV配制缓冲液稀释。在注射前将稀释的AAV置于冰上，并在2小时内使用。
将伊米苷酶按照制造商的说明书重悬，分成等分试样(40IU/ml)并储存在-80℃下。在注射前，将等分试样在冰上解冻并稀释，轻柔但充分地混合。
血清和组织收集
在4℃下、0.5小时内通过以12,000rpm离心15分钟，从不含抗凝剂的新鲜血液中分离血清。将血清于-80℃下储存。对于伊米苷酶组，在注射后1.5小时收集血清。
将小鼠麻醉并实施安乐死。在用盐水灌注后从小鼠收集组织，并储存在-80℃条件下。对于伊米苷酶组，在注射后1.5小时收集组织样品。将组织样品分成4个部分，将其中3个部分冷冻在单独的管中并储存在-80℃条件下，用于GCase活性测定、葡萄糖鞘氨醇分析和mRNA分析。将剩余的部分在10％中性缓冲福尔马林溶液(NBF，pH 7.4)中，在室温下固定约24-48h，用于组织学分析。从小鼠双腿的股骨和胫骨收集骨髓细胞。
小鼠血清和组织GCase活性测定
从小鼠血液获得血清样品并储存在-80℃下。使用匀浆器(Shanghai jingxin)在特定程序(50Hz，工作30s并冷却30s，总共4min)下将组织在组织裂解缓冲液(柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液，pH5.0，0.25％牛黄胆酸钠、1％TX-100和蛋白酶抑制剂混合物)中裂解。对于酶活性测定，β-葡萄糖脑苷脂酶(酸性β-葡萄糖苷酶；GCase)活性通过基于荧光的测定法测定。将4-甲基伞形酮基β-D-吡喃葡萄糖苷(4MU-Glc，Carbosynth)用作GCase酶的底物。在测定当天，使用酶测定缓冲液(柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液，pH5.0，0.25％牛黄胆酸钠，0.25％TX-100)将血清1:100稀释。使用裂解缓冲液(柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液，pH5.0，0.25％牛黄胆酸钠、1％ TX-100和蛋白酶抑制剂混合物)将组织裂解物1:40稀释。将所有样品在柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液、pH5.0、0.25％牛黄胆酸钠、0.25％ TX-100、1mM 4MU-Glc中，在37℃下测定1小时。通过添加三倍体积(150ul)的终止溶液(0.5M甘氨酸，pH 10.8)终止反应。使用Varioskan LUX读板器(ThermoFisher)，分别使用360nm和460nm的激发和发射波长来评估相对荧光水平(RFU)。组织裂解物样品也通过BCA试剂盒(Thermofisher)进行蛋白质浓度测定。然后基于4-甲基伞形酮(4-MU，Sigma-Aldrich)的标准曲线将荧光水平转换成nmol/h/ml(血清)或nmol/h/mg总蛋白(肝脏、脾、肺、骨髓和脑)。
载体基因组拷贝数、相对RNA转录水平
为了确定在rAAV注射后组织样品中的载体基因组拷贝数，使用DNeasy血液和组织试剂盒(QIAGEN)，按照制造商的说明书从冷冻的肝脏组织分离DNA。在DNA分离后，进行基于探针的qPCR(Roche)以确定载体基因组拷贝数/反应。按照DNA量的定量结果计算细胞数/反应。然后通过将基因组拷贝数/反应归一化到细胞数/反应来计算载体基因组拷贝数/细胞。
为了确定在rAAV注射后组织样品中的相对RNA转录水平，使用RNeasy试剂盒(QIAGEN)，按照制造商的说明书从冷冻的肝脏样品分离RNA。在RNA分离后，使用Primescript RT master mix(TAKARA)合成cDNA。向每个RT反应中加入300-500ng RNA。然后将cDNA稀释并应用于基于探针的qPCR(Roche)测试。
免疫组织化学
使用兔抗小鼠CD68抗体(1:25Abcam AB53444)检测小鼠巨噬细胞。将福尔马林固定的小鼠组织用二甲苯脱蜡并用分级乙醇洗涤，然后按照产品使用建议使用胃蛋白酶回收抗原。将切片用苏木精复染。使用生物素标记的第二抗体进行检测。使用链霉亲和素-HRP和Tyramide信号扩增试剂盒，按照建议进行信号显色。
储存细胞计数
将组织切片用苏木精和伊红(H&E)染色。将染色的组织用Aperio AT2(Leica，40X)扫描。用Aperio ImageScope(V12.4.3.5008)处理组织图像。对每只小鼠的肝脏和肺的整个组织切片上的所有戈谢细胞进行手动计数。将来自整个切片的戈谢细胞计数归一化到组织切片面积(平方厘米)，用于数据图。
葡萄糖鞘氨醇(Lyso-GL1)分析
通过用9倍体积(w:v)的PBS缓冲液匀浆来制备组织匀浆物。对组织裂解物或血清样品的等分试样(10pL)进行LC/MS分析。将定量的组织Lyso-GL1通过组织重量进行归一化，并将血清中的底物水平通过血清体积进行归一化。在相应的图中，低于10ng/g(对于组织)和1ng/mL(对于血清或血浆)的Lyso-GL1定量下限(LLOQ)的值将被标记为BQL。
统计分析
数据以平均值±平均值的标准误差(平均值±SEM)表示。使用GraphPad Prism软件进行不同组之间的差异的统计分析。p值≤0.05被认为是统计学上具有显著性的。
实施例1：构建体
为了改善由代谢紊乱引起的戈谢病的基因疗法的治疗效果，本公开概述了一种用于设计和筛选在肝脏中高效且选择性地表达治疗性GCase的新型表达盒的综合方法。
第一步涉及将萤火虫荧光素酶基因和GBA1基因的核苷酸序列克隆到目标载体中。为了将荧光素酶和GCase蛋白的表达局限于肝脏，将萤火虫荧光素酶基因和GBA1基因的核苷酸序列用一系列嵌合的肝特异性调控元件(chimeric hepatic specific regulatoryelements，CHSRE)驱动，所述CHSRE用不同启动子与各种调控元件的组合进行合理设计。本文描述的这些启动子是HSRE001、HSRE002、HSRE003、HSRE004、HSRE005、HSRE015、HSRE016。本文描述的调控元件是HSRE006、HSRE007、HSRE008、HSRE009、HSRE010、HSRE011、HSRE012、HSRE013和HSRE014。在某些实施方式中，还使用内含子进一步提高GCase表达。表1中示出了在本公开中使用的不同启动子和各种调控元件ID以及它们的核苷酸序列。具有K321N突变的密码子优化的GBA1基因是示例性的一个感兴趣的核苷酸序列。
表1.在本公开中使用的不同调控元件
表2.荧光素酶和人GBA1的核苷酸序列
不含信号肽部分但具有K321N突变的密码子优化的人GBA1的多肽序列(SEQ IDNO：22)
ARPCIPKSFGYSSVVCVCNATYCDSFDPPTFPALGTFSRYESTRSGRRMELSMGPIQANHTGTGLLLTLQPEQKFQKVKGFGGAMTDAAALNILALSPPAQNLLLKSYFSEEGIGYNIIRVPMASCDFSIRTYTYADTPDDFQLHNFSLPEEDTKLKIPLIHRALQLAQRPVSLLASPWTSPTWLKTNGAVNGKGSLKGQPGDIYHQTWARYFVKFLDAYAEHKLQFWAVTAENEPSAGLLSGYPFQCLGFTPEHQRDFIARDLGPTLANSTHHNVRLLMLDDQRLLLPHWAKVVLTDPEAAKYVHGIAVHWYLDFLAPANATLGETHRLFPNTMLFASEACVGSKFWEQSVRLGSWDRGMQYSHSIITNLLYHVVGWTDWNLALNPEGGPNWVRNFVDSPIIVDITKDTFYKQPMFYHLGHFSKFIPEGSQRVGLVASQKNDLDAVALMHPDGSAVVVVLNRSSKDVPLTIKDPAVGFLETISPGYSIHTYLWRRQ*
含有信号肽部分并具有K321N突变的密码子优化的人GBA1的多肽序列(SEQ IDNO：23)
MEFSSPSREECPKPLSRVSIMAGSLTGLLLLQAVSWASGARPCIPKSFGYSSVVCVCNATYCDSFDPPTFPALGTFSRYESTRSGRRMELSMGPIQANHTGTGLLLTLQPEQKFQKVKGFGGAMTDAAALNILALSPPAQNLLLKSYFSEEGIGYNIIRVPMASCDFSIRTYTYADTPDDFQLHNFSLPEEDTKLKIPLIHRALQLAQRPVSLLASPWTSPTWLKTNGAVNGKGSLKGQPGDIYHQTWARYFVKFLDAYAEHKLQFWAVTAENEPSAGLLSGYPFQCLGFTPEHQRDFIARDLGPTLANSTHHNVRLLMLDDQRLLLPHWAKVVLTDPEAAKYVHGIAVHWYLDFLAPANATLGETHRLFPNTMLFASEACVGSKFWEQSVRLGSWDRGMQYSHSIITNLLYHVVGWTDWNLALNPEGGPNWVRNFVDSPIIVDITKDTFYKQPMFYHLGHFSKFIPEGSQRVGLVASQKNDLDAVALMHPDGSAVVVVLNRSSKDVPLTIKDPAVGFLETISPGYSIHTYLWRRQ*
实施例2：
嵌合肝脏特异性启动子的体外筛选
为了将荧光素酶或GCase的表达限制在肝脏中，特别地设计了包含核心启动子和1、2、3个或更多个调控元件的一系列嵌合肝特异性调控元件(CHSRE)，并通过比较荧光素酶或GCase在HepG2细胞中的表达效率进行了体外或体内筛选。将萤火虫荧光素酶或mGBA-C110(具有K321N突变的密码子优化的GBA1版本)在各种CHSRE控制下进行表达。
嵌合肝调控元件(CHSRE)由1、2、3个拷贝或多个拷贝的增强子组成，所述增强子选自HSRE010、HSRE014、HSRE012、HSRE006、HSRE009，然后与HSRE002、HSRE004、HSRE003或HSRE005这4种启动子组合构建来驱动荧光素酶基因或GBA1基因的表达，并将得到的构建体PG130-PG165和PG023、PG024、PG025、PG026、PG027、PG028、PG029、PG030、PG033、PG034、PG035、PG036、PG037、PG038、PG040、PG041、PG042、PG043、PG044、PG045、PG047、PG048、PG049、PG050、PG051、PG052用于进一步研究荧光素酶或GCase在HepG2细胞中的表达。这些构建体的信息示出在表3中。
表3.构建体信息
与相应的仅有启动子的版本相比，所有具有CHSRE的荧光素酶构建体均显示出更高的荧光素酶活性(图1A、B、C、D)。当将荧光素酶基因用GBA1基因代替时，与相应的仅有启动子的版本相比，除了PG024-CHSRE003、PG027-CHSRE006和PG050-CHSRE029之外，所有其他GBA1构建体均显示出明显更高的GCase活性(图1E、F、G、H)。
为了确定这些增强子对荧光素酶和GBA1的表达效率是否存在进一步的累加效应，将不同拷贝数的增强子或其进一步的串联组合构建在CHSRE中。结果显示，HSRE010(PG141-CHSRE007相比于PG131-CHSRE004)或HSRE007(PG142-CHSRE008相比于PG132-CHSRE005)拷贝数的进一步增加不影响荧光素酶的表达(图1A)。同样地，HSRE010(PG028-CHSRE007相比于PG025-CHSRE004)和HSRE007(PG029-CHSRE008相比于PG026-CHSRE005)拷贝数的进一步增加对GCase的表达没有影响(图1E)。与PG132-CHSRE005相比，在PG143中向CHSRE005进一步串联添加HSRE010的CHSRE009显著增强了荧光素酶表达(图1A)，然而与PG026-CHSRE005的相应对照相比，在PG030中的CHSRE009没有观察到对GCase表达的影响(图1E)。
测试了HSRE012相对于HSRE002启动子的位置对荧光素酶或GBA1表达的影响，结果显示当HSRE012从HSRE002启动子的上游PG131-CHSRE004-luci和PG132-CHSRE005-luci，PG025-CHSRE004-和PG026-CHSRE005-)移动到下游(PG133-CHSRE032-luci和PG134-CHSRE033-luci，PG053-CHSRE032-和PG054-CHSRE033-)时，荧光素酶或GCase表达显著降低(图2A、C)。如PG136-CHSRE034-luci、PG137-CHSRE035-luci、PG138-CHSRE036-luci、PG055-CHSRE034-GBA1、PG056-CHSRE035-GBA1和PG057-CHSRE036-GBA1中所示增加CHSRE中HSRE012的拷贝数与具有单个HSRE012拷贝的相应构建体(PG131-CHSRE004-luci、PG132-CHSRE005-luci、PG135-CHSRE006-luci、PG025-CHSRE004-GBA1、PG026-CHSRE005-GBA1和PG027-CHSRE006-GBA1)相比并不能进一步提高荧光素酶或GCase的表达(图2B、D)。
实施例3：
不同内含子的体外筛选
为了进一步增强GCase表达，使用mGBA-C110将选自人GBA1来源的内源内含子Int001(插入在SEQ ID NO：21的27-28bp之间)、Int002(插入在SEQ ID NO：21的115-116bp之间)、Int003(插入在SEQ ID NO：21的307-308bp之间)、Int004(插入在SEQ ID NO：21的454-455bp之间)、Int005(插入在SEQ ID NO：21的588-589bp之间)、Int006(插入在SEQ IDNO：21的761-762bp之间)、Int007(插入在SEQ ID NO：21的999-1000bp之间)、Int008(插入在SEQ ID NO：21的1224-1225bp之间)、Int009(插入在SEQ ID NO：21的1388-1389bp之间)和Int0010(插入在SEQ ID NO：21的1505-1506bp之间)的内含子克隆到HSRE002启动子之下，得到构建体PG059、PG060、PG061、PG062、PG063、PG064、PG065、PG066、PG067和PG068，不含任何内含子的构建体是PG058。使用mGBA-C110将选自Int002、Int003、Int005的内源内含子和选自Int011和Int020的外源内含子克隆到HSRE002启动子之下，得到PG069-PG073的构建体。将上述构建体以及PG058和PG059转染到Huh7细胞中，用于研究细胞培养上清液中的GCase活性。证明了与不含内含子的对照相比，插入有Int001的PG059构建体具有更高的GCase表达(图3C)。
同时，使用mGBA-C110将选自Int012、Int013、Int014、Int015、Int016、Int017、Int018、Int019和Int011的外源内含子克隆到肝脏特异性启动子HSRE001、HSRE015和HSRE016之下，分别得到PG074-101的构建体。将这些具有插入到GBA1编码序列上游的外源内含子的构建体转染到HepG2细胞和HEK293T细胞中，以研究细胞培养上清液中的GCase活性。结果显示，所有构建体均在HepG2细胞中高效表达GCase，但在HEK293T细胞中表达非常低(图3A和3B)。
上述结果证明，当使用肝脏特异性启动子时，外源内含子和GBA1内源内含子在HepG2细胞中显示出GCase的高表达，但它们在HEK293T中全都显示出非常弱的GCase活性。上述结果表明，使用本文描述的肝脏特异性启动子结合内源或外源内含子的构建的表达盒可特异性地在肝脏组织中转录GBA1。
表4.内含子的序列
表5.构建体信息
表6.带有内含子的密码子优化的GBA1核苷酸序列
实施例4：带有内含子的嵌合HSRE的体外测试
从上述结果来看，当用不同CHSRE构建时，具有内源GBA1内含子1(Int001，i1)和嵌合内含子(Int011，iC)的构建体在HepG2细胞中显示出更高的GCase表达，因此将这两种内含子克隆到包含CHSRE和mGBA-C110的GCase表达盒中。具有插入在GBA1的SEQ ID NO：21的27bp与28bp之间的Int001的构建体是PG103、PG104、PG105、PG106、PG168、PG107、PG108。具有插入在嵌合HSRE和GBA1编码序列之间的外源嵌合内含子的构建体是PG110、PG111、PG112和PG113、PG169、PG114和PG115。对HepG2和HEK293T细胞进行转染，并收获培养上清液用于测量GCase活性。结果显示，所有这些具有嵌合HSRE与内源内含子1和外源嵌合内含子两者的组合的构建体均在HepG2细胞中高效表达GCase(图4A)。与用作通用表达对照的启动子CRE001驱动的mGBA-C110的PG011构建体相比，所有这些构建体在HEK293T细胞中均显示出非常弱的GCase活性(图4B)。
表7.构建体信息
构建体ID 调控元件ID 内含子ID 内含子位置
PG102 HSRE002 Int001 插入在SEQ ID NO：21的27-28bp之间
PG103 CHSRE005 Int001 插入在SEQ ID NO：21的27-28bp之间
PG104 CHSRE002 Int001 插入在SEQ ID NO：21的27-28bp之间
PG105 CHSRE030 Int001 插入在SEQ ID NO：21的27-28bp之间
PG106 CHSRE027 Int001 插入在SEQ ID NO：21的27-28bp之间
PG107 CHSRE016 Int001 插入在SEQ ID NO：21的27-28bp之间
PG108 CHSRE013 Int001 插入在SEQ ID NO：21的27-28bp之间
PG109 HSRE002 Int011 插入在启动子与GBA1编码序列之间
PG110 CHSRE005 Int011 插入在启动子与GBA1编码序列之间
PG111 CHSRE002 Int011 插入在启动子与GBA1编码序列之间
PG112 CHSRE030 Int011 插入在启动子与GBA1编码序列之间
PG113 CHSRE027 Int011 插入在启动子与GBA1编码序列之间
PG114 CHSRE016 Int011 插入在启动子与GBA1编码序列之间
PG115 CHSRE013 Int011 插入在启动子与GBA1编码序列之间
PG168 HSRE005 Int001 插入在SEQ ID NO：21的27-28bp之间
PG169 HSRE005 Int011 插入在启动子与GBA1编码序列之间
实施例5：
在野生型小鼠中使用AAV8载体的具有嵌合HSRE和内含子的构建体的体内研究
根据上述结果，选择构建体PG102、PG026、PG103、PG104、PG037、PG107、PG108、PG051、PG105和PG106并将其用AAV8进行包装并用于在野生型小鼠中进一步研究。将这些AAV8产物以及如专利WO2020161483A1中所述使用SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：23的序列组合构建的参比产品PG127以2E12 vg/kg的剂量注射到野生型小鼠中(图5)。在本研究中还包括缓冲液对照组和酶替代疗法(伊米苷酶)组。结果显示，所有这些AAV8产物均有效提高血清、肝脏、脾和肺中的GCase活性。血清中的酶活性结果与不同组织裂解物中的结果高度一致。大多数AAV8产物PG102、PG026、PG103、PG104、PG037、PG107、PG108、PG051、PG105和PG106组的表现远好于伊米苷酶组或至少与伊米苷酶组相当。
总之，用AAV8包装的具有本文描述的HSREs或嵌合HSREs结合Int001的构建体可将GBA1特异性递送到肝脏，并系统性提高血清和所有其他靶组织中的GCase活性。
实施例6：
AAV8候选物对戈谢病的治疗潜力的体内研究
上述构建体PG011、PG103、PG104、PG107和PG105都带有氨苄青霉素抗性，将它们均用卡那霉素代替并重命名为PG117、PG118、PG119、PG120、PG121和PG122。为了研究这些AAV8候选物用于针对戈谢病的基因疗法的长期治疗效果，将PG119、PG120、PG121和PG122的使用CHSRE驱动的mGBAi1-C110的构建体、PG118的使用CHSRE驱动的GBAi1-C110的构建体以及PG117的使用CRE001驱动的mGBA-C110的构建体包装成AAV8。将这些AAV8候选物以及野生型GBA1对照PG001和作为参比产品的PG127以2E12 vg/kg的剂量通过尾静脉注射施用到戈谢病小鼠中，并进行12周的治疗研究。在本研究中还包括一些对照组，包括野生型对照缓冲液对照和酶替代疗法(伊米苷酶)组。在注射后的间隔时间点(第1、2、4、6、8和12周)监测血清酶活性和葡萄糖鞘氨醇积累。根据所述结果，所有AAV8注射组在血清中均显示出高且稳定的GCase活性。与缓冲液对照组、伊米苷酶组和PG127参比产品相比，PG117、PG118、PG119、PG120、PG121和PG122显示出更高的GCase活性(图6A)。在注射AAV8产物后，血清中的葡萄糖鞘氨醇水平迅速降低。在注射后8周后，PG117、PG118、PG119、PG120、PG121和PG122的AAV8候选物将葡萄糖鞘氨醇水平降低至接近野生型小鼠的水平(图6B)。
在研究结束时收集组织样品，用于GCase酶活性和葡萄糖鞘氨醇分析。对于所有注射AAV的组，肝脏、肺和脾中的GCase酶活性提高。与上述血清中的结果相一致，与伊米苷酶组和PG127参比产品组相比，PG117、PG118、PG119、PG120、PG121和PG122的AAV8产物组在所有测试的组织中显示出更高的GCase活性和更低的葡萄糖鞘氨醇积累(图7和图8)。
总之，证明了PG117、PG118、PG119、PG120、PG121和PG122的AAV8产物是针对戈谢病的有希望的治疗候选物，并且表现优于现有的伊米苷酶疗法。
表8.构建体信息
实施例7：
在野生型小鼠中使用AAV9载体的具有内含子的构建体的体内研究
与AAV8产物相同，为了进一步提高表达GCase的AAV9产品的治疗潜力，将Int001、Int002、Int005或Int001与Int005组合的内源GBA1内含子插入到mGBA-C110的表达盒中通用启动子CRE001之后，得到mGBAi1-C110(PG123)、mGBAi2-C110(PG124)、mGBAi5-C110(PG125)和mGBAi1i5-C110(PG126)。将PG001、PG123、PG124、PG125和PG126的构建体包装成AAV9，并在野生型小鼠中进行体内评估。将这些AAV9产物与如专利US10837028B2中所述使用SEQ ID NO：1的序列(149bp-3806bp)构建的PG128的参比产品一起，通过尾静脉注射以2E12 vg/kg的剂量注射到野生型小鼠中。在本研究中还包括缓冲液对照组和酶替代疗法(伊米苷酶)组。与缓冲液对照、PG001和PG128的参比产物组相比，PG123、PG124、PG125和PG126的AAV9产物在血清和组织裂解物两者中显示出更高的GCase活性。在所有组中，来自血清和不同组织裂解物的GCase活性高度一致(图9)。因此，新设计的AAV9产物的候选物提高了血清和组织两者中的GCase活性，表明了它们对戈谢病以及帕金森病和阿尔茨海默病具有优越的治疗潜力。AAV9可以跨过血脑屏障并将GBA1基因高效递送到CNS以实现GCase的表达，这具有缓解神经症状并有益于II型和III型戈谢病以及帕金森病和阿尔茨海默病的潜力。

Claims (18)

1.一种表达构建体，其包含与感兴趣的多核苷酸序列可操作连接的转录调控元件，其中所述表达构建体包含启动子和增强子，所述增强子位于所述启动子的上游，
其中所述表达构建体以5’至3’方向包含下述元件：
a)增强子3，所述增强子3是任选的；
b)增强子2；
c)增强子1；和
d)启动子；
所述增强子1包含含有选自由SEQ ID NO：13和15以及与SEQ ID NO：13和15具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％同一性的序列组成的组中的至少一个的序列的全部或部分，所述序列的全部或部分保留了增强子的功能，并且
所述增强子2包含含有选自SEQ ID NO：8-11和13以及与SEQ ID NO：8-11和13具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％同一性的序列中的至少一个的序列的全部或部分，所述序列的全部或部分保留了增强子的功能。
2.根据权利要求1所述的表达构建体，其中所述增强子3包含含有选自由SEQ ID NO：8-11以及与SEQ ID NO：8-11具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％同一性的序列组成的组中的至少一个的序列的全部或部分，所述序列的全部或部分保留了增强子的功能。
3.根据权利要求1所述的表达构建体，其中所述启动子包含选自由SEQ ID NO：2-6以及与SEQ ID NO：2-6具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％同一性的序列组成的组中的序列的全部或部分，所述序列的全部或部分保留了启动子的功能。
4.根据权利要求3所述的表达构建体，其中所述启动子包含选自由SEQ ID NO：3-6以及与SEQ ID NO：3-6具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％同一性的序列组成的组中的序列的全部或部分，所述序列的全部或部分保留了启动子的功能。
5.根据权利要求1所述的表达构建体，其中所述增强子1包含含有选自由SEQ ID NO：13和15以及与SEQ ID NO：13和15具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％同一性的序列组成的组中的至少一个的序列的全部或部分，所述序列的全部或部分保留了增强子的功能；
所述增强子2包含含有选自由SEQ ID NO：8-9以及与SEQ ID NO：8-9具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％同一性的序列组成的组中的至少一个的序列的全部或部分，所述序列的全部或部分保留了增强子的功能。
6.根据权利要求5所述的表达构建体，其中所述增强子1包含含有选自由SEQ ID NO：13和15以及与SEQ ID NO：13和15具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％同一性的序列组成的组中的至少一个的序列的全部或部分，所述序列的全部或部分保留了增强子的功能；
所述增强子2包含含有SEQ ID NO：8以及与SEQ ID NO：8具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％同一性的序列的全部或部分，所述序列的全部或部分保留了增强子的功能。
7.根据权利要求1所述的表达构建体，其中所述表达构建体进一步包含非翻译内含子区。
8.根据权利要求7所述的表达构建体，其中所述非翻译内含子区包含选自由SEQ IDNO：24-43以及与SEQ ID NO：24-43具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％同一性的序列组成的组中的序列的全部或部分。
9.根据权利要求7所述的表达构建体，其中所述非翻译内含子区可操作连接到所述感兴趣的多核苷酸序列的5’端。
10.根据权利要求7所述的表达构建体，其中所述非翻译内含子区位于所述感兴趣的多核苷酸序列的5’与3’端之间。
11.一种载体，其包含权利要求1-10中任一项所述的表达构建体。
12.根据权利要求11所述的载体，其中所述载体是病毒载体，优选AAV载体。
13.根据权利要求12所述的载体，其中所述载体进一步包含位于所述表达构建体侧翼的两个腺相关病毒反向末端重复(ITR)序列，优选地进一步包含多聚A序列。
14.一种腺相关病毒(AAV)，其包含根据权利要求11-13中任一项所述的载体和衣壳蛋白。
15.根据权利要求14所述的AAV，其中
所述AAV选自由血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAVrh10、AAVhu37或从人类或非人哺乳动物分离的AAV血清型中的任一者或其变体组成的组。
16.一种组合物，其包含：
根据前述权利要求中任一项所述的多核苷酸、表达构建体、载体或AAV以及药学上可接受的赋形剂。
17.根据权利要求1-10中任一项所述的表达构建体、根据权利要求11-13中任一项所述的载体、根据权利要求14-15中任一项所述的AAV或根据权利要求16所述的组合物在制备用于在受试者中治疗疾病或病症的药物中的用途。
18.根据权利要求17所述的用途，其中
治疗包括向受试者施用有效量的根据权利要求1-10中任一项所述的表达构建体、根据权利要求11-13中任一项所述的载体、根据权利要求14-15中任一项所述的AAV或根据权利要求16所述的组合物。
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