CN118679157A - 四氢环庚吲唑化合物的盐型、晶型 - Google Patents
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Abstract
一类四氢环庚吲唑化合物的盐型、晶型及其制备方法，具体公开了式(I)化合物的盐型和晶型在制备治疗相关药物中的应用。
Description
本申请主张如下优先权：
CN202111631128.4，申请日2021年12月28日。
本发明涉及一类四氢环庚吲唑化合物的盐型、晶型及其制备方法，具体涉及式(I)化合物的盐型和晶型在制备治疗相关药物中的应用。
根据WHO统计，乳腺癌已成为全球发病率第二高的癌症，也是女性中发病率最高的癌症。经过多年的研究，已经确定了雌激素-雌激素受体信号通路在乳腺癌发展中的作用；而雌激素受体(ER)也已经发展成了乳腺癌最重要的生物标记物。以雌激素受体表达为判别指标，乳腺癌可以划分为雌激素受体阳性乳腺癌及雌激素受体阴性乳腺癌；其中，雌激素受体阳性的乳腺癌占乳腺癌患者总数的70％以上。
针对乳腺癌细胞内雌激素-雌激素受体信号通路的内分泌疗法(Endocrine Therapy，ET)因其危害性最小，疗效显著，已经成为治疗雌激素受体阳性乳腺癌的首选疗法。内分泌疗法一线疗法主要为芳香化酶抑制剂(Aromatase inhibitor,AI)。尽管芳香化酶抑制剂来曲唑在治疗雌激素受体阳性乳腺癌方面表现了良好的疗效，但是，随着两类药物的应用，雌激素受体阳性乳腺癌针对芳香化酶抑制剂的耐药性问题也表现的越来越突出。大量的研究表明，对于芳香化酶抑制剂，雌激素受体可产生相应的变异，主要在Y537X变异，使得变异后的雌激素受体可在无雌激素存在的条件下本身保持激动的构象，使得其继续发挥受体功能以促进乳腺癌细胞增殖。作为唯一上市的选择性雌激素受体下调剂氟维司群(Fulvestrant)在治疗耐荷尔蒙疗法的乳腺癌上表现出了良好的效果。但是，氟维司群对于治疗AI耐药型ER变异的乳腺癌存在很多问题。首先，因为其药代动力学性质很差，氟维司群表现出接近于零的口服生物利用度；同时，氟维司群又有较高的血液清除率。由于以上两种原因，这个药物只能通过肌肉注射给药。但是，由于其强亲脂性结构，肌肉注射给药的氟维司群在组织分布上也存在严重问题；其临床变现为只有约50％应用氟维司群的乳腺癌患者表现出了临床响应。同样由于药代动力学性质不佳，现在批准剂量下的氟维斯群在组织浓度中无法达到对ER，尤其是变异ER的完全降解，针对AI耐药型ER变异的乳腺癌该治疗方案并非最佳。因此，研发有更好的药代动力学性质且针对ER变异性乳腺癌的药物依旧是未被满足的医疗需求。
Radius与Menarini公司研发的选择性雌激素受体降解剂Elacestrant(RAD1901，Garner,F.et al.,Anticancer Drugs,2015,26,948-956.)在III期临床试验中展现出优于标准疗法的无进展生存率，特别对 于ESR1突变患者其获益率更高，目前已向FDA提交了NDA申请。WO2018/077630A1报道了AstraZeneca目前正在研发的新一代非共价型雌激素受体降解剂Camizestrant(AZD9833)用于治疗ER阳性乳腺癌，该分子治疗ER阳性HER2阴性乳腺癌的临床III期试验正在进行中。WO2019/245974A1和WO2020/049150A1分别报道了Genetech和Sanofi目前正在研发的新一代非共价型雌激素受体降解剂Giredestrant(GDC-9545)和Amcenestrant(SAR439859)，其中Giredestrant处于临床III期试验阶段，其单药的临床II期与现有疗法比较未展现出优势；Amcenestrant在临床II期阶段也未展现出优势，目前已宣布停研。
发明内容
本发明提供式(III)化合物
本发明还提供式(III)化合物的A晶型，
其特征在于，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有衍射峰：20.92±0.20°、22.08±0.20°、24.70±0.20°。
在本发明的一些方案中，上述式(III)化合物的A晶型，其特征在于，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有衍射峰：12.30±0.20°、15.64±0.20°、17.00±0.20°、18.26±0.20°、20.92±0.20°、22.08±0.20°、22.62±0.20°、24.70±0.20°。
在本发明的一些方案中，上述式(III)化合物的A晶型，其特征在于，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有衍射峰：5.18±0.20°、5.92±0.20°、8.12±0.20°、12.30±0.20°、15.64±0.20°、17.00±0.20°、18.26±0.20°、20.92±0.20°、22.08±0.20°、24.70±0.20°。
在本发明的一些方案中，上述式(III)化合物的A晶型，其特征在于，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有衍射峰：5.18±0.20°、5.92±0.20°、8.12±0.20°、12.30±0.20°、15.64±0.20°、17.00±0.20°、18.26±0.20°、19.54±0.20°、20.92±0.20°、22.08±0.20°、22.62±0.20°、24.70±0.20°。
在本发明的一些方案中，上述式(III)化合物的A晶型，其特征在于，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有衍射峰：5.18±0.20°、5.92±0.20°、8.12±0.20°、12.30±0.20°、15.64±0.20°、17.00±0.20°、18.26±0.20°、19.54±0.20°、20.92±0.20°、22.08±0.20°、24.70±0.20°、25.48±0.20°。
在本发明的一些方案中，上述式(III)化合物的A晶型，其特征在于，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有衍射峰：5.18±0.20°、5.92±0.20°、8.12±0.20°、12.30±0.20°、15.64±0.20°、17.00±0.20°、18.26±0.20°、19.54±0.20°、20.92±0.20°、22.08±0.20°、22.62±0.20°、24.70±0.20°、25.48±0.20°
在本发明的一些方案中，上述式(III)化合物的A晶型，其特征在于，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有衍射峰：5.18±0.20°、5.92±0.20°、8.12±0.20°、12.30±0.20°、15.64±0.20°、16.42±0.20°、17.00±0.20°、17.66±0.20°、18.26±0.20°、19.54±0.20°、20.06±0.20°、20.92±0.20°、22.08±0.20°、22.62±0.20°、23.32±0.20°、23.86±0.20°、24.70±0.20°、25.48±0.20°、26.68±0.20°、28.50±0.20°、29.54±0.20°、31.58±0.20°、33.20±0.20°。
在本发明的一些方案中，上述式(III)化合物的A晶型，其特征在于，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有衍射峰：5.181°、5.920°、8.119°、12.299°、15.638°、16.418°、17.002°、17.660°、18.261°、19.539°、20.061°、20.919°、22.080°、22.621°、23.320°、23.861°、24.700°、25.483°、26.681°、28.498°、29.542°、31.578°、33.198°。
在本发明的一些方案中，上述式(III)化合物的A晶型，其特征在于，其X射线粉末衍射图谱基本上如图1所示。
本发明的一些方案中，上述A晶型的XRPD图谱解析数据如表1所示：
表1式(III)化合物A晶型的XRPD图谱解析数据
在本发明的一些方案中，上述式(III)化合物的A晶型，其特征在于，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有衍射峰：和/或5.18±0.20°、和/或5.92±0.20°、和/或8.12±0.20°、和/或12.30±0.20°、和/或15.64±0.20°、和/或16.42±0.20°、和/或17.00±0.20°、和/或17.66±0.20°、和/或18.26±0.20°、和/或19.54±0.20°、和/或20.06±0.20°、和/或20.92±0.20°、和/或22.08±0.20°、和/或22.62±0.20°、和/或23.32±0.20°、和/或23.86±0.20°、和/或24.70±0.20°、和/或25.48±0.20°、和/或26.68±0.20°、和/或28.50±0.20°、和/或29.54±0.20°、和/或31.58±0.20°、和/或33.20±0.20°。
在本发明的一些方案中，上述式(III)化合物的A晶型，其特征在于，其热重分析曲线在150.000±3℃处失重达0.198％，在240.000±3℃处失重达10.880％。
在本发明的一些方案中，上述式(III)化合物的A晶型，其特征在于，其热重分析曲线如图2所示。
在本发明的一些方案中，上述式(III)化合物的A晶型，其特征在于，其差示扫描量热曲线在175.87±5℃、214.68±5℃和292.11±5℃处具有吸热峰的起始点。
在本发明的一些方案中，上述式(III)化合物的A晶型，其特征在于，其差示扫描量热曲线如图3所示。
本发明还提供式(II)化合物的B晶型，
其特征在于，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有衍射峰：14.24±0.20°、22.18±0.20°、23.78±0.20°。
在本发明的一些方案中，上述式(II)化合物的B晶型，其特征在于，其X射线粉末衍射图谱在下 列2θ角处具有衍射峰：6.50±0.20°、14.24±0.20°、15.80±0.20°、18.18±0.20°、22.18±0.20°、23.78±0.20°、25.30±0.20°。
在本发明的一些方案中，上述式(II)化合物的B晶型，其特征在于，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有衍射峰：6.50±0.20°、7.86±0.20°、14.24±0.20°、15.80±0.20°、16.92±0.20°、18.18±0.20°、19.66±0.20°、20.76±0.20°、22.18±0.20°、23.78±0.20°、25.30±0.20°、26.12±0.20°。
在本发明的一些方案中，上述式(II)化合物的B晶型，其特征在于，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有衍射峰：6.499°、7.860°、9.739°、10.257°、11.862°、12.255°、13.021°、14.240°、15.417°、15.797°、16.541°、16.920°、17.558°、18.182°、18.439°、18.702°、19.660°、20.381°、20.761°、21.494°、21.647°、22.180°、23.781°、24.099°、24.498°、25.304°、26.118°、26.821°、27.239°、28.579°、28.924°、29.302°、29.881°、30.278°、30.681°、30.938°、31.764°、32.978°、34.260°、35.101°、35.419°、35.761°、36.597°、37.083°、37.540°、38.423°。
本发明的一些方案中，上述B晶型的XRPD图谱解析数据如表2所示：
表2式(II)化合物B晶型的XRPD图谱解析数据
在本发明的一些方案中，上述式(II)化合物的B晶型，其特征在于，其X射线粉末衍射图谱在下 列2θ角处具有衍射峰：和/或6.50±0.20°、和/或7.86±0.20°、和/或9.74±0.20°、和/或10.26±0.20°、和/或11.86±0.20°、和/或12.26±0.20°、和/或13.02±0.20°、和/或14.24±0.20°、和/或15.42±0.20°、和/或15.80±0.20°、和/或16.54±0.20°、和/或16.92±0.20°、和/或17.56±0.20°、和/或18.18±0.20°、和/或18.44±0.20°、和/或18.70±0.20°、和/或19.66±0.20°、和/或20.38±0.20°、和/或20.76±0.20°、和/或21.49±0.20°、和/或21.65±0.20°、和/或22.18±0.20°、和/或23.78±0.20°、和/或24.10±0.20°、和/或24.50±0.20°、和/或25.30±0.20°、和/或26.12±0.20°、和/或26.82±0.20°、和/或27.24±0.20°、和/或28.58±0.20°、和/或28.92±0.20°、和/或29.30±0.20°、和/或29.88±0.20°、和/或30.28±0.20°、和/或30.68±0.20°、和/或30.94±0.20°、和/或31.76±0.20°、和/或32.98±0.20°、和/或34.26±0.20°、和/或35.10±0.20°、和/或35.42±0.20°、和/或35.76±0.20°、和/或36.60±0.20°、和/或37.08±0.20°、和/或37.54±0.20°、和/或38.42±0.20°。
在本发明的一些方案中，上述式(II)化合物的B晶型，其特征在于，其X射线粉末衍射图谱基本上如图4所示。
在本发明的一些方案中，上述式(II)化合物的B晶型，其特征在于，其热重分析曲线在200.000±3℃处失重达0.085％。
在本发明的一些方案中，上述式(II)化合物的B晶型，其特征在于，其热重分析曲线如图5所示。
在本发明的一些方案中，上述式(II)化合物的B晶型，其特征在于，其差示扫描量热曲线在215.60±3℃处具有吸热峰。
在本发明的一些方案中，上述式(II)化合物的B晶型，其特征在于，其差示扫描量热曲线如图6所示。
本发明还提供式(I)化合物的C晶型，
其特征在于，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有衍射峰：4.90±0.20°、15.82±0.20°、22.26±0.20°。
在本发明的一些方案中，上述式(I)化合物的C晶型，其特征在于，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有衍射峰：4.90±0.20°、9.82±0.20°、15.82±0.20°、17.48±0.20°、18.64±0.20°、22.26±0.20°、23.74±0.20°、29.36±0.20°。
在本发明的一些方案中，上述式(I)化合物的C晶型，其特征在于，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有衍射峰：30±0.20°、4.90±0.20°、9.82±0.20°、11.06±0.20°、14.20±0.20°、15.82±0.20°、 17.48±0.20°、18.64±0.20°、22.26±0.20°、23.74±0.20°、24.46±0.20°、29.36±0.20°。
在本发明的一些方案中，上述式(I)化合物的C晶型，其特征在于，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有衍射峰：3.301°、4.901°、7.898°、9.319°、9.819°、11.061°、14.200°、14.721°、15.197°、15.821°、16.457°、17.481°、18.101°、18.642°、19.762°、20.961°、21.382°、22.259°、23.740°、24.461°、25.761°、26.295°、26.943°、27.518°、29.358°、30.075°、31.317°、31.916°、34.598°、37.661°。
本发明的一些方案中，上述C晶型的XRPD图谱解析数据如表3所示：
表3式(I)化合物C晶型的XRPD图谱解析数据
在本发明的一些方案中，上述式(I)化合物的C晶型，其特征在于，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有衍射峰：和/或3.30±0.20°、和/或4.90±0.20°、和/或7.90±0.20°、和/或9.32±0.20°、和/或9.82±0.20°、和/或11.06±0.20°、和/或14.20±0.20°、和/或14.72±0.20°、和/或15.20±0.20°、和/或15.82±0.20°、和/或16.46±0.20°、和/或17.48±0.20°、和/或18.10±0.20°、和/或18.64±0.20°、和/或19.76±0.20°、和/或20.96±0.20°、和/或21.38±0.20°、和/或22.26±0.20°、和/或23.74±0.20°、和/或24.46±0.20°、和/或25.76±0.20°、和/或26.30±0.20°、和/或26.94±0.20°、和/或27.52±0.20°、和/或29.36±0.20°、和/或30.08±0.20°、和/或31.32±0.20°、和/或31.92±0.20°、和/或34.60±0.20°、和/或37.66±0.20°。
在本发明的一些方案中，上述式(I)化合物的C晶型，其特征在于，其X射线粉末衍射图谱基本上如图7所示。
在本发明的一些方案中，上述式(I)化合物的C晶型，其特征在于，其差示扫描量热曲线在124.14±5℃处具有吸热峰的起始点、在199.34±5℃处具有放热峰的起始点、在278.70±5℃处具有放热峰的起始点。
在本发明的一些方案中，上述式(I)化合物的C晶型，其特征在于，其差示扫描量热曲线如图8 所示。
本发明还提供上述式(II)化合物的晶型，其特征在于，其晶体结构如图9所示。
本发明还提供上述化合物及其晶型在制备治疗ESR1阳性肿瘤药物中的应用。
技术效果
本发明对化合物具有较好的PK性质及口服吸收率，其晶型稳定。
本发明化合物对野生型和突变型的ESR1阳性肿瘤模型显示出优良的活性，并在各类ESR1阳性细胞中展现出优秀的有效性。它们对ER
+/HER2
-局部晚期或转移型乳腺癌患者可能提供更有效的治疗。
定义和说明
本发明采用下述缩略词：DMSO代表二甲基亚砜；TsOH代表对甲基苯磺酸；PBS代表0.9％氯化钠磷酸缓冲溶液；THP代表四氢吡喃基；Nf代表全氟-1-正丁基。
Weight loss代表失重；Weight percent loss代表失重百分比；Residue代表残余物；Residue percent代表残余物百分比；Integral代表总放热(吸热)量；Normalized代表标准放热(吸热)量；Peak代表峰值；Onset代表初熔温度；Endset代表终熔温度；Left limit代表左极限温度；Right limit代表右极限温度。
化合物依据本领域常规命名原则或者使用
软件命名，市售化合物采用供应商目录名称。
本发明粉末X-射线衍射(X-ray powder diffractometer,XRPD)方法
仪器型号：布鲁克D8 advance X-射线衍射仪
测试方法：大约10～20mg样品用于XRPD检测。
详细的XRPD参数如下：
光管：Cu,kα,
光管电压：40kV，光管电流：40mA
发散狭缝：0.60mm
探测器狭缝：10.50mm
防散射狭缝：7.10mm
扫描范围：4-40deg
步径：0.02deg
步长：0.12秒
样品盘转速：15rpm
本发明差热分析(Differential Scanning Calorimeter,DSC)方法
仪器型号：TA Q2000差示扫描量热仪
测试方法：取样品(～1mg)置于DSC铝锅内进行测试，在50mL/min N
2条件下，以10℃/min的升温速率，加热样品从30℃(室温)到300℃(或350℃)。
本发明热重分析(Thermal Gravimetric Analyzer,TGA)方法
仪器型号：TA Q5000IR热重分析仪
测试方法：取样品(2～5mg)置于TGA铂金锅内进行测试，在25mL/min N
2条件下，以10℃/min的升温速率，加热样品从室温到350℃或失重20％。
本发明单晶衍射方法
样品培养：2mg式(II)化合物在室温条件下溶解于400μL甲醇/乙酸乙酯(1:1)中，将样品溶液置于1mL半密封样品瓶中，在室温条件下缓慢挥发，第二天得到晶体，晶体图见图9。
仪器型号：Rigaku Oxford Diffraction XtaLAB Synergy-S four-circle diffractometer equipped with a HyPix-6000HE area detector。
图1为(III)化合物A晶型的XRPD谱图。
图2为(III)化合物A晶型的TGA谱图。
图3为(III)化合物A晶型的DSC谱图。
图4为(II)化合物B晶型的XRPD谱图。
图5为(II)化合物B晶型的TGA谱图。
图6为(II)化合物B晶型的DSC谱图。
图7为(I)化合物C晶型的XRPD谱图。
图8为(I)化合物C晶型的DSC谱图。
图9为(II)化合物的单晶结构示意图。
图10为式(I)化合物C晶型在人乳腺癌MCF7细胞皮下异种移植瘤模型荷瘤鼠在给予受试化合物后的肿瘤生长曲线。
图11为式(I)化合物C晶型对比氟维司群与哌柏西利在人乳腺癌MCF7细胞皮下异种移植瘤模型荷瘤鼠在给予受试化合物后的肿瘤生长曲线。
图12为式(I)化合物C晶型联合哌柏西利在人乳腺癌MCF7细胞皮下异种移植瘤模型荷瘤鼠在给予受试化合物后的肿瘤生长曲线。
图13为式(I)化合物C晶型在人乳腺癌MCF7细胞皮下异种移植瘤模型荷瘤鼠在给药过程中的体重变化百分比(％)。
图14为式(I)化合物C晶型对比氟维司群与哌柏西利在人乳腺癌MCF7细胞皮下异种移植瘤模型荷瘤鼠在给药过程中的体重变化百分比(％)。
图15为式(I)化合物C晶型联合哌柏西利在人乳腺癌MCF7细胞皮下异种移植瘤模型荷瘤鼠在给药过程中的体重变化百分比(％)。
图16为式(II)化合物B晶型在携带ESR1 D538G突变的MCF7细胞皮下异种移植瘤模型荷瘤鼠的肿瘤生长曲线。
图17为式(II)化合物B晶型联合哌柏西利在携带ESR1 D538G突变的MCF7细胞皮下异种移植瘤模型荷瘤鼠的肿瘤生长曲线。
图18为式(II)化合物B晶型在携带ESR1 D538G突变的MCF7细胞皮下异种移植瘤模型荷瘤鼠在给药过程中的体重变化百分比(％)。
图19为式(II)化合物B晶型联合哌柏西利在携带ESR1 D538G突变的MCF7细胞皮下异种移植瘤模型荷瘤鼠在给药过程中的体重变化百分比(％)。
下面通过实施例对本发明进行详细描述，但并不意味着对本发明任何不利限制。本发明的化合物可以通过本领域技术人员所熟知的多种合成方法来制备，包括下面列举的具体实施方式、其与其他化学合成方法的结合所形成的实施方式以及本领域技术上人员所熟知的等同替换方式，优选的实施方式包括但不限于本发明的实施例。对本领域的技术人员而言，在不脱离本发明精神和范围的情况下针对本发明具体实施方式进行各种变化和改进将是显而易见的。
实施例1：式(I)化合物的制备
中间体化合物1-11的制备：
步骤A:在25摄氏度下，向搅拌中的1-13(100.0克，420.38毫摩尔)的N-甲基吡咯烷酮(1000毫升)溶液中依次加入三乙胺(87.77毫升，630.57毫摩尔)和1-14(78.30克，420.38毫摩尔)，混合液在氮气保护下于130摄氏度(内温)搅拌12小时。冷却至25摄氏度后，搅拌反应液加入水(1000毫升)，并继续于25摄氏度搅拌1小时。所得混悬液通过布氏漏斗减压过滤，滤饼中加入水(200毫升×2)洗涤。收集滤饼，真空干燥得化合物1-15。
步骤B:在25摄氏度下，向搅拌中的1-15(100克，291.36毫摩尔)的四氢呋喃(700毫升)的混合溶液中加入对甲苯磺酸一水合物(166.26克，874.08毫摩尔)，混合液在35摄氏度搅拌12小时。反应液减压浓缩至不再蒸发出液体。浓缩后的粗品在25摄氏度下加入乙腈(300毫升)溶清后加入甲氧基环戊醚(1500毫升)，并于25摄氏度搅拌12小时。所得混悬液通过布氏漏斗减压过滤。滤饼使用甲氧基环戊醚(50毫升×2)洗涤，收集滤饼，真空干燥得化合物1-16。
步骤C：在25摄氏度下，向搅拌中的1-16(100克，170.21毫摩尔)的乙腈(1升)混悬液中加入无水磷酸钾(112.00克，527.65毫摩尔)和1-17(32.64克，173.62毫摩尔)，并在氮气保护下于40摄氏度搅拌12小时。反应液减压浓缩至不再蒸发出液体，向残留物中加入2-甲基四氢呋喃(500毫升×3)和饱和碳酸钠水溶液(400毫升)。分液后的有机相加入饱和食盐水(300毫升×2)，分液后的有机相通过无水硫酸钠干燥、过滤，滤液减压浓缩干燥得化合物1-11。LCMS(ESI)m/z:303/305[M+H]
+。
式(I)化合物的制备：
步骤A：0摄氏度氮气保护下，向N,N-二异丙胺(7.73克，76.41毫摩尔)的四氢呋喃(100毫升)溶液中缓慢滴加正丁基锂的正己烷溶液(2.5摩尔每升，28.21毫升3)，反应液于0摄氏度搅拌0.5小时后降温至-70摄氏度，缓慢滴加1-1(10克，58.78毫摩尔)的四氢呋喃(100毫升)溶液，滴加完毕反应液于-70摄氏度搅拌0.5小时后，向反应液中缓慢滴加1-2(8.53克，70.53毫摩尔)的甲苯(10毫升)溶液，滴加完毕反应液于-70摄氏度搅拌反应3小时。向反应液中加入饱和氯化铵水溶液(200毫升)，乙酸乙酯(100毫升×2)萃取；合并有机相依次加入饱和氯化铵水溶液(200毫升×2)和饱和食盐水(200毫升×2)洗涤、无水硫酸钠干燥、过滤后减压浓缩得粗产物。经柱层析纯化(洗脱剂：石油醚)得化合物1-3。
化合物1-3：
1HNMR(400MHz,CDCl
3)δ＝5.82-5.59(m,1H),5.15(d,J＝1.0Hz,1H),5.13-5.09(m,1H),4.19(q,J＝7.1Hz,2H),2.82-2.74(m,1H),2.69-2.53(m,1H),2.50-2.40(m,1H),2.39-2.30(m,1H),2.30-2.17(m,1H),1.32-1.27(m,3H).
步骤B：20摄氏度氮气保护下，1-3(3.1克，14.75毫摩尔)的四氢呋喃(18毫升)溶液中加入9-硼双环[3.3.1]壬烷(0.5摩尔每升，32.45毫升)，反应液于60摄氏度搅拌3小时后冷却至室温。向反应液依次加入水(10毫升)、1-4(3.53克，11.80毫摩尔)、四(三苯基膦)钯(0)(1.7克，1.47毫摩尔)和磷酸钾(4.7克，22.12毫摩尔)。混合液在氮气保护下于70摄氏度搅拌16小时。所得反应液加入乙酸乙酯 (100毫升)稀释后用饱和食盐水(200毫升×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩得粗品。经柱层析纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝100/1至0/1)得化合物1-5。LCMS(ESI)m/z:431.1[M+H]
+。
步骤C：向1-5(6.7克，13.46毫摩尔)的甲醇(75毫升)和水(25毫升)的混合溶液中加入氢氧化钠(2.15克，53.83毫摩尔)，混合液于25摄氏度搅拌16小时。所得反应液减压浓缩除去溶剂甲醇，残余物加入水(150毫升)稀释后用二氯甲烷萃取(100毫升×2)，水相加入盐酸(2摩尔每升)调节至pH＝2后用乙酸乙酯(80毫升×4)萃取，合并的有机相用饱和食盐水(200毫升×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩得化合物1-6。
化合物1-6：
1HNMR(400MHz,CDCl
3)δ＝7.34(d,J＝4.3Hz,2H),6.99-6.90(m,1H),5.59(td,J＝2.4,9.3Hz,1H),4.04(br d,J＝11.0Hz,1H),3.73(dt,J＝2.9,10.9Hz,1H),2.97(br t,J＝7.1Hz,2H),2.82-2.72(m,1H),2.72-2.56(m,1H),2.56-2.42(m,1H),2.28-2.13(m,2H),2.06-1.99(m,1H),1.79-1.58(m,7H)。LCMS(ESI)m/z:403.1[M+H]
+。
步骤D：将1-6(2.7克，6.54毫摩尔)溶于多聚磷酸(30毫升)中，混合液于110摄氏度搅拌16小时。所得反应液加入水(300毫升)稀释，用乙酸乙酯萃取(100毫升×3)。合并的有机相用饱和碳酸钠水溶液(200毫升×2)和饱和食盐水(200毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩得化合物1-7。LCMS(ESI)m/z:301.1[M+H]
+。
步骤E:将1-7(2.7克，8.99毫摩尔)溶于二氯甲烷(50毫升)中，加入一水合对甲苯磺酸(855.26毫克，4.5毫摩尔)和3,4-二氢吡喃(1.13克，13.49毫摩尔)。混合液于25摄氏度搅拌16小时。反应液减压浓缩得粗品。经柱层析纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝40/1至20/1)得化合物1-8。
化合物1-8：
1HNMR(400MHz,CDCl
3)δ＝7.81(dd,J＝5.4,8.9Hz,1H),7.38(td,J＝2.0,8.8Hz,1H),5.59(td,J＝2.4,9.2Hz,1H),4.06-3.95(m,1H),3.81-3.64(m,2H),3.36-3.23(m,1H),3.22-2.95(m,2H),2.53-2.38(m,1H),2.35-2.20(m,2H),2.19-2.08(m,2H),2.06-2.00(m,1H),1.80-1.65(m,5H))。LCMS(ESI)m/z:385.1[M+H]
+。
步骤F:在-40摄氏度，氮气保护下向双(三甲基硅基)氨基钾的四氢呋喃溶液(1摩尔每升，114.47毫升，114.47毫摩尔)滴加1-8(40克，104.07毫摩尔)的四氢呋喃(266毫升)溶液，滴加完毕，混合液在-40摄氏度下搅拌1小时。于-40摄氏度向反应液中滴加全氟丁基磺酰氟(20.11毫升，114.47毫摩尔)，逐渐升温至25摄氏度并搅拌12小时。在25摄氏度下，向所得反应液加入饱和氯化铵水溶液(1300毫升)淬灭，混合液用500毫升水稀释后加入乙酸乙酯(600毫升×3)萃取。合并的有机相用饱和食盐水(200毫升×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩得粗品(79.13g)。将粗品用乙醇(160毫升)在25摄氏度搅拌12小时，过滤，洗涤得化合物1-9。
步骤G：在25摄氏度下，向1-9(25克，37.51毫摩尔)和双联频哪醇硼酸酯(14.29克，56.27毫摩尔)的1,4-二氧六环(200毫升)溶液加入碳酸钾(7.78克，56.27毫摩尔)、三苯基膦(1.48克，5.63摩尔)和二氯二(三苯基膦)钯(0)(1.84克，2.63毫摩尔)。混合液在氮气保护下于90摄氏度搅拌12小时。所得反应液用硅藻土过滤，用水(40毫升)稀释，用乙酸乙酯(50毫升×3)萃取。合并的有机相用饱和食盐水(40毫升×1)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩得粗品30.43克。加入乙腈(150毫升)和水(37.5毫升)并加热至50摄氏度溶清，降温至25摄氏度并搅拌12小时。所得混悬液经减压过滤后收集滤饼得化合物1-10。LCMS(ESI)m/z:495.2[M+H]
+
步骤H：在25摄氏度下，向1-11(1.91克，6.31毫摩尔)和1-10(3.12克，6.31毫摩尔)的四氢呋喃(30毫升)和水(6毫升)的混合溶液加入氢氧化钾(1.95克，34.71毫摩尔)和四(三苯基膦)钯(0)(364.67毫克，315.58微摩尔)。混合液在氮气保护下于60摄氏度搅拌12小时。所得反应液用水(20毫升)稀释，用二氯甲烷(20毫升*3)萃取。合并的有机相用饱和食盐水(20毫升×1)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩得粗品。经反向硅胶柱层析纯化(0.1％氨水溶液/乙腈梯度洗脱)得化合物1-12。LCMS(ESI)m/z:591.2[M+H]
+。
步骤I：在20摄氏度下，向1-12(18克，7.87毫摩尔)的乙腈(180毫升)溶液加入三氟乙酸(60毫升)。混合液于80摄氏度搅拌16小时。所得反应液减压浓缩至不再蒸发出液体，加入碳酸钠水溶液调节pH至8～10，用二氯甲烷萃取。合并的有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩得粗品。经柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝10/1)得式(I)化合物。LCMS(ESI)m/z:507.3[M+H]
+
实施例2：式(III)化合物A晶型的制备
取5g的式(I)化合物，加入30毫升乙腈溶解。加热至90℃加入富马酸(1.26g)下搅拌1小时，缓慢降温至20摄氏度并继续搅拌12小时。所得悬浮液过滤，滤饼干燥后得式(III)化合物的A晶型。
1H NMR(400MHz,DMSO-d
6)δ＝12.60(s,1H),8.01(d,J＝1.2Hz,1H),7.71(d,J＝0.8Hz,1H),7.61(br d,J＝6.4Hz,1H),7.28(dd,J＝2.4,8.8Hz,1H),6.87(d,J＝8.8Hz,1H),6.64(s,2H),4.61(t,J＝6.0Hz,1H),4.50(t,J＝6.0Hz,1H),4.46-4.35(m,1H),3.54(q,J＝11.6Hz,2H),3.13-2.94(m,4H),2.85-2.70(m,4H),2.45-2.24(m,3H),2.10(br t,J＝6.8Hz,2H),2.03-1.87(m,2H),1.86-1.74(m,1H).
实施例3：式(II)化合物B晶型的制备
称取1g式(I)化合物加入到50毫升单口瓶中，加入乙腈(9毫升)溶解。加入磁子后，将上述溶液置于磁力加热搅拌器上(90℃)搅拌，90℃下加入甲磺酸(155微升)的乙腈溶液(1毫升)搅拌。缓慢降温至20摄氏度并继续搅拌12小时，所得悬浮液过滤，滤饼干燥后得式(II)化合物的B晶型。
称取1g式(I)化合物加入到50毫升单口瓶中，加入乙酸乙酯(10毫升)溶解。加入磁子后，将上述溶液置于磁力加热搅拌器上(90℃)搅拌，90℃下加入甲磺酸(155微升)的乙酸乙酯溶液(1毫升)搅拌1小时。缓慢降温至20摄氏度并继续搅拌12小时，所得悬浮液过滤，滤饼干燥后得式(II)化合物的B晶型。
称取1g式(I)化合物加入到50毫升单口瓶中，加入乙酸异丙酯(9毫升)溶解。加入磁子后，将上述溶液置于磁力加热搅拌器上(20℃)搅拌，20℃下加入甲磺酸(155微升)的乙酸异丙酯溶液(1毫升)搅拌。缓慢降温至4摄氏度并继续搅拌17小时，所得悬浮液过滤，滤饼干燥后得式(II)化合物的B晶型。
称取350g如前述制备方法所得的式(II)化合物B晶型加入到5升单口瓶中，加入二甲基亚砜(455毫升)，并加热至60～70摄氏度直至完全溶解。在60～70摄氏度下经过1小时滴加乙酸异丙酯(3升)，于该温度下搅拌1小时。混合液搅拌下经4～6小时缓慢降温至25～30摄氏度，并在该温度下搅拌12小时得到乳白色悬浊液。反应液过滤后得到淡黄色滤饼，滤饼用乙酸异丙酯充分搅拌洗涤两次(500毫升×2)，恒温抽滤后得到的滤饼真空干燥得粗产品。加入丙酮(4.6升)并于55～60摄氏度搅 拌16小时，过滤。所得滤饼再次加入丙酮(3.9升)于55～60摄氏度搅拌16小时，过滤，滤饼干燥后得式(II)化合物的B晶型。
1H NMR(400MHz,DMSO-d
6)δ＝12.55(s,1H),9.84-9.66(m,1H),8.03(br d,J＝6.8Hz,1H),7.72(s,1H),7.70-7.53(m,1H),7.24(dd,J＝2.0,8.7Hz,1H),6.81(d,J＝8.8Hz,1H),4.60(q,J＝5.6Hz,1H),4.52-4.43(m,2H),4.05-3.62(m,2H),3.61-3.37(m,4H),3.29(br s,2H),3.23-2.99(m,1H),2.96(br t,J＝6.8Hz,2H),2.40-2.31(m,5H),2.14-1.94(m,6H).
实施例4：式(I)化合物C晶型的制备
取4g的式(I)化合物，加入12毫升乙酸异丙酯溶解，然后在搅拌下缓慢加入30毫升的正庚烷。25℃下搅拌12小时，所得悬浮液过滤，滤饼干燥后得式(I)化合物的C晶型。
1H NMR(400MHz,CD
3OD)δ＝7.92(d,J＝1.3Hz,1H),7.72(d,J＝1.3Hz,1H),7.18(dd,J＝2.4,8.8Hz,1H),6.85(d,J＝8.8Hz,1H),4.55(t,J＝5.9Hz,1H),4.47-4.37(m,2H),3.41-3.33(m,2H),3.08(br t,J＝7.0Hz,2H),2.98(dd,J＝7.1,9.9Hz,1H),2.79(dt,J＝6.3,8.6Hz,1H),2.68-2.58(m,3H),2.54(dd,J＝4.9,10.0Hz,1H),2.46-2.30(m,3H),2.19-2.11(m,2H),2.00-1.84(m,2H),1.82-1.71(m,1H)。LCMS(ESI)m/z:507.2[M+H]
+
实验例1：生物测试
(1)ERα结合实验：在放射性配体结合试验中评价式(I)化合物的活性
实验材料：
雌激素ERα
来源：人重组昆虫Sf9细胞
配体：0.5nM[
3H]雌二醇
溶媒：1.0％DMSO
非特异性配体：1.0μM己烯雌酚
孵育时间/温度：2小时@25℃
特异性结合：85％
孵育缓冲液：10mM Tris-HCl，pH 7.4,0.1％BSA,10％甘油，1mM DTT
定量方法：放射性配体结合
Kd：0.2nM
具有显著性的标准：≥50％最大激活或抑制
Bmax：1400pmol/mg蛋白
实验方法：
本研究中采用的方法采自科研文献(Obourn,J.D.et al.,Biochemistry,1993,32,6229-6236)。
数据分析：
利用MathIQ
TM(ID Business Solutions Ltd.,UK)软件采用非线性、最小二乘回归法得到IC
50值。所展示出的抑制常数(K
i)，由实验测得的供试化合物IC
50、试验中使用的放射性配体浓度和配体K
D的历史值(在Eurofins Panlabs,Inc.通过实验获得)，通过Cheng和Prusoff方程(Cheng,Y.,Prusoff,W.H.,Biochem.Pharmacol.22:3099-3108,1973)计算得出。如所示，定义竞争性结合曲线斜率的希尔系数(n
H)采用MathIQ
TM计算得出。如果希尔系数严重偏离数值1，可能表明该结合置换不符合单个结合位点的质量作用定律。如果IC
50、K
i和/或n
H数据不包括平均值的标准误差(SEM)，数据不足以定量，应谨慎 解释该数据(K
i、IC
50、n
H)。
表4 ERα结合实验结果
结论：
本发明化合物在体外与ERα具有较强结合作用。
(2)HEK293/GAL4/ERα拮抗实验
实验材料：
表5
| 名称 | 生产厂家 |
| DMEM培养基 | Viva Cell |
| DMEM培养基无酚红 | Basal Media |
| 胎牛血清 | Biosera |
| 碳吸附血清 | Biosun |
| DMSO | 国药 |
| 96孔细胞培养板 | Corning |
| 96孔化合物板 | 上海晶饶生物科技有限公司 |
| Bright-Glo TM Luciferase Assay | Promega |
| 细胞培养皿 | 耐思 |
| Estradiol | 陶术 |
| EDTA | Basal Media |
细胞信息及培养条件：
表6
实验培养基：
DMEM(无酚红)，含碳吸附血清10％，即500mL细胞培养基中包含450mL DMEM，50mL碳吸附血清
Bright Glo检测试剂：
Bright-Glo
TM Luciferase Assay试剂盒中包含两种试剂：
Bright-Glo
TM Buffer
Bright-Glo
TM Substrate
使用前将两种试剂平衡到室温(25℃)，之后再将两种试剂混合，待试剂完全溶解后可使用，未用完的Bright Glo可储存在-20℃继续使用。
实验设计：
分析式(I)化合物对ERα的拮抗作用，设置三复孔，化合物浓度范围为：200nM至0.00256nM。实验步骤：
1)将HEK293/GAL4/ERα细胞悬液收集起来，1000转/分钟离心5分钟，去掉上清，用预热的实验培养基重悬，计数后用实验培养基稀释细胞悬液。按照40000细胞每孔接种到96孔细胞培养板中，每孔接种80μL细胞悬液，37℃，5％CO
2培养箱，孵育过夜。
2)实验当天，按照化合物排布图，每孔加入10μL化合物工作液到细胞板中，37℃，5％CO
2培养箱，继续孵育1小时，再每孔加入10μL含有10nM Estradiol的Assay培养基，空白对照加入10μL Assay培养基，Estradiol终浓度为1nM。细胞板在37℃，5％CO
2培养箱中继续孵育24小时。
3)结束孵育后，去掉细胞上清，细胞板每孔加入50μL Bright Glo检测试剂，25℃，孵育2分钟。结束孵育后，使用EnVision进行发光信号检测。
数据分析：
数据根据如下公式计算化合物处理后的ERa抑制率：％抑制率＝100-(RFU化合物–RFU空白对照)/(RFU阴性对照–RFU空白对照)×100％。阴性对照：1nM Estradiol处理的细胞；空白对照：无Estradiol处理的细胞，然后利用Prism作图计算化合物的IC
50值。
实验结果
式(I)化合物对HEK293/GAL4/ERα的拮抗作用IC
50如下表7所示。
表7化合物对HEK293/GAL4/ERα的拮抗作用总结
实验结论：
式(I)化合物对HEK293/GAL4/ERα转录功能有明显的拮抗作用。
(3)MCF-7、T-47D、CAMA-1细胞ERα降解实验
实验材料：
表8
细胞信息及培养条件：
表9
检测试剂配制：
TritonX-100配制：将TritonX-100用DPBS稀释100倍得1.00％TritonX-100。
含0.100％Tween 20的封闭缓冲液配制：将Tween 20用封闭缓冲液稀释1000倍得含0.100％Tween 20的封闭缓冲液。
一抗稀释液配制：将一抗(Estrogen Receptor alpha Monoclonal Antibody(SP1))储存液用含0.100％Tween-20的封闭缓冲液稀释1000倍，得到一抗稀释液。
二抗和DRAQ5混合液配制：以含0.100％Tween-20的封闭缓冲液稀释二抗(LI-COR-926-32211，1:1000稀释)和DRAQ5(DR51000，1:2000稀释)，混匀。
实验步骤：
1)吸出培养瓶中的完全培养基，加入适量的胰蛋白酶润洗后吸出以去除残留血清。
2)培养瓶中加入适量胰蛋白酶二次润洗后吸出，将培养瓶放在培养箱中2-3分钟后取出，晃动培养瓶使细胞脱落。
3)用新鲜完全培养基重悬细胞并用细胞计数仪计数。
4)根据铺板密度配置细胞悬液。
5)384孔板每孔加入30.0μL细胞悬液。
6)实验孔板放置到离心机中于1000rpm离心1分钟。
7)将实验孔板置于细胞培养箱中过夜培养。
8)根据实验孔板加样示意图(见3.5.1)，每孔中加入20.0μL稀释好的待测样品。DMSO在反应体系中的终浓度为1.00％。
9)实验孔板放置到离心机中于1000rpm离心1分钟。
10)将孔板放置在37℃，5％CO
2培养箱培养4小时。
11)将板子取出，室温下平衡10分钟后，去除孔板中培养基。
12)每孔加入100μL 4.00％PFA，室温固定40分钟。
13)拍掉板子里的液体，使用multidrop加入1×PBS，每孔100μL，重复洗板两次。
14)加入50μL含0.1％TritonX-100的冰PBS透化，在室温下放置15分钟。
15)拍掉板中液体，使用multidrop往板子里加入PBS每孔100μL，拍掉，如此洗板五次。
16)每孔50μL加入含0.1％Tween-20的封闭缓冲液(LI-COR-927-40000)，室温下封闭1小时。
17)拍掉板中缓冲液。
18)将一抗稀释液按每孔25μL加入384孔板。4℃孵育过夜。
19)拍掉板中一抗，用multidrop加PBS洗板五次。
20)每孔加入25μL二抗和DRAQ5混合液，室温孵育1小时。
21)使用Multidrop加入PBS洗板5次。
22)加入ddH
2O洗板2次，拍干。
23)用Odyssey远红外成像系统仪器读板。
数据分析
高对照组平均值：计算高对照组的平均值；低对照组平均值：计算低对照组的平均值；高对照组标准差(SD)：计算高对照组的标准差；低对照组标准差(SD)：计算低对照组的标准差。
高对照组变异系数(CV)＝(高对照组标准差÷高对照组平均值)×100
低对照组变异系数(CV)＝(低对照组标准差÷低对照组平均值)×100
实验窗口＝高对照组平均值÷低对照组平均值
Z值＝1-[3×(高对照组标准差+低对照组标准差)÷(高对照组平均值-低对照组平均值)]
抑制率(％)＝(1-(实验孔信号值-低对照组的平均值)/(高对照组平均值-低对照组的平均值))×100
用数据分析软件Graph Pad Prism 7.0计算IC
50值。
分析质控标准：实验窗口>2，Z值>0.5，参考/阳性化合物数据一致。
实验结果：
本实验评估了式(I)化合物对MCF-7、T-47D、CAMA-1细胞内ERα蛋白表达的影响，在用药物处理4小时后，通过ICW实验检测ERα蛋白的表达水平。结果如下：
表10化合物对ERα的降解作用总结
| 细胞 | IC 50(nM) |
| MCF-7 | 0.235 |
| T-47D | 0.780 |
| CAMA-1 | 1.25 |
实验结论：
式(I)化合物在多种乳腺癌细胞中对ERα具有明显的降解作用。
(4)MCF-7、T-47D和CAMA-1细胞增殖抑制作用实验
实验材料：
表11
细胞信息及培养条件：
表12
饥饿培养基：
1.CAMA-1：EMEM(无酚红)，含碳吸附血清10％，即500mL细胞培养基中包含440mL EMEM，50mL碳吸附血清，5mL NEAA，5mL 100mM丙酮酸钠；
2.T-47D：RPMI-1640(无酚红)，含碳吸附血清10％，即500mL细胞培养基中包含450mL RPMI-1640，50mL碳吸附血清。
实验设计
分析受试化合物式(I)化合物对MCF-7、CAMA-1和T-47D细胞增殖的抑制作用。MCF-7测试10个浓度梯度，设置三个重复，化合物浓度范围为100nM至0.0003815nM；CAMA-1测试 9个浓度梯度，设置三个重复，化合物浓度范围为100nM至0.001526nM；T-47D测试9个浓度梯度，设置三个重复，化合物浓度范围为2μM至0.00512nM，分别进行两次独立实验。
实验步骤：
MCF-7细胞：
用胰酶消化已达到80％细胞融合的MCF-7细胞，离心重悬计数。并用对应培养基制成细胞悬液，384孔板中每孔加入45μL/孔细胞悬液，置于含5％CO
2的细胞培养箱中37℃培养。受试化合物式(I)用DMSO溶液以浓度20μM为起始浓度4×递减稀释10个浓度。细胞培养过夜后，用对应细胞培养基将稀释好的化合物进行进一步稀释，并将稀释好的混合液分别转移至相应的细胞板中，化合物终浓度为100nM为起始浓度，4×递减稀释10个浓度，阳性对照孔为2μM氟维斯群，混匀离心，置于含5％CO
2的细胞培养箱中37℃培养上表对应天数。
T-47D细胞：
将T-47D细胞使用饥饿培养基饥饿处理三天后用胰酶消化，离心重悬计数。分别用对应培养基制成细胞悬液后，细胞移入384孔板中每孔加入40μL/孔细胞悬液，置于含5％CO
2的细胞培养箱中37℃培养。受试化合物式(I)用DMSO溶液以浓度400μM为起始浓度5×递减稀释9个浓度。细胞培养过夜后，用对应细胞培养基将稀释好的化合物进行进一步稀释，并将稀释好的混合液分别转移至相应的细胞板中，化合物终浓度为2μM为起始浓度，5×递减稀释9个浓度，阳性对照孔为2μM氟维斯群，整板加入1nM雌二醇，混匀离心，置于含5％CO
2的细胞培养箱中37℃培养上表对应天数。
CAMA-1细胞：
CAMA-1细胞使用饥饿培养基饥饿处理三天后用胰酶消化，离心重悬计数。分别用对应培养基制成细胞悬液后，移入96孔板中每孔加入80μL/孔细胞悬液，置于含5％CO
2的细胞培养箱中37℃培养。受试化合物式(I)用DMSO溶液以浓度20μM为起始浓度4×递减稀释9个浓度。细胞培养过夜后，用对应细胞培养基将稀释好的化合物进行进一步稀释，并将稀释好的混合液分别转移至相应的细胞板中，化合物终浓度为100nM为起始浓度，4×递减稀释9个浓度，阳性对照孔为2μM氟维斯群，整板加入1nM雌二醇后混匀离心，置于含5％CO
2的细胞培养箱中37℃培养上表对应天数。
化合物孵育到上述时间后取细胞培养板，加入CTG试剂，混匀离心，室温孵育10分钟。使用Envision多标记分析仪读数。
数据分析：
数据根据如下公式计算化合物处理后的细胞活率：％抑制率＝100-(RFU化合物–RFU阳性对照)/(RFU阴性对照–RFU阳性对照)×100％。阳性对照：2μM氟维斯群处理的细胞；阴性对照：0.5％DMSO处理的细胞，然后利用Prism 5作图计算化合物的IC
50值。IC
50计算公式为log(inhibitor)vs.response-Variable slope。
实验结果：
本实验分析待测式(I)化合物对MCF-7、CAMA-1和T-47D细胞增殖的抑制作用，设置三个重复，进行两次独立实验评价。
化合物对细胞增殖抑制的IC
50如下表。
表13化合物对细胞增殖的抑制作用
实验结论
式(I)化合物在MCF-7、CAMA-1和T-47D细胞上展现出明显的体外抗增殖活性。
(5)HCC1428和MDA-MB-134VI细胞增殖抑制作用实验
实验材料：
表14
| 试剂 | 品牌 |
| DMSO | Sigma |
| MDA-MB-134Ⅵ | COBIOER |
| HCC1428 | COBIOER |
| DMEM | ATCC |
| RPMI1640 | ATCC |
| TrypLE TM Express Enzyme(1X),no phenol red | Gibco |
| Penicillin-streptomycin | Gibco |
| DPBS | Gibco |
| CellTiter Glo assay kit(CTG) | Promega |
| T75 flask | Corning |
| 96-well,Flat Bottom | Corning |
实验设计：
式(I)化合物检测起始浓度为200nM，4倍梯度稀释，10个浓度梯度。
实验步骤
MDA-MB-134VI细胞：
1)用含有20％FBS和1％PenStrep的DMEM完全生长培养基培养MDA-MB-134Ⅵ细胞。
2)当细胞在T75培养瓶中达到80～90％汇合度时，使用胰酶消化并收集细胞，第一次和第二次独立实验细胞代数分别为第八代和第六代。
3)1000转速离心细胞，用完全培养基重悬计数，测得第一次和第二次独立实验的细胞密度分别为每毫升3.60×10
6和每毫升1.93×10
6个细胞，活率均大于95％。
4)用完全培养基配制细胞悬液，两次实验中细胞悬液密度均为每毫升4.00×10
4个细胞，每孔种植8000个细胞/195μL至96孔圆底孔板,在37℃&5％CO
2培养箱中孵育过夜。
5)第二天加入5μL稀释好的化合物，使DMSO的最终浓度0.1％。以DMSO孔作为High control，Medium only孔作为Low Control。
6)MDA-MB-134Ⅵ细胞在37℃&5％CO
2培养箱孵育10天。
7)从培养箱取出细胞将其平衡至室温，1000转速离心5分钟，每孔弃掉100μL细胞培养上清，加入100μL CellTiter Glo。室温避光孵育30分钟。
8)使用BMG读取Luminescence值。
按照上述步骤进行两次独立重复实验。
HCC1428细胞：
1)用含有10％FBS和1％PenStrep的RPMI1640完全生长培养基培养HCC1428细胞。
2)当细胞在T75培养瓶中达到80～90％汇合度时，使用胰酶消化并收集细胞，第一次和第二次独立实验细胞代数分别为第七代和第十三代。
3)1000转速离心细胞，用完全培养基重悬计数，测得第一次和第二次独立实验的细胞密度分别为每毫升1.30×10
6和每毫升9.50×10
5个细胞，活率均大于95％。
4)用完全培养基配制细胞悬液，两次实验中细胞悬液密度均为每毫升1.25×10
4个细胞，每孔种植2500个细胞/195μL至96孔圆底孔板,在37℃&5％CO
2培养箱中孵育过夜。
5)加入5μL稀释好的化合物，使DMSO的最终浓度0.1％。以DMSO孔作为High control，Medium only孔作为Low Control。
6)在37℃&5％CO
2培养箱孵育7天。
7)从培养箱取出细胞将其平衡至室温，1000转速离心5分钟，每孔弃掉100μL细胞培养上清，加入100μL CellTiter Glo。室温避光孵育30分钟。
8)使用BMG读取Luminescence值。
按照上述步骤进行两次独立重复实验。
数据分析
将阴性对照的读值设为0％抑制率，阳性对照的读值设为100％抑制率，计算各测试溶液的抑制率。
DMSO对照孔信号值的平均值
Medium only对照孔信号值的平均值
利用以下非线性拟合公式来得到化合物的IC
50(半数抑制浓度)：
Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC
50-X)*HillSlope))
X:化合物浓度log值
Y:化合物抑制率(％inh)
Z'因子计算方程：
Z'＝1-3*(SD_H+SD_L)/(Ave_H-Ave_L)
SD为标准误差，AVE为平均值。
实验结果
本实验分析式(I)化合物对MDA-MB-134VI和HCC1428细胞增殖的抑制作用，化合物对细胞增殖抑制的IC
50如下表。
表15化合物对细胞增殖的抑制作用
实验结论：
式(I)化合物在MDA-MB-134VI和HCC1428细胞上展现出明显的体外抗增殖活性。
(6)MCF-7突变细胞系MCF-7 ESR1-Y537S和MCF-7 ESR1-D538G增殖抑制作用实验
实验材料：
表16
| 名称 | 生产厂家 |
| RPMI-1640(without phenol) | Thermo |
| Dulbecco's PBS | Hyclone |
| EMEM | ATCC |
| FBS | Hyclone |
| L-Glutamine | GIBCO |
| Non Essential Amino Acids(NEAA) | GIBCO |
| Antibiotic-antimycotic | GIBCO |
| 0.25％Trypsin | GIBCO |
| DMSO | SIGMA |
细胞信息及培养条件：
表17
| 细胞名称 | 细胞来源 | 培养方法 |
| MCF-7 ESR1-Y537S | WuXi | EMEM+10％FBS+2mM L-Glutamine+0.1％NEAA |
| MCF-7 ESR1-Y537S | WuXi | EMEM+10％FBS+2mM L-Glutamine+0.1％NEAA |
实验方法及步骤：
1.细胞培养
将肿瘤细胞系在37℃，5％CO
2的培养箱中进行培养。定期传代，取处于对数生长期的细胞用于铺板。
2.细胞铺板
1)用台盼兰进行细胞染色并计数活细胞。
2)将细胞使用PBS清洗一次后重悬于无酚红的RPMI 1640+10％FBS培养基中，浓度调整至合适浓度。
3)在培养板中每孔加入135μL细胞悬液，在空白对照孔中加入不含细胞的培养液。
4)将培养板在37℃,5％CO
2,及100％相对湿度的培养箱中培养过夜。
3. 10X化合物工作液的配制及化合物处理细胞
1)10X化合物工作液的配制：在V形底的96孔板中加入199μL细胞培养液，从2000X化合物存储 板中吸取1μL化合物加入96孔板的细胞培养液中。在溶媒对照和空白对照中加入1μL DMSO。加入化合物或DMSO后用排枪吹打混匀。
2)加药：取15μL的10X化合物工作液按表1所示加入到细胞培养板中。在溶媒对照和空白对照中加入15μL DMSO-细胞培养液混合液。DMSO终浓度为0.05％。
3)将96孔细胞板放回培养箱中培养，细胞培养7天后检测。
4.CellTiter-Glo发光法细胞活性检测
以下步骤按照Promega CellTiter-Glo发光法细胞活性检测试剂盒(Promega-G7573)的说明书来进行。
1)将CellTiter-Glo缓冲液融化并放置至室温。
2)将CellTiter-Glo底物放置至室温。
3)在一瓶CellTiter-Glo底物中加入CellTiter-Glo缓冲液以溶解底物，从而配制CellTiter-Glo工作液。
4)缓慢涡旋震荡使底物充分溶解。
5)取出细胞培养板放置30分钟使其平衡至室温。
6)在每孔中加入75μL(等于每孔中细胞培养液一半体积)的CellTiter-Glo工作液。用铝箔纸包裹细胞板以避光。
7)将培养板在轨道摇床上振摇2分钟以诱导细胞裂解。
8)培养板在室温放置10分钟以稳定发光信号。
9)在2104 EnVision读板器上检测发光信号。
数据分析：
用下列公式来计算检测化合物的抑制率(Inhibition rate，IR):IR(％)＝(1–(RLU化合物–RLU空白对照)/(RLU溶媒对照–RLU空白对照))*100％。在Excel中计算不同浓度化合物的抑制率，然后用GraphPad Prism(6.02.328)软件使用log(inhibitor)vs.response--Variable slope拟合抑制曲线，并得出相关参数。
相对IC
50是使曲线降至曲线顶部与底部平台之间一半的点所需的浓度，相对IC
90是使曲线降至曲线顶部与底部平台之间90％的点所需的浓度。
实验结果：
本实验分析待测化合物式(I)对两种突变MCF-7细胞增殖的抑制作用，化合物对细胞增殖抑制的IC
50如下表。
表18化合物对细胞增殖的抑制作用
| 细胞系 | 相对IC 50(nM) | 相对IC 90(nM) |
| MCF-7 ESR1-Y537S | 11.17 | 100.53 |
| MCF-7 ESR1-D538G | 2.90 | 26.1 |
实验结论：
式(I)化合物在ESR1-Y537S和ESR1-D538G突变的MCF-7细胞上展现出明显的体外抗增殖活性。
实验例2：DMPK性质评价
(1)对胞色素P450同工酶的抑制性研究
实验材料：
表19
实验方法及步骤：
将探针底物、供试品、人肝微粒体与辅助因子共同孵育，LC-MS/MS检测探针底物产生的代谢产物的浓度，从而计算出IC
50值。溶剂对照样品不加供试品而加入等量溶剂，并将溶剂对照样品的酶活作为100％。实验所用人肝微粒体浓度，各CYP对应的探针底物浓度、孵育时间、阳性对照和代谢产物等详细信息见下表：
表20
供试品和阳性对照抑制剂孵育：
所有样品在37℃水浴锅条件下进行孵育反应，供试品的每个浓度为三个平行，阳性对照抑制剂的每个浓度为两个平行，孵育体系包含相应同工酶的探针底物(指定浓度)和微粒体(0.100mg protein/mL)的混合工作液以及供试品或阳性对照抑制剂(一系列终浓度)的工作液。所有样品在37℃条件下预热10分钟，然后加入辅助因子启动反应。对于以咪达唑仑为探针底物的CYP3A代谢反应，反应时间为3分钟，其余反应均为10分钟。
溶剂对照孵育：
溶剂对照数据作为一个基底值，用来计算孵育体系中各同工酶的活性。溶剂对照分为两种：(1)供试品的溶剂对照，三个平行，孵育体系包含相应同工酶的探针底物(指定浓度)和微粒体(0.100mg/mL)的混合工作液以及相应的溶剂DMSO：甲醇(v:v，1:9)；(2)阳性对照抑制剂的溶剂对照，两个平行，孵育体系包含相应同工酶的探针底物(指定浓度)和微粒体(0.100mg protein/mL)的混合工作液以及相应的溶剂甲醇。所有样品在37℃条件下预热10分钟，然后加入辅助因子启动反应。对于以咪达唑仑为探针底物的CYP3A代谢反应，反应时间为3分钟，其余反应均为10分钟。
样品处理：
各个同工酶的孵育体系到达相应的反应时间后，加入200μL含有相应内标的终止液至反应板中终止反应。充分震荡后置于离心机以3220×g离心20分钟，然后取出上清液并按一定比例加入合适的稀释液稀释。将反应板置于摇板机上摇板至混合均匀。然后用LC-MS/MS对探针底物的代谢物进行分析，若样品不能立即进行分析，储存样品于2-8℃备用。
孵育后的样品经蛋白沉淀后用LC-MS/MS对探针底物的代谢物进行定量分析。
数据分析：
用各探针底物代谢物的生成速率体现各CYP同工酶的活性。设定不加供试品或阳性抑制剂的溶剂对照孵育体系中各同工酶的活性为100％，将含不同浓度供试品或阳性抑制剂时探针底物代谢产物的生成速率与溶剂对照样品代谢产物的生成速率相比再乘以100％作为各同工酶的剩余活性百分比。以剩余活性百分比为纵坐标，抑制剂浓度为横坐标，使用SigmaPlot(V.14)软件中三参数或四参数进行非线性回归分析，计算得到供试品及各阳性抑制剂的IC
50值。当SigmaPlot软件拟合得到的IC
50大于最高给药浓度(100μM)或无法拟合得到IC
50时，则IC
50值标记为“>100μM”。
三参数方程：
四参数方程：
max：最大酶活性。
min：最小酶活性。
x：供试品或阳性对照抑制剂的浓度。
y：对应浓度下的酶活性。
hillslope：斜率。
IC
50：半抑制浓度。
当最小酶活性在±10％内时使用四参数方程，否则使用三参数方程。
实验结果：
式(I)化合物对CYP1A2的IC
50值为97.2μM，对CYP3A(以咪达唑仑为底物)的IC
50值为8.38μM，对CYP3A(以睾酮为底物)的IC
50值为10.9μM。本发明的化合物对CYP酶抑制较弱，预示药物相互作用风险低。
(2)小鼠体内药代动力学研究
实验目的：以雌性Balb/c小鼠为受试动物，应用LC/MS/MS法测定小鼠静脉和灌胃给予受试化合物后不同时刻血浆中的药物浓度。研究式(I)化合物C晶型在小鼠体内的药代动力学行为，评价其药代动力学特征。
实验方案：
试验动物：动物购买自上海灵畅生物技术有限公司。
药物配制：
称取适量样品，配制为1mg/mL溶液，搅拌超声后达到澄清状态，溶媒为15％HP-β-CD。
给药：禁食一夜后，IV组进行静脉给药，给药剂量为5mg/kg；PO组分别进行灌胃给药，给药剂量为10mg/kg。
实验操作：
雌性Balb/c小鼠静脉注射组给予受试化合物后，在0.0833，0.25，0.5，1，2，4，8，及24小时从隐静脉采血30μL，置于预先加有EDTA-K
2的商品化抗凝管中。灌胃给药组给予受试化合物后，分别在0.25，0.5，1，2，4，8，12及24小时从颈静脉采血30μL，置于预先加有EDTA-K
2的商品化抗凝管中，随后离心处理(3,200g，4℃，10分钟)后取血浆，将血浆转移至预冷的离心管，在干冰中速冻，并储存在-60℃或更低的超低温冰箱中，直到进行LC-MS/MS分析。给药4小时后动物可进食。用LC/MS/MS法测定小鼠静脉和灌胃给药后，血浆中的受试化合物含量。方法的线性范围为2.00～2000nM。
实验结果：
表21小鼠药代动力学表征参数
式(I)化合物C晶型在小鼠体内代谢稳定，组织分布大，口服吸收利用度大，预示着在生物体内有良好的药代动力学特征。
(3)大鼠体内药代动力学研究
实验目的：以雌雄Sprague-Dawley大鼠为受试动物，应用LC/MS/MS法测定大鼠静脉和灌胃给予受试化合物后不同时刻血浆中的药物浓度。研究式(II)化合物B晶型在大鼠体内的药代动力学行为，评价其药代动力学特征。
实验方案：
试验动物：动物购买自北京维通利华实验动物技术有限公司。
药物配制：
称取适量样品，配制为0.2mg/mL溶液，搅拌后达到澄清状态，溶媒为20％SBE-β-CD。
给药：禁食一夜后，IV组进行静脉给药，给药剂量为1mg/kg；PO组分别进行灌胃给药，给药剂量为2mg/kg。
实验操作：
雌雄Sprague-Dawley大鼠静脉注射组分别给予受试化合物后，在0.0830，0.250，0.500，1.00，2.00，4.00，6.00，8.00，24.0，32.0及48.0小时从颈静脉采血200μL，置于预先加有EDTA-K
2的商品化抗凝管中。灌胃给药组分别给予受试化合物后，分别在0.250，0.500，1.00，2.00，4.00，6.00，8.00，24.0，32.0及48.0小时从颈静脉采血200μL，置于预先加有EDTA-K
2的商品化抗凝管中，随后离心处理(3,200g，4℃，10分钟)后取血浆，将血浆转移至预冷的离心管，在干冰中速冻，并储存在-60℃或更低的超低温冰箱中，直到进行LC-MS/MS分析。给药4小时后动物可进食。用LC/MS/MS法测定大鼠静脉和灌胃给药后，血浆中的受试化合物含量。方法的线性范围为2.00～2000nM。
实验结果：
表22大鼠药代动力学表征参数
式(II)化合物B晶型在大鼠体内代谢稳定，组织分布大，口服吸收利用度大，预示着在生物体内有良好的药代动力学特征。
(4)犬体内药代动力学研究
实验目的：以雌雄比格犬为受试动物，应用LC/MS/MS法测定比格犬静脉和灌胃给予受试化合物后不同时刻血浆中的药物浓度。研究式(II)化合物B晶型在比格犬体内的药代动力学行为，评价其药代动力学特征。
实验方案：
试验动物：动物购买自北京玛斯生物技术有限公司。
药物配制：
称取适量样品，配制为0.2和0.3mg/mL溶液，搅拌后达到澄清状态，溶媒为20％SBE-β-CD。
给药：禁食一夜后，IV组进行静脉给药，给药剂量为0.3mg/kg；PO组分别进行灌胃给药，给药剂量为1mg/kg。
实验操作：
比格犬静脉注射组分别给予受试化合物后，在0.25，0.5，1，2，4，6，8，24，32，48，72及96小时从外周静脉采血800μL，置于预先加有EDTA-K
2的商品化抗凝管中。灌胃给药组分别给予受试化合物后，分别在0.25，0.5，1，2，4，6，8，24，32，48，72及96小时从外周静脉采血800μL，置于预先加有EDTA-K
2的商品化抗凝管中，随后离心处理(3,200g，2-8℃，10分钟)后取血浆，将血浆转移至预冷的离心管，在干冰中速冻，并储存在-60℃或更低的超低温冰箱中，直到进行LC-MS/MS分析。给药4小时后动物可进食。用LC/MS/MS法测定比格犬静脉和灌胃给药后，血浆中的受试化合物含量。方法的线性范围为2.00～2000nM。
实验结果：
表23比格犬药代动力学表征参数
本发明的式(II)化合物B晶型在比格犬体内代谢稳定，组织分布大，口服吸收利用度大，预示着在生物体内有良好的药代动力学特征。
实验例3：体内药效评价
(1)乳腺癌MCF-7细胞皮下异种移植肿瘤BALB/c裸小鼠模型的体内药效学研究
实验目的：本试验使用人乳腺癌MCF-7细胞皮下异种移植肿瘤裸小鼠模型评价式(I)化合物C晶型的体内药效。
实验材料：
表24
| 名称 | 生产厂家 |
| EMEM培养基 | ATCC |
| 胰酶 | Gibco |
| Matrigel | CORNING |
| Anti-anti | Gibco |
| 胎牛血清 | Cellmax |
实验方法及步骤：
细胞培养准备：
人乳腺癌MCF-7细胞体外常规单层培养，培养条件为EMEM(EBSS；ATCC)培养基中加10％胎牛血清(Cellmax)，2mM谷氨酰胺(Gibco)和1％非必需氨基酸(NEAA；Gibco)，37℃5％CO
2孵箱培养。一周两次用胰酶-EDTA(Gibco)进行常规消化处理传代。当细胞饱和度为80％-90％，数量到达要求时，收取细胞，计数，接种。
实验动物：购买自北京维通利华实验动物技术有限公司(浙江分公司)。
肿瘤细胞接种及分组
细胞接种：将雌激素片(0.36mg/片；IRA)皮下接种于每只小鼠的左后背，三天后，将0.2mL(1×107个)MCF-7细胞(加基质胶；CORNING，体积比为1:1)皮下接种于每只小鼠的右后背，肿瘤平均体积达到188mm
3时开始分组给药。
表25实验动物分组及给药方案
药物配制：
称取适量式(I)化合物样品，分别配制为0.1、0.3、1和3mg/mL溶液，涡旋片刻后超声成澄清透明溶液，溶媒为10％HP-β-CD。称取适量Palbociclib，配制为2.5mg/mL溶液，调节pH为4.0，涡旋片刻后超声成澄清透明溶液，溶媒为50mM乳酸钠缓冲液。氟维司群采用市售注射液药物芙仕得。
肿瘤测量和实验指标：
每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b
2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。
化合物的抑瘤疗效用TGI(％)或相对肿瘤增殖率T/C(％)评价。相对肿瘤增殖率T/C(％)＝T
RTV/C
RTV×100％(T
RTV：治疗组RTV平均值；C
RTV：对照组RTV平均值)。根据肿瘤测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)，计算公式为RTV＝V
t/V
0，其中V
0是分组给药时(即D0)测量所得肿瘤体积，V
t为某一次测量时的肿瘤体积，T
RTV与C
RTV取同一天数据。
TGI(％)，反映肿瘤生长抑制率。TGI(％)＝[1-(某处理组给药结束时平均瘤体积－该处理组开始给药时平均瘤体积)/(对照组治疗结束时平均瘤体积－对照组开始治疗时平均瘤体积)]×100％。
联合用药指数按照金氏公式计算Q值，判断标准为Q值在0.85～1.15为协同相加(+)，>1.15～2.0为增强(++)，<0.85～0.55为拮抗(–)，<0.55为明显拮抗(––)；Q＝Ea+b/(Ea+Eb-Ea×Eb)其中Ea+b为联合用药组抑瘤率，Ea以及Eb分别为单用药组抑瘤率。
在实验结束后将检测肿瘤重量，并计算T/C
weight百分比，T
weight和C
weight分别表示给药组和溶媒对照组的瘤重。
统计分析基于试验结束时RTV的数据运用SPSS软件进行分析。组间比较用one-way ANOVA进行分析，方差不齐(F值有显著性差异)，应用Games-Howell法进行检验。p<0.05认为有显著性差异。
实验结果：
本实验评价了式(I)化合物C晶型在人乳腺癌异种移植瘤模型中的药效，以溶剂对照组为参照。各组在不同时间点的瘤体积及相应的统计分析结果如表14及图10所示，给药期间小鼠体重变化如图11所示。
给药后第21天，空白对照组的平均瘤体积为1225mm
3。式(I)化合物在1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg、或30mg/kg四种剂量下，其平均瘤体积分别为340mm
3、179mm
3、140mm
3、和121mm
3，T/C值分别为27.2％、14.8％、11.3％、和9.7％，TGI分别为85.3％、100.9％、104.6％、和106.5％，与对照组相比P值分别为0.003、0.001、0.001、和0.001；在10mg/kg及30mg/kg剂量下客观反应率(ORR)达25％；因此，式(I)化合物C晶型在以上剂量下均有显著抑瘤作用,随着剂量增加呈现一定的量效关系。
表26受试化合物对乳腺癌MCF7细胞皮下异种移植瘤模型的抑瘤效果
在第21天，氟维斯群(5mg/mouse)和哌柏西利(25mg/kg)单药组的平均瘤体积分别为593mm
3和781mm
3，T/C值分别为46.9％和64.0％，TGI分别为60.9％和42.8％，与对照组相比P值分别为0.019和0.219；因此，氟维斯群单药具有抗肿瘤作用，而哌柏西利单药未呈现抗肿瘤作用。与上述两种参照化合物相比，式(I)化合物C晶型在3mg/kg呈现出更强的抗肿瘤作用，其疾病控制率(DCR)达100％。
哌柏西利单药未见抗肿瘤作用；然而，当式(I)化合物(3mg/kg)与哌柏西利联合用药时，平均瘤体 积为79mm
3，T/C值为6.1％，TGI为110.5％；与对照组、哌柏西利、和式(I)化合物C晶型(3mg/kg)组相比P值分别为0.001、0.002、和0.012；其客观反应率(ORR)达87.5％；金氏公式计算Q值为1.10(+)，因此，联合用药呈现比式(I)化合物C晶型单药更强的抗肿瘤作用，为协同相加作用。实验结论：
与空白对照组相比，式(I)化合物C晶型在1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg或30mg/kg四种剂量下均有显著抑瘤作用，起效剂量为1mg/kg(TGI为85.3％)。当式(I)化合物C晶型(3mg/kg)与哌柏西利联合用药时，呈现比单药更强的抗肿瘤作用。荷瘤小鼠对式(I)化合物C晶型耐受良好。本发明的化合物在小鼠药效模型中展现出优秀的肿瘤抑制药效，具有良好的临床治疗潜力。
(2)在携带ESR1 D538G突变的人乳腺癌MCF-7细胞皮下异种移植肿瘤小鼠模型的体内药效学研究
实验目的：使用携带ESR1 D538G突变的人乳腺癌MCF7细胞在BALB/c Nude小鼠体内构建皮下异种移植肿瘤模型，以评价式(II)化合物B晶型的体内抗肿瘤作用。
实验材料：
表27
| 名称 | 生产厂家 |
| 胎牛血清 | 东岭 |
| EMEM | ATCC |
| PBS | Hyclone |
| EDTA | gibco |
| L-Glutamine | gibco |
| NEAA | gibco |
| Matrigel | Corning |
| Anti-anti | gibco |
实验方法及步骤：
细胞培养准备：
携带ESR1 D538G突变的人乳腺癌MCF7细胞在体外进行常规单层培养，培养条件为EMEM培养基中加10％胎牛血清，1％Antibiotic-Antimycotic，2mM L-Glutamine，1％NEAA，37℃5％CO
2孵箱培养。一周两次用胰酶-EDTA进行常规消化处理传代。当细胞饱和度为80％-90％，并且数量到达要求时，收集细胞，计数，接种。
实验动物：动物购买自北京维通利华实验动物技术有限公司。
肿瘤细胞接种及分组
细胞接种：将0.2mL(10×106个)MCF7 ESR1 D538G细胞(PBS+基质胶，体积比为1：1)皮下接种于每只小鼠的右后背，肿瘤平均体积达到147mm
3时开始分组给药。实验分组和给药方案见下表。给药的第一天记为0天。
表28实验动物分组及给药方案
药物配制：
称取适量式(II)化合物B晶型样品，分别配制为0.5、1.5和5.0mg/mL溶液，涡旋片刻后超声成澄清透明溶液，溶媒为10％HP-β-CD。称取适量哌柏西利，配制为5mg/mL溶液，调节pH为4.0，涡旋片刻后超声成澄清透明溶液，溶媒为50mM乳酸钠缓冲液。
肿瘤测量和实验指标：
每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b
2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。
化合物的抑瘤疗效用TGI(％)或相对肿瘤增殖率T/C(％)评价。相对肿瘤增殖率T/C(％)＝T
RTV/C
RTV×100％(T
RTV：治疗组RTV平均值；C
RTV：阴性对照组RTV平均值)。根据肿瘤测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)，计算公式为RTV＝V
t/V
0，其中V
0是分组给药时(即D0)测量所得肿瘤体积，V
t为某一次测量时的肿瘤体积，T
RTV与C
RTV取同一天数据。
TGI(％)，反映肿瘤生长抑制率。TGI(％)＝[1-(某处理组给药结束时平均瘤体积－该处理组开始给药时平均瘤体积)/(溶剂对照组治疗结束时平均瘤体积－溶剂对照组开始治疗时平均瘤体积)]×100％。
在实验结束后将检测肿瘤重量，并计算T/C
weight百分比，T
weight和C
weight分别表示给药组和溶媒对照组的瘤重。
统计分析基于试验结束时RTV的数据运用GraphPad Prism软件进行分析。多组间比较用one-way ANOVA进行分析，p<0.05认为有显著性差异，p>0.05认为无显著性差异。
实验结果：
本实验评价了式(II)化合物B晶型在携带ESR1 D538G突变的人乳腺癌MCF7细胞异种移植瘤模型中的药效，以空白对照组为参照。各组在不同时间点的瘤体积及统计学处理如图12及表29所示，给药期间小鼠体重变化如图13所示。
表29受试化合物对人乳腺癌MCF7 ESR1 D538G细胞皮下异种移植瘤模型的抑瘤效果
在分组后第31天，空白对照组的平均瘤体积为654mm
3。哌柏西利(50mg/kg)单药组平均瘤体积为295mm
3，T/C值为45.47％，TGI为70.91％，与空白对照组相比p值<0.0001；结果证实哌柏西利单药有显著抗肿瘤作用。式(II)化合物B晶型在5mg/kg、15mg/kg和50mg/kg剂量下平均瘤体积分别为153mm
3、124mm
3和43mm
3，T/C分别为24.15％、18.93％和6.37％，TGI分别为98.86％、104.52％和120.51％，与空白对照组相比p值均<0.0001。式(II)化合物B晶型在上述剂量下均有显著抗肿瘤作用，客观反应率呈现良好的剂量依赖性。式(II)化合物B晶型(5mg/kg)与哌柏西利(50mg/kg)联用组平均肿瘤体积为31mm
3，其T/C为4.67％，TGI为122.83％，与空白对照组p值<0.0001，与式(II)化合物B晶型或者哌柏西利单药组相比也具有统计学意义(p值<0.0001，协同因子为2.21)；联合用药组客观反应率达100％。因此，联合用药具有比单药更为显著抑瘤作用。
上述结果提示在携带ESR1 D538G突变的人乳腺癌MCF7细胞皮下异种移植肿瘤BALB/c nude小鼠模型中，式(II)化合物B晶型单药在5mg/kg、15mg/kg和50mg/kg剂量下均具有显著抗肿瘤作用。式(II)化合物B晶型在5mg/kg剂量下与哌柏西利(50mg/kg)联用具有协同抗肿瘤作用，且与式(II)化合物B晶型50mg/kg的抗肿瘤作用相当。
实验结论：
式(II)化合物B晶型对携带ESR1 D538G突变的MCF7小鼠皮下移植瘤生长具有抗肿瘤作用，并呈现一定的剂量依赖性；与哌柏西利联用时展现比单药更好的体内抗肿瘤效果。实验过程中，各受试组小鼠耐受性良好。
Claims (25)
- 式(III)化合物
- 式(III)化合物的A晶型，其特征在于，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有衍射峰：20.92±0.20°、22.08±0.20°、24.70±0.20°。
- 根据权利要求2所述的式(III)化合物的A晶型，其特征在于，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有衍射峰：12.30±0.20°、15.64±0.20°、17.00±0.20°、18.26±0.20°、20.92±0.20°、22.08±0.20°、22.62±0.20°、24.70±0.20°。
- 根据权利要求2所述的式(III)化合物的A晶型，其特征在于，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有衍射峰：5.18±0.20°、5.92±0.20°、8.12±0.20°、12.30±0.20°、15.64±0.20°、17.00±0.20°、18.26±0.20°、20.92±0.20°、22.08±0.20°、24.70±0.20°。
- 根据权利要求4所述的式(III)化合物的A晶型，其特征在于，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有衍射峰：5.18±0.20°、5.92±0.20°、8.12±0.20°、12.30±0.20°、15.64±0.20°、17.00±0.20°、18.26±0.20°、19.54±0.20°、20.92±0.20°、22.08±0.20°、22.62±0.20°、24.70±0.20°。
- 根据权利要求4所述的式(III)化合物的A晶型，其特征在于，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有衍射峰：5.18±0.20°、5.92±0.20°、8.12±0.20°、12.30±0.20°、15.64±0.20°、17.00±0.20°、18.26±0.20°、19.54±0.20°、20.92±0.20°、22.08±0.20°、24.70±0.20°、25.48±0.20°。
- 根据权利要求4所述的式(III)化合物的A晶型，其特征在于，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角 处具有衍射峰：5.18±0.20°、5.92±0.20°、8.12±0.20°、12.30±0.20°、15.64±0.20°、17.00±0.20°、18.26±0.20°、19.54±0.20°、20.92±0.20°、22.08±0.20°、22.62±0.20°、24.70±0.20°、25.48±0.20°。
- 根据权利要求2-7任意一项所述的式(III)化合物的A晶型，其特征在于，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有衍射峰：5.18±0.20°、5.92±0.20°、8.12±0.20°、12.30±0.20°、15.64±0.20°、16.42±0.20°、17.00±0.20°、17.66±0.20°、18.26±0.20°、19.54±0.20°、20.06±0.20°、20.92±0.20°、22.08±0.20°、22.62±0.20°、23.32±0.20°、23.86±0.20°、24.70±0.20°、25.48±0.20°、26.68±0.20°、28.50±0.20°、29.54±0.20°、31.58±0.20°、33.20±0.20°。
- 根据权利要求2-8任意一项所述的式(III)化合物的A晶型，其特征在于，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有衍射峰：5.181°、5.920°、8.119°、12.299°、15.638°、16.418°、17.002°、17.660°、18.261°、19.539°、20.061°、20.919°、22.080°、22.621°、23.320°、23.861°、24.700°、25.483°、26.681°、28.498°、29.542°、31.578°、33.198°。
- 根据权利要求2-8任意一项所述的式(III)化合物的A晶型，其特征在于，其X射线粉末衍射图谱基本上如图1所示。
- 根据权利要求2-9任意一项所述的式(III)化合物的A晶型，其特征在于，其热重分析曲线在150.000±3℃处失重达0.198％，在240.000±3℃处失重达10.880％。
- 根据权利要求11所述的式(III)化合物的A晶型，其特征在于，其热重分析曲线如图2所示。
- 根据权利要求2-9任意一项所述的式(III)化合物的A晶型，其特征在于，其差示扫描量热曲线在175.87±5℃、214.68±5℃和292.11±5℃处具有吸热峰的起始点。
- 根据权利要求13所述的式(III)化合物的A晶型，其特征在于，其差示扫描量热曲线如图3所示。
- 式(II)化合物的B晶型，其特征在于，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有衍射峰：14.24±0.20°、22.18±0.20°、23.78±0.20°。
- 根据权利要求15所述的式(II)化合物的B晶型，其特征在于，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有衍射峰：6.50±0.20°、14.24±0.20°、15.80±0.20°、18.18±0.20°、22.18±0.20°、23.78±0.20°、25.30±0.20°。
- 根据权利要求16所述的式(II)化合物的B晶型，其特征在于，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ 角处具有衍射峰：6.50±0.20°、7.86±0.20°、14.24±0.20°、15.80±0.20°、16.92±0.20°、18.18±0.20°、19.66±0.20°、20.76±0.20°、22.18±0.20°、23.78±0.20°、25.30±0.20°、26.12±0.20°。
- 根据权利要求17所述的式(II)化合物的B晶型，其特征在于，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有衍射峰：6.499°、7.860°、9.739°、10.257°、11.862°、12.255°、13.021°、14.240°、15.417°、15.797°、16.541°、16.920°、17.558°、18.182°、18.439°、18.702°、19.660°、20.381°、20.761°、21.494°、21.647°、22.180°、23.781°、24.099°、24.498°、25.304°、26.118°、26.821°、27.239°、28.579°、28.924°、29.302°、29.881°、30.278°、30.681°、30.938°、31.764°、32.978°、34.260°、35.101°、35.419°、35.761°、36.597°、37.083°、37.540°、38.423°。
- 根据权利要求15-18任意一项所述的式(II)化合物的B晶型，其特征在于，其X射线粉末衍射图谱基本上如图4所示。
- 根据权利要求18-19任意一项所述的式(II)化合物的B晶型，其特征在于，其热重分析曲线在200.000±3℃处失重达0.085％。
- 根据权利要求20所述的式(II)化合物的B晶型，其特征在于，其热重分析曲线如图5所示。
- 式(I)化合物的C晶型，其特征在于，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有衍射峰：4.90±0.20°、15.82±0.20°、22.26±0.20°。
- 根据权利要求22所述的式(I)化合物的C晶型，其特征在于，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有衍射峰：4.90±0.20°、9.82±0.20°、15.82±0.20°、17.48±0.20°、18.64±0.20°、22.26±0.20°、23.74±0.20°、29.36±0.20°。
- 根据权利要求23所述的式(I)化合物的C晶型，其特征在于，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有衍射峰：30±0.20°、4.90±0.20°、9.82±0.20°、11.06±0.20°、14.20±0.20°、15.82±0.20°、17.48±0.20°、18.64±0.20°、22.26±0.20°、23.74±0.20°、24.46±0.20°、29.36±0.20°。
- 根据权利要求24所述的式(I)化合物的C晶型，其特征在于，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有衍射峰：3.301°、4.901°、7.898°、9.319°、9.819°、11.061°、14.200°、14.721°、15.197°、15.821°、16.457°、17.481°、18.101°、18.642°、19.762°、20.961°、21.382°、22.259°、23.740°、24.461°、25.761°、26.295°、26.943°、27.518°、29.358°、30.075°、31.317°、31.916°、34.598°、37.661°。
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