CN118685353B - 一种人脐带高活性间充质干细胞及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人脐带高活性间充质干细胞及其制备方法和应用。用含5% CloneR的TeSR‑E8以及LN521‑Coated培养瓶，从人脐带组织中分离出HA‑MSC，建立HA‑MSC分离、扩增、冻存技术体系。比起其它分离方式，更加简单易行，组织离体后到进入培养箱的时间较短，很大程度上保持了细胞活性。建立的原代培养方式使组织内原始细胞或多能性强的细胞从原代就分选出来，并能稳定的传代和保存，为后续的扩增提供了先决条件。本发明制备的HA‑MSC与常规培养的MSC相比，增殖活性较高，体积较小，核质比较高，高表达胚胎干细胞相关标志性抗原SOX2、Nanog、OCT4，具有向三胚层来源的神经、心肌和肝肠祖细胞分化的潜能。
Description
技术领域
本发明涉及人脐带干细胞技术领域，特别涉及一种人脐带高活性间充质干细胞及其制备方法和应用。
背景技术
间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell，MSC）是一群具有自我更新和分化能力的成体多能干细胞。MSC可以从几乎所有的人体组织中获得，例如脂肪、牙髓、经血、胎盘、羊水、脐带和滑液等。MSC具有免疫调节功能，并分泌细胞因子和免疫受体，调节宿主组织中的微环境，已验证在心血管疾病、自身免疫性疾病、血管缺血、组织损伤以及各种退行性疾病中的巨大的治疗潜力，因此MSC细胞本身及其分泌物在疾病预防和治疗中均有广泛的应用前景。而鉴于其分泌的多种生物活性物质在细胞/柱子修复、炎症控制等方面的功能，MSC及其分泌物也被用于制备化妆品和保健品。
由于MSC形态和功能上的异质性削弱了其治疗效果，所以在临床评估有效性和机制研究时引入差异，这可能部分解释了为什么基于MSC的临床试验的数据在很大程度上不一致。为解决异质性带来的疗效差异，已有报道从不同组织来源的MSC分离更多能的、更原始的MSC亚群，尽管这些亚群具有高增殖性和分化潜能，但是否能保持多谱系的分化能力，类似于胚胎干细胞可塑性仍有待确定。
已有报道的高潜能MSC亚群分离方式有基于物理方式的分离，根据对胰蛋白酶的反应，分离出耐胰蛋白酶作用的多向分化耐压的细胞，也有根据免疫表型的分离，通过流式细胞仪分离出多能性表面标记分子的细胞亚型，或者引入外源基因进行细胞重编辑，这些分离方法都较为繁琐，细胞活性不高，得率较低，很难得到后续疗效研究的细胞治疗量，安全性难于保障，且大部分培养体系均含有动物源血清，不适于临床转化运用。
发明内容
本发明的目的是提供一种人脐带高活性MSC及其制备方法和应用，用一种简单的分离方式，以及一种适宜于临床转化应用的培养条件，无需引入外源基因，在无动物源血清的简化版培养体系中，从脐带组织中选择性分离出一个细胞群，该细胞群能稳定大规模扩增，在保持低端粒酶活性的同时展现出较高的增殖活性和多能性，可以跨胚层分化为外胚层及中胚层谱系的细胞。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种人脐带高活性MSC的制备方法，包括以下步骤：
S1、试剂制备；
S2、原代培养；
S3、传代培养。
优选地，还包括S4、高活性MSC冻存。
进一步优选地，S1包括：
S11、高活性MSC完全培养基的配制：在TeSR-E8 Basal Medium中加入TeSR-E8Supplement，颠倒混匀后再加入CloneR，用6.6%NaHCO3调节PH值范围在7.2-7.4，4℃储存备用；
S12、高活性MSC培养瓶的制作：2-8℃缓慢解冻层粘连蛋白LN521原液，用1×DPBS（Ca2+/Mg2+）稀释层粘连蛋白LN521原液，即为包被液，培养瓶中加入包被液，使之均匀覆盖整个瓶底，置于2-8℃孵育备用；
进一步优选地，S2包括：
S21、将采集的人脐带清洗去掉残留的血液；
S22、将脐带分解为小组织块，转移至高活性MSC培养瓶中；
S23、高活性MSC培养瓶加入高活性MSC完全培养基，缓慢晃动瓶身，置于37℃、5%CO2的培养箱中进行原代培养；
S24、第3天补充高活性MSC完全培养基，之后每隔3-4天换液
S25、传代时，收集脱落组织块，按照以上方式可以进行二次贴壁培养；
进一步优选地，S3包括：
S31、从培养箱取出细胞，丢弃陈旧培养基，加入生理盐水轻轻冲洗1次；
S32、原代高活性MSC加入Recombinant Trypsin-EDTA Solution，置于37℃、5%CO2的培养箱中作用3-5mins；
S33、细胞完全脱落后，加入等量高活性MSC完全培养基终止消化，收集细胞加入生理盐水，1500rpm离心4mins；
S34、离心后弃上清，加入高活性MSC完全培养基，轻轻吹打混匀细胞，台盼蓝染色计数活细胞数量；
S35、按照5000个细胞/cm2的接种密度将细胞接种至新的高活性MSC培养瓶；
S36、置于37℃、5%CO2的培养箱中进行扩增培养；
进一步优选地，S4包括：
选择对数生长期的高活性MSC用Recombinant Trypsin-EDTA Solution消化，待细胞回缩变圆后，加入高活性MSC完全培养基终止，1500rpm离心4mins后，弃上清，轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管中，把装有细胞的冻存管放入程序性降温盒置于－80℃冰箱中，4h后置于-196℃液氮罐中保存待用。
进一步优选地，步骤S11中，TeSR-E8 Basal Medium、TeSR-E8 Supplement、CloneR的比例为24:1:1。
进一步优选地，步骤S12中，层粘连蛋白LN521原液稀释至5μg/ml。
进一步优选地，步骤S21中，人脐带用含100u/ml双抗的生理盐水反复冲洗。
一种上述人脐带高活性MSC的制备方法制得的人脐带高活性MSC。
进一步优选地，上述人脐带高活性MSC具有创面修复、细胞修复、促进组织/细胞再生和分化、调节免疫、抗衰老，等功能。
一种上述人脐带高活性MSC在制备化妆品、保健品、药品中的用途。
进一步优选地，上述人脐带高活性MSC为细胞培养物或冻干粉。
进一步优选地，上述保健品、药品的剂型选自注射剂、口服剂、片剂、胶囊或贴剂。
进一步优选地，上述化妆品中还包括抗氧化剂、稳定剂、乳化剂、可溶化剂、颜料及香料等通常的助剂。
一种上述人脐带高活性MSC在制备预防、改善或治疗衰老的制剂中的用途。
进一步优选地，上述人脐带高活性MSC用于制备预防、改善或治疗皮肤、肝脏、心脏、卵巢、子宫、睾丸、肌肉、神经、肾脏、免疫、代谢的生理和/或病理性衰老/功能减弱，或者全身衰老/功能减弱的药剂。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
其一、改善培养基及配套使用的培养条件，包括TeSR-E8培养基、ClonR、细胞密度以及重组层粘连蛋白涂层，旨在营造一个整体适合于原始细胞的体内生态微环境。在该培养条件中，TeSR-E8培养基不含动物源，蛋白含量低，整个培养条件只添加了一种生长因子ClonR，重组层粘连蛋白涂层的运用维持了细胞的高多能性。在此条件下，采用全组织贴壁的方式进行原代培养，比起其它分离方式，这种方式简单易行，组织离体后到进入培养箱的时间较短，最大程度上提高并保持了非常高的细胞活性。
其二、原代培养方式使组织内原始细胞或多能性强的细胞从原代就分选出来，并能稳定的传代和保存，为后续的扩增提供了先决条件。
其三、高活性MSC与常规培养的MSC相比，增殖活性较高，体积较小，核质比较高，高表达胚胎干细胞相关标志性抗原SOX2、Nanog、OCT4，具有向三胚层来源的神经、心肌和肝肠祖细胞分化的潜能，表明该细胞是高活性MSC中的一种亚全能干细胞。
附图说明
图1是倒置相差显微镜下脐带HA-MSC和MSC的形态（×50）；1A：HA-MSC在第8天、就能看到细胞在组织块周围散在生长，呈短小梭形（红圈）；1B：第12天HA-MSC形成大片集落，集落呈鱼群状排列；1C：MSC在第10天有细胞在组织块周围散在生长，细胞呈长梭形，成纤维细胞样；1D：第15天MSC集落呈漩涡状排列。
图2是倒置相差显微镜下HA-MSC和MSC传代后三个代次的细胞形态（×50）；2A、2B、2C分别为HA-MSC传代后的P3、P6、P9，各代次保持均一的短小细胞形态；2D、2E、2F分别为MSC传代后的P3、P6、P9，随着代次的增高，胞体增大，边缘不规则，部分细胞多边形，胞浆内颗粒增多。
图3是全息活细胞显微镜下48h动态观察P3代HA-MSC和MSC。
图4是HA-MSC和MSC的生长曲线；4A:P3代HA-MSC和MSC生长曲线，呈典型“S”型；4B:P9代HA-MSC生长曲线保持不变，P9代MSC生长曲线趋于平缓，细胞增殖能力降低。
图5是HA-MSC和MSC的群体倍增时间。
图6是HA-MSC透射电镜；6A:Bar=5um；6B: Bar=2um。
图7是MSC透射电镜；7A:Bar=5μm；7B: Bar=2μm。
图8是HA-MSC和MSC的核质比测量；8A、8B、8C为HA-MSC；8D、8E、8F为MSC，8G为统计结果。Bar=5μm。n=3，**P＜0.01。
图9是HA-MSC和MSC的细胞周期；9A、9B分别为HA-MSC和MSC结果。
图10是HA-MSC和MSC表面标志物（CD73、CD105、CD90、 CD34、CD45）表达流式图；10A、10B分别为HA-MSC和MSC结果。
图11是HA-MSC和MSC表面标志物（SSEA-3、 SSEA-4、TRA-1-60）表达流式图；11A，11B分别为HA-MSC和MSC结果。
图12是WB检测HA-MSC和MSC多能性转录因子表达情况。12A、12B分别为WB检测电泳图及其表达统计结果。
图13是HA-MSC和MSC三系分化能力鉴定。
图14是 HA-MSC和MSC外胚层分化标志分子表达鉴定； DAPI定位细胞核，二抗用Cy3标记，显示红色荧光。Bar=20μm。n=3，***P＜0.001， **P＜0.01。14A、14B分别为荧光成像图及分化标志分子表达统计结果。
图15是 HA-MSC和MSC中胚层分化标志分子表达鉴定；DAPI定位细胞核，二抗用Cy3标记，显示红色荧光。Bar=20μm。n=3，***P＜0.001， **P＜0.01。15A、15B分别为荧光成像图及分化标志分子表达统计结果。
图16是 HA-MSC和MSC内胚层分化标志分子表达鉴定；DAPI定位细胞核，二抗用Cy3标记，显示红色荧光。Bar=20μm。n=3，***P＜0.001。16A、16B分别为荧光成像图及分化标志分子表达统计结果。
具体实施方式
下面将结合实施例详细地描述本发明，但在此提供的实施例仅出于说明目的，而并不意欲限制本发明。
术语“HA-MSC”和“高活性MSC”和“高活性间充质干细胞”在全文中可互换使用。
术语“治疗”是指减缓、缓解、改善或减轻至少一种疾病的症状，或在发病后逆转其发作。
术语“预防”指在发病前起作用，以防止形成该疾病或减轻疾病的严重程度或延缓其发展的过程。
本文使用的术语“药剂”指一种产生或能够产生效果的物质，可以包括但不限于化学品、医药品、药物、生物剂、小分子、抗体、核酸、肽类和蛋白质。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
实施例1：人脐带高活性MSC（HA-MSC）的制备方法
1 材料
1.1 人脐带来源
本实验脐带来源于解放军联勤保障部队第九二〇医院妇产科，入选产妇需无传染性疾病、无肿瘤性疾病、无家族遗传病史、胎儿足月无先天性疾病。在征得产妇和家属的同意下签署《脐带采集知情同意书》，于分娩时采集脐带。脐带采集经中国人民解放军联勤保障部队第九二〇医院伦理委员会批准，批件号：2019-036（科）-01。
1.2 主要仪器
| 仪器 | 生产厂家 | 型号 |
| 百级层流超净工作台 | 苏州佳宝净化工程设备公司 | SW-CJ- 2F |
| 培养箱 | 上海力申科学仪器有限公司 | Heal Force-240 |
| 倒置相差显微镜 | 日本Olymus公司 | CKX41 |
| 3D全息活细胞成像系统 | 瑞士NANOLIVE | 3D Explorer |
| 离心机 | 上海安亭仪器厂 | DL-5-B |
| 流式细胞仪 | 美国BD公司 | Canto Ⅱ |
| 4℃冰箱 | 青岛澳柯玛公司 | Aucma SC-1000 |
| -80℃超低温冰箱 | 青岛海尔公司 | DW-86L386 |
| 液氮罐 | 四川西亚公司 | BMT/LNA-200 |
1.3主要试剂
| 名称 | 成产厂家 | 型号/货号 |
| DMEM/F12 | 以色列BI | 01-172-1ACS |
| FBS | 以色列BI | 04-001-1A |
| 0.25%trypsin-EDTA | GIBCO | 2102080 |
| TeSR-E8 Medium | STEMCELL | 05990 |
| CloneR | STEMCELL | 05888 |
| 层粘连蛋白LN 521 | Biolamina | LN521-02 |
| DPBS（Ca2+/Mg2+） | 以色列BI | 02-020-1A |
| Recombinant Trypsin-EDTA Solution | 以色列BI | 03-079-1A |
| NutriFreez™D10 Cryopreservation Medium | 以色列BI | 05-714-1A |
| MTS | Promega | G3580 |
2.实验方法
包括以下步骤：
S1、试剂制备
S1-1、培养基的筛选和配制：
S1-1-1、以DMEM/F12为基础，逐渐丰富培养基组分，如将牛血清改为含人血小板裂解物，将牛血清白蛋白改为人血清白蛋白，逐步将由动物来源的组分改为人来源的组分，从而降低因物种来源差别带来的免疫排斥反应；还有以DMEM/F12为基础彻底摒弃动物来源的成分的做法，即彻底的无动物来源的成分（包括含人体来源），添加有硒等微量元素、维生素、转贴蛋白、胰岛素、碱性成纤维细胞生长因子、以及保持溶液PH稳定的缓冲对、抗氧化剂等物质。尝试了DMEM/F12为基础，添加人血小板裂解物取代FBS，观察到细胞增殖能力保持良好，但体外成骨和成脂能力有所降低，后继续添加转贴蛋白、胰岛素、碱性成纤维细胞生长因子等，观察到细胞形态与原始的干细胞更接近，细胞小而透亮，轮廓清晰，核质比较高，体外三系分化能力保持良好，上述添加物对维持干细胞干性发挥了关键的作用；为防治干细胞单细胞的克隆效率我们还添加了CloneR，观察到低密度的接种密度下细胞仍然保持较好的增殖能力。最终确定如S1-1-2所述HA-MSC完全培养基。
S1-1-2、HA-MSC完全培养基的配制：480ml TeSR-E8 Basal Medium中加入20mlTeSR-E8 Supplement，颠倒混匀后再加入20ml CloneR，用6.6%NaHCO3调节PH值范围在7.2-7.4，4℃冰箱储存备用。
S1-2、培养环境的优化
S1-2-1、包被液优化筛选：从如何营造一个干细胞生长的原始微环境出发，我们考虑到对2维空间进行优化处理，由原来的使用血清和或小鼠胚胎成纤维细胞滋养层，改为使用明胶、Matrigel、LN521对培养瓶进行了前期的预处理，进过反复的实验摸索，发现明胶包被后原代细胞分离时很少见到有生长，首先排除了明胶包被处理的方案，针对Matrigel和LN521细胞外基质进行了研究，发现两者均可对我们分离的细胞保持相对原始的一种细胞状态。最终确定如S1-2-2中的包被液及培养瓶处理方法。
S1-2-2、HA-MSC培养瓶的包被液：2-8℃缓慢解冻层粘连蛋白LN 521原液，用1×DPBS（Ca2+/Mg2+）稀释层粘连蛋白LN521原液至5μg/ml，即为STSC包被液。每T75cm2中加入5ml包被液，使之均匀覆盖整个瓶底，置于2-8℃孵育过夜备用，瓶子记为LN521-CoatedT75cm2。
S2、人脐带HA-MSC的原代培养
S2-1、在超净工作台中，将采集的人脐带用含100u/ml双抗的生理盐水反复冲洗，去掉残留的血液后置于10cm培养皿中。
S2-2、先用组织剪将脐带分解为1mm3的组织块，每个小组织块转移至一个1.5mlEP管内，用虹膜剪将EP管内的组织分离直至糊状后转移至LN521-Coated T75cm2培养瓶中。
S2-3、每瓶加入3mlHA-MSC完全培养液后，缓慢晃动瓶身，使微组织块均匀分散，瓶子上注明培养时间，细胞名称和代次后置于37℃、5%CO2的培养箱中进行原代培养。
S2-4、第3天补充完全培养液3ml，之后每隔3-4天换液，倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。换液时移液管轻轻吸取陈旧培养基丢弃，动作轻缓，尽量不让贴壁的组织块移动。
S2-5、传代时，收集脱落组织块，按照以上方式可以进行二次贴壁培养。
S3、 HA-MSC的传代培养
待原代细胞生长至80%左右融合状态时，需进行传代培养，具体步骤如下：
S3-1、从培养箱取出细胞，在超净工作台中丢弃陈旧培养基，加入生理盐水轻轻冲洗1次。
S3-2、原代HA-MSC每瓶加入Recombinant Trypsin-EDTA Solution 4ml，置于37℃、5%CO2的培养箱中作用3-5mins。
S3-3、显微镜下观察细胞完全脱落后，加入等量的HA-MSC完全培养基终止消化。收集细胞至50ml离心管，加入生理盐水，1500rpm离心4mins。
S3-4、离心后弃上清，加入2ml完全培养基，轻轻吹打混匀细胞，台盼蓝染色计数活细胞数量。
S3-5、按照5000个细胞/ cm2的接种密度将细胞接种至新的LN521-Coated T75的培养瓶。
S3-6、瓶子上注明培养时间，细胞名称和代次后置于37℃、5%CO2的培养箱中进行扩增培养。每代细胞拍照记录。
S4、高活性MSC冻存
选择对数生长期的HA-MSC用Recombinant Trypsin-EDTA Solution消化，待细胞回缩变圆后，加入相应的完全培养基终止，1500rpm离心4mins后，弃上清。HA-MSC加入NutriFreez™D10 Cryopreservation Medium，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管中，每只冻存管加液1.8ml。冻存管上写明细胞名称、批号和冻存时间，并做好记录。把装有细胞的冻存管放入程序性降温盒置于－80℃冰箱中，4h后置于-196℃液氮罐中保存待用。
实施例2：常规MSC的制备方法
制备方法包括以下步骤：
S1、试剂制备
S1-1、MSC完全培养基配制：500ml DMEM/F12培养液中加入55ml胎牛血清，用6.6%NaHCO3调节PH值范围在7.2-7.4，4℃冰箱储存备用。
S1-2、MSC采用普通的T75cm2培养瓶。
S2、人脐带MSC的原代培养
S2-1、在超净工作台中，将采集的人脐带用含100u/ml双抗的生理盐水反复冲洗，去掉残留的血液后置于10cm培养皿中。
S2-2、先用组织剪将脐带分解为1mm3的组织块，每个小组织块转移至一个1.5mlEP管内，用虹膜剪将EP管内的组织分离直至糊状后转移至普通T75cm2培养瓶中。
S2-3、每瓶加入3mlMSC完全培养液后，缓慢晃动瓶身，使微组织块均匀分散，瓶子上注明培养时间，细胞名称和代次后置于37℃、5%CO2的培养箱中进行原代培养。
S2-4、第3天补充完全培养液3ml，之后每隔3-4天换液，倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。换液时移液管轻轻吸取陈旧培养基丢弃，动作轻缓，尽量不让贴壁的组织块移动。
S2-5、传代时，收集脱落组织块，按照以上方式可以进行二次贴壁培养。
S3、常规MSC的传代培养
待原代细胞生长至80%左右融合状态时，需进行传代培养，具体步骤如下：
S3-1、从培养箱取出细胞，在超净工作台中丢弃陈旧培养基，加入生理盐水轻轻冲洗1次。
S3-2、原代MSC每瓶加入0.25%trypsin-EDTA Solution 4ml，置于37℃、5%CO2的培养箱中作用3-5mins。
S3-3、显微镜下观察细胞完全脱落后，加入等量的MSC完全培养基终止消化。收集细胞至50ml离心管，加入生理盐水，1500rpm离心4mins。
S3-4、离心后弃上清，加入2ml完全培养基，轻轻吹打混匀细胞，台盼蓝染色计数活细胞数量。
S3-5、按照5000个细胞/ cm2的接种密度将细胞接种至新的T75的培养瓶。
S3-6、瓶子上注明培养时间，细胞名称和代次后置于37℃、5%CO2的培养箱中进行扩增培养。每代细胞拍照记录。
S4、常规MSC冻存[SL1]
选择对数生长期的MSC用Recombinant Trypsin-EDTA Solution消化，待细胞回缩变圆后，加入相应的完全培养基终止，1500rpm离心4mins后，弃上清。MSC加入配制好的冻存液（含10%的DMSO，5%的甘油）并调整细胞密度为4×106个/ml，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管中，每只冻存管加液1.8ml。冻存管上写明细胞名称、批号和冻存时间，并做好记录。把装有细胞的冻存管放入程序性降温盒置于-80℃冰箱中，4h后置于-196℃液氮罐中保存待用。
实施例3：HA-MSC与常规培养的MSC的比较
下文及说明书附图中，以HA-MSC代指高活性MSC，以MSC代指常规培养的MSC。
1.人脐带HA-MSC和MSC的原代培养的生长形态
采用不剥离血管和包膜的全组织贴壁法培养两种干细胞，在含5%ClonR的TeSR-E8Medium的培养体系下，脐带HA-MSC在层粘连蛋白LN 521包被的培养瓶中，第8天观察到有细胞在组织块周围散在生长。脐带HA-MSC形态小，呈短小梭形，核质比高。换液后第12天观察到大量细胞从组织块周边游出（图1A、1B）。脐带MSC第10天观察到细胞零星生长于组织块周围，呈细长梭形，第15天呈漩涡状融合生长（图1C、1D）。HA-MSC比起MSC，体积较小，核质比高，原代细胞中杂细胞较少。
2．人脐带HA-MSC和MSC的传代培养及3D全息活细胞动态观察
2.1传代培养
待原代细胞生长至80%左右融合状态时，进行传代培养。传代到P3的两种干细胞形态保持不变，生长状况良好（图2A、2D）。对比同一脐带来源的细胞，HA-MSC传代到P9，一直维持短小杆状的形态，活性较好（图2B、2C）；MSC的P9细胞体积增大，形态逐渐宽大扁平，部分细胞呈多边形，胞浆内颗粒增多，呈衰老状态（图2E、2F）。
2.2 3D全息活细胞动态观察
在3D全息活细胞显微镜下48h动态观察P3代的HA-MSC和MSC，各选择一个细胞的视野进行动态观察。HA-MSC体积小，胞体边缘规则，胞浆少，具有明显的细胞核且核仁明显，核内折光性强的遗传物质密集，处于分裂前期。HA-MSC在48h观察结束前，细胞正准备进入分裂期，且MSC体积较大，胞体呈不规则型，胞浆可见少量颗粒。细胞核小，核仁明显。MSC在48h观察结束前，该细胞没有分裂（图3）。图3显示HA-MSC细胞核较大，胞质少，胞核染色物质逐渐增多，即将进入分裂期。MSC细胞体积呈不规则形，胞质多，细胞核大，核仁明显，胞体一直变化游走（×400）。
3．人脐带HA-MSC和MSC的生长曲线和群体倍增时间
3.1生长曲线
MTS法测量HA-MSC和MSC的生长曲线，P3的两种细胞刚接种2d处于滞留期，增殖不明显；3-7d进入对数生长期，细胞生长旺盛，活性好（图4A）；第8d进入平台期，生长曲线均呈典型的“S”型。P9的MSC相较于同代HA-MSC，对数生长期曲线平缓，提前进入平台期，提示细胞增殖能力降低（图4B）。
3.2群体倍增时间
群体倍增时间是细胞在培养条件下细胞数目倍增所需的时间，反映了细胞的增殖能力。通过取生长曲线上对数生长期的OD值，计算两种细胞的群体倍增时间（PDT），P3-HA-MSC的PDT低于P3-MSC（P＜0.01）；P9-HA-MSC的PDT明显低于P9-MSC（P＜0.001）；说明P3和P9的HA-MSC的增殖能力均高于MSC（图5）。
4. 人脐带HA-MSC和MSC透射电镜观察和核质比
4.1透射电镜观察
透射电镜下的HA-MSC细胞轻微水肿。细胞膜完整，其表面可见丰富伪足及突起，形态细长，胞内基质均匀，细胞器均匀分布，轻微肿胀。细胞核（N）呈不规则形，核膜完整，异染色质轻微边集(图6A)；线粒体（M）数量丰富，大多结构清晰，膜完整、嵴平行排列，个别膜内基质变淡，嵴减少；粗面内质网（RER）明显扩张，内质网池可见大量絮状物聚集，内质网潴留，高尔基体（Go）肥大，囊膜扩张。自噬溶酶体（ASS）少量存在，该视野可见2个(图6B)。
透射电镜下的MSC细胞整体轻度水肿，部分细胞器略显肿胀，胞质均匀分布。细胞膜完整，其周围丰富伪足（PS）形态细长，膜内少量细胞器空泡变。细胞核（N）较大，呈不规则形，核膜完整，核周隙正常，染色质均匀，核仁（Nu）较大，结构致密(图7A)；线粒体（M）数量丰富，大多轻度肿胀，膜内基质变淡，嵴断裂、减少，部分严重者，嵴消失，空泡变；粗面内质网（RER）局部扩张，内质网池可见少量絮状物聚集。溶酶体（Ly）个别存在。糖原颗粒（GL）局部聚集。自噬溶酶体（ASS）数量较多，该视野可见5个(图7B)。
4.2核质比
通过每组测量3个细胞计算核质比，HA-MSC核质比明显高于MSC（P＜0.01)。结果见图8。
5.细胞周期
通过流式细胞仪检测细胞周期，P3代的HA-MSC有79.48%和MSC有63%处于G0/G1期，符合体外培养的MSC特征。HA-MSC具有高比例的G0/G1期，证明有高度的分化潜能特征(图9)。
6.表面标志物的表达
HA-MSC和MSC都高表达MSC相关表面标志物CD73、CD105、CD90，低表达或不表达CD34、CD45(表1、图10)，符合MSC表型特征；HA-MSC部分表达ESC相关表面标志物SSEA-3、SSEA-4和TRA-1-60，MSC受培养环境中血清的影响SSEA-4表达 25.8%，不表达SSEA-3和TRA-1-60(表1、图11)。
表1 HA-MSC和MSC表面标志物表达百分比
| CD73 | CD105 | CD90 | CD34 | CD45 | SSEA-3 | SSEA-4 | TRA-1-60 | |
| HA-MSC | 100% | 99.8% | 95.0% | 0.84% | 0.23% | 26.9% | 19.6% | 15.7% |
| MSC | 99% | 99.6% | 95.3% | 2.26% | 0.66% | 0 | 25.8% | 0 |
7. 免疫蛋白印迹（Western blot，WB）检测多能性转录因子的表达情况
运用WB检测两种干细胞多能性转录因子的表达发现，HA-MSC表达多能性转录因子SOX2、OCT4、Nanog，分析目的条带灰度值， SOX2、Nanog表达量明显高于MSC（P＜0.001）；而MSC仅表达OCT4，与HA-MSC表达量无差异（P＞0.05）（图12)，说明HA-MSC比起MSC是处于发育比较早期的细胞。
8.三系分化能力鉴定
成脂分化：细胞成脂分化诱导14天后，经油红O染色，胞浆内可见红色脂滴；成骨分化：诱导21 天后，钙质结节可被茜素红染成红色；成软骨分化：诱导14 天后，可见软骨胶原基质被阿甲新蓝染成蓝色。从染色程度分析，HA-MSC三系分化的能力均强于MSC（图13)。
9.三胚层分化后标志分子表达水平
两种干细胞经过三胚层诱导分化后，每个胚层选择两个特异性标志物（外胚层标志物：Nestin、PAX6；中胚层标志物：Meso-CXCR4、Brachyury（T）；内胚层标志物：Endo-CXCR4、SOX-17）运用免疫荧光检测标志物的表达，结果显示HA-MSC能向外胚层分化，细胞形态呈神经祖细胞样细长型，免疫荧光鉴定表达外胚层特异性标志物；同时也能向中胚层、内胚层分化并表达相应胚层的特异性标志物，而MSC只能向中胚层方向分化（图14-16)。
综上所述，HA-MSC与常规培养的MSC相比，增殖活性较高，体积较小，核质比较高，高表达胚胎干细胞相关标志性抗原SOX2、Nanog、OCT4，具有向三胚层来源的神经、心肌和肝肠祖细胞分化的潜能，表明该细胞是UC-MSC中的一种亚全能干细胞。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (2)
1.一种人脐带高活性间充质干细胞(MSC)的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、试剂制备
S11、高活性MSC完全培养基的配制：在TeSR-E8 Basal Medium中加入TeSR-E8Supplement，颠倒混匀后再加入CloneR，用6.6% NaHCO3调节pH值范围在7.2-7.4，4℃储存备用；
S12、高活性MSC培养瓶的制作：2-8℃缓慢解冻层粘连蛋白LN521原液，用含有Ca2+和Mg2+的1×DPBS稀释层粘连蛋白LN521原液，即为包被液，培养瓶中加入包被液，使之均匀覆盖整个瓶底，置于2-8℃孵育备用；
S2、原代培养；
采用不剥离血管和包膜的全组织贴壁法培养干细胞；
S21、将采集的人脐带清洗去掉残留的血液；
S22、将脐带分解为小组织块，转移至高活性MSC培养瓶中；
S23、高活性MSC培养瓶加入高活性MSC完全培养基，缓慢晃动瓶身，置于37℃、5%CO2的培养箱中进行原代培养；
S24、第3天补充高活性MSC完全培养基，之后每隔3-4天换液；
S25、传代时，收集脱落组织块，按照以上方式进行二次贴壁培养；
S3、传代培养；
待原代细胞生长至80%左右融合状态时，进行传代培养；
S31、从培养箱取出细胞，丢弃陈旧培养基，加入生理盐水轻轻冲洗1次；
S32、原代高活性MSC加入Recombinant Trypsin-EDTA Solution，置于37℃、5%CO2的培养箱中作用3-5mins；
S33、细胞完全脱落后，加入等量高活性MSC完全培养基终止消化，收集细胞加入生理盐水，1500rpm离心4mins；
S34、离心后弃上清，加入高活性MSC完全培养基，轻轻吹打混匀细胞，台盼蓝染色计数活细胞数量；
S35、按照5000个细胞/cm2的接种密度将细胞接种至新的高活性MSC培养瓶；
S36、置于37℃、5%CO2的培养箱中进行扩增培养；
S4、高活性MSC的冻存，具体步骤如下，
选择对数生长期的高活性MSC用Recombinant Trypsin-EDTA Solution消化，待细胞回缩变圆后，加入高活性MSC完全培养基终止，1500rpm离心4mins后，弃上清，轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管中，把装有细胞的冻存管放入程序性降温盒置于－80℃冰箱中，4h后置于-196℃液氮罐中保存待用；
所述步骤S11中，TeSR-E8 Basal Medium、TeSR-E8 Supplement、CloneR的比例为24:1:1；
所述步骤S12中，层粘连蛋白LN521原液稀释至5μg/ml；
所述步骤S21中，人脐带用含100u/ml双抗的生理盐水反复冲洗。
2.根据权利要求1所述的一种人脐带高活性MSC的制备方法制得的人脐带高活性MSC。
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