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CN118685490A - 一种稳定、抗干扰能力强的单胺氧化酶试剂盒及制备方法 - Google Patents

一种稳定、抗干扰能力强的单胺氧化酶试剂盒及制备方法 Download PDF

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CN118685490A CN202410776367.6A CN202410776367A CN118685490A CN 118685490 A CN118685490 A CN 118685490A CN 202410776367 A CN202410776367 A CN 202410776367A CN 118685490 A CN118685490 A CN 118685490A
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俸小雄
叶志杰
黄艳妮
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Urit Medical Electronic Co Ltd
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    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
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    • G01N2333/90605Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • G01N2333/90633Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with oxygen as acceptor (1.4.3) in general
    • G01N2333/90638Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with oxygen as acceptor (1.4.3) in general with a definite EC number (1.4.3.-)

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Abstract

本发明涉及医学检测技术领域,具体涉及一种稳定、抗干扰能力强的单胺氧化酶试剂盒及制备方法,本发明选用的激活剂在低金属离子干扰体系下,通过特定非离子性表面活性剂辅助实现加速前期反应,使脂类、NH3等内源性物质在反应延时期除去,消除样本中内源性干扰物质对测试的干扰,提升试剂测试结果的准确性和特异性;选用的稳定剂和胺类化合物组合,降低试剂吸收二氧化碳的吸收能力,提升试剂的效期稳定性、开瓶稳定性;还原型辅酶实现试剂空白吸光度实现长时间稳定状态,提升试剂的效期稳定性,从而解决了现有的单胺氧化酶试剂盒效期稳定性较差的问题。

Description

一种稳定、抗干扰能力强的单胺氧化酶试剂盒及制备方法
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域,尤其涉及一种稳定、抗干扰能力强的单胺氧化酶试剂盒及制备方法。
背景技术
单胺氧化酶是一个线粒体酶家族,催化氧化单胺的脱氨作用。单胺氧化酶实验室检测方法可分为荧光法、分光光度法和免疫抑制法,目前常用方法为分光光度法包括以下几种:醛苯腙比色法,该方法通过MAO氧化苄胺,再与2,4二硝基苯肼作用生成的醛苯腙在碱性条件下产生棕红色,于470nm比色测定,计算MAO的浓度。MCDP比色法,该法是通过MAO氧化苄胺产生过氧化氢,过氧化氢在过氧化物酶存在下与MCDP作用生成有色的甲烯蓝,于660nm处比色测定,计算MAO的浓度。此法需要加入终止液后测定,不宜于大批量标本的检测,而且MCDP见光易分解。连速监测法,该方法是通过MAO催化苄胺生成氨,氨在α-酮戊二酸、NADH(或NADPH)和GLDH的存在下生成谷氨酸,同时NADH(或NADPH)还原成NAD+(或NADP+),引起340nm处吸光度的下降,通过监测其下降的速率即可得出样本中MAO的活性。连续监测法具有方法快捷、操作简单、适合自动化分析的优势,可减少人为误差,具有良好的准确度与精密度,适合大多数临床实验室应用。
现有技术中专利号公开为101498662A的《单胺氧化酶MAO单试剂测定试剂盒》专利,阐述了一种在反应体系中偶联一个再生系统酶、底物和辅酶组成的再生酶循环系统,确保试剂的稳定性及临床测值的准确性,但未提及如何消除血清内源性干扰物质(如血氨)影响的方法。申请公开号为CN117551738A《一种单胺氧化酶的检测试剂及制备方法、试剂盒》的专利阐述了将单胺氧化酶单试剂做成双试剂,并在第一试剂包括血氨清除剂、第一螯合剂、金属盐、第一表面活性剂和保护剂的一种单胺氧化酶检测试剂,并没有一步法解决血氨的干扰效果,采用双试剂的剂型反应时间更长,占据了更多的试剂舱位。
现有技术的缺点:
(1)试剂空白稳定性:还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶I)自身在弱碱性环境会缓慢水解,导致试剂空白吸光度下降从而导致试剂整体稳定性差。
(2)试剂抗干扰性能差:较高浓度的抗坏血酸、血氨等内源性物质对反应干扰很大,导致测试结果异常,容易导致临床结果的误判。
(3)试剂灵敏度低和测试结果不稳定:为了提高试剂的抗干扰能力,往往需要加入较多的氨清除剂,但这些物质导致酶的脱氨反应受抑制,造成测试结果不稳定和灵敏度的降低。
(4)开瓶稳定性不理想:现有技术都采用苄胺为反应底物,苄胺为碱性,有较强的二氧化碳吸收能力,导致试剂的在仓开瓶稳定性较差;同时苄胺为无色至淡琥珀色液体,具有具强刺激性气味,对眼睛、粘膜、呼吸道及皮肤有强烈刺激作用,对试剂生产人员、实验室操作人员有一定的化学危害。
发明内容
本发明的目的在于提供一种稳定、抗干扰能力强的单胺氧化酶试剂盒及制备方法,旨在解决现有的单胺氧化酶试剂盒效期稳定性较差的问题。
为实现上述目的,第一方面,本发明提供了一种稳定、抗干扰能力强的单胺氧化酶试剂盒制备方法,包括以下步骤:
称取80~200mmol/LpH7.0~9.0缓冲液、0.1~2g/L激活剂、5~20mmol/La一酮戊二酸、NADH再生酶循环系统、0.5~2g/L稳定剂、0.5~5g/L表面活性剂、2~5g/L金属络合剂、5~20mmol/L胺类化合物和防腐剂放入盛有80%水的容器内搅拌10min后得到第一溶液,使用调节剂将所述第一溶液调节至pH8.3±0.05范围内;
称取0.25mmol/L的还原型辅酶I、1KU/L的谷氨酸脱氢酶和0.35U/L的羟丁酸脱氢酶加入所述第一溶液中,搅拌至完全溶解,得到第二溶液;
将预设配制量的纯化水放入所述第二溶液中搅拌均匀并静置平衡后用尼龙滤膜过滤不溶物,得到单胺氧化酶试剂盒。
其中,所述缓冲液为pH稳定范围在7.0~9.0之间的三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCL)缓冲液和GOOD’S生物缓冲液,所述GOOD’S生物缓冲液包括N,N—二(2—羟乙基)甘氨酸、3—[(1,1—二甲基—2—羟乙基)氨基]—2—羟基丙磺酸、N—tris(羟甲基)甲基—3—氨基丙磺酸中任意一种。
其中,所述稳定剂为牛血清白蛋白、酪蛋白、海藻糖和甘露醇中的任意一种或任意两者混合物。
其中,所述胺类化合物为盐酸苄胺和酪氨。
其中,所述激活剂为葡聚糖T-500和还原型谷胱甘肽中任意一种或任意两者混合物。
其中,所述表面活性剂为聚乙二醇单烷基醚和丙二醇嵌段聚醚中任意一种或两者混合物
其中,所述金属络合剂为乙二胺四乙酸钠盐和二乙烯基三胺基五乙酸中任意一种或两者混合物。
其中,所述防腐剂为叠氮化钠、甲基氯异噻唑啉酮和甲基异噻唑啉酮中任意一种或任意两者混合物。
第二方面,一种稳定、抗干扰能力强的单胺氧化酶试剂盒,采用第一方面所述的一种稳定、抗干扰能力强的单胺氧化酶试剂盒制备方法制备,
包括第一溶剂和第二溶剂。
本发明的一种稳定、抗干扰能力强的单胺氧化酶试剂盒制备方法,称取80~200mmol/LpH7.0~9.0缓冲液、0.1~2g/L激活剂、5~20mmol/La一酮戊二酸、NADH再生酶循环系统、0.5~2g/L稳定剂、0.5~5g/L表面活性剂、2~5g/L金属络合剂、5~20mmol/L胺类化合物和防腐剂放入盛有80%水的容器内搅拌10min后得到第一溶液,使用调节剂将所述第一溶液调节至pH8.3±0.05范围内;称取0.25mmol/L的还原型辅酶I、1KU/L的谷氨酸脱氢酶和0.35U/L的羟丁酸脱氢酶加入所述第一溶液中,搅拌至完全溶解,得到第二溶液;将预设配制量的纯化水放入所述第二溶液中搅拌均匀并静置平衡后用尼龙滤膜过滤不溶物,得到单胺氧化酶试剂盒。本发明选用的激活剂在低金属离子干扰体系下,通过特定非离子性表面活性剂辅助实现加速前期反应,使脂类、NH3等内源性物质在反应延时期除去,消除样本中内源性干扰物质对测试的干扰,提升试剂测试结果的准确性和特异性;选用的稳定剂和胺类化合物组合,降低试剂吸收二氧化碳的吸收能力,提升试剂的效期稳定性、开瓶稳定性;由于还原型辅酶I在弱碱性环境下,容易缓慢水解导致试剂空白吸光度下降,选用的NADH再生酶循环系统可以在NADH氧化后产生的NAD+经酶循环反应重新生成NADH,循环补充试剂中NADH,从而实现试剂空白吸光度实现长时间稳定状态,提升试剂的效期稳定性,从而解决了现有的单胺氧化酶试剂盒效期稳定性较差的问题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明提供的一种稳定、抗干扰能力强的单胺氧化酶试剂盒制备方法的流程图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例,所述实施例的示例在附图中示出,其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的,旨在用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
请参阅图1,第一方面,本发明提供一种稳定、抗干扰能力强的单胺氧化酶试剂盒及制备方法,包括以下步骤:
S1称取80~200mmol/LpH7.0~9.0缓冲液、0.1~2g/L激活剂、5~20mmol/La一酮戊二酸、NADH再生酶循环系统、0.5~2g/L稳定剂、0.5~5g/L表面活性剂、2~5g/L金属络合剂、5~20mmol/L胺类化合物和防腐剂放入盛有80%水的容器内搅拌10min后得到第一溶液,使用调节剂将所述第一溶液调节至pH8.3±0.05范围内;
所述缓冲液为pH稳定范围在7.0~9.0之间的三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCL)缓冲液和GOOD’S生物缓冲液,所述GOOD’S生物缓冲液包括N,N—二(2—羟乙基)甘氨酸、3—[(1,1—二甲基—2—羟乙基)氨基]—2—羟基丙磺酸、N—tris(羟甲基)甲基—3—氨基丙磺酸中任意一种。
所述稳定剂为牛血清白蛋白、酪蛋白、海藻糖和甘露醇中的任意一种或任意两者混合物。
所述胺类化合物为盐酸苄胺、酪氨或其衍生物。
所述激活剂为葡聚糖T-500和还原型谷胱甘肽中任意一种或任意两者混合物。
所述表面活性剂为聚乙二醇单烷基醚和丙二醇嵌段聚醚中任意一种或两者混合物
所述金属络合剂为乙二胺四乙酸钠盐和二乙烯基三胺基五乙酸中任意一种或两者混合物。
所述防腐剂为叠氮化钠、甲基氯异噻唑啉酮和甲基异噻唑啉酮中任意一种或任意两者混合物。
所述的NADH再生酶循环系统为葡萄糖-葡萄糖脱氢酶-还原型辅酶I、葡萄糖6磷酸-葡萄糖6磷酸脱氢酶--还原型辅酶I、羟丁酸-羟丁酸脱氢酶-还原型辅酶I中任意一种系统
具体的,混合容器中加入试剂配制总量约80%的纯化水,分别准确称取并依次搅拌溶解全批量的Tris、乙二胺四乙酸二钠、葡聚糖T500、β-羟丁酸、牛血清白蛋白、谷胱甘肽、丙二醇嵌段聚醚F68、乳化剂TO-9、腺苷-5-二磷酸钾盐、a一酮戊二酸、盐酸苄胺、ProClin300到混合容器中,完全溶解后继续搅拌10分钟,用6mol/L盐酸溶液或10mol/L氢氧化钠溶液调节至pH8.3±0.05范围内。
S2称取0.25mmol/L的还原型辅酶I、1KU/L的谷氨酸脱氢酶和0.35U/L的羟丁酸脱氢酶加入所述第一溶液中,搅拌至完全溶解,得到第二溶液;
具体的,准确称取和加入全批量还原型辅酶I、谷氨酸脱氢酶、羟丁酸脱氢酶,缓慢搅拌10分钟至完全溶解,此过程避免剧烈搅拌和磁力搅拌器使用。
S3将预设配制量的纯化水放入所述第二溶液中搅拌均匀并静置平衡后用尼龙滤膜过滤不溶物,得到单胺氧化酶试剂盒。
具体的,用纯化水定量至配制量,搅拌均匀,待溶液静置平衡30分钟,用0.8微米孔径尼龙滤膜过滤不溶物即可。
实施例1
pH值为8.3的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCL)缓冲液200mmol/L
实施例2
以实施案例一为例阐述单胺氧化酶测定试剂制备方法:
(1)混合容器中加入试剂配制总量约80%的纯化水,分别准确称取并依次搅拌溶解全批量的Tris、乙二胺四乙酸二钠、葡聚糖T500、β-羟丁酸、牛血清白蛋白、谷胱甘肽、丙二醇嵌段聚醚F68、乳化剂TO-9、腺苷-5-二磷酸钾盐、a一酮戊二酸、盐酸苄胺、ProClin300到混合容器中,完全溶解后继续搅拌10分钟,用6mol/L盐酸溶液或10mol/L氢氧化钠溶液调节至pH8.3±0.05范围内。
(2)准确称取和加入全批量还原型辅酶I、谷氨酸脱氢酶、羟丁酸脱氢酶,缓慢搅拌10分钟至完全溶解,此过程避免剧烈搅拌和磁力搅拌器使用。
(3)用纯化水定量至配制量,搅拌均匀,待溶液静置平衡30分钟,用0.8微米孔径尼龙滤膜过滤不溶物即可。
检验原理:
苄胺在单胺氧化酶(MAO)的作用下,生成氨,生成的氨在GLDH作用下与α-酮戊二酸和辅酶反应。通过测定辅酶吸光度下降的变化率测定血清样本中单胺氧化酶的活性。
本发明试剂可采用手工测试方法,也可以通过全自动生化分析仪等分析仪器对样本进行检测,具体测试方法如下:
表1单胺氧化酶测定试剂测试参数表
计算方法:
其中为了保证测试结果可靠性,要求在检测前需通过MAO标准品或标准血清对试剂进行校准。
实例案例3:MAO试剂抗干扰性能验证
试剂抗干扰性试验,使用添加法测试试剂的抗干扰能力,分别测试含有抗坏血酸、胆红素、血红蛋白、氨不同浓度的样品,按干扰浓度标示量的10倍配制干扰物质浓缩液,从中吸取1份浓缩液,并加入9份样本血清混合均匀,对照样本以相同体积的生理盐水代替干扰物浓缩液,每个样本测试3遍,计算平均值的相对偏差。结果判定:与空白对照测试结果相对偏差不超过±10%即为不产生干扰。
抗干扰试验结果表明若样本中含有以下浓度的干扰物,对检测结果无影响:氨<60μmol/L、血红蛋白<1g/L、抗坏血酸<50mg/dL、胆红素<40mg/dL。
表2试剂抗干扰验证
实例案例4MAO试剂稳定性性能验证
(1)将实施例1的单胺氧化酶测定试剂在2℃~8℃处保存,在0个月、4个月、8个月、12个月、13个月、14个月,进行试剂空白吸光度、分析灵敏度和准确度(相对偏差)性能验证;
(2)将实施例1的单胺氧化酶测定试剂模拟医院检验科的操作模式,每天上班后开瓶放置试剂盘中,下班后2℃~8℃冰箱存放,连续第0天、第7天、第14天、第21天、第28天、第30天、第32天,进行试剂空白吸光度、分析灵敏度和准确度(相对偏差)性能验证;
(3)将实施例1的单胺氧化酶测定试剂以台式恒温振荡器模拟运输交通工具,在37℃环境下,每天以200rpm的转速颠簸4小时,连续3天,进行试剂空白吸光度、分析灵敏度和准确度(相对偏差)性能验证。
1、空白吸光度:用纯化水作为样本加入单胺氧化酶试剂测试时,空白吸光度应>0.8(温度37℃、波长340nm、光径10mm)。
表3-1MAO测定试剂空白吸光度验证
2、分析灵敏度:用MAO试剂测试单胺氧化酶浓度为60U/L±20U/L的血清样本,记录试剂在规定参数下产生的吸光度改变,计算的吸光度变化率(ΔA/min)≥0.02。
3、表3-2MAO测定试剂分析灵敏度验证
4、准确度:用单胺氧化酶试剂测试靶值为18.9U/L质控品,平行测试3次后计算结果的平均值以及平均值与靶值的相对偏差,其结果应符合相对偏差不超过靶值的±10%。
表3-2MAO测定试剂准确度验证
第二方面,一种稳定、抗干扰能力强的单胺氧化酶试剂盒,采用第一方面所述的一种稳定、抗干扰能力强的单胺氧化酶试剂盒制备方法制备,
包括第一溶剂和第二溶剂。
有益效果:
1、本发明选用的激活剂在低金属离子干扰体系下,通过特定非离子性表面活性剂辅助实现加速前期反应,使脂类、NH3等内源性物质在反应延时期除去,消除样本中内源性干扰物质对测试的干扰,提升试剂测试结果的准确性和特异性;
2、本发明选用的稳定剂和胺类化合物组合,降低试剂吸收二氧化碳的吸收能力,提升试剂的效期稳定性、开瓶稳定性;
3、由于还原型辅酶I(NADH)在弱碱性环境下,容易缓慢水解导致试剂空白吸光度下降,选用的NADH再生酶循环系统可以在NADH氧化后产生的NAD+经酶循环反应重新生成NADH,循环补充试剂中NADH,从而实现试剂空白吸光度实现长时间稳定状态,提升试剂的效期稳定性。
以上所揭露的仅为本发明一种稳定、抗干扰能力强的单胺氧化酶试剂盒及制备方法较佳实施例而已,当然不能以此来限定本发明之权利范围,本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程,并依本发明权利要求所作的等同变化,仍属于发明所涵盖的范围。

Claims (9)

1.一种稳定、抗干扰能力强的单胺氧化酶试剂盒制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
称取80~200mmol/LpH7.0~9.0缓冲液、0.1~2g/L激活剂、5~20mmol/La一酮戊二酸、NADH再生酶循环系统、0.5~2g/L稳定剂、0.5~5g/L表面活性剂、2~5g/L金属络合剂、5~20mmol/L胺类化合物和防腐剂放入盛有80%水的容器内搅拌10min后得到第一溶液,使用调节剂将所述第一溶液调节至pH8.3±0.05范围内;
称取0.25mmol/L的还原型辅酶I、1KU/L的谷氨酸脱氢酶和0.35U/L的羟丁酸脱氢酶加入所述第一溶液中,搅拌至完全溶解,得到第二溶液;
将预设配制量的纯化水放入所述第二溶液中搅拌均匀并静置平衡后用尼龙滤膜过滤不溶物,得到单胺氧化酶试剂盒。
2.如权利要求1所述的一种稳定、抗干扰能力强的单胺氧化酶试剂盒制备方法,其特征在于,
所述缓冲液为pH稳定范围在7.0~9.0之间的三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCL)缓冲液和GOOD’S生物缓冲液,所述GOOD’S生物缓冲液包括N,N—二(2—羟乙基)甘氨酸、3—[(1,1—二甲基—2—羟乙基)氨基]—2—羟基丙磺酸、N—tris(羟甲基)甲基—3—氨基丙磺酸中任意一种。
3.如权利要求1所述的一种稳定、抗干扰能力强的单胺氧化酶试剂盒制备方法,其特征在于,
所述稳定剂为牛血清白蛋白、酪蛋白、海藻糖和甘露醇中的任意一种或任意两者混合物。
4.如权利要求1所述的一种稳定、抗干扰能力强的单胺氧化酶试剂盒制备方法,其特征在于,
所述胺类化合物为盐酸苄胺和酪氨。
5.如权利要求1所述的一种稳定、抗干扰能力强的单胺氧化酶试剂盒制备方法,其特征在于,
所述激活剂为葡聚糖T-500和还原型谷胱甘肽中任意一种或任意两者混合物。
6.如权利要求1所述的一种稳定、抗干扰能力强的单胺氧化酶试剂盒制备方法,其特征在于,
所述表面活性剂为聚乙二醇单烷基醚和丙二醇嵌段聚醚中任意一种或两者混合物。
7.如权利要求1所述的一种稳定、抗干扰能力强的单胺氧化酶试剂盒制备方法,其特征在于,
所述金属络合剂为乙二胺四乙酸钠盐和二乙烯基三胺基五乙酸中任意一种或两者混合物。
8.如权利要求1所述的一种稳定、抗干扰能力强的单胺氧化酶试剂盒制备方法,其特征在于,
所述防腐剂为叠氮化钠、甲基氯异噻唑啉酮和甲基异噻唑啉酮中任意一种或任意两者混合物。
9.一种稳定、抗干扰能力强的单胺氧化酶试剂盒,采用权利要求1所述的一种稳定、抗干扰能力强的单胺氧化酶试剂盒制备方法制备,其特征在于,
包括第一溶剂和第二溶剂。
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