CN118681052B

CN118681052B - 一种脱细胞基质凝胶海绵及其制备方法

Info

Publication number: CN118681052B
Application number: CN202411170943.9A
Authority: CN
Inventors: 牛文雅; 吴卫东; 陆之豪; 李晓萌; 李春明
Original assignee: Shanghai Poyuan Medical Materials Co ltd
Current assignee: Shanghai Poyuan Medical Materials Co ltd
Priority date: 2024-08-26
Filing date: 2024-08-26
Publication date: 2024-11-05
Anticipated expiration: 2044-08-26
Also published as: CN118681052A

Abstract

本发明提供一种脱细胞基质凝胶海绵及其制备方法，所述脱细胞基质凝胶海绵的制备方法包括以下步骤：脱细胞基质被蛋白酶溶液消化获得预备液；调节预备液的pH值，将预备液与缓冲液混合得脱细胞基质凝胶液；脱细胞基质凝胶液进行冷冻干燥获得疏松多孔的脱细胞基质凝胶冻干物；脱细胞基质凝胶冻干产品进行气态交联，干燥得所述脱细胞基质凝胶海绵。本发明优先优化脱细胞基质凝胶海绵的冷冻干燥参数以获得孔径符合细胞生长要求且均匀的支架，再通过引入气态交联剂的方式对海绵进行交联，这种交联方式无需使用溶剂洗脱，既提高了脱细胞基质凝胶海绵的机械性能，又避免了因多次冷冻干燥引起孔径减小的问题。

Description

一种脱细胞基质凝胶海绵及其制备方法

技术领域

本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种脱细胞基质凝胶海绵及其制备方法。

背景技术

医用敷料是指用以覆盖疮、伤口，控制伤口感染的包伤医用材料。传统敷料主要使用脱脂棉纱布、纱布条、棉球和棉垫等天然纤维性材料类敷料，可使创面干燥，具备物理隔离功能，但这类敷料存在与渗出物结痂，造成创口粘连，换药时引发疼痛，以及细菌滋生、保湿和止血性能不佳等问题。相对传统敷料，现代生物敷料具有保湿、吸湿性好，能有效保留创面渗液的同时不保留积液，创面组织处粘连程度轻，不易与创面渗液粘连成痂，减轻换药时的痛苦；抗菌、抑菌性能较好，预防创面感染等优点。

在种类繁多的现代生物敷料中，海绵敷料因其三维网络结构，能为细胞迁移、增殖提供支架，促使毛细血管生成，加速肉芽组织生长的优势，在伤口敷料应用中显示出极大的吸引力。目前，市面上最常见的海绵敷料是从动物结缔组织中（如牛跟腱、牛肌腱等）提取出的胶原蛋白制成的海绵，由于其多孔的结构形态，可有效诱导修复细胞在敷料中的浸润和增值，加速肉芽组织生长，为组织的生长提供丰富的营养物质。尽管动物源性胶原蛋白产品有诸多优势，但其提取方法复杂，过程繁多，另外从动物组织中提取出的胶原蛋白虽说不一定会产生异体排斥反应，但仍存在一定的免疫原性风险，且在运输、保存、行业标准等方面均存在一定限制性。

胶原蛋白除了可以从结缔组织提取外，还可以将动物组织器官的细胞外基质(ECM)进行脱细胞处理获得，即去除细胞而保留其生物活性成分（例如碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、血管内皮生长因子（VEGF））。大大降低甚至消除了动物源组织的免疫原性。目前脱细胞ECM的来源广泛，可从人体、猪、牛或羊的皮肤、心脏瓣膜、胎盘羊膜、小肠粘膜、膀胱基底膜、韧带、血管、神经、软骨、食道和气管等器官获得。与传统从动物组织中提取出的胶原蛋白相比，细胞外基质中的胶原蛋白更加复杂，不仅胶原的序列更全，而且保留了完整的胶原三螺旋的结构，相对于单一或简单提取出的胶原蛋白，抗原性更低、生物相容性更好、修复效果更佳。利用脱细胞基质制备生物敷料海绵的三维结构与体内细胞生长的天然环境更加接近，不仅能起到支撑细胞的作用，为后续的组织修复再生提供良好的生物力学支持。还富含多种生长因子，为后续的原位诱导提供足够的物理、化学、生物信号。

尽管如此，由脱细胞基质制备的海绵仍然存在与传统胶原蛋白海绵相似的缺点，即支架孔径分布难以控制和机械性能不足，尤其是脱细胞基质经过粉碎、消化、凝胶、冷冻干燥等处理后，入水极易溶散，这也限制了其在相关领域的应用。为了解决上述问题，一般通过引入化学交联反应获得机械性能良好的脱细胞基质凝胶海绵。尽管引入交联剂能改善海绵机械性能不足的问题，但现有的化学交联剂大部分都是以溶液的形式进行反应，海绵冷冻干燥后需反复清洗以除去残留的交联剂，多次的洗涤将导致脱细胞基质凝胶海绵内部的孔隙塌陷、孔径减小，在后续细胞生长的过程中无法满足生长增殖条件，影响修复效果。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种脱细胞基质凝胶海绵及其制备方法。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种脱细胞基质凝胶海绵的制备方法，所述脱细胞基质凝胶海绵的制备方法包括以下步骤：

（1）脱细胞基质被蛋白酶溶液消化获得预备液；调节预备液的pH值，将预备液与缓冲液混合得脱细胞基质凝胶液；

（2）脱细胞基质凝胶液进行冷冻干燥获得疏松多孔的脱细胞基质凝胶冻干物；

（3）脱细胞基质凝胶冻干物进行气态交联，干燥得所述脱细胞基质凝胶海绵。

本发明通过引入气态交联剂的方式对海绵进行交联，这种交联方式无需使用溶剂洗脱，很好地避免了传统交联方式中还需采用二次冷冻干燥去除液体溶剂的过程，既提高了海绵的机械性能，又避免了因多次冷冻干燥引起孔径减小的问题。

优选地，所述脱细胞基质的原料选自皮肤组织、心脏瓣膜、胎盘羊膜、小肠粘膜、膀胱基底膜、韧带、血管、神经、软骨、食道或气管中的任意一种。

优选地，所述蛋白酶为胃蛋白酶。

优选地，所述脱细胞基质被蛋白酶溶液消化时的pH值为1~3，例如1.1、1.3、1.45、2、2.3、2.5、2.7、3等。

优选地，步骤（1）所述消化的时间为24~48h；例如24h、26h、28h、30h、35h、37h、40h、43h、45h、48h等；上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，步骤（1）所述预备液的pH值调节至6~8，例如6、6.3、6.5、6.8、7、7.2、7.4、7.8、8等，上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，步骤（1）所述消化的温度为20~28℃，例如20℃、22℃、24℃、26℃、28℃等，上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，步骤（1）所述缓冲液与预备液的体积比为1:(1~11)，例如1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11等，上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，步骤（2）所述冷冻干燥包括以下步骤：

（S1）将脱细胞基质凝胶液置于容器内，静置凝固得脱细胞基质凝胶；

（S2）按预设的脱细胞基质凝胶预冻程序对脱细胞基质凝胶进行预冻；

（S3）按预设的脱细胞基质凝胶升华干燥程序对步骤（S2）中预冻处理过的脱细胞基质凝胶进行升华干燥；

（S4）按预设的脱细胞基质凝胶解析干燥程序对步骤（S3）中升华干燥处理过的脱细胞基质凝胶进行解析干燥，得到疏松多孔的脱细胞基质凝胶冻干物。

优选地，所述容器内脱细胞基质凝胶溶液的填料高度为0.4~1.5cm；例如0.4cm、0.5cm、0.6cm、0.8cm、0.9cm、1cm、1.1cm、1.2cm、1.3cm、1.4cm、1.5cm等，上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，步骤（S1）所述脱细胞基质凝胶液的浓度为10~20mg/mL；例如10mg/mL、12mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、20mg/mL等，上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述静置凝固的时间为0.5~1.5h；例如0.5h、0.6h、0.8h、1h、1.2h、1.3h、1.4h、1.5h等，上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述静置凝固的温度为30-40℃，例如30℃、32℃、34℃、36℃、37℃、38℃、40℃等，上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，步骤（S2）所述预冻程序包括以下步骤：

（T1）依次将温度调节至≤-30℃（例如-60℃、-55℃、-50℃、-45℃、-40℃、-35℃、-30℃等，优选为-45℃~-30℃），过渡时间为≥0.2h（例如0.2h、0.3h、0.4h、0.5h、0.8h、1h、1.2h、1.5h、1.8h、2h等，优选为0.2~0.5h），恒温≥1h（例如1h、1.2h、1.5h、1.8h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h等，优选为1~2h）；

（T2）升温，再将此温度升温至此范围：下限温度高于前一段温度至少7℃（例如7℃、7.5℃、8℃、8.5℃、9℃、9.5℃、10℃等），上限温度≤-20℃，过渡0.2-0.5h（例如0.2h、0.3h、0.4h、0.5h等），恒温1-2h（例如1h、1.2h、1.5h、1.8h、2h等）；

（T3）降温，最后将温度再次降温至≤-30℃（例如-60℃、-55℃、-50℃、-45℃、-40℃、-35℃、-30℃等，优选为-45℃~-30℃），过渡时间≥0.2h（例如0.2h、0.3h、0.4h、0.5h、0.8h、1h、1.2h、1.5h、1.8h、2h等，优选为0.2~0.5h），恒温时间≥1h（例如1h、1.2h、1.5h、1.8h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h等，优选为1~2h）。

本发明采用上述特定工艺参数的预冻工艺，并在此范围内通过对预冻参数进行调整，可以有效改善海绵的孔径大小，从而改善海绵的吸液能力和保水能力。

步骤（S3）所述升华干燥程序在真空度不大于30Pa的条件下进行，优选为10~30Pa，例如可以是10Pa、12Pa、15Pa、18Pa、20Pa、22Pa、25Pa、28Pa、30Pa等，上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，步骤（S3）所述升华干燥程序包括以下步骤：

（R1）将温度调节至-30~-25℃（例如-30℃、-29℃、-28℃、-27℃、-26℃、-25℃等），过渡时间为0.1~0.2h（例如0.1h、0.11h、0.12h、0.15h、0.18h、0.2h等），恒温8~16h（例如8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h等）；

（R2）升温至-25~-15℃（例如-25℃、-22℃、-20℃、-18℃、-17℃、-15℃等），升温时间为0.1~0.2h（例如0.1h、0.12h、0.15h、0.18h、0.2h等），恒温8~16h（例如8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h等）。

本发明采用上述特定工艺参数的升华干燥工艺，可以去除工艺体系中的自由水，并可以有效防止产品内部温度超过材料的塌陷温度，进而可以有效避免海绵在冻干过程中发生塌陷，从而改善海绵的机械性能。

优选地，步骤（S4）所述解析干燥程序包括：将温度调节至10~20℃（例如10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、16℃、18℃、20℃等），过渡时间为0.5~1h（例如0.5h、0.6h、0.7h、0.8h、0.9h、1h等），恒温8~10h（例如8h、8.5h、9h、9.5h、10h等）。

优选地，所述解析干燥程序在真空度不大于30Pa的条件下进行，优选为10~30Pa，例如可以是10Pa、12Pa、15Pa、18Pa、20Pa、22Pa、25Pa、28Pa、30Pa等，上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，步骤（3）所述的气态交联包括以下步骤：

（P1）用交联剂对脱细胞基质凝胶冻干物进行蒸汽气态交联；

（P2）真空干燥去除气态交联残留的交联剂。

本发明通过气态交联的方式制备脱细胞基质凝胶海绵，可以有效避免液态交联剂使用后需用溶液洗脱的缺陷，避免了重复多次的冻干处理所引起的海绵塌陷，机械性能下降的风险。

优选地，所述交联剂选自戊二醛、多聚磷酸钠、海藻酸二醛溶液或其他蒸发温度在30-37℃的交联剂中的任意一种；

优选地，所述交联剂溶液的浓度为0.1%~0.5%，例如0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%等。

本发明采用上述特定浓度范围的交联剂，可以进一步提升交联效果。

优选地，所述气态交联的时间为18~72h；例如18h、20h、30h、36h、48h、56h、60h、72h等。

本发明通过控制气态交联的时间在上述特定范围中，可以进一步优化交联效果。

优选地，所述气态交联的温度为30~37℃，例如30℃、32℃、34℃、36℃、37℃等。

优选地，所述真空干燥的温度为30~37℃，例如30℃、32℃、34℃、36℃、37℃等。

优选地，所述真空干燥的时间为8~16h，例如8h、9h、10h、12h、13h、14h、16h等，上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

第二方面，本发明提供一种根据第一方面所述脱细胞基质凝胶海绵的制备方法制备的脱细胞基质凝胶海绵。

优选地，所述脱细胞基质凝胶海绵的孔隙率为60%~90%，孔径为100~200μm，断裂伸长率为15~30%。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明优先优化脱细胞基质凝胶海绵的冷冻干燥参数以获得孔径符合细胞生长要求且均匀的脱细胞基质凝胶海绵支架，再通过引入气态交联剂的方式对海绵进行交联，这种交联方式无需使用溶剂洗脱，既提高了海绵的机械性能，又避免了因多次冷冻干燥引起孔径减小的问题。

另外，现有技术通常是通过添加外来物质使得孔径分布均匀，而本发明无需添加外来物质，仅依靠调节冷冻干燥即可

而且，现有交联技术通常是将交联剂加入原材料中混合均匀后，冻干。这往往导致交联剂难以洗脱，而本发明是先制成海绵，再去用交联剂蒸汽进行交联，较容易去除交联剂。

附图说明

图1是实施例1制备得到的脱细胞基质凝胶海绵的电镜图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

下述实施例涉及的胃蛋白酶为购买自博奥森公司的编号为D10368的产品；

胶原酶为购买自博奥森公司的编号为D13006的产品。

实施例1

本实施例提供一种脱细胞基质凝胶海绵及其制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

（1）制备浓度为20mg/mL的凝胶预备液。将1g猪小肠粘膜下层脱细胞基质研磨成粒径在200μm的颗粒，然后在24℃下用含100mg胃蛋白酶的盐酸溶液消化32h。其中盐酸浓度为0.3mol/L；制备预备液体积为50mL。

（2）制备浓度为10mg/mL的脱细胞基质凝胶。将步骤（1）获取的预备液用1mol/L的NaOH溶液调节至pH=7，并按照预备液:10×PBS（体积）=10:1的比例加入10×PBS，最后加入1×PBS定容至100mL混合均匀。

（3）将浓度为10mg/mL的脱细胞基质（SIS）凝胶转移至容器内，注意此过程避免产生气泡，填充高度为1.5cm，置于37℃恒温箱内静置0.5h，等待凝固。

（4）将步骤（3）装有脱细胞基质凝胶的容器放置在冻干机搁板上进行预冻过程。此过程为阶段性降温，温度由25℃（室温）降至-35℃，过渡时间为0.5h，恒温1h。再由此温度升温至-25℃，过渡时间为0.2h，恒温2h。最后再将温度降温至-40℃，过渡时间为0.2h，恒温1h。

（5）在真空度为10Pa的条件下，对凝胶进行阶段性的升华干燥过程。温度维持-30℃，过渡时间为0.1h，恒温14h。然后再将温度升温至-15℃，过渡时间为0.2h，恒温10h。

（6）在真空度为10Pa的条件下，对凝胶进行解析干燥过程。温度升至10℃，过渡时间为0.5h，恒温10h。

（7）将步骤（6）获得的SIS海绵放置在蒸汽室的蒸汽架子上，在蒸汽架下部放置装有浓度为0.3%的海藻糖二醛溶液。关闭蒸汽室舱门，将温度调至37℃进行交联，交联时间为72h。

（8）将步骤（7）交联完毕的SIS海绵放置在真空干燥箱内进行干燥，压力设置为50Pa，温度设置为30℃，时间设置为16h。

实施例2

（4）将步骤（3）装有脱细胞基质凝胶的容器放置在冻干机搁板上进行预冻过程。此过程为阶段性降温，温度由25℃（室温）降至-35℃，过渡时间为0.3h，恒温1h。再由此温度升温至-25℃，过渡时间为0.2h，恒温2h。最后再将温度降温至-40℃，过渡时间为0.2h，恒温1h。

实施例3

本实施例提供一种脱细胞基质凝胶海绵，其制备方法与实施例2不同之处仅在于冷冻干燥时预冻第二段温度不同，第二段温度升温至-30℃，其他条件保持不变，制备方法参照实施例2。

实施例4

本实施例提供一种脱细胞基质凝胶海绵，其制备方法与实施例2不同之处仅在于冷冻干燥时预冻第二段温度不同，第二段温度升温至-19℃，其他条件保持不变，制备方法参照实施例2。

实施例5

本实施例提供一种脱细胞基质凝胶海绵，其制备方法与实施例2不同之处仅在于冷冻干燥时预冻参数不同，温度由25℃（室温）降至-27℃，再由此温度升温至-20℃。最后再将温度降温至-27℃。其他条件保持不变，制备方法参照实施例2。

实施例6

本实施例提供一种脱细胞基质凝胶海绵，其制备方法与实施例1不同之处仅在于冷冻干燥时预冻的过渡时间不同，过渡时间为0.1h，其他条件保持不变，制备方法参照实施例1。

实施例7

本实施例提供一种脱细胞基质凝胶海绵，其制备方法与实施例1不同之处仅在于交联时的交联剂种类不同，交联剂为多聚磷酸钠，其他条件保持不变，制备方法参照实施例1。

实施例8

本实施例提供一种脱细胞基质凝胶海绵，其制备方法与实施例1不同之处仅在于交联时的交联剂种类不同，交联剂为戊二醛，其他条件保持不变，制备方法参照实施例1。

实施例9

本实施例提供一种脱细胞基质凝胶海绵，其制备方法与实施例8不同之处仅在于交联时预冻的交联剂浓度不同，戊二醛浓度为0.5%，其他条件保持不变，制备方法参照实施例8。

实施例10

本实施例提供一种脱细胞基质凝胶海绵，其制备方法与实施例8不同之处仅在于交联时预冻的交联剂浓度不同，戊二醛浓度为0.1%，其他条件保持不变，制备方法参照实施例8。

实施例11

本实施例提供一种脱细胞基质凝胶海绵，其制备方法与实施例1不同之处仅在于交联时的交联时间不同，交联时间为56h，其他条件保持不变，制备方法参照实施例1。

实施例12

本实施例提供一种脱细胞基质凝胶海绵，其制备方法与实施例1不同之处仅在于交联时的交联时间不同，交联时间为18h，其他条件保持不变，制备方法参照实施例1。

实施例13

本实施例提供一种脱细胞基质凝胶海绵，其制备方法与实施例1不同之处仅在于冷冻干燥时填料的高度不同，填料的高度为1cm，其他条件保持不变，制备方法参照实施例1。

实施例14

本实施例提供一种脱细胞基质凝胶海绵，其制备方法与实施例1不同之处仅在于冷冻干燥时填料的高度不同，填料的高度为0.4cm，其他条件保持不变，制备方法参照实施例1。

实施例15

本实施例提供一种脱细胞基质凝胶海绵，其制备方法与实施例1不同之处仅在于步骤（4）的预冻过程不同，直接将温度调节至-35℃，恒温4h，其他条件保持不变，制备方法参照实施例1。

实施例16

本实施例提供一种脱细胞基质凝胶海绵，其制备方法与实施例1不同之处仅在于步骤（5）的升华干燥过程不同，直接将温度调节至-10℃，恒温24h，其他条件保持不变，制备方法参照实施例1。

实施例17

本实施例提供一种脱细胞基质凝胶海绵，其制备方法与实施例1不同之处仅在于步骤（7）的交联时间不同，交联时间为8h，其他条件保持不变，制备方法参照实施例1。

实施例18

本实施例提供一种脱细胞基质凝胶海绵，其制备方法与实施例1不同之处仅在于步骤（7）的交联时间不同，交联时间为84h，其他条件保持不变，制备方法参照实施例1。

测试例

测试方法

（1）孔隙率测试：依据压汞法，即在外加压力下将汞注入固体孔中，对于圆柱型孔模型，汞能进入的孔的大小与压力符合Washburn方程，控制不同的压力，即可测出压入孔中汞的体积，由此得到对应于不同压力的孔径大小的累积分布曲线或微分曲线。

（2）交联度检测：利用茚三酮显色法测定脱细胞基质凝胶海绵中自由氨基酸的含量，交联度通过如下公式进行计算：交联度（%）=（未交联氨基酸含量-已交联氨基酸含量）/未交联氨基酸含量×100%。

（3）断裂伸长率测试：将制备得到的脱细胞基质凝胶海绵裁切成10mm×20mm大小，置于拉力试验机夹具上，速度为50mm/min，材料断裂后，计算断裂伸长率（%）。

（4）降解率测试：将脱细胞基质凝胶海绵裁剪成1cm×1cm大小，称重，记录干重W₀。然后与浓度为0.05mg/mL的胶原酶溶液混合（脱细胞基质凝胶海绵和胶原酶溶液的比例为1mg:1mL），37℃培养7天取出样品，使用去离子水离心洗涤3次，真空冷冻干燥后称重，记为W_t。脱细胞基质凝胶海绵的体外降解率通过如下公式进行计算：降解率（%）=(W₀-W_t)/W₀×100%。

（5）平均孔径测试：通过S-4800型扫描电子显微镜观察海绵的微观结构和表面形貌对冻干后的脱细胞基质凝胶进行观察，然后利用孔径软件（Image-J）统计平均孔径。

（6）吸水率测试：取各实施例制备的材料准确称重，记录干重W_d，浸入37℃的生理盐水中5min后取出，用钝头镊子一端悬空30s，以除去海绵表面的水分，称重，记录W_W。吸水率通过如下公式计算：吸水率（%）=(W_W-W_d)/W_d×100%。

（7）DNA残留检测：依据YY/T0606.25-2014组织工程医疗产品第25部分：《动物源性生物材料DNA残留量测定法》的要求进行测定。

（8）脂肪残留检测：依据GB5009.6-2016食品安全国家标准《食品中脂肪的测定》的要求进行测定。

（9）内毒素含量检测：依据《中国药典2020版》第四部1143细菌内毒素检查法的要求进行测定。

（10）细胞毒性检测：依据GB/T 16886.5-2017医疗器械生物学评价第5部分：《体外细胞毒性试验结果》，采用MTT法进行测定对L929细胞是否有潜在毒性。

测试例1

通过扫描电镜对实施例1制备得到的脱细胞基质凝胶海绵的表面形态进行分析，结果见图1，图中标尺为1mm。

测试例2

对实施例1-6、13-16进行了平均孔径、孔隙率、吸水率和断裂伸长率的相关检测，检测结果如表1所示：

表1

通过表中数据可知：

（1）平均孔径及孔隙率：由于预冻时过渡时间的差异，对实施例1、2、6的平均孔径有明显影响。这是由于预冻过渡时间越快，脱细胞基质凝胶海绵在降温时降温速度越快，海绵内部溶剂瞬间成核，生成数量多，孔径小的冰晶，进而导致干燥后海绵的孔径降低。同理，实施例1过渡时间高于实施例2、7，因此实施例1的孔径较高。

而实施例3在预冻第二阶段温度与第一阶段温度差值＜7℃，导致其第二阶段无法各临近冰晶融合，无法增大海绵孔径，因此其孔径较小，孔隙率降低；

实施例4在预冻时第二阶段温度＞-20℃，高于脱细胞基质海绵预冻时的共晶点温度，因此海绵发生融化现象，即便经历第三阶段的降温过程仍无法生成均匀一致的冰晶，因此其孔径也较低，孔隙率降低；

实施例5预冻时第一阶段温度较高，且第二阶段温度高于脱细胞基质海绵预冻时的共晶点温度，后续无法生成稳定且均匀的冰晶，因此其孔径较低，孔隙率降低；

实施例16由于未进行梯度降温和升温的过程，使得孔径较小；实施例17在升华干燥过程中未设置温度梯度，原因是因为激进的升温过程使得产品发生塌陷，因此孔径降低，孔隙率降低。

（2）吸水率与孔隙率密切相关，实施例13、14由于填料高度相较于实施例1有所减低，使得同样的交联条件下，实施例13、14的交联效果更好，因此在海绵内部形成了更多的交联键，这些交联键具有亲水功能，因此其吸水率有所提高。

（3）断裂伸长率：相同的交联条件下，实施例13、14的交联效果更好，因此其断裂伸长率表现出良好的效果。

本发明通过调节预冻步骤的工艺参数，可以实现对于制得的脱细胞基质凝胶海绵孔径的调节和控制，从而进一步地可以控制其吸液度，即脱细胞基质凝胶海绵的吸液值在一定范围内是可控的，通过调节平均孔径来控制和调节吸液值，而平均孔径可以通过预冻参数来进行调节。

测试例3

对实施例1、7-12、17-18进行了交联度、降解率和断裂伸长率的相关检测，检测结果如表2所示：

表2

通过表中数据可知：

（1）交联度：实施例1、7-8所选用的海藻糖二醛、多聚磷酸钠和戊二醛三种交联剂交联效果差异较小，但随着交联剂浓度的降低，交联效果逐渐下降。随着交联时间的减少，交联效果也逐渐下降。

（2）降解率：在相同的时间点，交联度越高的脱细胞基质凝胶海绵的降解率越低。这是由于交联剂的交联作用，增强了胶原分子间的作用，使得脱细胞基质海绵的降解有所降低。通过调控不同的交联时间，获取不同交联度的脱细胞基质海绵，进而获得不同降解时间的脱细胞基质海绵。

（3）断裂伸长率：脱细胞基质海绵的断裂伸长率与其交联度呈现正相关关系。

可见，本发明通过调整交联剂的浓度和控制交联时间，可以调节产品的交联度，进一步调整其力学性能。

测试例4

对实施例1制得的脱细胞基质凝胶海绵进行生物安全性验证，检测结果如表3所示：

表3

通过表中数据可知，本发明制备得到的脱细胞基质凝胶海绵去除了免疫原性物质，有效降低了使用后免疫排斥的风险；并且，脂肪含量和内毒素含量均符合相关要求；并且对L929细胞未检测到存在潜在的细胞毒性。

综上所述，本发明通过优先优化脱细胞基质凝胶海绵的冷冻干燥参数的方式，获得了孔径符合细胞生长要求且均匀的脱细胞基质凝胶海绵支架，再通过引入气态交联剂的方式对海绵进行交联，这种交联方式无需使用溶剂洗脱，既提高了海绵的机械性能，又避免了因多次冷冻干燥引起孔径减小的问题。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims

1.一种脱细胞基质凝胶海绵的制备方法，其特征在于，所述脱细胞基质凝胶海绵的制备方法包括以下步骤：

（1）脱细胞基质被蛋白酶溶液消化获得预备液；调节预备液的pH值，将预备液与PBS缓冲液混合得脱细胞基质凝胶液；

（3）脱细胞基质凝胶冻干物进行气态交联，干燥得所述脱细胞基质凝胶海绵；

步骤（2）所述冷冻干燥包括：（S1）将脱细胞基质凝胶液置于容器内，静置凝固得脱细胞基质凝胶；

其中，步骤（S2）所述预冻程序包括以下步骤：

（T1）将温度调节至≤-30℃，过渡时间≥0.2h，恒温时间≥1h；

（T2）升温，再将温度升温至此范围：下限温度高于步骤（T1）目标温度至少7℃，上限温度≤-20℃；过渡时间0.2-0.5h，恒温时间1-2h；

（T3）降温，将温度再次降温至≤-30℃，过渡时间≥0.2h，恒温时间≥1h。

2.根据权利要求1所述脱细胞基质凝胶海绵的制备方法，其特征在于，所述脱细胞基质的原料选自皮肤组织、心脏瓣膜、胎盘羊膜、小肠粘膜、膀胱基底膜、韧带、血管、神经、软骨、食道或气管中的任意一种；

步骤（1）所述脱细胞基质被蛋白酶溶液消化时的pH值为1~3，所述消化的温度为20~28℃，时间为24~48h；

步骤（1）所述预备液的pH值调节至6~8，缓冲液与预备液的体积比为1:(1~11)。

3.一种根据权利要求1所述的脱细胞基质凝胶海绵的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述冷冻干燥包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的脱细胞基质凝胶海绵的制备方法，其特征在于，所述容器内脱细胞基质凝胶液的填料高度为0.4~1.5cm；

步骤（S1）所述脱细胞基质凝胶液的浓度为10~20mg/mL，静置凝固的温度为30~40℃，时间为0.5~1.5h。

5.根据权利要求3所述脱细胞基质凝胶海绵的制备方法，其特征在于，步骤（S3）所述升华干燥程序包括：在真空度不大于30Pa的条件下进行；

（R1）将温度调节至-30~-25℃，过渡时间为0.1~0.2h，恒温8~16h；

（R2）升温至-25~-15℃，升温时间为0.1~0.2h，恒温8~16h。

6.根据权利要求3所述脱细胞基质凝胶海绵的制备方法，其特征在于，步骤（S4）所述解析干燥程序包括：在真空度不大于30Pa的条件下，将温度调节至10~20℃，过渡时间0.5~1h，恒温时间8~10h。

7.根据权利要求1所述脱细胞基质凝胶海绵的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述的气态交联包括以下步骤：

（P2）真空干燥去除气态交联残留的交联剂。

8.根据权利要求7所述脱细胞基质凝胶海绵的制备方法，其特征在于，所述交联剂选自戊二醛、多聚磷酸钠或海藻酸二醛溶液中的任意一种。

9.根据权利要求7所述脱细胞基质凝胶海绵的制备方法，其特征在于，步骤（P1）所述交联剂溶液的浓度为0.1%~0.5%，气态交联的温度为30~37℃，气态交联时间为18~72h。

10.根据权利要求7所述脱细胞基质凝胶海绵的制备方法，其特征在于，步骤（P2）所述真空干燥的温度为30~37℃，真空干燥的时间为8~16h。

11.根据权利要求1~10任一项所述脱细胞基质凝胶海绵的制备方法制备的脱细胞基质凝胶海绵；

所述脱细胞基质凝胶海绵的孔隙率为60%~90%，孔径为100~200μm，断裂伸长率为15~30%。