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CN118678961A - 用于糖尿病的细胞疗法 - Google Patents

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CN118678961A
CN118678961A CN202380019754.9A CN202380019754A CN118678961A CN 118678961 A CN118678961 A CN 118678961A CN 202380019754 A CN202380019754 A CN 202380019754A CN 118678961 A CN118678961 A CN 118678961A
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CN
China
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cells
cell
positive
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isl1
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Application number
CN202380019754.9A
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费利西亚·帕柳卡
乔治·哈伯
詹森·加利亚
安德里亚·韦尔加尼
克里斯多佛·萨诺斯
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Vertex Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Vertex Pharmaceuticals Inc
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Publication date
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Abstract

本文公开了与用于以长时间段内高血糖水平为特征的疾病(诸如糖尿病)的细胞疗法相关的组合物、药盒和方法。在一些方面，本文提供的方法涉及将非天然胰腺细胞施用至患有以长时间段内高血糖水平为特征的疾病(诸如糖尿病)的受试者。在一些方面，本公开内容提供了包含非天然细胞的药物组合物。

Description

用于糖尿病的细胞疗法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2022年2月1日提交的美国临时专利申请第63/305,575号的权益，该申请通过引用以其整体特此并入。
通过引用并入序列表
在2023年1月19日创建并经由Patent Center提交的名为41639_SequenceListing.xml的28KB的XML文件中的序列表通过引用并入本文。
背景
干细胞衍生的β细胞的产生可以为胰岛和胰腺器官的产生提供可能有用的步骤。可以由干细胞衍生的组织治疗的快速增长的疾病之一是糖尿病。1型糖尿病由胰岛中β细胞的自身免疫破坏而导致。2型糖尿病由外周组织胰岛素抗性和β细胞功能障碍而导致。糖尿病患者，尤其是罹患1型糖尿病的患者，能够有可能通过移植新的β细胞而治愈。通过这一策略，可以使移植了尸体的人胰岛的患者在5年或更长时间内不依赖于胰岛素，但是由于供体胰岛的缺乏和质量问题，这种方法是有限的。从干细胞产生无限的人β细胞供应可以将这种疗法扩展到数百万新患者，并且可以成为将干细胞生物学转化到临床中的重要测试案例。
通过引用并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指出通过引用来并入。除非另有说明，否则本说明书中提及的出版物、专利和专利申请通过引用以其整体并入本文。
概述
在一些方面，本文公开了一种治疗有相应需要的受试者的方法，该方法包括：经由输注将包含液体悬浮液中的细胞群体的第一药物组合物施用至受试者，其中该细胞群体包含1×108个至10×108个(例如，3×108个至8.5×108个)细胞，并且其中该细胞群体包括表达C-肽和ISL1的非天然细胞。
在一些情况下，当在施用后至少约1、2、3、4、5或6个月使用混合膳食耐受性测试测量时，该方法将受试者的刺激血液C-肽水平升高至至少450pmol/L、460pmol/L、470pmol/L、480pmol/L、490pmol/L、500pmol/L、510pmol/L、520pmol/L、530pmol/L、540pmol/L、550pmol/L、700pmol/L、800pmol/L、900pmol/L、1000pmol/L、1400pmol/L或150pmol/L-350pmol/L、250pmol/L-400pmol/L、400pmol/L-1400pmol/L、400pmol/L-1200pmol/L、400pmol/L-1000pmol/L、400pmol/L-800pmol/L、400pmol/L-600pmol/L、600pmol/L-800pmol/L、600pmol/L-1400pmol/L或900pmol/L-1200pmol/L之间。在一些情况下，当在施用后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月使用混合膳食耐受性测试测量时，该方法将受试者的刺激血液C-肽水平升高至至少450pmol/L、460pmol/L、470pmol/L、480pmol/L、490pmol/L、500pmol/L、510pmol/L、520pmol/L、530pmol/L、540pmol/L或550pmol/L、700pmol/L、800pmol/L、900pmol/L、1000pmol/L、1400pmol/L或150pmol/L-350pmol/L、250pmol/L-400pmol/L、400pmol/L-1400pmol/L、400pmol/L-1200pmol/L、400pmol/L-1000pmol/L、400pmol/L-800pmol/L、400pmol/L-600pmol/L、600pmol/L-800pmol/L、600pmol/L-1400pmol/L或900pmol/L-1200pmol/L之间。在一些情况下，当在施用后约3个月使用混合膳食耐受性测试测量时，该方法将受试者的刺激血液C-肽水平升高至至少200pmol/L、300pmol/L、450pmol/L、460pmol/L、470pmol/L、480pmol/L、490pmol/L、500pmol/L、510pmol/L、520pmol/L、530pmol/L、540pmol/L、550pmol/L、600pmol/L或650pmol/L或150pmol/L-350pmol/L、200pmol/L-700pmol/L、150pmol/L-700pmol/L、300pmol/L-650pmol/L或500pmol/L-700pmol/L之间。
在一些情况下，当在施用后约6个月使用混合膳食耐受性测试测量时，该方法将受试者的刺激血液C-肽水平升高至至少450pmol/L、460pmol/L、470pmol/L、480pmol/L、490pmol/L、500pmol/L、510pmol/L、520pmol/L、530pmol/L、540pmol/L、550pmol/L、560pmol/L、700pmol/L、800pmol/L、900pmol/L、1000pmol/L、1400pmol/L或150pmol/L-350pmol/L、250pmol/L-400pmol/L、400pmol/L-1400pmol/L、400pmol/L-1200pmol/L、400pmol/L-1000pmol/L、400pmol/L-800pmol/L、400pmol/L-600pmol/L、600pmol/L-800pmol/L、600pmol/L-1400pmol/L或900pmol/L-1200pmol/L之间。在一些情况下，当在施用后至少约1、2、3、4、5或6个月测量时，该方法将受试者在空腹条件下的血液C-肽水平升高至至少100pmol/L、120pmol/L、130pmol/L、150pmol/L、160pmol/L、180pmol/L、200pmol/L、210pmol/L、220pmol/L、230pmol/L、240pmol/L、250pmol/L、260pmol/L、270pmol/L或280pmol/L。在一些情况下，当在施用后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月测量时，该方法将受试者在空腹条件下的血液C-肽水平升高至至少100pmol/L、120pmol/L、130pmol/L、150pmol/L、160pmol/L、180pmol/L、200pmol/L、210pmol/L、220pmol/L、230pmol/L、240pmol/L、250pmol/L、260pmol/L、270pmol/L或280pmol/L。在一些情况下，当在施用后约3个月测量时，该方法将受试者在空腹条件下的血液C-肽水平升高至至少100pmol/L、120pmol/L、130pmol/L、150pmol/L、160pmol/L、180pmol/L、200pmol/L、210pmol/L、220pmol/L、230pmol/L、240pmol/L、250pmol/L、260pmol/L、270pmol/L或280pmol/L。在一些情况下，当在施用后约3个月测量时，该方法将受试者在空腹条件下的血液C-肽水平升高至约200pmol/L、220pmol/L、240pmol/L、260pmol/L或280pmol/L。
在一些情况下，在施用之前，当使用混合膳食耐受性测试测量时，受试者具有少于100pmol/L、80pmol/L、60pmol/L、40pmol/L、30pmol/L、20pmol/L或10pmol/L的刺激血液C-肽水平。在一些情况下，在施用之前，当使用混合膳食耐受性测试测量时，受试者具有检测不到的刺激血液C-肽水平。在一些情况下，在施用之前，当在空腹条件下测量时，受试者具有检测不到的刺激血液C-肽水平。
在一些情况下，当在施用后至少约1、2、3、4、5或6个月使用HbA1c测试测量时，该方法将受试者的血红蛋白A1c水平(Hb1Ac)水平降低至少于8％、7.5％、7.0％、6.5％、6.0％、5.5％或5％-8％、5％-7.5％、5％-6.5％、5％-5.5％、5.5％-8％、5.5％-7％、5.5％-6.5％、6％-8％、6％-7％或6％-6.5％之间。在一些情况下，当在施用后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月使用HbA1c测试测量时，该方法将受试者的Hb1Ac水平降低至少于8％、7.5％、7.0％、6.5％、6.0％、5.5％或5％或5％-8％、5％-7.5％、5％-6.5％、5％-5.5％、5.5％-8％、5.5％-7％、5.5％-6.5％、6％-8％、6％-7％或6％-6.5％之间。在一些情况下，当在施用后约3个月测量时，该方法将受试者的Hb1Ac水平降低至少于8％、7.5％、7.0％或6.75％，或5％-8.0％、6.5％-8.0％、6.5％-7.5％、6.5％-7.0％或7％-8％之间。在一些情况下，当在施用后约9个月测量时，该方法将受试者的Hb1Ac水平降低至少于8％、7.5％、7.0％、6.5％、6.0％、5.5％或5％，或4.5％-8％、5％-8％、5％-7.5％、5％-7％、5％-6.5％、5％-5.5％、5.5％-8％、5.5％-7％、5.5％-6.5％、6％-8％、6％-7％或6％-6.5％之间。
在一些情况下，在施用之前，受试者具有大于7.0％、7.3％、7.8％、8.0％、8.1％、8.2％、8.3％、8.4％、8.5％、8.6％、8.8％或9.0％的基线Hb1Ac水平。在一些情况下，在施用之前，受试者以至少约20U/天、22U/天、24U/天、26U/天、28U/天、30U/天、32U/天或34U/天的水平接受胰岛素输注。在一些情况下，在施用之前，受试者具有严重低血糖事件的病史。在一些情况下，在施用之前，受试者具有低血糖意识受损的病史。在一些情况下，在施用之前，受试者表现出无残留的内源性胰岛细胞功能。在一些情况下，无残留的内源性胰岛细胞功能由在混合膳食耐受性测试中检测不到的空腹C-肽和检测不到刺激C-肽指示。在一些情况下，无残留的内源性胰岛细胞功能由在混合膳食耐受性测试中大于350mg/dL、400mg/dL、450mg/dL、475mg/dL或500mg/dL的持续刺激葡萄糖水平指示。在一些情况下，在施用之前，受试者具有大于7.7％、8％、8.2％或8.5％的HbA1c水平。在一些情况下，在施用之前，受试者每天接受大于10单位、15单位、20单位、25单位、30单位或35单位的胰岛素。
在一些情况下，受试者患有以长时间段内高血糖水平为特征的疾病。在一些情况下，疾病是糖尿病。在一些情况下，疾病是1型糖尿病。
在一些情况下，细胞群体包含至多约12×108个、10×108个、8×108个、7×108个、6.5×108个、6×108个、5.5×108个、5×108个、4.5×108个、4×108个、3.5×108个、3×108个、2.5×108个或2×108个细胞。在一些情况下，细胞群体包含约1×108个至约7×108个、约1×108个至约6×108个、约1×108个至约5×108个、约1×108个至约4×108个、约1×108个至约3×108个、约1×108个至约2×108个、约1.5×108个至约6.5×108个、约2×108个至约7×108个、约2×108个至约6×108个、约2×108个至约5×108个、约2×108个至约4×108个、约2×108个至约3×108个、约2.5×108个至约5.5×108个、约3×108个至约7×108个、约3×108个至约6×108个、约3×108个至约5×108个、约3×108个至约4×108个、约3.5×108个至约4.5×108个或约3.8×108个至约4.2×108个细胞。在一些情况下，细胞群体包含约3.5×108个至约4.5×108个细胞。在一些情况下，细胞群体包含约3.5×108个至约8.5×108个细胞。
在一些情况下，经由输注将包含液体悬浮液中的细胞群体的第二药物组合物施用至受试者，其中该细胞群体包含1×108个至10×108个(例如，3×108个至8.5×108个、4×108个至8.5×108个或5×108个至8.5×108个)细胞，并且其中该细胞群体包含表达C-肽和ISL1的非天然细胞，其中第二药物组合物在比第一药物组合物晚的时间点施用至受试者。在一些情况下，在向受试者施用第一药物组合物之后至少3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、15个月或在3-12个月、3-10个月、3-9个月、3-7个月、3-5个月、5-12个月、8-10个月、7-12个月、9-15个月或9-12个月之间向受试者施用第二药物组合物。在一些情况下，第一药物组合物包含3.5×108个至约8.5×108个细胞，并且其中第二药物组合物包含3.5×108个至约8.5×108个细胞。在一些情况下，第一药物组合物包含3.5×108个至约8.5×108个细胞，并且其中第二药物组合物包含3.5×108个至约4.5×108个细胞。
在一些情况下，受试者还被施用至少一种免疫抑制剂。在一些情况下，至少一种免疫抑制剂选自由以下组成的组：胸腺球蛋白、依那西普、巴利昔单抗(basiliximab)、他克莫司、西罗莫司和霉酚酸酯。在一些情况下，受试者还被施用胸腺球蛋白和依那西普。在一些情况下，受试者还被施用胸腺球蛋白和巴利昔单抗。在一些情况下，受试者还被施用他克莫司和西罗莫司。在一些情况下，受试者还被施用他克莫司和巴利昔单抗。在一些情况下，受试者还被施用西罗莫司和霉酚酸酯。
在一些情况下，第一药物组合物包含糖。在一些情况下，糖是蔗糖或葡萄糖。在一些情况下，液体悬浮液包含浓度在约0.05％和约1.5％之间的糖。
在一些情况下，第一药物组合物包含CMRL培养基。在一些情况下，第一药物组合物包含FRS Preservation Media。
在一些情况下，第一药物组合物中的细胞群体还包含表达胰高血糖素但不表达生长抑素的非天然细胞和表达生长抑素但不表达胰高血糖素的非天然细胞。
在该方法的一些情况下，(a)第一药物组合物中的细胞群体中30％-90％、30％-80％、30％-70％、30％-60％、30％-50％、30％-40％、40％-90％、40％-80％、40％-70％、40％-60％、40％-50％、50％-90％、50％-80％、50％-70％、50％-60％、60％-90％、60％-80％、60％-70％、70％-90％、70％-80％、70％-90％、70％-80％或80％-90％的细胞表达C-肽和ISL1但不表达VMAT1；(b)第一药物组合物中的细胞群体中3％-40％、3％-35％、3％-30％、3％-25％、3％-20％、3％-15％、3％-10％、5％-40％、5％-35％、5％-30％、5％-25％、5％-20％、5％-15％、5％-10％、10％-40％、10％-35％、10％-30％、10％-25％、10％-20％、10％-15％、15％-40％、15％-35％、15％-30％、15％-25％、15％-20％、20％-40％、20％-35％、20％-30％、20％-25％、25％-40％、25％-35％、25％-30％、30％-40％、30％-35％或35％-40％的细胞表达胰高血糖素但不表达生长抑素；和/或(c)第一药物组合物中的细胞群体中1％-20％、1％-15％、1％-12％、1％-10％、1％-8％、1％-5％、2％-20％、2％-15％、2％-12％、2％-10％、2％-8％、2％-5％、3％-20％、3％-15％、3％-12％、3％-10％、3％-8％、3％-5％、4％-20％、4％-15％、4％-12％、4％-10％、4％-8％、4％-5％、5％-20％、5％-15％、5％-12％、5％-10％、5％-8％、7％-20％、7％-15％、7％-12％、7％-10％、9％-20％、9％-15％、9％-12％、8％-10％、8％-12％、8％-15％、8％-20％、10％-20％、10％-12％、10％-15％、12％-20％、12％-15％或15％-20％的细胞表达生长抑素但不表达胰高血糖素。
在该方法的一些情况下，(a)细胞群体中30％-90％、30％-80％、30％-70％、30％-60％、30％-50％、30％-40％、40％-90％、40％-80％、40％-70％、40％-60％、40％-50％、50％-90％、50％-80％、50％-70％、50％-60％、60％-90％、60％-80％、60％-70％、70％-90％、70％-80％、70％-90％、70％-80％或80％-90％的细胞表达C-肽和ISL1但不表达VMAT1；(b)细胞群体中3％-40％、3％-35％、3％-30％、3％-25％、3％-20％、3％-15％、3％-10％、5％-40％、5％-35％、5％-30％、5％-25％、5％-20％、5％-15％、5％-10％、10％-40％、10％-35％、10％-30％、10％-25％、10％-20％、10％-15％、15％-40％、15％-35％、15％-30％、15％-25％、15％-20％、20％-40％、20％-35％、20％-30％、20％-25％、25％-40％、25％-35％、25％-30％、30％-40％、30％-35％或35％-40％的细胞表达胰高血糖素但不表达生长抑素；和(c)细胞群体中1％-20％、1％-15％、1％-12％、1％-10％、1％-8％、1％-5％、2％-20％、2％-15％、2％-12％、2％-10％、2％-8％、2％-5％、3％-20％、3％-15％、3％-12％、3％-10％、3％-8％、3％-5％、4％-20％、4％-15％、4％-12％、4％-10％、4％-8％、4％-5％、5％-20％、5％-15％、5％-12％、5％-10％、5％-8％、7％-20％、7％-15％、7％-12％、7％-10％、9％-20％、9％-15％、9％-12％、8％-10％、8％-12％、8％-15％、8％-20％、10％-20％、10％-12％、10％-15％、12％-20％、12％-15％或15％-20％的细胞表达生长抑素但不表达胰高血糖素。
在该方法的一些情况下，(a)细胞群体中35％-60％的细胞表达C-肽和ISL1但不表达VMAT1；(b)细胞群体中4％-25％的细胞表达胰高血糖素但不表达生长抑素；和(c)细胞群体中1％-10％的细胞表达生长抑素但不表达胰高血糖素。在该方法的一些情况下，(a)细胞群体中40％-60％的细胞表达C-肽和ISL1但不表达VMAT1；(b)细胞群体中10％-25％的细胞表达胰高血糖素但不表达生长抑素；和(c)细胞群体中4％-10％的细胞表达生长抑素但不表达胰高血糖素。
在一些情况下，细胞群体中少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于18％、少于15％、少于12％或少于10％的细胞表达VMAT1但不表达C-肽。在一些情况下，如通过流式细胞术确定的，第一药物组合物中不少于50％、40％、30％或20％的细胞是NKX6.1+/ISL1+细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术确定的，第一药物组合物中不少于20％的细胞是NKX6.1+/ISL1+细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术确定的，第一药物组合物中不少于40％、35％、30％、26％、25％或20％的细胞是NKX6.1-/ISL1+细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术确定的，第一药物组合物中不少于26％的细胞是NKX6.1-/ISL1+细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术确定的，第一药物组合物中5％-25％、5％-40％、5％-35％或8％-20％的细胞是NKX6.1-/ISL1+细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术确定的，第一药物组合物中不多于50％、45％、40％、35％、30％或25％的细胞是NKX6.1+/ISL1-细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术确定的，第一药物组合物中不多于50％的细胞是NKX6.1+/ISL1-细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术确定的，药物组合物中20％-60％、20％-50％、20％-45％、20％-40％、20％-35％、20％-30％、20％-25％、25％-50％、25％-40％、25％-35％、30％-60％、30％-50％、30％-40％、30％-35％、35％-50％、40％-50％之间的细胞是NKX6.1+/ISL1+细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术确定的，药物组合物中20％-60％、20％-50％、20％-45％、20％-40％、20％-35％、20％-30％、20％-25％、25％-50％、25％-40％、25％-35％、30％-60％、30％-50％、30％-40％、30％-35％、35％-50％或40％-50％之间的细胞是NKX6.1-/ISL1+细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术确定的，药物组合物中20％-50％、20％-45％、20％-40％、20％-35％、20％-30％、20％-25％、25％-50％、25％-40％、25％-35％、30％-60％、30％-50％、30％-40％、30％-35％、35％-50％、40％-50％、10％-20％或10％-25％之间的细胞是NKX6.1+/ISL1-细胞。在该方法的一些情况下，组合物中至少20％的细胞是NKX6.1+/ISL1+细胞；组合物中至少25％的细胞是NKX6.1-/ISL1+细胞；并且组合物中10％-50％的细胞是NKX6.1+/ISL1-细胞。在一些情况下，组合物包含在体外展示GSIS的NKX6.1+/ISL1+细胞。在一些情况下，组合物包含在体内展示GSIS的NKX6.1+/ISL1+细胞。在一些情况下，细胞群体在体外从干细胞产生。在一些情况下，细胞群体中表达C-肽和ISL1但不表达VMAT1的非天然细胞在体外表现出葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。在一些情况下，由表达C-肽和ISL1但不表达VMAT1的非天然细胞响应于葡萄糖刺激分泌的胰岛素与葡萄糖刺激的葡萄糖浓度成比例。在一些情况下，由表达C-肽和ISL1但不表达VMAT1的非天然细胞响应于第一葡萄糖刺激、第二葡萄糖刺激和第三葡萄糖刺激而分泌胰岛素，其中第一葡萄糖刺激、第二葡萄糖刺激和第三葡萄糖刺激顺序地施加。
在一些情况下，细胞群体中的至少一部分细胞以多于一个细胞簇存在。在一些情况下，细胞簇的直径为约50μm至约500μm、约50μm至约400μm、约50μm至约300μm、约60μm至约400μm、约60μm至约300μm、约60μm至约250μm、约75μm至约400μm、约75μm至约300μm、约75μm至约250μm、约125μm至约225μm、约130μm至约160μm、约170μm至约225μm、约140μm至约200μm、约140μm至约170μm、约160μm至约220μm、约170μm至约215μm或约170μm至约200μm。在一些实施方案中，细胞簇的直径在约80微米和270微米之间。
在一些情况下，细胞群体作为单细胞悬浮液存在于第一药物组合物中。
在一些情况下，在第一药物组合物中，细胞群体悬浮在无血清溶液中。
在一些情况下，该方法还包括向受试者施用免疫应答调节剂。在一些情况下，免疫应答调节剂与第一药物组合物同时施用。在一些情况下，免疫应答调节剂在第一药物组合物之前或之后施用。在一些情况下，免疫应答调节剂不是类固醇。在一些情况下，免疫应答调节剂包括硫唑嘌呤、霉酚酸、来氟米特、特立氟胺、甲氨蝶呤、他克莫司、环孢素、吡美莫司、阿贝莫司、胍立莫司、来那度胺、泊马度胺、沙利度胺、PDE4抑制剂、阿普斯特、阿那白滞素、西罗莫司、依维莫司、利罗莫司(Ridaforolimus)、坦罗莫司、优美莫司(Umirolimus)、佐他莫司、抗胸腺细胞球蛋白抗体、抗淋巴细胞球蛋白抗体、CTLA-4、阿巴西普、贝拉西普、依那西普、培那西普(Pegsunercept)、阿柏西普、阿法西普、利纳西普、依库珠单抗、阿达木单抗、阿非莫单抗、培塞妥珠单抗(certolizumab pegol)、戈利木单抗、英夫利昔单抗、奈瑞莫单抗、美泊利单抗、奥马珠单抗、法拉莫单抗、艾西莫单抗、来金珠单抗(Lebrikizumab)、乌司奴单抗、苏金单抗、莫罗单抗-CD3、奥昔珠单抗、替利珠单抗、维西珠单抗、克立昔单抗(Clenoliximab)、凯利昔单抗(Keliximab)、扎木单抗(Zanolimumab)、依法珠单抗、厄利珠单抗(Erlizumab)、奥妥珠单抗、利妥昔单抗、奥瑞珠单抗(Ocrelizumab)、帕考珠单抗(Pascolizumab)、Gomiliximab、鲁昔单抗、替奈昔单抗、托利珠单抗(Toralizumab)、阿塞珠单抗、加利昔单抗、加维莫单抗(Gavilimomab)、芦利珠单抗(Ruplizumab)、贝利木单抗、Blisibimod、伊匹木单抗、曲美木单抗、柏替木单抗、乐德木单抗(Lerdelimumab)、美替木单抗(Metelimumab)、那他珠单抗、托珠单抗、奥度莫单抗、巴利昔单抗、达克珠单抗、伊诺莫单抗、阿托木单抗(Atorolimumab)、西地珠单抗(Cedelizumab)、芳妥珠单抗(Fontolizumab)、马司莫单抗、莫罗木单抗(Morolimumab)、培克珠单抗、瑞利珠单抗、罗维珠单抗(Rovelizumab)、西利珠单抗(Siplizumab)、他利珠单抗、阿替莫单抗(Telimomab aritox)、伐利昔单抗、维帕莫单抗、阿仑珠单抗、霉酚酸酯、FTY720或其任何组合。在一些情况下，免疫应答调节剂包括他克莫司、环孢素、霉酚酸酯、硫唑嘌呤、依维莫司、西罗莫司、阿巴西普、贝拉西普、抗胸腺细胞球蛋白、阿仑单抗、利妥昔单抗、巴利昔单抗、达克珠单抗、莫罗单抗-CD3、依法珠单抗、FTY720或其任何组合。在一些情况下，免疫应答调节剂包括皮质类固醇。
在一些情况下，第一药物组合物被输注到受试者的门静脉中。
在一些情况下，受试者接受单剂量的第一药物组合物。
在一些情况下，表达C-肽和ISL1的非天然细胞获自包含PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性细胞的细胞培养物，所述细胞培养物用以下处理：i)TGF-β信号通路抑制剂(例如，Alk5i)、ii)甲状腺激素信号通路激活剂(例如，GC-1)、iii)BMP通路抑制剂(例如，LDN193189)、iv)ROCK抑制剂(例如，thiazovivin)、v)蛋白激酶抑制剂(例如，星形孢菌素)和/或vi)表观遗传修饰剂(例如，DZNEP)。在一些情况下，表达C-肽和ISL1的非天然细胞获自包含PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性细胞的细胞培养物，所述细胞培养物用以下处理至少3天：i)TGF-β信号通路抑制剂(例如，Alk5i)、ii)甲状腺激素信号通路激活剂(例如，GC-1)、iii)BMP通路抑制剂(例如，LDN193189)、iv)ROCK抑制剂(例如，thiazovivin)、v)蛋白激酶抑制剂(例如，星形孢菌素)和/或vi)表观遗传修饰剂(例如，DZNEP)。在一些情况下，PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性细胞也用人类血清白蛋白处理。在一些情况下，PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性细胞也用人类血清白蛋白处理至少6天。在一些情况下，PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性细胞获自包含PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阴性细胞的细胞培养物，所述细胞培养物用以下处理：i)TGF-β信号通路抑制剂(例如，Alk5i)、ii)TH信号通路激活剂(例如，GC-1)、iii)至少一种SHH通路抑制剂(例如，Sant1)、iv)RA信号通路激活剂(例如，视黄酸)、v)γ-分泌酶抑制剂(例如，XXI)、vi)至少一种来自表皮生长因子(EGF)家族的生长因子(例如，β细胞素)、vii)BMP通路抑制剂(例如，LDN193189)、viii)ROCK抑制剂(例如，thiazovivin)、ix)蛋白激酶抑制剂(例如，星形孢菌素)和/或x)表观遗传修饰剂(例如，DZNEP)。
在一些情况下，PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性细胞获自包含PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阴性细胞的细胞培养物，所述细胞培养物用以下处理2天或3天：i)TGF-β信号通路抑制剂(例如，Alk5i)、ii)TH信号通路激活剂(例如，GC-1)、iii)至少一种SHH通路抑制剂(例如，Sant1)、iv)RA信号通路激活剂(例如，视黄酸)、v)γ-分泌酶抑制剂(例如，XXI)、vi)至少一种来自表皮生长因子(EGF)家族的生长因子(例如，β细胞素)、vii)BMP通路抑制剂(例如，LDN193189)、viii)ROCK抑制剂(例如，thiazovivin)、ix)蛋白激酶抑制剂(例如，星形孢菌素)和/或x)表观遗传修饰剂(例如，DZNEP)，然后使PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞与以下接触持续四天或五天的时间段：i)TGF-β信号通路抑制剂(例如，Alk5i)、ii)TH信号通路激活剂(例如，GC-1)、iii)γ-分泌酶抑制剂(例如，XXI)、iv)BMP通路抑制剂(例如，LDN193189)、v)ROCK抑制剂(例如，thiazovivin)、vi)蛋白激酶抑制剂(例如，星形孢菌素)和vii)表观遗传修饰剂(例如，DZNEP)。
在一些情况下，PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性细胞获自包含PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阴性细胞的细胞培养物，所述细胞培养物用以下处理2天或3天：i)TGF-β信号通路抑制剂(例如，Alk5i)、ii)TH信号通路激活剂(例如，GC-1)、iii)至少一种SHH通路抑制剂(例如，Sant1)、iv)RA信号通路激活剂(例如，视黄酸)、v)γ-分泌酶抑制剂(例如，XXI)、vi)至少一种来自表皮生长因子(EGF)家族的生长因子(例如，β细胞素)、vii)BMP通路抑制剂(例如，LDN193189)、viii)ROCK抑制剂(例如，thiazovivin)、ix)蛋白激酶抑制剂(例如，星形孢菌素)和/或x)表观遗传修饰剂(例如，DZNEP)，然后在不存在i)SHH通路抑制剂(例如，Sant1)、ii)RA信号通路激活剂(例如，视黄酸)和iii)来自表皮生长因子(EGF)家族的生长因子(例如，β细胞素)的情况下使PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞与以下接触持续四天或五天的时间段：i)TGF-β信号通路抑制剂(例如，Alk5i)、ii)TH信号通路激活剂(例如，GC-1)、iii)γ-分泌酶抑制剂(例如，XXI)、iv)BMP通路抑制剂(例如，LDN193189)、v)ROCK抑制剂(例如，thiazovivin)、vi)蛋白激酶抑制剂(例如，星形孢菌素)和vii)表观遗传修饰剂(例如，DZNEP)。
在一些情况下，PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阴性细胞获自包含PDX1阳性、NKX6.1阴性细胞的细胞培养物，所述细胞培养物用以下处理：i)至少一种来自FGF家族的生长因子(例如，KGF)、ii)至少一种SHH通路抑制剂(例如，Sant1)、iii)RA信号通路激活剂(例如，视黄酸)、iv)ROCK抑制剂(例如，thiazovivin)和v)至少一种来自TGFβ超家族的因子(例如，激活素A)。
在一些情况下，PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阴性细胞获自包含PDX1阳性、NKX6.1阴性细胞的细胞培养物，所述细胞培养物用以下处理5天的时间段：i)至少一种来自FGF家族的生长因子(例如，KGF)、ii)至少一种SHH通路抑制剂(例如，Sant1)、iii)RA信号通路激活剂(例如，视黄酸)、iv)ROCK抑制剂(例如，thiazovivin)和v)至少一种来自TGF-β超家族的因子(例如，激活素A)。
在一些情况下，PDX1阳性、NKX6.1阴性细胞获自包含PDX1阴性原始肠细胞的细胞培养物，所述细胞培养物用以下处理：i)视黄酸信号通路激活剂、ii)至少一种来自FGF家族的因子(例如，KGF)、iii)SHH通路抑制剂(例如，Sant1)、iv)PKC激活剂(例如，PDBU)、v)ROCK抑制剂(例如，thiazovivin)和vi)BMP通路抑制剂(例如，DMH-1)。
在一些情况下，PDX1阳性、NKX6.1阴性细胞获自包含PDX1阴性原始肠细胞的细胞培养物，所述细胞培养物用以下处理1天：i)视黄酸信号通路激活剂、ii)至少一种来自FGF家族的因子(例如，KGF)、iii)SHH通路抑制剂(例如，Sant1)、iv)PKC激活剂(例如，PDBU)、v)ROCK抑制剂(例如，thiazovivin)和vi)BMP通路抑制剂(例如，DMH-1)，然后使细胞与以下接触另外一天：i)视黄酸信号通路激活剂、ii)至少一种来自FGF家族的因子(例如，KGF)、iii)SHH通路抑制剂(例如，Sant1)、iv)PKC激活剂(例如，PDBU)、v)ROCK抑制剂(例如，thiazovivin)。
在一些情况下，PDX1阳性、NKX6.1阴性细胞获自包含PDX1阴性原始肠细胞的细胞培养物，所述细胞培养物用以下处理1天：i)视黄酸信号通路激活剂、ii)至少一种来自FGF家族的因子(例如，KGF)、iii)SHH通路抑制剂(例如，Sant1)、iv)PKC激活剂(例如，PDBU)、v)ROCK抑制剂(例如，thiazovivin)和vi)BMP通路抑制剂(例如，DMH-1)，然后在不存在BMP通路抑制剂的情况下使细胞与以下接触另外一天：i)视黄酸信号通路激活剂、ii)至少一种来自FGF家族的因子(例如，KGF)、iii)SHH通路抑制剂(例如，Sant1)、iv)PKC激活剂(例如，PDBU)、v)ROCK抑制剂(例如，thiazovivin)。
在一些情况下，PDX1阴性原始肠细胞获自用来自FGF家族的因子(例如，KGF)处理的包含定形内胚层细胞的培养物。
在一些情况下，PDX1阴性原始肠细胞获自用来自FGF家族的因子(例如，KGF)处理3天的时间段的包含定形内胚层细胞的培养物。
在一些情况下，定形内胚层细胞获自用来自TGFβ超家族的因子(例如，激活素A)和WNT信号通路激活剂(例如，CHIR99021)处理的包含多能干细胞的培养物。在一些情况下，定形内胚层细胞获自包含多能干细胞的培养物，所述培养物用来自TGFβ超家族的因子(例如，激活素A)和WNT信号通路激活剂(例如，CHIR99021)处理一天，然后使细胞与来自TGFβ超家族的因子(例如，激活素A)接触另外的两天。
在一些方面，本文公开了被配制用于输注的药物组合物，该药物组合物包含液体悬浮液中的细胞群体，其中该细胞群体包含约1×108个至约10×108个(例如，3×108个至8.5×108个)细胞，并且其中该细胞群体包含表达C-肽和ISL1的非天然细胞。
在一些情况下，细胞群体包含至多约12×108个、10×108个、8×108个、7×108个、6.5×108个、6×108个、5.5×108个、5×108个、4.5×108个、4×108个、3.5×108个、3×108个、2.5×108个或2×108个细胞。在一些情况下，细胞群体包含约1×108个至约7×108个、约1×108个至约6×108个、约1×108个至约5×108个、约1×108个至约4×108个、约1×108个至约3×108个、约1×108个至约2×108个、约1.5×108个至约6.5×108个、约2×108个至约7×108个、约2×108个至约6×108个、约2×108个至约5×108个、约2×108个至约4×108个、约2×108个至约3×108个、约2.5×108个至约5.5×108个、约3×108个至约7×108个、约3×108个至约6×108个、约3×108个至约5×108个、约3×108个至约4×108个、约3.5×108个至约4.5×108个或约3.8×108个至约4.2×108个细胞。在一些情况下，细胞群体包含约3.5×108个至约4.5×108个细胞。在一些情况下，细胞群体包含约3.5×108个至约8.5×108个细胞。在一些情况下，细胞群体还包含表达胰高血糖素但不表达生长抑素的非天然细胞和表达生长抑素但不表达胰高血糖素的非天然细胞。
在药物组合物的一些情况下，(a)细胞群体中30％-90％、30％-80％、30％-70％、30％-60％、30％-50％、30％-40％、40％-90％、40％-80％、40％-70％、40％-60％、40％-50％、50％-90％、50％-80％、50％-70％、50％-60％、60％-90％、60％-80％、60％-70％、70％-90％、70％-80％、70％-90％、70％-80％或80％-90％的细胞表达C-肽和ISL1但不表达VMAT1；(b)细胞群体中3％-40％、3％-35％、3％-30％、3％-25％、3％-20％、3％-15％、3％-10％、5％-40％、5％-35％、5％-30％、5％-25％、5％-20％、5％-15％、5％-10％、10％-40％、10％-35％、10％-30％、10％-25％、10％-20％、10％-15％、15％-40％、15％-35％、15％-30％、15％-25％、15％-20％、20％-40％、20％-35％、20％-30％、20％-25％、25％-40％、25％-35％、25％-30％、30％-40％、30％-35％或35％-40％的细胞表达胰高血糖素但不表达生长抑素；和/或(c)细胞群体中1％-20％、1％-15％、1％-12％、1％-10％、1％-8％、1％-5％、2％-20％、2％-15％、2％-12％、2％-10％、2％-8％、2％-5％、3％-20％、3％-15％、3％-12％、3％-10％、3％-8％、3％-5％、4％-20％、4％-15％、4％-12％、4％-10％、4％-8％、4％-5％、5％-20％、5％-15％、5％-12％、5％-10％、5％-8％、7％-20％、7％-15％、7％-12％、7％-10％、9％-20％、9％-15％、9％-12％、8％-10％、8％-12％、8％-15％、8％-20％、10％-20％、10％-12％、10％-15％、12％-20％、12％-15％或15％-20％的细胞表达生长抑素但不表达胰高血糖素。
在药物组合物的一些情况下，(a)细胞群体中30％-90％、30％-80％、30％-70％、30％-60％、30％-50％、30％-40％、40％-90％、40％-80％、40％-70％、40％-60％、40％-50％、50％-90％、50％-80％、50％-70％、50％-60％、60％-90％、60％-80％、60％-70％、70％-90％、70％-80％、70％-90％、70％-80％或80％-90％的细胞表达C-肽和ISL1但不表达VMAT1；(b)细胞群体中3％-40％、3％-35％、3％-30％、3％-25％、3％-20％、3％-15％、3％-10％、5％-40％、5％-35％、5％-30％、5％-25％、5％-20％、5％-15％、5％-10％、10％-40％、10％-35％、10％-30％、10％-25％、10％-20％、10％-15％、15％-40％、15％-35％、15％-30％、15％-25％、15％-20％、20％-40％、20％-35％、20％-30％、20％-25％、25％-40％、25％-35％、25％-30％、30％-40％、30％-35％或35％-40％的细胞表达胰高血糖素但不表达生长抑素；和(c)细胞群体中1％-20％、1％-15％、1％-12％、1％-10％、1％-8％、1％-5％、2％-20％、2％-15％、2％-12％、2％-10％、2％-8％、2％-5％、3％-20％、3％-15％、3％-12％、3％-10％、3％-8％、3％-5％、4％-20％、4％-15％、4％-12％、4％-10％、4％-8％、4％-5％、5％-20％、5％-15％、5％-12％、5％-10％、5％-8％、7％-20％、7％-15％、7％-12％、7％-10％、9％-20％、9％-15％、9％-12％、8％-10％、8％-12％、8％-15％、8％-20％、10％-20％、10％-12％、10％-15％、12％-20％、12％-15％或15％-20％的细胞表达生长抑素但不表达胰高血糖素。
在药物组合物的一些情况下，(a)细胞群体中35％-60％的细胞表达C-肽和ISL1但不表达VMAT1；(b)细胞群体中4％-25％的细胞表达胰高血糖素但不表达生长抑素；和(c)细胞群体中1％-10％的细胞表达生长抑素但不表达胰高血糖素。
在药物组合物的一些情况下，(a)细胞群体中40％-60％的细胞表达C-肽和ISL1但不表达VMAT1；(b)细胞群体中10％-25％的细胞表达胰高血糖素但不表达生长抑素；和(c)细胞群体中4％-10％的细胞表达生长抑素但不表达胰高血糖素。
在一些情况下，细胞群体中少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于18％、少于15％、少于12％或少于10％的细胞表达VMAT1但不表达C-肽。在一些情况下，如通过流式细胞术确定的，药物组合物中不少于50％、40％、30％或20％的细胞是NKX6.1+/ISL1+细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术确定的，组合物中不少于30％的细胞是NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞，组合物中不少于25％的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阳性细胞，组合物中少于12％的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阴性细胞，或组合物中9％-25％之间的细胞是NKX6.1阳性、ISL1阴性细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术确定的，药物组合物中不少于40％、35％、30％、26％、25％或20％的细胞是NKX6.1-/ISL1+细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术确定的，药物组合物中不少于26％的细胞是NKX6.1-/ISL1+细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术确定的，药物组合物中5％-25％、5％-40％、5％-35％或8％-20％之间的细胞是NKX6.1-/ISL1+细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术确定的，药物组合物中不多于50％、45％、40％、35％、30％或25％的细胞是NKX6.1+/ISL1-细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术确定的，药物组合物中不多于50％的细胞是NKX6.1+/ISL1-细胞。
在一些情况下，细胞群体在体外从干细胞产生。在一些情况下，表达C-肽和ISL1但不表达VMAT1的非天然细胞在体外表现出葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。在一些情况下，由表达C-肽和ISL1但不表达VMAT1的非天然细胞响应于葡萄糖刺激分泌的胰岛素与葡萄糖刺激的葡萄糖浓度成比例。在一些情况下，由表达C-肽和ISL1但不表达VMAT1的非天然细胞响应于第一葡萄糖刺激、第二葡萄糖刺激和第三葡萄糖刺激而分泌胰岛素，其中依次施加第一葡萄糖刺激、第二葡萄糖刺激和第三葡萄糖刺激。
在一些情况下，细胞群体中的至少一部分细胞以多于一个细胞簇存在。在一些情况下，细胞簇的直径为约50μm至约500μm、约50μm至约400μm、约50μm至约300μm、约60μm至约400μm、约60μm至约300μm、约60μm至约250μm、约75μm至约400μm、约75μm至约300μm、约75μm至约250μm、约125μm至约225μm、约130μm至约160μm、约170μm至约225μm、约140μm至约200μm、约140μm至约170μm、约160μm至约220μm、约170μm至约215μm或约170μm至约200μm。在一些情况下，细胞群体作为单细胞悬浮液存在于药物组合物中。在一些情况下，细胞群体被悬浮在无血清溶液中。
在一些方面，本文公开了一种药盒，该药盒包含：本文公开的药物组合物，以及用于向有相应需要的受试者施用该药物组合物的说明书。
在一些方面，本文公开了一种药盒，该药盒包含：(a)被配制用于输注的药物组合物，其中该药物组合物包含悬浮液中的细胞群体，其中该细胞群体包含至少约1×108个细胞，并且其中该细胞群体包含表达C-肽和ISL1的非天然细胞；和(b)用于向有相应需要的受试者施用该药物组合物的说明书。
在一些情况下，药盒还包含免疫应答调节剂。在一些情况下，免疫应答调节剂不是类固醇。在一些情况下，免疫应答调节剂包括硫唑嘌呤、霉酚酸、来氟米特、特立氟胺、甲氨蝶呤、他克莫司、环孢素、吡美莫司、阿贝莫司、胍立莫司、来那度胺、泊马度胺、沙利度胺、PDE4抑制剂、阿普斯特、阿那白滞素、西罗莫司、依维莫司、利罗莫司(Ridaforolimus)、坦罗莫司、优美莫司(Umirolimus)、佐他莫司、抗胸腺细胞球蛋白抗体、抗淋巴细胞球蛋白抗体、CTLA-4、阿巴西普、贝拉西普、依那西普、培那西普(Pegsunercept)、阿柏西普、阿法西普、利纳西普、依库珠单抗、阿达木单抗、阿非莫单抗、培塞妥珠单抗、戈利木单抗、英夫利昔单抗、奈瑞莫单抗、美泊利单抗、奥马珠单抗、法拉莫单抗、艾西莫单抗、来金珠单抗(Lebrikizumab)、乌司奴单抗、苏金单抗、莫罗单抗-CD3、奥昔珠单抗、替利珠单抗、维西珠单抗、克立昔单抗(Clenoliximab)、凯利昔单抗(Keliximab)、扎木单抗(Zanolimumab)、依法珠单抗、厄利珠单抗(Erlizumab)、奥妥珠单抗、利妥昔单抗、奥瑞珠单抗(Ocrelizumab)、帕考珠单抗(Pascolizumab)、Gomiliximab、鲁昔单抗、替奈昔单抗、托利珠单抗(Toralizumab)、阿塞珠单抗、加利昔单抗、加维莫单抗(Gavilimomab)、芦利珠单抗(Ruplizumab)、贝利木单抗、Blisibimod、伊匹木单抗、曲美木单抗、柏替木单抗、乐德木单抗(Lerdelimumab)、美替木单抗(Metelimumab)、那他珠单抗、托珠单抗、奥度莫单抗、巴利昔单抗、达克珠单抗、伊诺莫单抗、阿托木单抗(Atorolimumab)、西地珠单抗(Cedelizumab)、芳妥珠单抗(Fontolizumab)、马司莫单抗、莫罗木单抗(Morolimumab)、培克珠单抗、瑞利珠单抗、罗维珠单抗(Rovelizumab)、西利珠单抗(Siplizumab)、他利珠单抗、阿替莫单抗(Telimomab aritox)、伐利昔单抗、维帕莫单抗、阿仑珠单抗、霉酚酸酯、FTY720或其任何组合。在一些情况下，免疫应答调节剂包括他克莫司、环孢素、霉酚酸酯、硫唑嘌呤、依维莫司、西罗莫司、阿巴西普、贝拉西普、抗胸腺细胞球蛋白、阿仑单抗、利妥昔单抗、巴利昔单抗、达克珠单抗、莫罗单抗-CD3、依法珠单抗、FTY720或其任何组合。在一些情况下，免疫应答调节剂包括皮质类固醇。
在一些情况下，药盒包含用于向具有严重低血糖事件病史的受试者施用药物组合物的说明书。在一些情况下，药盒包含用于向具有低血糖意识受损病史的受试者施用药物组合物的说明书。在一些情况下，药盒包含用于将药物组合物施用至无残留的内源性胰岛细胞功能的受试者的说明书。在一些情况下，无残留的内源性胰岛细胞功能由在混合膳食耐受性测试中检测不到的空腹C-肽和检测不到的刺激C-肽指示。在一些情况下，无残留的内源性胰岛细胞功能由在混合膳食耐受性测试中大于350mg/dL、400mg/dL、450mg/dL、475mg/dL或500mg/dL的持续刺激葡萄糖水平指示。
在一些情况下，该药盒包含用于向具有大于7.7％、8％、8.2％或8.5％的HbA1c水平的受试者施用药物组合物的说明书。在一些情况下，该药盒包含用于将药物组合物施用至已经接受大于10单位/天、15单位/天、20单位/天、25单位/天、30单位/天或35单位/天胰岛素的受试者的说明书。在一些情况下，该药盒包含用于将药物组合物施用至患有以延长时间段内高血糖水平为特征的疾病的受试者的说明书。在一些情况下，疾病是糖尿病。在一些情况下，所述疾病是1型糖尿病。
附图简述
本公开内容的特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考以下对利用本公开内容原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图，将会获得对本发明的特征和优点的更好理解，并且在这些附图中：
图1A示出了在输注根据本公开内容的实施方案的非天然胰腺细胞之前的筛查期期间在MMTT测试中测量的受试者A1的刺激血液C-肽水平(上图)和刺激葡萄糖水平(下图)。LLOQ：定量下限；MMTT：混合膳食耐受性测试。低于LLOQ(13pmol/L[0.04ng/mL])的C-肽值作为1/2LLOQ(7pmol/L[0.02ng/mL])输入。图1B示出了在输注根据本公开内容的实施方案的非天然胰腺细胞之前的筛查期期间在MMTT测试中测量的受试者A2/B2的刺激血液C-肽水平(上图)和刺激葡萄糖水平(下图)。LLOQ：定量下限；MMTT：混合膳食耐受性测试。低于LLOQ(13pmol/L[0.04ng/mL])的C-肽值作为1/2LLOQ(7pmol/L[0.02ng/mL])输入。图1C示出了在输注根据本公开内容的实施方案的非天然胰腺细胞之前的筛查期期间在MMTT测试中测量的受试者B1的刺激血液C-肽水平(上图)和刺激葡萄糖水平(下图)。LLOQ：定量下限；MMTT：混合膳食耐受性测试。低于LLOQ(13pmol/L[0.04ng/mL])的C-肽值作为1/2LLOQ(7pmol/L[0.02ng/mL])输入。
图2A是总结了受试者A1在接受根据本公开内容的实施方案的非天然胰腺细胞的输注之前和之后的HbA1c的变化的图。B：基线；D：天数；HbA1c：血红蛋白A1c；M：月份；SCR：筛查；Unsch：计划外的。图2B是总结了受试者A2/B2在接受根据本公开内容的实施方案的非天然胰腺细胞的输注之前和之后的HbA1c的变化的图。B：基线；D：天数；HbA1c：血红蛋白A1c；INF1：第一次输注SC-胰岛；INF2：第二次输注SC-胰岛；SCR：筛查；Unsch：计划外的。图2C是总结了受试者B1在接受根据本公开内容的实施方案的非天然胰腺细胞的输注之前和之后的HbA1c的变化的图。B：基线；D：天数；HbA1c：血红蛋白A1c；SCR：筛查。
图3A是总结了根据本公开内容的实施方案的通过CGM测量的受试者A1的处于范围内的时间(time-in-range)的条形图。天数[301,330]和天数[426,455]的时间百分比被设置为缺失，因为<70％的数据是可用的，并且没有连续14天的时间段的≧70％的可用的数据。图3B是总结了根据本公开内容的实施方案的通过CGM测量的受试者A2/B2的处于范围内的时间的条形图。INF1：第一次输注SC-胰岛；INF2：第二次输注SC胰岛。在第一次输注后第249天，受试者A2/B2停止使用CGM和胰岛素泵进行胰岛素输送，并开始使用混合闭环系统(HCLS)。图3C是总结了根据本公开内容的实施方案的通过CGM测量的受试者B1的处于范围内的时间的条形图。
图4A是总结了受试者A1的每日外源性胰岛素总剂量随时间的变化的图。图4B是总结了受试者A2/B2的每日外源性胰岛素总剂量随时间的变化的图。从基线到第一次输注后第57天和从第一次输注后第150天到第210天的每日外源性胰岛素总剂量数据是基于胰岛素泵数据。第一次输注后第90天和第120天的数据是基于eDiary。在研究第249天，第一次输注后，受试者A2/B2停止使用CGM和胰岛素泵进行胰岛素输送，并开始使用混合闭环系统(HCLS)。图4C是总结了受试者B1的每日外源性胰岛素总剂量随时间的变化的图。从基线到第150天的每日外源性胰岛素总剂量数据是基于胰岛素泵数据。第180天数据是基于eDiary。
详述
以下描述和实例详细阐述了本公开内容的实施方案。应当理解，本公开内容不限于本文描述的特定实施方案，并且因此可以变化。本领域技术人员将意识到，本公开内容存在许多变化和修改，这些变化和修改均包含在本发明的范围内。
所有术语旨在被理解为本领域技术人员将理解的。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，并且不被解释为限制所描述的主题。
尽管可以在单一实施方案的上下文中描述本公开内容的各种特征，但是这些特征也可以单独提供或以任何合适的组合提供。相反，尽管为了清楚起见，本文可以在分开的实施方案的上下文中描述本公开内容，但是本公开内容也可以在单一实施方案中实现。
以下定义补充了本领域的定义，并针对本申请，而不应归于任何相关或不相关的情况，例如，任何共同拥有的专利或申请。尽管与本文描述的那些相似或等同的任何方法和材料都可以用于测试本公开内容的实践，但本文描述了优选的材料和方法。因此，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不意图是限制性的。
在本申请中，除非另外明确说明，否则单数的使用包括复数。必须注意，除非上下文另外清楚地指示，否则如在说明书中使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述/该(the)”包括复数指代。
在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用表示“和/或”。如本文所使用的术语“和/或”和“其任何组合”及其语法等同物可以互换使用。这些术语可以表示任何组合都是特别设想的。仅出于说明性目的，以下短语“A、B和/或C”或“A、B、C或其任何组合”可以意指“单独的A；单独的B；单独的C；A和B；B和C；A和C；以及A、B和C”。术语“或”可以结合(conjunctively)使用或分别(disjunctively)使用，除非上下文明确地指示分别使用。
此外，术语“包括/包含(including)”以及其他形式，诸如“包括/包含(include)”、“包括/包含(includes)”和“包括/包含(included)”的使用不是限制性的。
说明书中提及“一些实施方案”、“实施方案”、“一种实施方案”或“其他实施方案”是指，结合实施方案描述的特定特征、结构或特性被包含在本公开内容的至少一些实施方案中，但不一定被包含在所有实施方案中。
如本说明书和权利要求书中使用的，词语“包含/包括(comprising)”(和包含/包括(comprising)的任何形式，诸如“包含/包括(comprise)”和“包含/包括(comprises)”)、“具有(having)”(和具有(having)的任何形式，诸如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括/包含(including)”(和包括/包含(including)的任何形式，诸如“包括/包含(includes)”和“包括/包含(include)”)或“包含/包含(containing)”(和“包含/含有(containing)”的任何形式，诸如“包含/含有(contains)”和“包含/含有(contain)”)是包含性的或开放式的，并不排除另外的、未列举的要素或方法步骤。设想的是本说明书中讨论的任何实施方案可以对于本公开内容的任何方法或组合物实施，反之亦然。此外，本公开内容的组合物可用于实现本公开内容的方法。
如本文使用的，涉及参考数值的术语“约”及其语法等同物可包括该数值自身和该数值加或减10％的值的范围。
术语“约(about)”或“大约(approximately)”意指在本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分地取决于如何测量或确定该值，例如，测量系统的局限性。例如，“约”可以根据本领域的实践意指1个或多于1个标准差以内。可选择地，“约”可意指给定值的至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的范围。在另一实例中，量“约10”包括10和从9到11的任何量。在又一实例中，关于参考数值的术语“约”还可包括该数值加减10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的值的范围。可选地，特别是对于生物系统或过程而言，该术语“约”可以意指在值的一个数量级以内，优选在值的5倍以内，并且更优选在值的2倍以内。当在本申请和权利要求书中描述特定值时，除非另有说明，否则术语“约”应被假定意指特定值的可接受的误差范围以内。
如本文所使用的术语“糖尿病”及其语法等同物可以指以延长时间段内高血糖水平为特征的疾病。例如，如本文所使用，术语“糖尿病”及其语法等同物可以指糖尿病的所有或任何类型，包括但不限于，1型糖尿病、2型糖尿病、囊性纤维化相关糖尿病、外科手术性糖尿病、妊娠糖尿病和线粒体糖尿病。在一些情况下，糖尿病可以是遗传性糖尿病的形式。
如果没有特别说明，术语“内分泌细胞”可以指存在于生物体胰腺中的激素产生细胞，诸如“胰岛(islet)”、“胰岛细胞”、“胰岛等同物”、“胰岛样细胞”、“胰岛(pancreaticislet)”及其语法等同物。在实施方案中，可以将内分泌细胞与胰腺祖细胞或前体区分。胰岛细胞可以包括不同类型的细胞，包括但不限于，胰腺α细胞、胰腺β细胞、胰腺δ细胞、胰腺F细胞和/或胰腺ε细胞。胰岛细胞还可以指一组细胞、细胞簇等。
如此处所用，术语“药学上可接受的”可以指在合理的医学判断范围内，适合于与人类和动物的组织接触使用而无过度的毒性、刺激、变态反应或者其他问题或并发症，与合理的获益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
如此处所用，术语“药学上可接受的载体”可以指涉及将主题化合物从一个器官或身体部分携带或运输到另一器官或身体部分的药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如，润滑剂、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌，或硬脂酸)或溶剂包封材料。每种载体必须是“可接受的”，其意义在于与制剂的其他成分相容并且对患者不是有害的。可以用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：(1)糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和醋酸纤维素；(4)粉状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，诸如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石；(8)赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；(9)油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二元醇，诸如丙二醇；(11)多元醇，诸如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇(PEG)；(12)酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；(22)填充剂(bulking agent)，诸如多肽和氨基酸；(23)血清组分，诸如血清白蛋白、HDL和LDL；(24)C2-C12醇，诸如乙醇；以及(25)在药物制剂中使用的其他无毒的相容性物质。制剂中还可存在润湿剂、着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。诸如“赋形剂”、“载体”、“药学上可接受的载体”等术语在本文中可互换使用。
术语“祖细胞”和“前体”细胞在本文中可互换使用，并且指相对于其可以通过分化产生的细胞具有更原始的细胞表型的细胞(例如，与完全分化的细胞相比，其处于发育途径或进展的较早步骤)。通常，祖细胞也可以具有显著的或非常高的增殖潜力。祖细胞可以产生多种不同的分化细胞类型或单一分化的细胞类型，这取决于发育途径和细胞在其中发育和分化的环境。
与胰岛素阳性内分泌细胞相关的术语“其前体”可以指当在适合于使前体细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的条件下培养时能够分化为胰岛素阳性内分泌细胞的任何细胞，包括例如，多能干细胞、定形内胚层细胞、原始肠管细胞、胰腺祖细胞或内分泌祖细胞。
术语“干细胞衍生的β细胞”、“SC-β细胞”、“功能性β细胞”、“功能性胰腺β细胞”、“成熟SC-β细胞”及其语法等同物可以指显示至少一种指示胰腺β细胞的标志物(例如，PDX-1或NKX6.1)并表达胰岛素的细胞(例如，非天然胰腺β细胞)。在一些实施方案中，SC-β细胞显示内源性成熟β细胞的葡萄糖刺激胰岛素分泌(GSIS)应答特征。在一些实施方案中，本文使用的术语“SC-β细胞”和“非天然β细胞”是可互换的。在一些实施方案中，“SC-β细胞”包括成熟的胰腺细胞。应当理解，SC-β细胞不需要衍生自干细胞(例如，直接地)，因为本公开内容的方法能够使用任何细胞作为起点从任何胰岛素阳性内分泌细胞或其前体衍生出SC-β细胞(例如，人们可以使用胚胎干细胞、诱导多能干细胞、祖细胞、部分重编程的体细胞(例如，已被部分重编程为诱导多能干细胞与其衍生自的体细胞之间的中间状态的体细胞)、多潜能细胞、全能细胞、任何前述细胞的转分化形式，等等，因为本公开内容并非旨在以这种方式进行限制)。在一些实施方案中，SC-β细胞表现出对多于一次葡萄糖刺激(例如，至少一次、至少两次或至少三次或更多次顺序的葡萄糖刺激)的响应。在一些实施方案中，该响应类似于内源性胰岛(例如，人类胰岛)对多于一次葡萄糖刺激的响应。在一些实施方案中，SC-β细胞的形态类似于内源性β细胞的形态。在一些实施方案中，SC-β细胞表现出类似于内源性β细胞的GSIS响应的体外GSIS响应。在一些实施方案中，SC-β细胞表现出类似于内源性β细胞的GSIS响应的体内GSIS响应。在一些实施方案中，SC-β细胞表现出类似于内源性β细胞的GSIS响应的体外GSIS响应和体内GSIS响应。可以在将SC-β细胞移植到宿主(例如，人类或动物)中的两周内观察到SC-β细胞的GSIS响应。在一些实施方案中，SC-β细胞将胰岛素包封在分泌颗粒内。在一些实施方案中，SC-β细胞表现出包封的结晶胰岛素颗粒。在一些实施方案中，SC-β细胞表现出大于1的刺激指数。在一些实施方案中，SC-β细胞表现出大于1.1的刺激指数。在一些实施方案中，SC-β细胞表现出大于2的刺激指数。在一些实施方案中，SC-β细胞响应于细胞因子表现出细胞因子诱导的凋亡。在一些实施方案中，SC-β细胞的胰岛素分泌响应于已知的抗糖尿病药物(例如，促分泌素)而增强。在一些实施方案中，SC-β细胞是单激素的。在一些实施方案中，SC-β细胞不异常地共表达其他激素，诸如胰高血糖素、生长抑素或胰腺多肽。在一些实施方案中，SC-β细胞表现出低复制速率。在一些实施方案中，SC-β细胞响应于葡萄糖而增加细胞内Ca2+。在一些实施方案中，SC-β细胞以比来自健康对照成人受试者胰腺的β细胞更低的水平表达MAFA。在一些实施方案中，SC-β细胞以比来自健康对照成人受试者胰腺的β细胞更高的水平表达MAFB。在一些实施方案中，SC-β细胞以比来自健康对照成人受试者胰腺的β细胞更高的水平表达SIX2、HOPX、IAPP和/或UCN3。在一些实施方案中，SC-β细胞不表达MAFA。在一些实施方案中，SC-β细胞表达MAFB。在一些实施方案中，通过流式细胞术检测本文公开的任何细胞标志物(例如，MAFA、MAFB、SIX2、HOPX、IAPP和/或UCN3)。在一些实施方案中，群体包含一个或更多个NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞，其以比来自健康对照成年受试者胰腺的NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞更高的水平(例如，至少10％、30％、50％、70％、100％、125％、150％或200％更高)表达CHGA、MAFB和/或ESRRG。在一些实施方案中，细胞群体中至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞以比来自健康对照成年受试者胰腺的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞更高的水平表达CHGA、MAFB和/或ESRRG。在一些实施方案中，群体包含一个或更多个NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞，其以比来自健康对照成年受试者胰腺的NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞更低的水平(例如，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％更低)表达SIX3、MAFA、CHGB、RBP4和/或FXYD2。在一些实施方案中，细胞群体中至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞以比来自健康对照成年受试者胰腺的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞更低的水平表达SIX3、MAFA、CHGB、RBP4和/或FXYD2。在一些实施方案中，该群体包含比来自健康对照成年受试者的胰腺的NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞表达更低水平的SIX3的NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞。在一些实施方案中，该群体包含比来自健康对照成年受试者的胰腺的NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞表达更低水平的CHGB的NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞。在一些实施方案中，该群体包含比来自健康对照成年受试者的胰腺的NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞表达更低水平的RBP4的NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞。在一些实施方案中，该群体包含比来自健康对照成年受试者的胰腺的NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞表达更低水平的FXYD2的NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞。
在一些实施方案中，本文公开的任何NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞也表达以下基因的任何一种或更多种：PC2、MNX1或ABCC8。
术语“干细胞衍生的α细胞”、“SC-α细胞”、“功能性α细胞”、“功能性胰腺α细胞”、“成熟SC-α细胞”及其语法等同物可以指显示至少一种指示胰腺α细胞的标志物(例如，胰高血糖素、表达ISL1但不表达NKX6.1)、表达胰高血糖素，并分泌功能性胰高血糖素的细胞(例如，非天然胰腺α细胞)。在一些实施方案中，“SC-α细胞”不表达生长抑素。在一些实施方案中，“SC-α细胞”不表达胰岛素。在一些实施方案中，本文使用的术语“SC-α细胞”和“非天然α细胞”是可互换的。在一些实施方案中，“SC-α细胞”包括成熟的胰腺细胞。
术语“干细胞衍生的δ细胞”、“SC-δ细胞”、“功能性δ细胞”、“功能性胰腺δ细胞”、“成熟SC-δ细胞”及其语法等同物可以指显示至少一种指示胰腺δ细胞的标志物(例如，生长抑素)、表达和分泌生长抑素的细胞(例如，非天然胰腺δ细胞)。在一些实施方案中，“SC-δ细胞”不表达胰高血糖素。在一些实施方案中，“SC-δ细胞”不表达胰岛素。在一些实施方案中，本文使用的术语“SC-δ细胞”和“非天然δ细胞”是可互换的。在一些实施方案中，“SC-δ细胞”包括成熟的胰腺细胞。
术语“干细胞衍生的肠嗜铬(EC)细胞”、“SC-EC细胞”及其语法等同物可以指显示至少一种指示胰腺EC细胞的标志物(例如，VMAT1、表达NKX6.1但不表达ISL1)的细胞(例如，非天然胰腺EC细胞)。在一些实施方案中，本文使用的术语“SC-EC细胞”和“非天然EC细胞”是可互换的。
与SC-β细胞类似，应当理解SC-α、SC-δ细胞和SC-EC细胞不需要衍生自干细胞(例如，直接地)，因为本公开内容的方法能够从作为起点的在SC-β细胞的体外分化期间产生的其他前体细胞(例如，人们可以使用胚胎干细胞、诱导多能干细胞、祖细胞、部分重编程的体细胞(例如，已被部分重编程为诱导多能干细胞与其衍生自的体细胞之间的中间状态的体细胞)、多潜能细胞、全能细胞、任何前述细胞的转分化形式，等等，因为本公开内容并非旨在以这种方式进行限制)。
短语“干细胞衍生的胰岛细胞”或“SC-胰岛细胞”是衍生自干细胞的胰岛细胞。SC-胰岛细胞的实例包括SC-β细胞、SC-α、SC-δ细胞和SC-EC细胞。SC-胰岛细胞不是从尸体或从人类受试者获得的成熟胰岛细胞。
如本文所用，关于细胞群体的短语“治疗有效量”意味着以适用于任何医学治疗的合理的获益/风险比在动物中细胞的至少亚群体中有效地产生一些期望的治疗效果的细胞群体中的相关细胞(例如，本公开内容的SC-β细胞或成熟的胰腺β细胞，或包含SC-β细胞的组合物)的量。例如，施用至受试者的SC-β细胞群体的量足以在1型、1.5型或2型糖尿病的至少一种症状诸如糖化血红蛋白水平、空腹血糖水平、低胰岛素血症等中产生统计学上显著的、可测量的变化。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。通常，治疗有效量可以随受试者的病史、年龄、状况、性别以及受试者的医学状况的严重程度和类型以及其他药物活性剂的施用而变化。
如本文所使用，术语“胰岛素产生细胞”及其语法等同物指从胰腺祖细胞或其前体分化的分泌胰岛素的细胞。胰岛素产生细胞可以包括如本文描述的术语胰腺β细胞，以及以组成型或诱导型方式合成(例如，转录胰岛素基因、翻译胰岛素原mRNA和将胰岛素原mRNA修饰为胰岛素蛋白)、表达(例如，表现出胰岛素基因携带的表型性状)或分泌(将胰岛素释放到细胞外间隙中)胰岛素的胰腺β样细胞(例如，胰岛素阳性、内分泌细胞)。胰岛素产生细胞群体，例如，根据本公开内容的方法通过使胰岛素阳性内分泌细胞或其前体分化为SC-β细胞而产生的胰岛素产生细胞群体可以是胰腺β细胞或β样细胞(例如，具有内源性β细胞的至少一种或至少两种特征并且可以表现出类似于内源性成体β细胞的葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)响应的细胞)。胰岛素产生细胞群体，例如，通过本文公开的方法产生的胰岛素产生细胞群体可以包含成熟胰腺β细胞或SC-β细胞，并且还可以包含非胰岛素产生细胞(例如，具有细胞样表型的细胞，但它们不产生或分泌胰岛素)。
术语“胰岛素阳性β样细胞”、“胰岛素阳性内分泌细胞”及其语法等同物可以指显示至少一种指示胰腺β细胞的标志物并且也表达胰岛素，但缺乏内源性β细胞的葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)响应特性的细胞(例如，胰腺内分泌细胞)。“胰岛素阳性内分泌细胞”的示例性标志物包括但不限于NKX6.1、ISL1和胰岛素。在一些情况下，术语“胰岛素阳性内分泌细胞”和“NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞”可以互换使用。
如本文使用的，“细胞标志物”是指但不限于蛋白质、肽、核酸、蛋白质和核酸的多态性、剪接变体、蛋白质或核酸的片段、元件和其他分析物，它们在一种或更多种特定细胞类型中特异性表达或存在并且在其他特定细胞类型中不表达或不存在。例如，细胞群体中的一些细胞可以表达PDX1，而群体中的其他细胞不表达。在特定实施方案中，使用商业上可获得的抗体，例如，在流式细胞术和/或免疫组织化学中确定一种或更多种细胞标志物的存在或不存在。在其他实施方案中，使用RT-PCR检测一种或更多种细胞标志物的存在或不存在。细胞标志物的实例包括PDX1、NKX6.1、NGN-3、NeuroD、ISL1、胰岛素、C-肽、胰高血糖素、生长抑素、VMAT1、MAFA和MAFB。在整个本公开内容中引用了特定细胞标志物的其他实例。
术语“β细胞标志物”是指但不限于在胰腺β细胞中特异性表达或存在的蛋白质、肽、核酸、蛋白质和核酸的多态性、剪接变体、蛋白质或核酸的片段、元件和其他分析物。示例性的β细胞标志物可以包括但不限于胰腺和十二指肠同源框1(PDX1)多肽、胰岛素、C-肽、胰岛淀粉素、E-钙黏着蛋白、Hnf3β、PCI/3、B2、Nkx2.2、GLUT2、PC2、ZnT-8、ISL1、Pax6、Pax4、NeuroD、1Inf1b、Hnf-6、Hnf-3β和MafA，以及在Zhang等人，Diabetes.50(10):2231-6(2001)中描述的那些。在一些实施方案中，β细胞标志物是核β细胞标志物。在一些实施方案中，β细胞标志物是PDX1或PH3。
术语“胰腺内分泌标志物”可以指但不限于在胰腺内分泌细胞中表达或存在的蛋白质、肽、核酸、蛋白质和核酸的多态性、剪接变体、蛋白质或核酸的片段、元件和其他分析物。示例性的胰腺内分泌细胞标志物包括但不限于Ngn-3、NeuroD和Islet-1。
术语“胰腺祖细胞”、“胰腺内分泌祖细胞”、“胰腺前体”、“胰腺内分泌前体”及其语法等同物在本文中可互换使用，并且可以指能够成为能够形成胰腺内分泌细胞、胰腺外分泌细胞或胰管细胞的胰腺激素表达细胞的干细胞。这些细胞定型于分化为至少一种类型的胰腺细胞，例如，产生胰岛素的β细胞；产生胰高血糖素的α细胞；产生生长抑素的δ细胞(或D细胞)；和/或产生胰腺多肽的F细胞。这样的细胞可以表达以下标志物中的至少一种：NGN3、NKX2.2、NeuroD、ISL-1、Pax4、Pax6或ARX。
如本文使用的，术语“PDX1-阳性胰腺祖细胞”或“PDX1-阳性、NKX6.1-阴性胰腺祖细胞”可以指为具有分化成SC-β细胞(诸如胰腺β细胞)的能力的胰腺内胚层(PE)细胞的细胞。PDX1阳性胰腺祖细胞表达标志物PDX1。其他标志物包括但不限于Cdcp1或Ptf1a或HNF6或NRx2.2。可以通过技术人员已知的任何方法，诸如流式细胞术、使用抗PDX1抗体的免疫化学或定量RT-PCR来评估PDX1的表达。在一些情况下，PDX1阳性胰腺祖细胞缺乏NKX6.1的表达。在一些情况下，由于PDX1阳性胰腺祖细胞缺乏NKX6.1的表达，因此也可以称为PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞。在一些情况下，PDX1阳性胰腺祖细胞也可以称为“胰腺前肠内胚层细胞”。
术语“PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞”和“NKX6.1阳性胰腺祖细胞”在本文中可以互换使用，并且可以指这样的细胞，其为具有分化为胰岛素产生细胞(诸如胰腺β细胞)的能力的胰腺内胚层(PE)细胞。PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞表达标志物PDX1和NKX6-1。其他标志物包括但不限于Cdcp1或Ptf1a或HNF6或NRx2.2。可以通过技术人员已知的任何方法，诸如流式细胞术、使用抗NKX6-1抗体的免疫化学或定量RT-PCR来评估NKX6-1的表达。如本文所使用，术语“NKX6.1”和“NKX6-1”是等同的并且可互换。在一些情况下，PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞也可以称为“胰腺前肠前体细胞”。
术语“NeuroD”和“NeuroD1”可互换使用并标识在胰腺内分泌祖细胞中表达的蛋白质以及编码该蛋白质的基因。
术语“表观遗传学”是指不涉及DNA序列改变的基因功能的可遗传改变。表观遗传学最常表示影响基因活性和表达的染色体变化，但也可用于描述并非源自基因组修饰的任何可遗传表型变化。这样的对细胞和生理表型性状的影响可能是由外部或环境因素引起的，或者是正常发育程序的一部分。表观遗传学也可以指基因组在功能上的相关改变，而不涉及核苷酸序列的改变。产生这样的变化的机制的实例是DNA甲基化和组蛋白修饰，每一种都改变基因的表达方式而不会改变基础的DNA序列。基因表达可通过附着于DNA沉默区的阻遏蛋白的作用来控制。这些表观遗传变化可通过细胞分裂持续到细胞生命的整个过程，并且也可持续多于一代，即使它们不涉及生物体基础DNA序列的变化。真核生物学中表观遗传学变化的一个实例是细胞分化过程。在形态发生过程中，全能干细胞变成各种多能细胞，继而又可以变成完全分化的细胞。
术语“表观遗传修饰化合物”是指可以使表观遗传改变基因(即改变基因表达而不改变DNA序列)的化合物。表观遗传改变可以帮助决定基因是开启还是关闭，并可以影响某些细胞(例如，β细胞)中蛋白质的产生。表观遗传修饰(诸如DNA甲基化和组蛋白修饰)改变DNA的可及性和染色质结构，从而调节基因表达的模式。这些过程对于成年生物体中不同细胞谱系的正常发育和分化至关重要。它们可以通过外源性影响进行修饰，并且因此，可以促进表型或病理表型的环境改变或可以是表型或病理表型的环境改变的结果。重要的是，表观遗传修饰在多能性基因的调节中可以起着至关重要的作用，多能性基因在分化期间失活。非限制性示例性表观遗传修饰化合物包括DNA甲基化抑制剂、组蛋白乙酰转移酶抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、组蛋白甲基转移酶抑制剂、布罗莫结构域抑制剂或其任何组合。
术语“分化的细胞”或其语法等同物意指在其天然形式下并非多能(如该术语在本文所定义的)的任何原代细胞。换句话说，术语“分化的细胞”可以指在细胞分化过程中衍生自特化程度较低的细胞类型的细胞(例如，干细胞，诸如诱导多能干细胞)的特化程度较高的细胞类型的细胞。不希望受限于理论，多能干细胞在正常个体发育过程中可以首先分化为能够形成胰腺细胞的内胚层细胞和其他内胚层细胞类型。内胚层细胞的进一步分化可能导致胰腺途径，其中，在一些实施方案中，约98％的细胞变为外分泌细胞、导管或基质细胞，并且约2％变为内分泌细胞。早期内分泌细胞是胰岛祖细胞，其可随后进一步分化为分泌胰岛素、胰高血糖素、生长抑素或胰腺多肽的胰岛素产生细胞(例如，功能性内分泌细胞)。内胚层细胞也可以分化为内胚层起源的其他细胞，例如，肺、肝、肠、胸腺等等的细胞。
如本文所使用，术语“体细胞”可以指形成生物体的身体的任何细胞，与种系细胞相反。在哺乳动物中，种系细胞(也称为“配子”)是精子和卵子，它们在受精过程中融合以产生称为合子的细胞，整个哺乳动物的胚胎都由其发育而来。哺乳动物体内的所有其他细胞类型(除了精子和卵子、形成它们的细胞(配子体)和未分化的干细胞)都是体细胞：内部器官、皮肤、骨骼、血液和结缔组织均由体细胞组成。在一些实施方案中，体细胞是“非胚胎体细胞”，是指不存在于胚胎中或不是从胚胎中获得并且不是由这样的细胞在体外增殖产生的体细胞。在一些实施方案中，体细胞是“成体体细胞”，是指存在于除胚胎或胎儿以外的生物体中或从中获得的细胞，或者从这样的细胞在体外增殖获得的细胞。除非另有说明，否则用于将至少一种胰岛素阳性内分泌细胞或其前体转化为胰岛素产生、葡萄糖响应性细胞的方法可以在体内和体外进行(其中当至少一种胰岛素阳性内分泌细胞或其前体存在于受试者体内时在体内实践，并且使用维持在培养物中的分离的至少一种胰岛素阳性内分泌细胞或其前体在体外实践)。
如本文所使用，术语“成体细胞”可以指在胚胎发育后在整个身体中发现的细胞。
如本文所使用，术语“内胚层细胞”可以指在非常早期的胚胎中来自三个主要胚细胞层(germ cell layer)之一的细胞(其他两个胚细胞层是中胚层和外胚层)。内胚层是这三层的最内层。内胚层细胞能够首先分化产生胚胎肠，并且然后再分化产生呼吸道和消化道(例如肠)、肝和胰腺的内膜。
如本文所使用，术语“内胚层起源的细胞”可以指从内胚层细胞发育或分化的任何细胞。例如，内胚层起源的细胞包括肝、肺、胰腺、胸腺、肠、胃和甲状腺的细胞。不希望受理论的束缚，肝和胰腺祖细胞(也被称为胰腺的祖细胞)能够从胚胎前肠中的内胚层细胞发育而来。特化后不久，肝和胰腺祖细胞迅速获得明显不同的细胞功能和再生能力。这些变化由在脊椎动物中高度保守的诱导信号和遗传调节因子所引起。在肝衰竭和I型糖尿病的治疗性治疗中对肝细胞和胰腺β细胞的强烈需求激起了人们对器官发育和再生的兴趣。在多种模式生物和人类中的研究表明，演化上保守的诱导信号和转录因子网络引发肝和胰腺细胞的分化，并为如何促进从多种干细胞和祖细胞类型分化肝细胞和β细胞提供指导。
如本文所使用，术语“定形内胚层(definitive endoderm)”可以指从内胚层细胞分化并且可以分化为SC-β细胞(例如，胰腺β细胞)的细胞。定形内胚层细胞表达标志物Sox17。定形内胚层细胞特征性的其他标志物可以包括但不限于MIXL2、GATA4、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CXCR4、Cerberus、OTX2、goosecoid、C-Kit、CD99、CMKOR1和CRIP1。特别地，本文的定形内胚层细胞表达Sox17，并且在一些实施方案中表达Sox17和HNF3B，并且不表达显著水平的GATA4、SPARC、APF或DAB。定形内胚层细胞对标志物PDX1不呈阳性(例如，它们为PDX1阴性)。定形内胚层细胞具有分化为包括肝、肺、胰腺、胸腺、肠、胃和甲状腺的细胞在内的细胞的能力。可以通过技术人员已知的任何方法，如使用抗Sox17抗体的免疫化学或定量RT-PCR来评估Sox17和定形内胚层的其他标志物的表达。
术语“胰腺内胚层”可以指内胚层起源的能够分化为多种胰腺谱系(包括胰腺β细胞)但不再具有分化为非胰腺谱系的能力的细胞。
如本文所使用，术语“原始肠管细胞”或“肠管细胞”可以指从内胚层细胞分化并且可以分化为SC-β细胞(例如，胰腺β细胞)的细胞。原始肠管细胞表达以下标志物中的至少一种：HNP1-β、HNF3-β或HNF4-α。在一些情况下，原始肠管细胞是FOXA2阳性和SOX2阳性的，即，表达FOXA2(也被称为HNF3-β)和SOX2二者。在一些情况下，原始肠管细胞是FOXA2阳性和PDX1阴性的，即，表达FOXA2但不表达PDX1。原始肠管细胞具有分化为包括肺、肝、胰腺、胃和肠细胞在内的细胞的能力。可以通过技术人员已知的任何方法，如使用例如，抗HNF1-β抗体的免疫化学来评估HNF1-β和原始肠管的其他标志物的表达。
如本文使用的，术语“干细胞”可以指能够增殖并产生更多祖细胞的未分化的细胞，祖细胞具有产生大量母细胞的能力，这些母细胞继而可以产生分化的(differentiated)或可分化的(differentiable)子细胞。子细胞本身可以被诱导增殖并产生子代，该子代随后分化为一种或更多种成熟细胞类型，同时还保留一种或更多种具有亲本发育潜力的细胞。术语“干细胞”可以指祖细胞的子集，其在特定情况下具有分化为特化或分化程度更高的表型的能力或潜力，并且在某些情况下保留增殖但基本不分化的能力。在一种实施方案中，术语干细胞通常是指天然存在的母细胞，其后代(子代)通常在不同的方向上通过分化(例如，通过获得完全独立的特征)而进行特化，这发生在胚胎细胞和组织的逐步多样化中。细胞分化是通常通过许多次细胞分裂而发生的复杂过程。分化的细胞可以衍生自多潜能细胞，该多潜能细胞本身也衍生自多潜能细胞，等等。虽然这些多潜能细胞中的每一种都可以被认为是干细胞，但是每种细胞所能产生的细胞类型的范围可能相差很大。一些分化的细胞也具有产生具有更大发育潜力的细胞的能力。这样的能力可以是天然的，也可以在用各种因子处理时由人工诱导。在许多生物学情况下，干细胞也是“多潜能的”，因为它们可以产生不止一种不同细胞类型的子代，但这不是“干性(stem-ness)”所必需的。自我更新是干细胞定义的另一个经典部分。从理论上讲，自我更新可以通过两种主要机制之一发生。干细胞可以不对称分裂，一个子代保持干细胞状态，并且另一个子代表现出一些不同的其他特定功能和表型。可选地，群体中的一些干细胞可以对称地分为两个干细胞，从而整体上维持群体中的一些干细胞，而群体中的其他细胞仅产生分化的子代。从形式上讲，开始于干细胞的细胞可能会走向分化的表型，但是然后“逆转”并重新表现干细胞表型，这在术语上通常被本领域普通技术人员称为“去分化”或“重编程”或“反分化”。如本文使用的，术语“多能干细胞”包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞、胎盘干细胞，等等。
如本文使用的，术语“多能”可以指在不同条件下具有分化为多于一种分化的细胞类型，并且优选地分化为所有三个胚细胞层特征性的细胞类型的能力的细胞。多能细胞的特征主要在于其分化为多于一种细胞类型，优选分化为所有三个胚层的能力，例如使用裸小鼠畸胎瘤形成测定。多能性还可以通过胚胎干(ES)细胞标志物的表达来证明，尽管多能性的优选测试是展示分化为三个胚层中的每一个的细胞的能力。应当注意，简单地培养这样的细胞本身并不能赋予其多能性。相对于原代细胞亲代，重编程的多能细胞(例如，iPS细胞，如该术语在本文所定义的)也具有延长传代而不丧失生长潜力的能力的特征，而原代细胞亲代在培养中通常仅具有有限的分裂次数。
如本文使用的，术语“iPS细胞”和“诱导多能干细胞”可互换使用，并且可以指从非多能细胞，通常是成体体细胞人工衍生(例如，诱导或通过完全逆转)的多能干细胞，例如，通过诱导一个或更多个基因的强制表达而人工衍生。
术语“表型”可以指在特定的一组环境条件和因素下定义细胞或生物体的一个或一定数量的总生物学特性，而与实际基因型无关。
术语“受试者”、“患者”或“个体”在本文可互换使用，并且可以指动物，例如，可以从其获得细胞的人类和/或向其提供使用本文描述的细胞的治疗(包括预防性治疗)的人类。对于特定动物诸如人类受试者特定的那些感染、状况或疾病状态的治疗，术语受试者可以指该特定动物。在本文可互换使用的“非人类动物”和“非人类哺乳动物”包括哺乳动物，诸如大鼠、小鼠、兔、绵羊、猫、狗、牛、猪和非人类灵长类动物。术语“受试者”还涵盖任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物、爬行动物、两栖动物和鱼类。然而，有利地，受试者是哺乳动物，诸如人类，或其他哺乳动物，诸如家养的哺乳动物例如，狗、猫、马等，或产生哺乳动物例如，牛、绵羊、猪等。“有相应需要的患者”或“有相应需要的受试者”在本文中是指被诊断患有或怀疑患有疾病或紊乱的患者，该疾病或紊乱例如，但不限于糖尿病。
本文使用的“施用”可以指向患者或受试者提供本文描述的一种或更多种组合物。举例而言而非限制，组合物施用(例如，注射)可通过静脉内(i.v.)注射、皮下(s.c.)注射、皮内(i.d.)注射、腹膜内(i.p.)注射或肌内(i.m.)注射进行。可以使用一种或更多种这样的途径。肠胃外施用可以是例如，通过团注或通过随时间逐渐灌注。可选地或同时地，可以通过口服途径施用。另外，还可以通过手术沉积细胞的丸剂或团剂或者定位医疗装置而施用。在一些实施方案中，施用是向受试者施用容纳细胞群体的一个或更多个装置(例如，经皮下和/或经腹膜前)。在实施方案中，本公开内容的组合物可包含表达本文描述的核酸序列的工程化细胞或宿主细胞，或包含至少一种本文描述的核酸序列的载体，其量有效治疗或预防增殖性病症。药物组合物可包含如本文描述的细胞群体，组合一种或更多种药学上或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。这样的组合物可以包含缓冲剂，诸如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；糖类，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或右旋糖酐、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；以及防腐剂。
治疗方法
在一些方面，本文提供了用于治疗受试者中的以延长时间段内高血糖水平为特征的疾病(例如，糖尿病，例如，1型糖尿病)的方法。在一些方面，本文提供了用于预防受试者(例如处于发展此类疾病的风险中的受试者)中的以延长时间段内高血糖水平为特征的疾病(例如糖尿病，例如1型糖尿病)的方法。在一些方面，本文提供了用于降低受试者中发展以延长时间段内高血糖水平为特征的疾病(例如糖尿病，例如1型糖尿病)的可能性的方法。可以将包含本文提供的或根据本文提供的方法产生的细胞群体(例如，细胞簇和/或细胞)的组合物施用至受试者以恢复受试者中的一定程度的胰腺功能。例如，可以向受试者施用类似于内源性胰岛的细胞簇或类似于内源性胰腺α、β和/或δ细胞(例如，非天然胰腺α、β和/或δ细胞)或其前体的细胞，以治疗、预防或降低发展以延长时间段内高血糖水平为特征的疾病(例如糖尿病，例如1型糖尿病)的可能性。
该方法可以包括经由将细胞移植到包封组合物(例如，装置)中，向受试者(例如，有相应需要的受试者)施用本申请中公开的细胞簇或细胞。在一些实施方案中，受试者被施用装置中的细胞/细胞簇(例如，经皮下或经腹膜前)。
该方法可以包括经由输注将本申请中公开的细胞簇或细胞施用至受试者(例如，有相应需要的受试者)。术语“输注”可以指将细胞或细胞簇、细胞或其细胞簇的任何部分、或包含细胞、细胞簇或其任何部分的任何组合物递送到受试者的血流中，举例来说，例如，递送到受试者的静脉(例如，肝门静脉)或插入到血流中的输注端口中。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括经由输注将本文公开的药物组合物施用至受试者。药物组合物可以包含液体悬浮液中的细胞群体(例如，SC-胰岛细胞)。细胞群体可包含类似于内源性胰岛的细胞簇，或类似于内源性胰腺α、β和/或δ细胞(例如，非天然胰腺α、β和/或δ细胞)或其前体的细胞。例如，细胞群体可以包含表达C-肽和ISL1的非天然细胞。在一些实施方案中，细胞群体包含表达C-肽和ISL1但不表达VMAT1的非天然细胞。另外地，细胞群体可包含表达胰高血糖素但不表达生长抑素的非天然细胞(例如，非天然α细胞)和表达生长抑素但不表达胰高血糖素的非天然细胞(例如，非天然δ细胞)。
如本文所使用，术语“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”可以指向受试者施用有效量的组合物(例如，细胞簇或其部分)，从而使受试者获得疾病的至少一种症状的减少或疾病改善，例如，有益或期望的临床结果。在一些实施方案中，受试者在治疗后变得不依赖于胰岛素。为了本公开内容的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于一种或更多种症状的缓和、疾病程度的减弱、疾病的稳定状态(例如，不恶化)、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或减轻、以及缓解(例如，部分的或完全的)，无论是可检测的还是无法检测的。治疗可以指与不接受治疗的情况下预期的生存期相比延长生存期。因此，本领域技术人员将意识到治疗可以改善疾病状况，但是可能不完全治愈该疾病。如本文所使用，术语“治疗”包括预防。
疾病或紊乱的“治疗”、“预防”或“改善”是指延迟或预防这样的疾病或紊乱的发作，逆转、缓和、改善、抑制、减慢或停止与这样的疾病或紊乱相关的状况的进展或严重程度的进展、加重或恶化。在一种实施方案中，疾病或紊乱的症状缓和了至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％。
糖尿病治疗的目标是使糖水平尽可能安全地降至接近正常水平。通常设定的目标是餐前80-120毫克每分升(mg/dl)，睡前100-140mg/dl。特定的医师可能会根据其他因素(诸如患者多久一次发生低或高血糖反应)为患者设定不同的目标。有用的医学测试包括对患者血液和尿液的测试以确定血糖水平、对糖基化血红蛋白水平(HbA1c；过去2-3个月中的平均血糖水平的量度，正常范围为4％-6％)的测试、对胆固醇和脂肪水平的测试以及对尿蛋白水平的测试。这样的测试是本领域技术人员已知的标准测试(参见例如，美国糖尿病协会(American Diabetes Association)，1998)。也可以通过在方案中减少具有与糖尿病相关的并发症(诸如严重低血糖事件、眼病、肾病或神经疾病)的患者来确定成功的治疗方案。
本文公开的治疗方法可以导致与血糖调节相关的一个或更多个生理参数的改善。在一些情况下，本文公开的方法可以导致受试者中葡萄糖响应性胰岛素分泌的至少部分恢复。不希望受理论束缚，通过本文公开的方法和组合物恢复的受试者中的葡萄糖响应性胰岛素分泌可以导致受试者中与糖尿病相关的一种或更多种症状或并发症的改善。在一些方面，本公开内容涉及一种方法，该方法包括向受试者施用包含本文提供的细胞群体(例如，SC-胰岛细胞)的药物组合物，其中所施用的细胞以足以降低受试者中的血糖水平的量释放胰岛素。
在施用根据本公开内容的实施方案的药物组合物之后，受试者中的血液C-肽水平可以增加至至少部分改善疾病的一种或更多种症状的水平，例如更稳定、降低的血糖水平、降低的血红蛋白A1c水平、降低的对摄入外源胰岛素的依赖性(例如，为了稳定血糖水平)或更少的严重低血糖事件。在一些情况下，当在施用后至少约1、2、3、4、5或6个月测量时，该方法将受试者的刺激血液C-肽水平升高至至少450pmol/L、460pmol/L、470pmol/L、480pmol/L、490pmol/L、500pmol/L、510pmol/L、520pmol/L、530pmol/L、540pmol/L、550pmol/L、700pmol/L、800pmol/L、900pmol/L、1000pmol/L、1400pmol/L、或150pmol/L-350pmol/L、250pmol/L-400pmol/L、400pmol/L-1400pmol/L、400pmol/L-1200pmol/L、400pmol/L-1000pmol/L、400pmol/L-800pmol/L、400pmol/L-600pmol/L、600pmol/L-800pmol/L、600pmol/L-1400pmol/L或900pmol/L-1200pmol/L之间。刺激血液C-肽水平的测量可以使用标准化测试进行，例如混合膳食耐受性测试或口服葡萄糖耐量测试。在一些情况下，当在施用后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月测量时，该方法将受试者的刺激血液C-肽水平升高至至少450pmol/L、460pmol/L、470pmol/L、480pmol/L、490pmol/L、500pmol/L、510pmol/L、520pmol/L、530pmol/L、540pmol/L或550pmol/L、700pmol/L、800pmol/L、900pmol/L、1000pmol/L、1400pmol/L或150pmol/L-350pmol/L、250pmol/L-400pmol/L、400pmol/L-1400pmol/L、400pmol/L-1200pmol/L、400pmol/L-1000pmol/L、400pmol/L-800pmol/L、400pmol/L-600pmol/L、600pmol/L-800pmol/L、600pmol/L-1400pmol/L或900pmol/L-1200pmol/L之间。在一些情况下，当在施用后约3个月测量时，该方法将受试者的刺激血液C-肽水平升高至至少200pmol/L、300pmol/L、450pmol/L、460pmol/L、470pmol/L、480pmol/L、490pmol/L、500pmol/L、510pmol/L、520pmol/L、530pmol/L、540pmol/L、550pmol/L、600pmol/L或650pmol/L，或150pmol/L-350pmol/L、200pmol/L-700pmol/L、150pmol/L-700pmol/L、300pmol/L-650pmol/L或500pmol/L-700pmol/L之间。在一些情况下，当在施用后约5个月测量时，该方法将受试者的刺激血液C-肽水平升高至至少450pmol/L、460pmol/L、470pmol/L、480pmol/L、490pmol/L、500pmol/L、510pmol/L、520pmol/L、530pmol/L、540pmol/L或550pmol/L。在一些实施方案中，当在施用后约3个月测量时，该方法将受试者的刺激血液C-肽水平升高至约480pmol/L、500pmol/L、520pmol/L、540pmol/L或560pmol/L。在一些实施方案中，当在施用后约5个月测量时，该方法将受试者的刺激血液C-肽水平升高至约480pmol/L、500pmol/L、520pmol/L、540pmol/L或560pmol/L。在一些实施方案中，当在施用后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月(例如，施用后3或5个月)测量时，经治疗的受试者的刺激血液C-肽水平在480pmol/L和560pmol/L之间。
在一些情况下，在过夜空腹>8小时后的早晨进行口服葡萄糖耐量测试或混合膳食耐受性测试。受试者可被限制剧烈运动、酒精、咖啡因和烟草使用，所有这些都可能影响胰岛素敏感性。混合膳食耐受性测试可以通过遵循提供有指定常量营养素含量的标准化膳食或专有膳食替代品的方案来进行，例如，(Abbott)或CompleteNutritional Drink High Protein(NestléHealth Science)。对于口服葡萄糖耐量测试，可以将75g无水葡萄糖溶于250ml水中作为参考方法。
在一些情况下，当在施用后至少约1、2、3、4、5或6个月测量时，该方法将受试者在空腹条件下的血液C-肽水平升高至至少100pmol/L、120pmol/L、130pmol/L、150pmol/L、160pmol/L、180pmol/L、200pmol/L、210pmol/L、220pmol/L、230pmol/L、240pmol/L、250pmol/L、260pmol/L、270pmol/L或280pmol/L。在一些实施方案中，当在施用后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月测量时，该方法将受试者在空腹条件下的血液C-肽水平升高至至少100pmol/L、120pmol/L、130pmol/L、150pmol/L、160pmol/L、180pmol/L、200pmol/L、210pmol/L、220pmol/L、230pmol/L、240pmol/L、250pmol/L、260pmol/L、270pmol/L或280pmol/L。在一些情况下，当在施用后约3个月测量时，该方法将受试者在空腹条件下的血液C-肽水平升高至至少100pmol/L、120pmol/L、130pmol/L、150pmol/L、160pmol/L、180pmol/L、200pmol/L、210pmol/L、220pmol/L、230pmol/L、240pmol/L、250pmol/L、260pmol/L、270pmol/L或280pmol/L。在一些情况下，当在施用后约5个月测量时，该方法将受试者在空腹条件下的血液C-肽水平升高至至少100pmol/L、120pmol/L、130pmol/L、150pmol/L、160pmol/L、180pmol/L、200pmol/L、210pmol/L、220pmol/L、230pmol/L、240pmol/L、250pmol/L、260pmol/L、270pmol/L或280pmol/L。在一些情况下，当在施用后约3个月测量时，该方法将受试者在空腹条件下的血液C-肽水平升高至约200pmol/L、220pmol/L、240pmol/L、260pmol/L或280pmol/L。在一些情况下，当在施用后约5个月测量时，该方法将受试者在空腹条件下的血液C-肽水平升高至约200pmol/L、220pmol/L、240pmol/L、260pmol/L或280pmol/L。在一些情况下，根据本公开内容的药物组合物的施用降低了受试者的血红蛋白A1c水平。例如，当在施用后至少约1、2、3、4、5或6个月测量时，受试者的Hb1Ac水平可以降低至少于8％、7.5％、7.0％、6.5％、6.0％、5.5％，或5％-8％、5％-7.5％、5％-6.5％、5％-5.5％、5.5％-8％、5.5％-7％、5.5％-6.5％、6％-8％、6％-7％或6％-6.5％之间。在一些情况下，当在施用后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月测量时，受试者的Hb1Ac水平降低至少于8％、7.5％、7.0％、6.5％、6.0％、5.5％或5％，或5％-8％、5％-7.5％、5％-6.5％、5％-5.5％、5.5％-8％、5.5％-7％、5.5％-6.5％、6％-8％、6％-7％或6％-6.5％之间。在一些情况下，当在施用后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月测量时，经治疗的受试者的Hb1Ac水平为7％-7.9％。在一些情况下，当在施用后约3个月测量时，其降低至少于8％、7.5％、7.0％或6.75％，或5％-8.0％、6.5％-8.0％、6.5％-7.5％、6.5％-7.0％或7％-8％之间。在一些情况下，当在施用后约5个月测量时，其降低至少于8％、7.9％、7.8％、7.7％、7.6％、7.5％、7.3％、7.2％、7.1％或7.0％。在一些情况下，当在施用后约9个月测量时，其降低至少于8％、7.5％、7.0％、6.5％、6.0％、5.5％或5％，或4.5％-8％、5％-8％、5％-7.5％、5％-7％、5％-6.5％、5％-5.5％、5.5％-8％、5.5％-7％、5.5％-6.5％、6％-8％、6％-7％或6％-6.5％之间。在一些情况下，当在施用后约5个月测量时，其降低至约7.6％、7.5％、7.4％、7.3％、7.2％、7.1％或7.0％。
患有以高血糖水平为特征的疾病(例如，糖尿病)的患者可能具有接受外部胰岛素的输注以管理血糖水平(“血糖控制”)的医学需要。通常，向具有预定血糖控制目标的这样的患者施用外部胰岛素，例如，将血糖水平维持在一定范围内，诸如在以下中讨论的那些：Louis Monnier和Claude Colette,Target for Glycemic Control,Diabetes Care Nov2009,32(suppl 2)S199-S204；DOI:10.2337/dc09-S310，其以其整体并入本文。在一些情况下，医生可以向受试者开出个性化血糖控制目标以指导他/她的胰岛素摄入。本文公开的方法可以减少受试者对外部胰岛素摄入的依赖，同时实现他/她的血糖控制目标。在一些情况下，在施用后至少约1、2、3、4、5或6个月，受试者的每日胰岛素在2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天的时间段内或在至少10天、15天、20天或一个月的时间段内平均降低至至多10单位(U)、9U、8U、7U、6U、5U、4U、3U或2U。在一些情况下，在施用后至少约1、2、3、4、5或6个月，受试者的每日胰岛素在2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天的时间段内或在至少10天、15天、20天或一个月的时间段内平均降低至约10单位(U)、9U、8U、7U、6U、5U、4U、3U、2U或1U。在一些情况下，在施用后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月，受试者不需要在2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天的时间段内或在至少10天、15天、20天或一个月的时间段内进行胰岛素输注。
在一些实施方案中，通过施用本文提供的药物组合物诱导的受试者中血糖水平的降低导致低于糖尿病阈值的葡萄糖量。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物受试者。在一些实施方案中，哺乳动物受试者是人类。在一些实施方案中，在施用后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天，葡萄糖的量减少至低于糖尿病阈值。
可以通过本文的方法治疗的受试者可以是人类或非人类动物。在一些情况下，受试者可以是哺乳动物。受试者的实例包括但不限于灵长类动物，例如，猴子、黑猩猩、狒狒或人类。在一些情况下，受试者是人类。受试者可以是非灵长类动物，包括但不限于狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、兔等。在一些情况下，接受治疗的受试者是有相应需要的受试者，例如，有相应需要的人类。
在某些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如灵长类动物，例如人类。术语“患者”和“受试者”在本文可互换使用。优选地，受试者是哺乳动物。哺乳动物可以是人类、非人类灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。非人类哺乳动物可以有利地用作代表1型糖尿病、2型糖尿病或前驱糖尿病状况的动物模型的受试者。另外，本文描述的方法可以用于治疗家养动物和/或宠物。受试者可以是雄性或雌性。受试者可以是先前已被诊断或被鉴定为罹患或具有糖尿病(例如1型或2型)、糖尿病相关的一种或更多种并发症或前驱糖尿病状况的个体，并且任选地但不必需已经经历了针对糖尿病、糖尿病相关的一种或更多种并发症或前驱糖尿病状况的治疗。受试者还可以是未罹患糖尿病或前驱糖尿病状况的受试者。受试者还可以是已经被诊断或被鉴定为罹患糖尿病、糖尿病相关的一种或更多种并发症或前驱糖尿病状况，但是由于接受针对糖尿病、糖尿病相关的一种或更多种并发症或前驱糖尿病状况的一种或更多种治疗而显示出已知糖尿病风险因素的改善的个体。可选地，受试者还可以是先前未被诊断患有糖尿病、糖尿病相关的一种或更多种并发症或前驱糖尿病状况的受试者。例如，受试者可以是表现出一种或更多种糖尿病、糖尿病相关的并发症或前驱糖尿病状况的风险因素的受试者，或者未表现出糖尿病风险因素的受试者，或者是对糖尿病、糖尿病相关的一种或更多种并发症或前驱糖尿病状况无症状的受试者。受试者还可以是罹患糖尿病或前驱糖尿病状况或具有发展糖尿病或前驱糖尿病状况风险的受试者。受试者还可以是已被诊断或鉴定为患有与本文所定义的糖尿病或前驱糖尿病状况相关的一种或更多种并发症的受试者，或者可选地，受试者可以是先前未被诊断或鉴定为患有与糖尿病或前驱糖尿病状况相关的一种或更多种并发症的受试者。
在一些实施方案中，在施用本文公开的任何药物组合物之前，当使用混合膳食耐受性测试测量时，受试者具有少于100pmol/L的刺激血液C-肽水平，诸如少于80pmol/L、60pmol/L、40pmol/L、30pmol/L、20pmol/L或10pmol/L。在一些实施方案中，在施用本文公开的药物组合物之前，当使用口服葡萄糖耐量测试测量时，受试者具有少于100pmol/L的刺激血液C-肽水平，诸如少于80pmol/L、60pmol/L、40pmol/L、30pmol/L、20pmol/L或10pmol/L。在一些情况下，在施用之前，例如，当使用混合膳食耐受性测试或使用口服葡萄糖耐量测试测量时，受试者具有检测不到的刺激血液C-肽水平。在一些情况下，在施用之前，当在空腹条件下测量时，受试者具有检测不到的刺激血液C-肽水平。在一些实施方案中，在施用之前，受试者具有无残留的内源性胰岛细胞功能。在一些实施方案中，无残留的内源性胰岛细胞功能由在混合膳食耐受性测试中检测不到的空腹C-肽和检测不到的刺激C-肽指示。在一些实施方案中，无残留的内源性胰岛细胞功能由大于350mg/dL、400mg/dL、450mg/dL、475mg/dL或500mg/dL的持续刺激葡萄糖水平指示。在一些实施方案中，在施用之前，受试者每天接受大于10单位、15单位、20单位、25单位、30单位或35单位的胰岛素。在一些情况下，在施用之前，受试者具有大于8.0％，诸如大于8.1％、8.2％、8.3％、8.4％、8.5％、8.6％、8.8％或9.0％的血红蛋白A1c的基线血浆水平。在一些实施方案中，在施用之前，受试者具有大于7.7％、8％、8.2％或8.5％的HbA1c水平。在一些情况下，在施用之前，受试者以至少约20U/天的水平接受胰岛素的输注，诸如至少约22U/天、24U/天、26U/天、28U/天、30U/天、32U/天或34U/天。在一些情况下，在施用之前，受试者具有严重低血糖事件的病史，例如，受试者可以具有每月至少1次严重低血糖事件，诸如至少2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、12次、15次或20次严重低血糖事件。“严重低血糖事件”可以指糖尿病患者需要另一个人的帮助以增加血糖的事件，通常通过施用胰高血糖素或联系医疗专业人员。通过剥夺大脑的葡萄糖，严重的低血糖会急性改变大脑功能，导致神经低血糖症状、惊厥发作，甚至死亡。在一些情况下，在施用之前，受试者具有低血糖意识受损的病史。
在一些情况下，本文提供的治疗的方法可以包括施用一种或更多种免疫应答调节剂，用于调节或降低针对所施用细胞的移植排斥应答或其他免疫应答。在一些实施方案中，免疫应答调节剂不是或不包含类固醇。在一些情况下，免疫应答调节剂包括类固醇，诸如皮质类固醇。可用于所述方法中的免疫应答调节剂的实例可以包括嘌呤合成抑制剂如硫唑嘌呤和霉酚酸、嘧啶合成抑制剂如来氟米特和特立氟胺、抗叶酸剂如甲氨蝶呤、他克莫司、环孢素、吡美莫司、阿贝莫司、胍立莫司、来那度胺、泊马度胺、沙利度胺、PDE4抑制剂、阿普斯特、阿那白滞素、西罗莫司、依维莫司、利罗莫司(Ridaforolimus)、坦罗莫司、优美莫司(Umirolimus)、佐他莫司、抗胸腺细胞球蛋白抗体、抗淋巴细胞球蛋白抗体、CTLA-4、其片段及其融合蛋白如阿巴西普和贝拉西普、TNF抑制剂如依那西普和培那西普(Pegsunercept)、阿柏西普、阿法西普、利纳西普、针对补体组分5的抗体如依库珠单抗、抗TNF抗体如阿达木单抗、阿非莫单抗、培塞妥珠单抗、戈利木单抗、英夫利昔单抗和奈瑞莫单抗、针对白介素5的抗体如美泊利单抗、抗IgE抗体如奥马珠单抗、抗干扰素抗体如法拉莫单抗、抗IL-6抗体如艾西莫单抗、针对IL-12和IL-23的抗体如来金珠单抗(Lebrikizumab)和乌司奴单抗、抗IL-17A抗体如苏金单抗、抗CD3抗体如莫罗单抗-CD3、奥昔珠单抗、替利珠单抗和维西珠单抗、抗CD4抗体如克立昔单抗(Clenoliximab)、凯利昔单抗(Keliximab)和扎木单抗(Zanolimumab)、抗CD11a抗体如依法珠单抗、抗CD18抗体如厄利珠单抗(Erlizumab)、抗CD20抗体如奥妥珠单抗、利妥昔单抗、奥瑞珠单抗(Ocrelizumab)和帕考珠单抗(Pascolizumab)、抗CD23抗体如Gomiliximab和鲁昔单抗、抗CD40抗体如替奈昔单抗和托利珠单抗(Toralizumab)、针对CD62L/L-选择素的抗体如阿塞珠单抗、抗CD80抗体如加利昔单抗、抗CD147/基础免疫球蛋白(Basigin)抗体如加维莫单抗(Gavilimomab)、抗CD154抗体如芦利珠单抗(Ruplizumab)、抗BLyS抗体如贝利木单抗和blisibimod、抗CTLA-4抗体如伊匹木单抗和曲美木单抗、抗CAT抗体如柏替木单抗、乐德木单抗(Lerdelimumab)和美替木单抗(Metelimumab)、抗整合素抗体如那他珠单抗、针对白介素-6受体的抗体如托珠单抗、抗LFA-1抗体如奥度莫单抗、针对IL-2受体/CD25的抗体如巴利昔单抗、达克珠单抗和伊诺莫单抗、针对T-淋巴细胞的抗体(阿佐莫单抗(Zolimomab aritox))如阿托木单抗(Atorolimumab)、西地珠单抗(Cedelizumab)、芳妥珠单抗(Fontolizumab)、马司莫单抗、莫罗木单抗(Morolimumab)、培克珠单抗、瑞利珠单抗、罗维珠单抗(Rovelizumab)、西利珠单抗(Siplizumab)、他利珠单抗、阿替莫单抗(Telimomab aritox)、伐利昔单抗和维帕莫单抗、针对CD25的抗体如阿仑单抗、肌苷一磷酸脱氢酶(IMPDH)的阻断剂如霉酚酸酯、细胞迁移的抑制剂如FTY720。
在一些实施方案中，还向根据本文公开的任何方法施用本文公开的任何药物组合物的受试者施用免疫抑制剂。在一些实施方案中，免疫抑制剂选自由以下组成的组：胸腺球蛋白、依那西普、巴利昔单抗、他克莫司、西罗莫司和霉酚酸酯。在一些实施方案中，还向施用SC-胰岛细胞的受试者施用胸腺球蛋白和依那西普。在一些实施方案中，还向施用SC-胰岛细胞的受试者施用胸腺球蛋白和巴利昔单抗。在一些实施方案中，还向施用SC-胰岛细胞的受试者施用他克莫司和西罗莫司。在一些实施方案中，还向施用SC-胰岛细胞的受试者施用他克莫司和巴利昔单抗。在一些实施方案中，还向施用SC-胰岛细胞的受试者施用西罗莫司和霉酚酸酯。在一些实施方案中，还向施用SC-胰岛细胞的受试者施用霉酚酸酯或霉酚酸钠。
在一些实施方案中，本公开内容提供了向受试者施用第一药物组合物，该第一药物组合物包含1×108个和12×108个(例如，8×108个至12×108个)之间的SC-胰岛细胞。在一些实施方案中，本公开内容提供了在单次施用中(即，在单次输注中，或在将一个或更多个装置植入受试者的一个或更多个切口部位的单次外科手术中)向受试者施用第一药物组合物，该第一药物组合物包含1×108个和12×108个(例如，8×108个至12×108个)之间的SC-胰岛细胞。在一些实施方案中，本公开内容提供了在多次施用中(即，在两次或更多次输注中，或在将一个或更多个装置植入受试者的一个或更多个切口部位的多次外科手术中)向受试者施用第一药物组合物，该第一药物组合物包含1×108个和12×108个之间(例如，8×108个至12×108个)的SC-胰岛细胞。在一些实施方案中，本公开内容提供了向受试者施用第一药物组合物，该第一药物组合物包含1×108个和10×108个之间(例如，3×108个至8.5×108个)的SC-胰岛细胞。在一些实施方案中，第一药物组合物包含至少约1×108个SC-胰岛细胞，诸如至少约1.5×108个、至少约2×108个、至少约2.5×108个、至少约3×108个、至少约3.5×108个、至少约4×108个、至少约4.5×108个、至少约5×108个、至少约5.5×108个、至少约6×108个、至少约6.5×108个或至少约7×108个SC-胰岛细胞。在一些情况下，本文公开的第一药物组合物包含至多约8×108个、至多约7×108个、至多约6.5×108个、至多约6×108个、至多约5.5×108个、至多约5×108个、至多约4.5×108个、至多约4×108个、至多约3.5×108个、至多约3×108个、至多约2.5×108或至多约2×108个SC-胰岛细胞。在一些实施方案中，第一药物组合物包含约1×108个至约8×108个、约1×108个至约7×108个、约1×108个至约6×108个、约1×108个至约5×108个、约1×108个至约4×108个、约1×108个至约3×108个、约1×108个至约2×108个、约1.5×108个至约6.5×108个、约2×108个至约7×108个、约2×108个至约6×108个、约2×108个至约5×108个、约2×108个至约4×108个、约2×108个至约3×108个、约2.5×108个至约5.5×108个、约3×108个至约7×108个、约3×108个至约6×108个、约3×108个至约5×108个、约3×108个至约4×108个、约3.5×108个至约4.5×108或约3.8×108个至约4.2×108个SC-胰岛细胞。在一些情况下，第一药物组合物包含约3.5×108个至约4.5×108个SC-胰岛细胞。在一些实施方案中，第一药物组合物包含约3.5×108个至约8.5×108个SC-胰岛细胞。在一些实施方案中，第一药物组合物包含约3.9×108个至约4.1×108个SC-胰岛细胞。在一些实施方案中，第一药物组合物包含约7.9×108个至约8.1×108个SC-胰岛细胞。在一些实施方案中，第一药物组合物包含约7.5×108个至12×108个SC-胰岛细胞(例如，7.5×108个至10×108个SC-胰岛细胞)。在一些实施方案中，受试者仅接受药物组合物的单次施用(例如，经由输注或经由本文公开的任何装置中的一种或更多种)，其中所述组合物包含在7×108个和14×108个之间、在8×108个和13×108个之间、在9×108个和12×108个之间、在9×108个和11×108个之间或在9×108个和10×108个之间的SC-胰岛细胞。在一些实施方案中，以单次施用(即，在单次输注中，或在将一个或更多个装置植入受试者的一个或更多个切口部位的单次外科手术中)向受试者施用细胞。
在一些实施方案中，向受试者施用包含SC-胰岛细胞的第一药物组合物，并且不向受试者施用包含SC-胰岛细胞的另外的药物组合物(即，向受试者施用的包含SC-胰岛细胞的第一药物组合物是向受试者施用的唯一包含SC-胰岛细胞的药物组合物)。在一些实施方案中，向受试者施用包含以下的第一药物组合物：约3.5×108个至约4.5×108个SC-胰岛细胞、约3.9×108个至约4.1×108个SC-胰岛细胞、约7.5×108个至约8.5×108个SC-胰岛细胞、约7.5×108个至约9×108个SC-胰岛细胞、约7.5×108个至约10×108个SC-胰岛细胞、约10×108个至约12×108个SC-胰岛细胞、约7.9×108个至约8.1×108个SC-胰岛细胞、约4.0×108个SC-胰岛细胞或约8.0×108个SC-胰岛细胞，并且不向受试者施用包含SC-胰岛细胞的另外的药物组合物。在一些实施方案中，向受试者施用包含SC-胰岛细胞的第一药物组合物，并且在接受包含SC-胰岛细胞的第一药物组合物的3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年或10年内不向受试者施用包含SC-胰岛细胞的另外的药物组合物。在一些实施方案中，向受试者施用包含SC-胰岛细胞的第一药物组合物，并且在接受包含SC-胰岛细胞的第一药物组合物的5年内不向受试者施用包含SC-胰岛细胞的另外的药物组合物。在一些实施方案中，向受试者施用包含SC-胰岛细胞的第一药物组合物，并且在接受包含SC-胰岛细胞的第一药物组合物的10年内不向受试者施用包含SC-胰岛细胞的另外的药物组合物。
在一些实施方案中，向受试者施用包含SC-胰岛细胞的第一药物组合物，并且不向受试者施用包含SC-胰岛细胞的另外的药物组合物。在一些实施方案中，在单次外科手术中向受试者施用一种或更多种包含SC-胰岛细胞的药物组合物(例如，以植入一个或更多个容纳SC-胰岛细胞的装置)，并且不向受试者施用任何另外的包含SC-胰岛细胞的药物组合物。在一些实施方案中，向受试者施用包含SC-胰岛细胞的第一药物组合物，并且至少向受试者施用包含SC-胰岛细胞的第二药物组合物。在一些实施方案中，在第一次外科手术中向受试者施用一种或更多种包含SC-胰岛细胞的药物组合物(例如，以植入容纳SC-胰岛细胞的一个或更多个装置)，并且在第二次外科手术中向受试者进一步施用一种或更多种包含SC-胰岛细胞的药物组合物(例如，以植入容纳SC-胰岛细胞的一个或更多个装置)。在一些实施方案中，向受试者施用包含SC-胰岛细胞的第二药物组合物，但在一年期间不施用包含SC-胰岛细胞的第三药物组合物。在一些实施方案中，在第一外科手术中向受试者施用一种或更多种包含SC-胰岛细胞的药物组合物(例如，以植入一个或更多个容纳SC-胰岛细胞的装置)，并且在第二外科手术中向受试者进一步施用一种或更多种包含SC-胰岛细胞的药物组合物(例如，以植入一个或更多个容纳SC-胰岛细胞的装置)，但是在一年的时间内不向受试者进一步施用任何包含SC-胰岛细胞的药物组合物。在一些实施方案中，向受试者施用包含以下的第一药物组合物：约3.5×108个至约4.5×108个SC-胰岛细胞、约3.9×108个至约4.1×108个SC-胰岛细胞或约4.0×108个SC-胰岛细胞，并且在稍后的时间点向受试者施用包含以下的第二药物组合物：约3.5×108个至约4.5×108个SC-胰岛细胞、约3.9×108个至约4.1×108个SC-胰岛细胞或约4.0×108个SC-胰岛细胞。在一些实施方案中，在向受试者施用第一药物组合物之后至少3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或15个月或在3-12个月、3-10个月、3-9个月、3-7个月、3-5个月、5-12个月、8-10个月、7-12个月、9-15个月或9-12个月之间向受试者施用第二药物组合物。
在一些实施方案中，向受试者施用包含以下的第一药物组合物：约3.5×108个至约8.5×108个SC-胰岛细胞、约3.5×108个至约4.5×108个SC-胰岛细胞、约3.9×108个至约4.1×108个SC-胰岛细胞、约7.5×108个至约8.5×108个SC-胰岛细胞、约7.9×108个至约8.1×108个SC-胰岛细胞、约4.0×108个SC-胰岛细胞或约8.0×108个SC-胰岛细胞，并且向受试者施用包含以下的第二药物组合物：约3.5×108个至约8.5×108个SC-胰岛细胞、约3.5×108个至约4.5×108个SC-胰岛细胞、约3.9×108个至约4.1×108个SC-胰岛细胞、约7.5×108个至约8.5×108个SC-胰岛细胞、约7.9×108个至约8.1×108个SC-胰岛细胞、约4.0×108个SC-胰岛细胞或约8.0×108个SC-胰岛细胞。在一些实施方案中，在将第一药物组合物施用至受试者之后至少3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年或10年或在3-20年、10-20年、15-20年、5-15年、3-5年、5-8年、8-10年、10-12年、12-15年或20-25年之间施用第二药物组合物。
药物组合物
在一些方面，本文提供了包含液体悬浮液中的细胞群体的药物组合物。在一些情况下，本文公开的药物组合物被配制用于输注。在一些情况下，细胞群体包含表达C-肽和ISL的非天然细胞，例如，SC-β细胞。在一些情况下，细胞群体还包含表达胰高血糖素但不表达生长抑素的非天然细胞，例如，SC-α细胞。在一些情况下，细胞群体还包含表达生长抑素但不表达胰高血糖素的非天然细胞，例如，SC-δ细胞。在一些情况下，细胞群体还包含表达VMAT1的非天然细胞，例如，SC-EC细胞。在一些情况下，本文公开的药物组合物的细胞成分类似于天然胰岛。本文公开的药物组合物中的非天然胰腺细胞可以通过遵循根据本公开内容的一些实施方案的分化方法的体外分化过程获得。
该药物组合物可用于治疗、预防或稳定糖尿病。例如，体细胞或干细胞可以从需要治疗的个体或健康个体获得，并通过本公开内容的方法重编程为干细胞衍生的β细胞。在本公开内容的一个实施方案中，干细胞衍生的β细胞，和在一些情况下，其他干细胞衍生的胰腺细胞(例如，SC-α细胞、SC-δ细胞、SC-EC细胞)根据本公开内容配制并施用至个体以治疗状况。在另一实施方案中，干细胞在引入到个体中之前在适于分化为β细胞的条件下培养，并且可以用于替代或辅助患病或受损组织的正常功能。本公开内容的巨大优势在于，其提供了本质上无限量的患者特异性人类β细胞或来自适合移植的健康个体的相容的干细胞衍生的β细胞。在细胞治疗中使用自体和/或相容细胞提供了优于使用非自体细胞的重大优势，非自体细胞可能会受到免疫排斥。相反，自体细胞不太可能引起显著的免疫应答。
在一些实施方案中，本文公开的药物组合物包含约1×108个至约12×108个(例如，3×108个至8.5×108个)细胞。在一些实施方案中，药物组合物在细胞群体中包含至少约1×108个细胞，诸如至少约1.5×108个、至少约2×108个、至少约2.5×108个、至少约3×108个、至少约3.5×108个、至少约4×108个、至少约4.5×108个、至少约5×108个、至少约5.5×108个、至少约6×108个、至少约6.5×108个或至少约7×108细胞。在一些情况下，本文公开的药物组合物中的细胞群体包含至多约8×108个、至多约7×108个、至多约6.5×108个、至多约6×108个、至多约5.5×108个、至多约5×108个、至多约4.5×108个、至多约4×108个、至多约3.5×108个、至多约3×108个、至多约2.5×108个或至多约2×108个细胞。在一些实施方案中，药物组合物包含约1×108个至约8×108个、约1×108个至约7×108个、约1×108个至约6×108个、约1×108个至约5×108个、约1×108个至约4×108个、约1×108个至约3×108个、约1×108个至约2×108个、约1.5×108个至约6.5×108个、约2×108个至约7×108个、约2×108个至约6×108个、约2×108个至约5×108个、约2×108个至约4×108个、约2×108个至约3×108个、约2.5×108个至约5.5×108个、约3×108个至约7×108个、约3×108个至约6×108个、约3×108个至约5×108个、约3×108个至约4×108个、约3.5×108个至约4.5×108个、约3.8×108个至约4.2×108个、约7.5×108个至约10×108个或约8×108个至约12×108个细胞。在一些情况下，药物组合物中的细胞群体包含约3.5×108个至约4.5×108个细胞。在一些实施方案中，药物组合物中的细胞群体包含约3.5×108个至约8.5×108个细胞。在一些实施方案中，药物组合物中的细胞群体包含约3.9×108个至约4.1×108个细胞。在一些实施方案中，药物组合物中的细胞群体包含约7.9×108个至约8.1×108个细胞。
在一些实施方案中，为了配制剂量，首先使用通过相差检测单个细胞的光学方法将细胞簇悬浮液计数为解离的单细胞。在对悬浮液中的细胞进行计数后，可以将沉淀的细胞储备物调节至合适的体积，并在溶液(例如，hyopthermasol)中配制至所需浓度(例如，总体积为每毫升200万个细胞)。例如，如果目标剂量是430e6细胞，则可以添加215mL的hypothermasol。
在一种实施方案中，为了达到目标剂量，从预先配制的收获的药物物质中取出两个0.5ml样品用于细胞计数和活力。当在输注介质中，可以取预先配制的药物物质的合并细胞悬浮液的毛重，并且用去皮重的试管起始质量计算细胞悬浮液的总体积。为了释放物质，可以经由血细胞计数器对细胞进行细胞计数和活力。台盼排除法与一次性Neubauer血细胞计数器一起可用于评估合并的药物物质悬浮液的细胞密度。该方法可以在0.4e6至2.5e6的浓度范围内准确计数单细胞悬浮液中的细胞。可以使用依赖于TrypLE酶解后排除法(台盼蓝)的手动细胞计数过程来评估剂量。染色时，活细胞对台盼蓝不可渗透并保持白色外观，而死细胞对染料可渗透并变成蓝色。该方法提供了用于合并细胞悬浮液的细胞数(总细胞/mL或活细胞/mL)和活力％的可报告值。在一些实施方案中，用两个生物重复评估细胞计数，每个生物重复有三个技术重复并且两个操作者执行计数。最终细胞浓度可以用以下确定：细胞/mL＝每个象限的平均手动计数×最终稀释因子×10e4。在一些实施方案中，为了使每个计数有效，每个技术重复在80-500个细胞的范围内，并且还在针对每个生物重复计数的技术重复的平均值的35％内。在一些实施方案中，生物重复之间的％差异必须小于或等于25％以计算细胞浓度和活力的可报告结果。在一些实施方案中，可以报告细胞浓度(活细胞/mL)，并且可以通过将合并的细胞悬浮液的毛重评估中测量的体积乘以本文公开的细胞浓度来计算活细胞。
总活细胞＝药物物质的合并悬浮液的体积×活细胞浓度
细胞组合物
在一些情况下，本公开内容的SC-β细胞共享β细胞的许多特有的特征，这些特征对于正常β细胞功能是重要的。在一些实施方案中，SC-β细胞表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)响应。在一些实施方案中，SC-β细胞表现出体内GSIS响应。在一些实施方案中，SC-β细胞表现出体外GSIS响应和体内GSIS响应。在一些实施方案中，GSIS响应类似于内源性成熟胰腺β细胞的GSIS响应。在一些实施方案中，SC-β细胞对至少一次葡萄糖刺激表现出GSIS响应。在一些实施方案中，SC-β细胞对至少两次顺序的葡萄糖刺激表现出GSIS响应。在一些实施方案中，SC-β细胞对至少三次顺序的葡萄糖刺激表现出GSIS响应。在一些实施方案中，GSIS响应类似于内源性人胰岛对多于一次葡萄糖刺激的GSIS响应。在一些实施方案中，在将细胞移植到人或动物中后立即观察到GSIS响应。在一些实施方案中，在将细胞移植到人或动物中后约24小时内观察到GSIS响应。在一些实施方案中，在将细胞移植到人或动物中后约一周内观察到GSIS响应。在一些实施方案中，在将细胞移植到人或动物中后约两周内观察到GSIS响应。在一些实施方案中，通过响应于高葡萄糖浓度与低葡萄糖浓度相比而分泌的胰岛素的比例表征的细胞刺激指数类似于内源性成熟胰腺β细胞的刺激指数。在一些实施方案中，SC-β细胞表现出大于1的刺激指数。在一些实施方案中，SC-β细胞表现出大于或等于1的刺激指数。在一些实施方案中，SC-β细胞表现出大于1.1的刺激指数。在一些实施方案中，SC-β细胞表现出大于或等于1.1的刺激指数。在一些实施方案中，SC-β细胞表现出大于2的刺激指数。在一些实施方案中，SC-β细胞表现出大于或等于1的刺激指数。在一些实施方案中，SC-β细胞表现出至少2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0或更大的刺激指数。
在一些情况下，如通过流式细胞术测量的，本文公开的药物组合物中的细胞组合物具有至少约30％的表达C-肽而不表达VMAT1的细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术测量的，本文公开的药物组合物中的细胞组合物具有至少约35％的表达C-肽而不表达VMAT1的细胞。在一些情况下，该细胞组合物的细胞中C-肽的表达和VMAT1的不存在表明该细胞是SC-β细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术测量的，该细胞组合物具有至少约30％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％或50％的表达C-肽而不表达VMAT1的细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术测量的，该细胞组合物具有约30％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％或60％的表达C-肽而不表达VMAT1的细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术测量的，该细胞组合物具有约30％至约60％、约35％至约55％、约40％至约50％的表达C-肽而不表达VMAT1的细胞。
在一些情况下，如通过流式细胞术测量的，本文公开的药物组合物中的细胞组合物具有至多约35％的表达VMAT1的细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术测量的，本文公开的药物组合物中的细胞组合物具有至多约35％的表达VMAT1而不表达C-肽的细胞。在一些情况下，该细胞组合物的细胞中VMAT1的表达和C-肽的不存在表明该细胞是SC-EC细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术测量的，该细胞组合物具有至多约45％、40％、35％、32％、31％、30％、28％、25％、24％、23％、22％、21％或20％的表达VMAT1而不表达C-肽的细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术测量的，该细胞组合物具有至多约35％、32％、31％、30％、28％、25％、24％、23％、22％、21％或20％的表达VMAT1而不表达C-肽的细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术测量的，该细胞组合物具有约35％、32％、31％、30％、28％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％或15％的表达VMAT1而不表达C-肽的细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术测量的，该细胞组合物具有约15％至约30％、约16％至25％、约17％至约22％、约18％至约20％的表达VMAT1而不表达C-肽的细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术测量的，该细胞组合物具有5％-25％、5％-15％、10％-25％、10％-15％或15％-25％的表达VMAT1且不表达C-肽的细胞。
在一些情况下，如通过流式细胞术测量的，该细胞组合物包含至少约3％的表达胰高血糖素的细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术测量的，该细胞组合物包含至少约5％的表达胰高血糖素的细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术测量的，该细胞组合物包含至少约10％的表达胰高血糖素的细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术测量的，该细胞组合物包含至少约20％的表达胰高血糖素的细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术测量的，该细胞组合物包含至少约15％的表达胰高血糖素而不表达生长抑素的细胞。在一些实施方案中，在该细胞组合物的细胞中表达胰高血糖素而不表达生长抑素表明该细胞是SC-α细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术测量的，该细胞组合物包含至少约3％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％或22％的表达胰高血糖素而不表达生长抑素的细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术测量的，该细胞组合物包含至少约12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％或22％的表达胰高血糖素而不表达生长抑素的细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术测量的，该细胞组合物包含约10％至约30％、约12％至约25％、约13％至约22％、约15％至约20％或约16％至约18％的表达胰高血糖素而不表达生长抑素的细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术测量的，该细胞组合物包含约3％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％或22％的表达胰高血糖素而不表达生长抑素的细胞。
在一些情况下，如通过流式细胞术测量的，该细胞组合物包含至少约1％的表达生长抑素而不表达胰高血糖素的细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术测量的，该细胞组合物包含至少约2％的表达生长抑素而不表达胰高血糖素的细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术测量的，该细胞组合物包含至少约3％的表达生长抑素而不表达胰高血糖素的细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术测量的，该细胞组合物包含至少约4％的表达生长抑素而不表达胰高血糖素的细胞。在一些实施方案中，在该细胞组合物的细胞中表达胰高血糖素而不表达生长抑素表明该细胞是SC-δ细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术测量的，该细胞组合物包含至少约2％、3％、4％、5％、6％、7％或8％的表达生长抑素而不表达胰高血糖素的细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术测量的，该细胞组合物包含约1％至约9％、约2％至约8％、约3％至约7％或约4％至约6％的表达生长抑素而不表达胰高血糖素的细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术测量的，该细胞组合物包含约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％或8％的表达生长抑素而不表达胰高血糖素的细胞。
在一些情况下，如通过流式细胞术测量的，该细胞组合物具有至少约35％的表达C-肽而不表达VMAT1的细胞、至多约50％的表达VMAT1的细胞、至少约4％的表达胰高血糖素而不表达生长抑素的细胞、和至少约1％的表达生长抑素而不表达胰高血糖素的细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术测量的，该细胞组合物具有至少约35％的表达C-肽而不表达VMAT1的细胞、至多约30％的表达VMAT1的细胞、和至少约20％的表达胰高血糖素的细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术测量的，该细胞组合物具有至少约35％的表达C-肽而不表达VMAT1的细胞、至多约30％的表达VMAT1的细胞、至少约20％的表达胰高血糖素的细胞、和至少4％的表达生长抑素而不表达胰高血糖素的细胞。
在一些情况下，如通过流式细胞术测量的，本文提供的细胞组合物包含(a)至少约35％的表达C-肽而不表达VMAT1的细胞；和(b)至少约10％的表达生长抑素的细胞。在一些情况下，如通过流式细胞术测量的，该细胞组合物中有至少有约15％的细胞表达生长抑素。
在一些情况下，本文提供了包含细胞群体的组合物，其中：(a)细胞群体中30％-90％、30％-80％、30％-70％、30％-60％、30％-50％、30％-40％、40％-90％、40％-80％、40％-70％、40％-60％、40％-50％、50％-90％、50％-80％、50％-70％、50％-60％、60％-90％、60％-80％、60％-70％、70％-90％、70％-80％、70％-90％、70％-80％或80％-90％的细胞表达C-肽和ISL1但不表达VMAT1；(b)细胞群体中3％-40％、3％-35％、3％-30％、3％-25％、3％-20％、3％-15％、3％-10％、5％-40％、5％-35％、5％-30％、5％-25％、5％-20％、5％-15％、5％-10％、10％-40％、10％-35％、10％-30％、10％-25％、10％-20％、10％-15％、15％-40％、15％-35％、15％-30％、15％-25％、15％-20％、20％-40％、20％-35％、20％-30％、20％-25％、25％-40％、25％-35％、25％-30％、30％-40％、30％-35％或35％-40％的细胞表达胰高血糖素但不表达生长抑素；和/或(c)细胞群体中1％-20％、1％-15％、1％-12％、1％-10％、1％-8％、1％-5％、2％-20％、2％-15％、2％-12％、2％-10％、2％-8％、2％-5％、3％-20％、3％-15％、3％-12％、3％-10％、3％-8％、3％-5％、4％-20％、4％-15％、4％-12％、4％-10％、4％-8％、4％-5％、5％-20％、5％-15％、5％-12％、5％-10％、5％-8％、7％-20％、7％-15％、7％-12％、7％-10％、9％-20％、9％-15％、9％-12％、8％-10％、8％-12％、8％-15％、8％-20％、10％-20％、10％-12％、10％-15％、12％-20％、12％-15％或15％-20％的细胞表达生长抑素但不表达胰高血糖素。
在一些情况下，本文提供了包含细胞群体的组合物，其中：(a)细胞群体中30％-90％、30％-80％、30％-70％、30％-60％、30％-50％、30％-40％、40％-90％、40％-80％、40％-70％、40％-60％、40％-50％、50％-90％、50％-80％、50％-70％、50％-60％、60％-90％、60％-80％、60％-70％、70％-90％、70％-80％、70％-90％、70％-80％或80％-90％的细胞表达C-肽和ISL1但不表达VMAT1；(b)细胞群体中3％-40％、3％-35％、3％-30％、3％-25％、3％-20％、3％-15％、3％-10％、5％-40％、5％-35％、5％-30％、5％-25％、5％-20％、5％-15％、5％-10％、10％-40％、10％-35％、10％-30％、10％-25％、10％-20％、10％-15％、15％-40％、15％-35％、15％-30％、15％-25％、15％-20％、20％-40％、20％-35％、20％-30％、20％-25％、25％-40％、25％-35％、25％-30％、30％-40％、30％-35％或35％-40％的细胞表达胰高血糖素但不表达生长抑素；和/或(c)细胞群体中1％-20％、1％-15％、1％-12％、1％-10％、1％-8％、1％-5％、2％-20％、2％-15％、2％-12％、2％-10％、2％-8％、2％-5％、3％-20％、3％-15％、3％-12％、3％-10％、3％-8％、3％-5％、4％-20％、4％-15％、4％-12％、4％-10％、4％-8％、4％-5％、5％-20％、5％-15％、5％-12％、5％-10％、5％-8％、7％-20％、7％-15％、7％-12％、7％-10％、9％-20％、9％-15％、9％-12％、8％-10％、8％-12％、8％-15％、8％-20％、10％-20％、10％-12％、10％-15％、12％-20％、12％-15％或15％-20％的细胞表达生长抑素但不表达胰高血糖素。
在一些情况下，在本文提供的细胞群体中，35％-60％的细胞表达C-肽和ISL1但不表达VMAT1；4％-25％的细胞表达胰高血糖素但不表达生长抑素；以及1％-10％的细胞表达生长抑素但不表达胰高血糖素。在一些情况下，本文提供的细胞群体中少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于18％、少于15％、少于12％或少于10％的细胞表达VMAT1但不表达C-肽。
在一些情况下，在本文提供的细胞群体中，40％-60％的细胞表达C-肽和ISL1但不表达VMAT1；10％-25％的细胞表达胰高血糖素但不表达生长抑素；以及4％-10％的细胞表达生长抑素但不表达胰高血糖素。在一些情况下，本文提供的细胞群体中少于25％、少于20％、少于18％、少于15％、少于12％或少于10％的细胞表达VMAT1但不表达C-肽。
在一些实施方案中，本文公开的任何药物组合物包含不少于50％、40％、30％或20％的NKX6.1+/ISL1+细胞(例如，如通过流式细胞术确定的)。在一些实施方案中，组合物中不少于30％的细胞是NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞，组合物中不少于25％的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阳性细胞，组合物中少于12％的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阴性细胞或组合物中9％-25％之间的细胞是NKX6.1阳性、ISL1阴性细胞(例如，如通过流式细胞术确定的)。在一些实施方案中，药物组合物中不少于40％、35％、30％、26％、25％或20％的细胞是NKX6.1-/ISL1+细胞(例如，如通过流式细胞术确定的)。在一些实施方案中，药物组合物中不少于26％的细胞是NKX6.1-/ISL1+细胞(例如，如通过流式细胞术确定的)。在一些实施方案中，药物组合物中5％-25％、5％-40％、5％-35％或8％-20％的细胞是NKX6.1-/ISL1+细胞(例如，如通过流式细胞术确定的)。在一些实施方案中，药物组合物中不多于50％、45％、40％、35％、30％或25％的细胞是NKX6.1+/ISL1-细胞(例如，如通过流式细胞术确定的)。在一些实施方案中，药物组合物中不多于50％的细胞是NKX6.1+/ISL1-细胞(例如，如通过流式细胞术确定的)。
在一些实施方案中，该群体中少于12％的细胞(例如，约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％或更少)是NKX6.1阴性、ISL1阴性细胞。在一些实施方案中，该群体中少于10％、少于8％、少于6％、少于4％或1％-11％、2％-10％、2％-12％、4％-12％、6％-12％、8％-12％、2％-8％、4％-8％、3％-6％或3％-5％的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阴性细胞。在一些实施方案中，该群体中2％-12％、4％-12％、6％-12％、8％-12％、2％-8％、4％-8％、3％-6％或3％-5％的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阴性细胞。
在一些实施方案中，该群体中至少15％的细胞(例如，约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％或更多)是NKX6.1阴性、ISL1阳性细胞。在一些实施方案中，该群体中至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％或15％-60％、15％-45％、15％-30％、30％-60％、30％-45％、45％-60％的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阳性细胞。在一些实施方案中，该群体中20％-60％、20％-50％、20％-40％、20％-30％、30％-60％、30％-50％、30％-40％、40％-60％、40％-50％或50％-60％的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阳性细胞。
在一些实施方案中，该群体中至少15％(例如，20％-60％、20％-50％、20％-40％、20％-30％、30％-60％、30％-50％、30％-40％、40％-60％、40％-50％或50％-60％)的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阳性细胞，并且群体中少于12％(例如，2％-12％、4％-12％、6％-12％、8％-12％、2％-8％、4％-8％、3％-6％或3％-5％)的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阴性细胞。
在一些实施方案中，该群体中至少60％、至少65％、至少70％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、约85％-95％或约90％-95％的细胞是ISL1阳性细胞。在一些实施方案中，该群体中50％-90％、50％-85％、50％-80％、50％-75％、50％-70％、50％-60％、60％-90％、60％-85％、60％-80％、60％-75％、60％-70％、65％-90％、65％-85％、65％-80％、65％-75％、65％-70％、70％-90％、70％-85％、70％-80％、70％-75％、75％-90％、75％-85％、75％-80％、80％-90％、80％-85％或85％-90％的细胞是ISL1阳性细胞。在一些实施方案中，该群体中至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、约85％-95％或约90％-95％的细胞是ISL1阳性细胞。在一些实施方案中，该群体中约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或约99％的细胞是ISL1阳性细胞。
在一些实施方案中，本文描述的体外分化的细胞群体包含的NKX6.1阴性、ISL1阳性细胞多于NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞。在一些实施方案中，该群体中至少40％的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阳性细胞。在一些实施方案中，该群体中至少45％、至少50％、约40％-50％、约45％-55％或约50％-55％的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阳性细胞。在一些实施方案中，该群体中约40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％或约55％的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阳性细胞。
在一些实施方案中，至少20％(例如，至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少50％、至少60％或更多)的ISL1阳性细胞是NKX6.1阴性的。在一些实施方案中，约20％-60％、20％-50％、20％-40％、20％-30％、30％-60％、30％-50％、30％-40％、40％-60％、40％-50％或50％-60％的ISL1阳性细胞是NKX6.1阴性的。在一些实施方案中，约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或更多的ISL1阳性细胞是NKX6.1阴性的。
在一些实施方案中，组合物中至少20％(例如，至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少50％、至少60％或更多)的细胞是ISL1阳性和NKX6.1阳性的。在一些实施方案中，组合物中约20％-60％、20％-50％、20％-40％、20％-30％、30％-60％、30％-50％、30％-40％、40％-60％、40％-50％或50％-60％的细胞是ISL1阳性和NKX6.1阳性的。在一些实施方案中，组合物中约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或更多的细胞是ISL1阳性和NKX6.1阳性的。
在一些实施方案中，组合物中至少20％(例如，至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少50％、至少60％或更多)的细胞是ISL1阳性和NKX6.1阴性的。在一些实施方案中，组合物中约20％-60％、20％-50％、20％-40％、20％-30％、30％-60％、30％-50％、30％-40％、40％-60％、40％-50％或50％-60％的细胞是ISL1阳性和NKX6.1阴性的。在一些实施方案中，组合物中约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或更多的细胞是ISL1阳性和NKX6.1阴性的。
在一些实施方案中，本文描述的体外分化的细胞群体包含至多20％(例如，至多20％、至多30％、至多40％或至多50％)的NXK6.1阳性、ISL1阳性细胞。在一些实施方案中，本文描述的体外分化的细胞群体包含约20％-50％、20％-40％、20％-30％、30％-50％、30％-40％或40％-50％的NXK6.1阳性、ISL1阳性细胞。在一些实施方案中，本文描述的体外分化的细胞群体包含约20％-50％、20％-40％、20％-30％、30％-50％、30％-40％或40％-50％的NXK6.1阳性、ISL1阳性细胞。
在一些实施方案中，NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞还表达PDX1。
在一些实施方案中，本公开内容提供了包含多于一个细胞的组合物(例如，包含细胞簇或多于一个细胞簇的组合物)；其中组合物中30％-60％、30％-55％、30％-50％、30％-45％、30％-40％、30％-35％、35％-60％、35％-55％、35％-50％、35％-45％、35％-40％、40％-60％、40％-55％、40％-50％、40％-45％、45％-60％、45％-55％、45％-50％、50％-60％或50％-55％的细胞是NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞；其中组合物中20％-50％、20％-45％、20％-40％、20％-35％、20％-30％、20％-25％、25％-50％、25％-45％、25％-40％、25％-35％、25％-30％、30％-50％、30％-45％、30％-40％、30％-35％、35％-50％、35％-35％、35％-40％、40％-50％、40％-45％或45％-50％的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阳性细胞；并且其中组合物中1％-12％、1％-10％、1％-8％、1％-6％、1％-4％、3％-5％、1％-2％、2％-12％、2％-10％、2％-8％、2％-6％、2％-4％、4％-12％、4％-10％、4％-8％、4％-6％、6％-12％、6％-10％、6％-8％、8％-12％、8％-10％或10％-12％的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阴性细胞。在一些实施方案中，本公开内容提供了包含多于一个细胞的组合物(例如，包含细胞簇或多于一个细胞簇的组合物)；其中组合物中35％-50％的细胞是NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞；其中组合物中30％-45％的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阳性细胞；并且其中组合物中2％-12％的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阴性细胞。在一些实施方案中，组合物中3％-25％、3％-20％、3％-15％、3％-10％、3％-5％、5％-25％、5％-20％、5％-15％、5％-10％、10％-25％、10％-20％、10％-15％、15％-25％、15％-20％或20％-25％的细胞是NKX6.1阳性、ISL1阴性细胞。
在一些实施方案中，本公开内容提供了包含多于一个细胞的组合物(例如，包含细胞簇或多于一个细胞簇的组合物)；其中组合物中至少30％的细胞是NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞；其中组合物中至少25％的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阳性细胞；并且其中组合物中9％-25％之间的细胞是NKX6.1阳性、ISL1阴性细胞。在一些实施方案中，本公开内容提供了包含多于一个细胞的组合物(例如，包含细胞簇或多于一个细胞簇的组合物)；其中组合物中30％-60％、30％-55％、30％-50％、30％-45％、30％-40％、30％-35％、35％-60％、35％-55％、35％-50％、35％-45％、35％-40％、40％-60％、40％-55％、40％-50％、40％-45％、45％-60％、45％-55％、45％-50％、50％-60％或50％-55％的细胞为NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞；其中组合物中20％-50％、20％-45％、20％-40％、20％-35％、20％-30％、20％-25％、25％-50％、25％-45％、25％-40％、25％-35％、25％-30％、30％-50％、30％-45％、30％-40％、30％-35％、35％-50％、35％-35％、35％-40％、40％-50％、40％-45％或45％-50％的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阳性细胞；并且其中组合物中9％-30％、9％-25％、9％-20％、9％-15％、9％-12％、12％-30％、12％-25％、12％-20％、12％-15％、15％-30％、15％-25％、15％-20％、20％-30％、20％-25％或25％-30％的细胞是NKX6.1阳性、ISL阴性细胞。在一些实施方案中，组合物中1％-12％、1％-10％、1％-8％、1％-6％、1％-4％、3％-5％、1％-2％、2％-12％、2％-10％、2％-8％、2％-6％、2％-4％、4％-12％、4％-10％、4％-8％、4％-6％、6％-12％、6％-10％、6％-8％、8％-12％、8％-10％或10％-12％的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阴性细胞。在一些实施方案中，本公开内容提供了包含多于一个细胞的组合物(例如，包含细胞簇或多于一个细胞簇的组合物)；其中组合物中35％-50％的细胞是NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞；其中组合物中30％-45％的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阳性细胞；并且其中组合物中9％-25％的细胞是NKX6.1阳性、ISL1阴性细胞。
在一些实施方案中，组合物中少于12％的细胞(例如，约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％或更少)是NKX6.1阴性、ISL1阴性细胞。在一些实施方案中，组合物中少于10％、少于8％、少于6％、少于4％、1％-11％、2％-10％、2％-12％、4％-12％、6％-12％、8％-12％、2％-8％、4％-8％、3％-6％或3％-5％的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阴性细胞。在一些实施方案中，该群体中2％-12％、4％-12％、6％-12％、8％-12％、2％-8％、4％-8％、3％-6％或3％-5％的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阴性细胞。
在一些实施方案中，组合物中至少15％的细胞(例如，约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％或更多)是NKX6.1阴性、ISL1阳性细胞。在一些实施方案中，组合物中至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、15％-60％、15％-45％、15％-30％、30％-60％、30％-45％、45％-60％的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阳性细胞。在一些实施方案中，组合物中20％-60％、20％-50％、20％-40％、20％-30％、30％-60％、30％-50％、30％-40％、40％-60％、40％-50％或50％-60％的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阳性细胞。
在一些实施方案中，组合物中至少15％(例如，20％-60％、20％-50％、20％-40％、20％-30％、30％-60％、30％-50％、30％-40％、40％-60％、40％-50％或50％-60％)的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阳性细胞，并且组合物中少于12％(例如，2％-12％、4％-12％、6％-12％、8％-12％、2％-8％、4％-8％、3％-6％或3％-5％)的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阴性细胞。
在一些实施方案中，组合物中至少60％、至少65％、至少70％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、约85％-95％或约90％-95％的细胞是ISL1阳性细胞。在一些实施方案中，组合物中50％-90％、50％-85％、50％-80％、50％-75％、50％-70％、50％-60％、60％-90％、60％-85％、60％-80％、60％-75％、60％-70％、65％-90％、65％-85％、65％-80％、65％-75％、65％-70％、70％-90％、70％-85％、70％-80％、70％-75％、75％-90％、75％-85％、75％-80％、80％-90％、80％-85％或85％-90％的细胞是ISL1阳性细胞。在一些实施方案中，组合物中至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、约85％-95％或约90％-95％的细胞是ISL1阳性细胞。在一些实施方案中，组合物中约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或约99％的细胞是ISL1阳性细胞。
在一些实施方案中，组合物包含的NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞多于NKX6.1阴性、ISL1阳性细胞。在一些实施方案中，组合物中至少40％的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阳性细胞。在一些实施方案中，组合物中至少45％、至少50％、约40％-50％、约45％-55％或约50％-55％的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阳性细胞。在一些实施方案中，组合物中约40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％或约55％的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阳性细胞。
在一些实施方案中，至少20％(例如，至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少50％、至少60％或更多)的ISL1阳性细胞是NKX6.1阴性的。在一些实施方案中，约20％-60％、20％-50％、20％-40％、20％-30％、30％-60％、30％-50％、30％-40％、40％-60％、40％-50％或50％-60％的ISL1阳性细胞是NKX6.1阴性的。在一些实施方案中，约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或更多的ISL1阳性细胞是NKX6.1阴性的。
在一些实施方案中，组合物包含至少20％(例如，至少20％、30％、40％、50％或60％)的NXK6.1阳性、ISL1阳性细胞。在一些实施方案中，组合物包含约20％-50％、20％-40％、20％-30％、30％-50％、30％-40％、40％-50％、40％-60％或50-60％的NXK6.1阳性、ISL1阳性细胞。在一些实施方案中，组合物包含约20％-50％、20％-40％、20％-30％、30％-50％、30％-40％或40％-50％的NXK6.1阳性、ISL1阳性细胞。
在一些实施方案中，组合物包含少于25％(例如，少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％或更少)的NKX6.1阳性、ISL1阴性细胞。在一些实施方案中，组合物包含约2％-25％、2％-20％、2％-15％、2％-10％、2％-5％、5％-25％、5％-20％、5％-15％、5％-10％、10％-25％、10％-20％、10％-15％、15％-25％、15％-20％或20％-25％的NKX6.1阳性、ISL1阴性细胞。在一些实施方案中，组合物包含约2％-10％、2％-8％、2％-6％、2％-4％、4％-10％、4％-8％、4％-6％、6％-10％、6％-8％或8％-10％的NKX6.1阳性、ISL1阴性细胞。在一些实施方案中，组合物包含约2％、4％、6％、8％或10％的NKX6.1阳性、ISL1阴性细胞。
在一些实施方案中，组合物包含少于10％的SOX9阳性细胞。在一些实施方案中，组合物包含少于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的SOX9阳性细胞。在一些实施方案中，组合物包含0.1％-10％、0.1％-7％、0.1％-3％、0.1％-1％、0.5％-10％、0.5％-7％、0.5％-3％、0.5％-1％、1％-10％、1％-5％、1％-3％、3％-10％、3％-5％或5％-10％的SOX9阳性细胞。
在一些实施方案中，组合物包含少于5％的Ki67阳性细胞。在一些实施方案中，组合物包含少于5％、4％、3％、2％或1％的Ki67阳性细胞。在一些实施方案中，组合物包含0.01％-0.1％、0.1％-5％、0.1％-3％、0.1％-1％、0.5％-5％、0.5％-3％、0.5％-1％、1％-5％、1％-3％或1％-2％的Ki67阳性细胞。
在一些实施方案中，组合物中至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的细胞是CHGA阳性细胞。在一些实施方案中，组合物中80％-100％、85％-100％、90％-100％、90％-99％、90％-98％、95％-99％或95％-99％的细胞是CHGA阳性细胞。
在一些实施方案中，通过流式细胞术测量表达本文提供的标志物的细胞的百分比。本技术人员知道通过流式细胞术测试细胞或细胞集合对于特定基因标志物(例如，NKX6.1、ISL1、INS、GCG、生长抑素、嗜铬粒蛋白A、SOX9、C-肽、Ki67)的表达是阳性还是阴性的代表性方法。在一些实施方案中，基于中值荧光强度(rMFI)，认为细胞对于特定基因(例如，NKX6.1、ISL1、INS、GCG、生长抑素、嗜铬粒蛋白A、SOX9、C-肽、Ki67)的表达呈阳性。如本文使用的，术语“rMFI”或相对中值荧光强度是通过使用针对特定靶(例如，NKX6.1、ISL1、INS、GCG、生长抑素、嗜铬粒蛋白A、SOX9、C-肽、Ki67)的抗体测量的荧光强度与从对照抗体(同种型对照)获得的强度之间的比率。在一些实施方案中，使用抗(人类)NKX6.1、ISL1、INS、GCG、生长抑素、嗜铬粒蛋白A或SOX9抗体。用于流式细胞术的合适抗体的实例是表1中公开的任何抗体。合适的流式细胞仪的一个实例是Accuri 6流式细胞仪。在一些实施方案中，如果测试，靶表达细胞(例如，表达NKX6.1和/或ISL1的细胞)表现出通过流式细胞仪测量的至少6、6.5、7、8、9或10的靶相对中值荧光强度(rMFI)。在另一种实施方案中，所述rMFI在6.5和15之间、6.5和14之间、6.5和13之间、6.5和13之间、6.5和12之间或6.5和10之间。
表1
在一些实施方案中，通过qRT-PCR测量表达本文提供的标志物的细胞的百分比。在一些实施方案中，通过单细胞RNA测序分析测量表达本文提供的标志物的细胞的百分比。本技术人员知道通过单细胞RNA测序分析来测试细胞或细胞集合是否对特定基因标志物(例如，NKX6.1、ISL1、INS、GCG、ARX或促生长激素释放素)的表达呈阳性的方法。
在一些实施方案中，本文描述的体外分化的细胞群体包含少于25％(例如，少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％或更少)的NKX6.1阳性、ISL1阴性细胞。在一些实施方案中，本文描述的体外分化的细胞群体包含约2％-25％、2％-20％、2％-15％、2％-10％、2％-5％、5％-25％、5％-20％、5％-15％、5％-10％、10％-25％、10％-20％、10％-15％、15％-25％、15％-20％或20％-25％的NKX6.1阳性、ISL1阴性细胞。在一些实施方案中，本文描述的体外分化的细胞群体包含约2％-10％、2％-8％、2％-6％、2％-4％、4％-10％、4％-8％、4％-6％、6％-10％、6％-8％或8％-10％的NKX6.1阳性、ISL1阴性细胞。在一些实施方案中，本文描述的体外分化的细胞群体包含约2％、4％、6％、8％或10％的NKX6.1阳性、ISL1阴性细胞。
在一些实施方案中，本公开内容提供了包含以比来自健康对照成人受试者的胰腺或来自尸体胰腺的NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞更低的水平表达MAFA的NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含以比来自健康对照成人受试者的胰腺或来自尸体胰腺的NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞更高的水平表达MAFB的NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞。在一些实施方案中，药物组合物包含以比来自健康对照成年受试者的胰腺或来自尸体胰腺的NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞更高的水平表达SIX2、HOPX、IAPP和/或UCN3的NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞。在一些实施方案中，药物组合物包含不表达MAFA的NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞。在一些实施方案中，药物组合物包含表达MAFB的NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞。在一些实施方案中，药物组合物包含被遗传修饰(例如，使用诸如CRISPR的基因编辑技术)的细胞。在一些实施方案中，药物组合物包含以与来自健康对照成人受试者的胰腺或来自尸体胰腺的NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞相比更低的水平表达β-2微球蛋白、CIITA、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ和HLADR的NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞。在一些实施方案中，药物组合物包含以与来自健康对照成人受试者的胰腺或来自尸体胰腺的NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞相比增加的水平表达CD47、PDL1、HLA-G、CD46、CD55、CD59和CTLA的NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞。在一些实施方案中，通过流式细胞术检测本文公开的任何细胞标志物(例如，NKX6.1、PDX1、MAFA、MAFB、SIX2、HOPX、IAPP和/或UCN3)。
在一些实施方案中，药物组合物在体外从干细胞衍生。在一些实施方案中，干细胞是被遗传修饰的(例如，使用诸如CRISPR的基因编辑技术)。在一些实施方案中，所述干细胞相对于未被遗传修饰的干细胞具有β-2微球蛋白、CIITA、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ和HLADR中的一种或更多种的表达减少。在一些实施方案中，所述干细胞相对于未被遗传修饰的干细胞具有CD47、PDL1、HLA-G、CD46、CD55、CD59和CTLA的表达增加。在一些实施方案中，通过流式细胞术检测本文公开的任何细胞标志物(例如，NKX6.1、PDX1、MAFA、MAFB、SIX2、HOPX、IAPP和/或UCN3)。
在一些情况下，本文公开的细胞群体或细胞簇是未分选的，例如，尚未经过细胞分选过程的分离的细胞群体或细胞簇。在一些实施方案中，本文公开的细胞簇可以指通过在给定环境中(例如，在3D悬浮培养中)培养的细胞的自聚集而形成的细胞簇。如本文描述的细胞分选可以指通过依赖于细胞大小、形状(形态)、表面蛋白质表达、内源性信号蛋白表达或其任何组合的差异，从多个细胞分离一组细胞的过程。在一些情况下，细胞分选包括使细胞经历流式细胞术。流式细胞术可以是基于激光或阻抗的生物物理学技术。在流式细胞术中，可以将细胞悬浮在流体流中，并使它们通过电子检测装置。在一种类型的流式细胞术，即基于细胞光学性质的一个或更多个参数(例如，激光激发后的发射波长)的荧光激活细胞分选(FACS)中，人们可以使用流式细胞术物理分离并由此纯化感兴趣的细胞。如本文所述，未分选的细胞簇可以是由尚未经历活性细胞分选过程例如流式细胞术的多于一个细胞形成的细胞簇。在一些情况下，本文讨论的流式细胞术可以基于细胞中表达的一种或更多种信号性肽(signal peptide)。例如，细胞簇可以包含表达信号性肽(例如，荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)或tdTomato)的细胞。在一些情况下，信号性肽作为细胞中胰岛素表达的指示物被表达。例如，细胞簇可以包含携带在胰岛素启动子的控制下的编码GFP的外源性核酸序列的细胞。胰岛素启动子可以是内源性或外源性启动子。在一些情况下，这些细胞中GFP的表达可以指示所述细胞中胰岛素的表达。因此，GFP信号可以是胰腺β细胞的标志物。在一些情况下，如本文描述的细胞分选可以包括使细胞经受磁激活分选过程，其中使用磁性抗体或其他配体来标记不同类型的细胞，并且磁性性质的差异可以用于细胞分选。
本文描述的表达一种或更多种特定标志物如PDX1、NKX6.1、胰岛素、NGN3或CHGA的细胞的百分比可以是使用诸如流式细胞术测定等技术检测到的百分比值。在一些情况下，在流式细胞术测定期间，通过在消化酶如胰蛋白酶或TrypLETM Express中孵育，将本文所讨论的细胞群体或细胞簇分散为单细胞悬浮液。分散的细胞可以在合适的缓冲液如PBS中洗涤、离心，并且然后重悬于固定缓冲液如4％ PFA中。然后可以用抗感兴趣的细胞标志物的第一抗体进行孵育，然后可以用第二抗体孵育。在抗体孵育后，可以洗涤细胞，并通过流式细胞术进行分离。还可以使用除流式细胞术以外的技术来表征本文描述的细胞，例如确定细胞百分比。细胞表征方法的非限制性实例包括基因测序、显微镜技术(荧光显微镜、原子力显微镜)、核型分析、同工酶分析、DNA性质、病毒易感性。
在一些实施方案中，本文公开的任何细胞包含至少一个基因序列中的基因组破坏，其中所述破坏减少或消除由所述基因序列编码的蛋白质的表达。在一些实施方案中，所述细胞包含至少一个基因序列中的基因组破坏，其中所述破坏减少或消除由所述基因序列编码的蛋白质的表达。在一些实施方案中，所述细胞包含至少一个基因序列中的基因组破坏，其中所述破坏减少或消除由所述基因序列编码的蛋白质的表达。在一些实施方案中，本文公开的任何细胞(例如，本文公开的任何SC-β细胞或任何簇中的细胞)包含至少一个基因序列中的基因组破坏，其中所述破坏减少或消除由所述基因序列编码的蛋白质的表达。在一些实施方案中，所述至少一种基因序列编码MHC-I类基因。在一些实施方案中，所述MHC I类基因编码β-2微球蛋白(B2M)、HLA-A、HLA-B或HLA-C。在一些实施方案中，所述至少一个基因序列编码CIITA。在一些实施方案中，细胞包含编码HLA-A和HLA-B的基因中的基因组破坏，但是不包含编码HLA-C的基因中的基因组破坏。在一些实施方案中，所述细胞包含自然杀伤细胞激活配体基因中的基因组破坏。在一些实施方案中，所述自然杀伤细胞激活配体基因编码细胞间黏附分子1(ICAM1)、CD58、CD155、癌胚抗原相关细胞黏附分子1(CEACAM1)、细胞黏附分子1(CADM1)、MHC-I类多肽相关序列A(MICA)或MHC-I类多肽相关序列B(MICB)。在一些实施方案中，相对于未被遗传修饰的细胞，细胞具有β-2微球蛋白、CIITA、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ和HLADR中的一种或更多种的表达减少。在一些实施方案中，相对于未被遗传修饰的细胞，细胞具有CD47、PDL1、HLA-G、CD46、CD55、CD59和CTLA的表达增加。在特定实施方案中，与来自健康对照受试者的内源性胰岛细胞相比，本文公开的胰岛细胞(例如，SC-β细胞)具有PDL1的表达增加。在特定实施方案中，与来自健康对照受试者的内源性胰岛细胞相比，本文公开的胰岛细胞(例如，SC-β细胞)具有CD47的表达增加。在一些实施方案中，通过使用基因编辑系统，例如，CRISPR Cas技术诱导基因组破坏。
在一些实施方案中，本文公开的任何细胞包含至少一个基因序列中的基因组破坏，其中所述破坏减少或消除由所述基因序列编码的蛋白质的表达(例如，通过敲除受试者中基因的一个或两个功能拷贝)。在一些实施方案中，所述至少一个基因序列是ABO序列，使得破坏导致细胞是O型血型。在一些实施方案中，所述至少一个基因序列编码MHC I类基因。在一些实施方案中，所述MHC I类基因编码β-2微球蛋白(B2M)、HLA-A、HLA-B或HLA-C。在一些实施方案中，所述至少一个基因序列编码CIITA。在一些实施方案中，细胞包含编码HLA-A和HLA-B的基因中的基因组破坏，但是不包含编码HLA-C的基因中的基因组破坏。在一些实施方案中，细胞包含编码CXCL10的基因中的基因组破坏。在一些实施方案中，细胞包含编码肾酶的基因中的基因组破坏。在一些实施方案中，所述细胞包含自然杀伤细胞激活配体基因中的基因组破坏。在一些实施方案中，所述自然杀伤细胞激活配体基因编码细胞间黏附分子1(ICAM1)、CD58、CD155、癌胚抗原相关细胞黏附分子1(CEACAM1)、细胞黏附分子1(CADM1)、MHC-I类多肽相关序列A(MICA)或MHC-I类多肽相关序列B(MICB)。在一些实施方案中，相对于未被遗传修饰的干细胞，细胞具有β-2微球蛋白、CIITA、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ和HLADR中的一种或更多种的表达减少。在一些实施方案中，相对于未被遗传修饰的细胞，细胞具有CD47、PDL1、HLA-G、CD46、CD55、CD59、CTLA、PDL2、HLA-C、HLA-E、HLA-G、C1-抑制剂、IL-35、DUX4、IDO1、IL10、CCL21、CCL22、CD16、CD52、H2-M3、CD200、FASLG、MFGE8和/或SERPINB9的表达增加。在特定实施方案中，与来自健康对照受试者的内源性胰岛细胞相比，本文公开的胰岛细胞(例如，SC-β细胞)具有PDL1的表达增加。在特定实施方案中，与来自健康对照受试者的内源性胰岛细胞相比，本文公开的胰岛细胞(例如，SC-β细胞)具有CD47的表达增加。在一些实施方案中，通过使用基因编辑系统，例如，CRISPR Cas技术诱导基因组破坏。在一些实施方案中，本文描述的任何分离的细胞(例如，干细胞或NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞)包含编码以下的任何一种或更多种基因中的破坏(例如，一个或更多个核苷酸的缺失、插入、易位、倒位或取代)：B2M、CIITA、CXCL10、肾酶、HLA-A、HLA-B、HLA-C、RFX-ANK、NFY-A、NLRC5、RFX5、RFX-AP、HLA-G、HLA-E、NFY-B、PD-L1、NFY-C、IRF1、TAPI、GITR、4-1BB、CD28、B7-1、CD47、B7-2、0X40、CD27、HVEM、SLAM、CD226、ICOS、LAG3、TIGIT、TIM3、CD160、BTLA、CD244、LFA-1、ST2、HLA-F、CD30、B7-H3、VISTA、TLT、PD-L2、CD58、CD2、HELIOS、IDO1、TRAC、TRB、NFY-A、CCR5、F3、CD142、MICA、MICB、LRP1、HMGB1、ABO、RHD、FUT1、KDM5D、PDGFRa、OLIG2和/或GFAP。在一些实施方案中，当与没有破坏的相同类型细胞中的基因表达相比时，基因的破坏导致基因表达减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas、piggybac转座子、TALEN和/或锌指技术破坏基因。
在一些实施方案中，本文描述的细胞(例如，分离的干细胞或NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞)对A抗原呈阴性，并对B抗原呈阴性。在一些实施方案中，本文描述的细胞对A抗原呈阴性。在一些实施方案中，本文描述的细胞对B抗原呈阴性。在一些实施方案中，本文描述的细胞(例如，分离的干细胞或NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞)对Rh抗原呈阴性。在一些实施方案中，本文描述的细胞(例如，分离的干细胞或NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞)对A抗原呈阴性，对B抗原呈阴性，并且对Rh抗原呈阴性。本文使用的“A抗原”是指由3α-N-乙酰半乳糖胺基转移酶产生并作为细胞表面抗原表达的组织血型抗原。本文使用的“B抗原”是指由3α-半乳糖胺基转移酶产生并作为细胞表面抗原表达的组织血型抗原。在一些实施方案中，细胞包含ABO基因中的破坏。在一些实施方案中，细胞包含ABO基因中的破坏，使得细胞具有降低的或缺失水平的A和B抗原。在一些实施方案中，细胞包含FUT1基因中的破坏。在一些实施方案中，细胞包含FUT1基因中的破坏，使得半乳糖苷2-α-L-岩藻糖基转移酶1的表达减少或缺失。本文使用的“Rh抗原”是指由两个高度多态性基因RHD和RHCE编码的高免疫原性抗原。Rh抗原蛋白是跨膜蛋白。在一些实施方案中，细胞包含RHAG基因中的破坏。在一些实施方案中，细胞包含RHAG基因中的破坏，使得细胞具有降低的或缺失水平的Rh相关糖蛋白。在一些实施方案中，细胞具有减少的或消除的选自由以下组成的组的Rh蛋白抗原表达：Rh C抗原、Rh E抗原、Kell K抗原(KEL)、Duffy(FY)Fya抗原、Duffy Fy3抗原、Kidd(JK)Jkb抗原、MNS抗原U和MNS抗原S。
在一些实施方案中，本文公开的任何细胞(例如，本文公开的任何SC-胰岛细胞)包含“安全开关”。在一些实施方案中，安全开关是编码诱导导致细胞死亡或停止细胞增殖的开关蛋白的核酸构建体。在一些实施方案中，安全开关被插入在工程化细胞基因组中确定的特定靶基因座(例如，安全港基因座)，通常在靶基因座的两个等位基因处。在一些实施方案中，靶基因座是安全港基因座，诸如，ActB或CLYBL。在一些实施方案中，靶基因座是被靶向破坏的基因(例如，B2M或CIITA)。在一些实施方案中，通过与有效剂量的临床上可接受的直系同源小分子接触来激活开关蛋白。在一些实施方案中，当被激活时，安全开关使细胞停止增殖，在一些实施方案中通过激活细胞的凋亡。在一些实施方案中，开关蛋白包含单纯疱疹病毒胸苷激酶。在一些实施方案中，开关蛋白包含人类胱天蛋白酶蛋白，例如胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶5、胱天蛋白酶6、胱天蛋白酶7、胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶10、胱天蛋白酶14等。在某些实施方案中，蛋白质是人类胱天蛋白酶9。在一些实施方案中，胱天蛋白酶蛋白融合到提供化学诱导二聚化(CID)的序列，其中二聚化仅在直系同源激活剂存在的情况下发生。一个或更多个CID结构域可以与胱天蛋白酶蛋白融合，例如，两个不同的CID结构域可以与胱天蛋白酶蛋白融合。在一些实施方案中，CID结构域是mTOR的FKBP或FRB(FKBP-雷帕霉素结合)结构域的二聚化结构域，其被雷帕霉素类似物激活。在一些实施方案中，安全开关是WO2021173449和Jones等人，2014,Frontiers in Pharmacology,5(254):1-8中描述的任何安全开关，其中每一个以其整体并入本文。
在一些实施方案中，在本文公开的药物组合物中，细胞群体中的至少一部分细胞以多于一个细胞簇存在。在一些情况下，细胞簇的直径为约50μm至约500μm、约50μm至约400μm、约50μm至约300μm、约60μm至约400μm、约60μm至约300μm、约60μm至约250μm、约75μm至约400μm、约75μm至约300μm、约75μm至约250μm、约125μm至约225μm、约130μm至约160μm、约170μm至约225μm、约140μm至约200μm、约140μm至约170μm、约160μm至约220μm、约170μm至约215μm或约170μm至约200μm。在一些情况下，在本文公开的药物组合物中，细胞群体作为单细胞悬浮液存在。在一些实施方案中，在本文公开的药物组合物中，至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少98％或至少99％的细胞以细胞簇存在。在一些实施方案中，在本文公开的药物组合物中，基本上所有的细胞以细胞簇存在，例如至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％、至少99.9％、至少99.99％、至少99.999％或至少99.9999％的细胞。
药学上可接受的赋形剂和/或载体
在一些方面，本文公开的药物组合物包含液体悬浮液中的细胞群体。液体悬浮液可以含有包含药学上可接受的赋形剂和/或载体的水性溶液。例如，药物组合物还可以包含生理相容的溶液，包括例如磷酸盐缓冲盐水。
在一些情况下，本公开内容提供了可以在用于治疗疾病(例如，糖尿病)的各种方法中利用非天然胰腺β细胞群体以及细胞组分和产物的药物组合物。某些情况包括包含活细胞(例如，单独的或与其他细胞类型混合的非天然胰腺β细胞)的药物组合物。其他情况包括包含非天然胰腺β细胞组分(例如，细胞裂解物、可溶性细胞级分、条件培养基、ECM或上述任一种的组分)或产物(例如，由非天然胰腺β细胞或通过遗传修饰产生的营养因子和其他生物因子、来自非天然胰腺β细胞培养物的条件培养基)的药物组合物。在任一种情况下，药物组合物还可以包含本领域技术人员已知的其他活性剂，诸如抗炎剂、外源性小分子激动剂、外源性小分子拮抗剂、抗凋亡剂、抗氧化剂和/或生长因子。
本公开内容的药物组合物可以包含与药学上可接受的载体(例如，介质或赋形剂)一起配制的非天然胰腺β细胞或其组分或产物。术语药学上可接受的载体(或培养基或赋形剂)可以与术语生物相容性载体或培养基可互换使用，可以指这样的试剂、细胞、化合物、材料、组合物和/或剂型，其不仅与待治疗性施用的细胞和其他剂相容，而且还适合于与人类和动物的组织接触使用而无过度的毒性、刺激、变态反应或其他并发症。合适的药学上可接受的载体可以包括水、盐溶液(诸如林格氏液)、醇、油、明胶和糖类，诸如乳糖、直链淀粉或淀粉、脂肪酸酯、羟甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷。这样的制品可以是灭菌的，并且在期望的情况下可以与诸如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂和着色剂等辅助剂混合。包含细胞组分或产物但不包含活细胞的药物组合物可以配制成液体悬浮液。
药物组合物可以包含本领域技术人员将会熟悉的辅助组分。例如，它们可以包含抗氧化剂，其范围取决于所使用的抗氧化剂的种类而变化。常用抗氧化剂的合理范围是约0.01％至约0.15％重量/体积的EDTA、约0.01％至约2.0％重量/体积的亚硫酸钠和约0.01％至约2.0％重量/体积的焦亚硫酸钠。对于上述每一种，本领域技术人员可以使用约0.1％重量/体积的浓度。其他代表性的化合物包括巯基丙酰甘氨酸、N-乙酰半胱氨酸、β-巯基乙胺、谷胱甘肽和类似物质，但还可以使用其他适合于肾脏施用的抗氧化剂，例如，抗坏血酸及其盐或亚硫酸盐或焦亚硫酸钠。
缓冲剂可用于将制剂的pH维持在约4.0至约8.0的范围内；以使对靶组织的刺激最小化。对于直接腹膜内注射，制剂应在pH 7.2至7.5，优选在pH 7.35-7.45。所述组合物还可以包含适合于向肾脏施用的张度剂。其中合适的是氯化钠，以使制剂与血液近似等渗。
在某些情况下，药物组合物与黏度增强剂一起配制。示例性的剂是羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。在必要时，药物组合物可以添加助溶剂。合适的助溶剂可以包括甘油、聚乙二醇(PEG)、聚山梨酯、丙二醇和聚乙烯醇。还可以包含防腐剂，例如，苯扎氯铵、苄索氯铵、氯丁醇、醋酸苯汞或硝酸苯汞、硫柳汞或者对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯。
包含细胞、细胞组分或细胞产物的药物组合物可以以本领域已知的几种递送方法中的一种或更多种递送至患者肝脏。在一些情况下，组合物被递送至肝脏。在另一个实施方案中，组合物可以经由门静脉内注射递送至肝脏。
在一些实施方案中，本文公开的任何细胞组合物(例如，包含体外分化的胰岛细胞的组合物)还包含液体溶液(或培养基)。在一些实施方案中，液体溶液包含糖。在一些实施方案中，糖是蔗糖或葡萄糖。在一些实施方案中，液体溶液包含浓度在约0.05％和约1.5％之间的糖。在一些实施方案中，液体溶液是CMRL培养基。在一些实施方案中，组合物包含FRS Preservation Media。在一些情况下，液体溶液不含血清。在一些情况下，悬浮细胞的液体溶液不含蛋白质。在一些情况下，悬浮细胞的液体溶液不含动物组分。在一些情况下，悬浮细胞的液体溶液不含蛋白质和动物组分。在一些情况下，液体溶液具有生理渗透压。在一些情况下，液体溶液是pH缓冲的。
在一些情况下，干细胞衍生的胰岛细胞的药物组合物以常规的方式使用一种或更多种生理上可接受的载体进行配制，所述载体包括赋形剂和助剂，其有助于将活性化合物加工成可药用的制品。合适的制剂取决于所选择的施用途径。本文描述的药物组合物的概要可以在例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Nineteenth Ed(Easton,Pa.:Mack Publishing Company,1995)；Hoover,John E.,Remington’sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania 1975；Liberman,H.A和Lachman,L.,Eds.,Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Decker,NewYork,N.Y.,1980；以及Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Seventh Ed.(Lippincott Williams&Wilkins1999)中找到。
药物组合物任选地以常规方式来制备，常规方式诸如，仅通过例示的方式，通过常规的混合、溶解、制粒、制糖衣丸、研磨、乳化、包封、包埋或压缩方法。
在某些实施方案中，组合物还可以包含一种或更多种pH调节剂或缓冲剂，包括酸诸如乙酸、硼酸、柠檬酸、乳酸、磷酸以及盐酸；碱诸如氢氧化钠、磷酸钠、硼酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠、乳酸钠以及三羟甲基氨基甲烷；以及缓冲剂诸如柠檬酸盐/右旋糖、碳酸氢钠和氯化铵。这些酸、碱和缓冲剂以所需的量包含在内，以使组合物的pH维持在可接受的范围内。
在其他实施方案中，组合物还可以包含所需量的一种或更多种盐，以使组合物的重量摩尔渗透压浓度在可接受的范围内。这样的盐包括含有钠、钾或铵阳离子和氯离子、柠檬酸根、抗坏血酸根、硼酸根、磷酸根、碳酸氢根、硫酸根、硫代硫酸根或亚硫酸氢根阴离子的那些盐；合适的盐包括氯化钠、氯化钾、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠和硫酸铵。
本文描述的药物组合物通过任何合适的施用途径施用，包括，但不限于，口服、肠胃外(例如、静脉内、皮下、肌内、脑内、脑室内、关节内、腹膜内或颅内)、鼻内、含服、舌下或直肠施用途径。在一些情况下，将药物组合物配制成用于肠胃外(例如，静脉内、皮下、肌肉内、脑内、脑室内、关节内、腹膜内或颅内)施用。在一些实施方案中，本文公开的任何药物组合物通过经由肝门静脉输注施用至受试者。
本文描述的药物组合物被配制为任何合适的剂型，包括，但不限于，水性口服分散体、液体、凝胶、糖浆、酏剂、浆剂、悬浮液等，用于由待治疗个体口服摄入，固体口服剂型、气雾剂、受控释放制剂、速融制剂、泡腾制剂、冻干制剂、片剂、粉末、丸剂、糖衣丸、胶囊、延迟释放制剂、延长释放制剂、脉冲释放制剂、多颗粒制剂以及混合立即释放和受控释放制剂。在一些实施方案中，药物组合物被配制为胶囊。在一些实施方案中，药物组合物被配制为溶液(例如，用于静脉内(IV)施用)。在一些情况下，药物组合物被配制为输注液。在一些情况下，药物组合物被配制为注射剂。
本文描述的药物固体剂型任选地包含本文描述的化合物和一种或更多种药学上可接受的添加剂，诸如相容的载体、黏合剂、填充剂、悬浮剂、调味剂、甜味剂、崩解剂、分散剂、表面活性剂、润滑剂、着色剂、稀释剂、增溶剂、湿润剂(moistening agen)、增塑剂、稳定剂、渗透促进剂、润湿剂、消泡剂、抗氧化剂、防腐剂或其一种或更多种组合。
在又其他方面，使用标准包衣程序，诸如在Remington's PharmaceuticalSciences，第20版(2000)中描述的那些包衣程序，围绕组合物提供膜包衣。在一些实施方案中，组合物被配制为颗粒(例如用于通过胶囊施用)，并且一些或全部颗粒被包衣。在一些实施方案中，组合物被配制为颗粒(例如用于通过胶囊施用)，并且一些或全部颗粒被微囊化。在一些实施方案中，组合物被配制为颗粒(例如用于通过胶囊施用)，并且一些或全部颗粒未被微囊化并且未被包衣。
在某些实施方案中，本文提供的组合物还可以包含一种或更多种防腐剂，以抑制微生物活性。合适的防腐剂包括含汞物质，诸如硼酸苯汞和硫柳汞；稳定化的二氧化氯；以及季铵化合物，诸如苯扎氯铵、十六烷基三甲基溴化铵和氯化十六烷基吡啶鎓。
在一些实施方案中，本公开内容的组合物可以以有效治疗或预防例如糖尿病的量包含干细胞衍生的胰岛细胞。药物组合物可以包含本文描述的干细胞衍生的胰岛细胞与一种或更多种药学或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合。这样的组合物可以包含缓冲剂，诸如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；糖类，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或右旋糖酐、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；以及防腐剂。
药物组合物可以包含本领域技术人员将会熟悉的辅助组分。例如，它们可以包含抗氧化剂，其范围取决于所使用的抗氧化剂的种类而变化。常用抗氧化剂的合理范围是约0.01％至约0.15％重量/体积的EDTA、约0.01％至约2.0％重量/体积的亚硫酸钠和约0.01％至约2.0％重量/体积的焦亚硫酸钠。对于上述每一种，本领域技术人员可以使用约0.1％重量/体积的浓度。其他代表性的化合物包括巯基丙酰甘氨酸、N-乙酰半胱氨酸、β-巯基乙胺、谷胱甘肽和类似物质，但还可以使用其他适合于肾脏施用的抗氧化剂，例如，抗坏血酸及其盐或亚硫酸盐或焦亚硫酸钠。
缓冲剂可用于将制剂的pH维持在约4.0至约8.0的范围内；以便使在靶组织中的刺激最小化。对于直接腹膜内注射，制剂应在pH 7.2至7.5，优选在pH 7.35-7.45。所述组合物还可以包含适合于向肾脏施用的张度剂。其中合适的是氯化钠，以使制剂与血液近似等渗。
在某些情况下，药物组合物与黏度增强剂一起配制。示例性的剂是羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。在必要时，药物组合物可以添加助溶剂。合适的助溶剂可以包括甘油、聚乙二醇(PEG)、聚山梨酯、丙二醇和聚乙烯醇。还可以包含防腐剂，例如，苯扎氯铵、苄索氯铵、氯丁醇、醋酸苯汞或硝酸苯汞、硫柳汞或者对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯。
本文描述的制剂可以得益于抗氧化剂、金属螯合剂、含硫醇化合物以及其他一般稳定剂。这样的稳定剂的实例包括但不限于：(a)约0.5％w/v至约2％w/v甘油、(b)约0.1％w/v至约1％w/v甲硫氨酸、(c)约0.1％w/v至约2％w/v单硫代甘油、(d)约1mM至约10mMEDTA、(e)约0.01％w/v至约2％w/v抗坏血酸、(f)0.003％w/v至约0.02％w/v聚山梨酯80、(g)0.001％w/v至约0.05％w/v聚山梨酯20、(h)精氨酸、(i)肝素、(j)硫酸右旋糖酐、(k)环糊精、(l)戊聚糖多硫酸酯和其他类肝素、(m)二价阳离子，诸如镁和锌；或(n)其组合。
“黏合剂”赋予内聚性质，并包括，例如，藻酸及其盐；纤维素衍生物诸如羧甲基纤维素、甲基纤维素(例如，)、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素(例如，)、乙基纤维素(例如，)以及微晶纤维素(例如，)；微晶右旋糖；直链淀粉；硅酸镁铝；多糖酸；膨润土；明胶；聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物；交联聚维酮；聚维酮；淀粉；预胶化淀粉；黄蓍胶、糊精、糖诸如蔗糖(例如，)、葡萄糖、右旋糖、糖蜜、甘露醇、山梨醇、木糖醇(例如，)以及乳糖；天然或合成的树胶诸如阿拉伯树胶、黄蓍胶、茄替胶、芒麻胶(mucilage of isapol husks)、聚乙烯吡咯烷酮(例如，CL、CL、XL-10)、落叶松阿拉伯半乳聚糖(larcharabogalactan)、聚乙二醇、蜡、藻酸钠等。
“载体”或“载体物质”包括任何制药学中常用的赋形剂，并且应当基于与本文公开的化合物(诸如，依鲁替尼和抗癌剂的化合物)的相容性以及期望剂型的释放谱特性来选择。示例性的载体材料包括，例如，黏合剂、悬浮剂、崩解剂、填充剂、表面活性剂、增溶剂、稳定剂、润滑剂、润湿剂、稀释剂等。“药学上相容的载体材料”可以包括但不限于，阿拉伯胶、明胶、胶体二氧化硅、甘油磷酸钙、乳酸钙、麦芽糊精、甘油、硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、胆固醇、胆固醇酯、酪蛋白酸钠、大豆卵磷脂、牛磺胆酸、磷脂酰胆碱、氯化钠、磷酸三钙、磷酸氢二钾、纤维素和纤维素缀合物、糖硬脂酰乳酸钠、卡拉胶、单酸甘油酯、甘油二酯、预胶化淀粉等。参见，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy,NineteenthEd(Easton,Pa.:Mack Publishing Company,1995)；Hoover,John E.,Remington’sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania 1975；Liberman,H.A和Lachman,L.,Eds.,Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Decker,NewYork,N.Y.,1980；以及Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Seventh Ed.(Lippincott Williams&Wilkins1999)。
“分散剂”和/或“黏度调节剂”包括通过液体介质或制粒方法或共混法控制药物的扩散和均匀性的物质。“分散剂”和/或“黏度调节剂”包括通过液体介质或造粒法或混合法控制药物扩散和均匀性的材料。在一些实施方案中，这些剂还促进包衣或可溶蚀性基质的有效性。示例性的扩散促进剂/分散剂包括例如亲水性聚合物、电解质、60或80、PEG、聚乙烯吡咯烷酮(PVP；商业上称为)和基于糖类的分散剂诸如例如羟丙基纤维素(例如，HPC、HPC-SL和HPC-L)、羟丙基甲基纤维素(例如，HPMC K100、HPMC K4M、HPMCK15M和HPMC K100M)、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、硬脂酸乙酸羟丙基甲基纤维素(HPMCAS)、非晶态纤维素、硅酸镁铝、三乙醇胺、聚乙烯醇(PVA)、乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S630)、带有环氧乙烷和甲醛的4-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯酚聚合物(也称为泰洛沙泊)、泊洛沙姆(例如，Pluronics 和其是环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物)；以及泊洛沙明(poloxamine)(例如，Tetronic也称为Poloxamine它是由环氧丙烷和环氧乙烷依次加成到乙二胺得到的四官能嵌段共聚物(BASF Corporation,Parsippany,N.J.))、聚乙烯吡咯烷酮K12、聚乙烯吡咯烷酮K17、聚乙烯吡咯烷酮K25或聚乙烯吡咯烷酮K30、聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S-630)、聚乙二醇(例如聚乙二醇可以具有约300至约6000，或约3350至约4000，或约7000至约5400的分子量)、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚山梨酯80、藻酸钠、树胶(诸如黄蓍胶和阿拉伯胶)、瓜尔胶、黄原胶类(包括黄原胶)、糖、纤维素(诸如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠)、聚山梨酯80、藻酸钠、聚乙氧基失水山梨醇单月桂酸酯、聚乙氧基失水山梨醇单月桂酸酯、聚维酮、卡波姆、聚乙烯醇(PVA)、藻酸盐、壳聚糖及其组合。增塑剂诸如纤维素或三乙基纤维素也可以用作分散剂。在脂质体分散体和自乳化分散体中特别有用的分散剂是二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、来自鸡蛋的天然磷脂酰胆碱、鸡蛋中的天然磷脂酰甘油、胆固醇和肉豆蔻酸异丙酯。
一种或更多种溶蚀促进剂与一种或更多种扩散促进剂的组合也可以用于本发明的组合物中。
术语“稀释剂”是指在递送前用于稀释感兴趣的化合物的化合物。稀释剂还可以用于稳定化合物，因为它们可以提供更稳定的环境。溶解在缓冲溶液中的盐(其也可以提供pH控制或维持)在本领域中用作稀释剂，其包括但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液。在某些实施方案中，稀释剂增加组合物的体积，以促进压缩或为胶囊填充的均匀混合产生足够的体积。这样的化合物包括例如乳糖、淀粉、甘露醇、山梨醇、右旋糖、微晶纤维素诸如磷酸氢钙、二水合磷酸氢钙；磷酸三钙、磷酸钙；无水乳糖、喷雾干燥乳糖；预胶化淀粉、可压缩糖诸如(Amstar)；甘露醇、羟丙基甲基纤维素、硬脂酸乙酸羟丙基甲基纤维素、蔗糖基稀释剂、糖粉；一水合硫酸钙、二水合硫酸钙；三水合乳酸钙、右旋糖类(dextrates)；水解谷物固体、直链淀粉；粉状纤维素、碳酸钙；甘氨酸、高岭土；甘露醇、氯化钠；肌醇，膨润土等。
“填充剂”包括诸如乳糖、碳酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、硫酸钙、微晶纤维素、纤维素粉末、右旋糖、右旋糖类、右旋糖酐、淀粉、预胶化淀粉、蔗糖、木糖醇、乳糖醇、甘露醇、山梨醇、氯化钠、聚乙二醇等化合物。
“润滑剂”和“助流剂”是防止、减少或抑制材料黏附或摩擦的化合物。示例性的润滑剂包括例如硬脂酸、氢氧化钙、滑石、硬脂富马酸钠、烃(诸如矿物油、或氢化植物油诸如氢化大豆油)、高级脂肪酸及其碱金属和碱土金属盐(诸如铝、钙、镁、锌)、硬脂酸、硬脂酸钠、甘油、滑石、蜡、硼酸、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠、亮氨酸、聚乙二醇(例如，PEG-4000)或甲氧基聚乙二醇(诸如CarbowaxTM)、油酸钠、苯甲酸钠、山萮酸甘油酯、聚乙二醇、十二烷基硫酸镁或十二烷基硫酸钠、胶体二氧化硅(诸如SyloidTM、)、淀粉(诸如玉米淀粉)、硅油、表面活性剂等。
“增塑剂”是用于软化微囊化材料或薄膜包衣，以使其不那么脆的化合物。合适的增塑剂包括例如聚乙二醇(诸如PEG 300、PEG 400、PEG 600、PEG 1450、PEG 3350和PEG800)、硬脂酸、丙二醇、油酸、三乙基纤维素和三乙酸甘油酯。在一些实施方案中，增塑剂还可以起分散剂或润湿剂的作用。
“增溶剂”包括诸如三乙酸甘油酯、柠檬酸三乙酯、油酸乙酯、辛酸乙酯、十二烷基硫酸钠、多库酯钠(sodium doccusate)、维生素E TPGS、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、N-羟乙基吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羟丙基环糊精、乙醇、正丁醇、异丙醇、胆固醇、胆盐、聚乙二醇200-600、三缩四乙二醇、二乙二醇单乙基醚、丙二醇和异山梨醇二甲醚等化合物。
“稳定剂”包括诸如任何抗氧化剂、缓冲剂、酸、防腐剂等化合物。
“悬浮剂”包括诸如聚乙烯吡咯烷酮(例如，聚乙烯吡咯烷酮K12、聚乙烯吡咯烷酮K17、聚乙烯吡咯烷酮K25或聚乙烯吡咯烷酮K30、乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S630))、聚乙二醇(例如，聚乙二醇可以具有约300至约6000，或约3350至约4000，或约7000至约5400的分子量)、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、硬脂酸乙酸羟甲基纤维素、聚山梨酯80、羟乙基纤维素、藻酸钠、树胶(诸如例如黄蓍胶和阿拉伯胶)、瓜尔胶、黄原胶类(包括黄原胶)、糖、纤维素(诸如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素)、聚山梨酯80、藻酸钠、聚乙氧基失水山梨醇单月桂酸酯、聚乙氧基失水山梨醇单月桂酸酯、聚维酮等化合物。
“表面活性剂”包括诸如十二烷基硫酸钠、多库酯钠、Tween 60或80、三乙酸甘油酯、维生素E TPGS、失水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯、聚山梨酸酯、泊洛沙姆、胆盐、单硬脂酸甘油酯、环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物例如(BASF)等化合物。其他一些表面活性剂包括聚氧乙烯脂肪酸甘油酯和植物油，例如，聚氧乙烯(60)氢化蓖麻油；以及聚氧乙烯烷基醚和烷基苯基醚，例如，辛苯昔醇(octoxynol)10、辛苯昔醇40。在一些实施方案中，可以包括表面活性剂以增强物理稳定性或用于其他目的。
“黏度增强剂”包括例如甲基纤维素、黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、硬脂酸乙酸羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、卡波姆、聚乙烯醇、藻酸盐、阿拉伯胶、壳聚糖及其组合。
“润湿剂”包括诸如油酸、单硬脂酸甘油酯、失水山梨醇单油酸酯、失水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、多库酯钠、油酸钠、十二烷基硫酸钠、多库酯钠、三乙酸甘油酯、Tween 80、维生素ETPGS、铵盐等化合物。
在一些实施方案中，本文公开的任何组合物被包封在本文公开的任何装置中。
干细胞和重编程
本文提供了使用干细胞用于产生SC-β细胞(例如，成熟胰腺β细胞或β样细胞)或其前体。在实施方案中，可以使用与美国专利申请公布号US20150240212和US20150218522中描述的类似方案，用胚细胞代替干细胞或与干细胞一起使用以提供至少一种SC-β细胞，该专利申请各自通过引用以其整体并入本文。合适的生殖细胞可以由例如末次月经期后约8-11周获取的人类胎儿材料中存在的原始生殖细胞制备。示例性胚细胞制备方法描述于例如Shamblott等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:13726,1998和美国专利第6,090,622号中。
本文提供了产生SC-胰岛细胞(例如，SC-β细胞)以及SC-α细胞和/或SC-δ细胞的组合物和方法。
通常，根据本文公开的方法产生的至少一种SC-胰岛细胞或其前体，例如，胰腺祖细胞，可以包含不同细胞的混合物或组合。
可以根据任何合适的培养方案来产生至少一种胰腺α、β和/或δ细胞或其前体，以使干细胞或多能细胞分化为期望的分化阶段。在一些实施方案中，通过在适合于使至少一种多能细胞分化为至少一种胰腺α、β和/或δ细胞或其前体的条件下将至少一种多能细胞培养一段时间来产生至少一种胰腺α、β和/或δ细胞或其前体。
在一些实施方案中，至少一种胰腺α、β和/或δ细胞或其前体是基本上纯的胰腺α、β和/或δ细胞或其前体的群体。在一些实施方案中，胰腺α、β和/或δ细胞或其前体的群体包含多能细胞或分化的细胞的混合物。在一些实施方案中，胰腺α、β和/或δ细胞或其前体的群体基本上不含或缺少胚胎干细胞或多能细胞或iPS细胞。
在一些实施方案中，体细胞(例如成纤维细胞)可以例如以组织活检(诸如，例如皮肤活检)从受试者分离，并重编程为诱导多能干细胞，以进一步分化从而产生用于本文描述的组合物和方法中的至少一种胰腺α、β和/或δ细胞或其前体。在一些实施方案中，通过本领域普通技术人员已知的方法将体细胞(例如成纤维细胞)维持在培养物中，并且在一些实施方案中，在通过本文公开的方法将其转化为胰腺α、β和/或δ细胞之前进行增殖。
在一些实施方案中，通过本领域普通技术人员已知的方法将至少一种胰腺α、β和/或δ细胞或其前体维持在培养物中，并且在一些实施方案中，在通过本文公开的方法将其转化为胰腺α、β和/或δ细胞之前进行增殖。
此外，至少一种胰腺α、β和/或δ细胞或其前体(例如胰腺祖细胞)可以来自任何哺乳动物物种，非限制性实例包括鼠科动物、牛科动物、猿、猪科动物、马科动物、绵羊(ovine)或人类细胞。为了清楚和简单起见，本文方法的描述是指哺乳动物的至少一种胰腺α、β和/或δ细胞或其前体，但是应当理解，本文描述的所有方法可以容易地应用于至少一种胰腺α、β和/或δ细胞或其前体的其他细胞类型。在一些实施方案中，至少一种胰腺α、β和/或δ细胞或其前体源自人类个体。
干细胞
本公开内容的实施方案涉及使用干细胞用于产生胰腺α、β和/或δ细胞或其前体。如本文使用的，术语“干细胞”可以指具有自我更新和产生分化细胞类型两种能力的细胞(例如，脊椎动物干细胞)(Morrison等人,(1997)Cell 88:287-298)。在细胞个体发育的上下文中，形容词“分化的(differentiated)”或“分化的(differentiating)”是相对术语。“分化的细胞”可以是相对于与之相比的细胞，沿着发育途径进一步向下发展的细胞。因此，多能干细胞可以分化为谱系限制性祖细胞(例如，定形内胚层细胞)，继而可以分化为进一步限制性的细胞(例如，胰腺祖细胞)，这些细胞可以分化为终末阶段细胞(即，终末分化的细胞，例如，β细胞，等等)，它们在某些组织类型中具有特征性作用，并且可以保留或不保留进一步增殖的能力。干细胞可以通过特异性标志物(例如，蛋白质、RNA，等等)的存在和特异性标志物的不存在来表征。干细胞也可以通过体外功能测定和体内功能测定来鉴别，特别是与干细胞产生多种分化的后代的能力相关的测定。在实施方案中，宿主细胞是成体干细胞、体细胞干细胞、非胚胎干细胞、胚胎干细胞、造血干细胞、诱导多能干细胞和滋养层干细胞。
感兴趣的干细胞，例如可以在本文提供的方法中使用的干细胞可以包括多能干细胞(PSC)。如本文使用的，术语“多能干细胞”或“PSC”可以指能够产生生物体的所有细胞类型的干细胞。因此，PSC可以产生生物体所有胚层的细胞(例如，脊椎动物的内胚层、中胚层和外胚层)。多能细胞可以能够形成畸胎瘤并有助于活生物体中的外胚层、中胚层或内胚层组织。植物的多能干细胞可以能够产生植物的所有细胞类型(例如，根、茎、叶等的细胞)。
本公开内容的实施方案涉及使用PSC用于生成胰腺α、β和/或δ细胞或其前体。动物的PSC可以通过多种不同方式获得。例如，胚胎干细胞(ESC)可以衍生自胚胎的内细胞团(Thomson等人,Science.1998Nov.6；282(5391):1145-7)，而诱导多能干细胞(iPSC)可以衍生自体细胞(Takahashi等人,Cell.2007Nov.30；131(5):861-72；Takahashi等人,NatProtoc.2007；2(12):3081-9；Yu等人,Science.2007Dec.21；318(5858):1917-20.Epub2007Nov.20)。因为术语PSC可以指多能干细胞而不考虑它们的起源，所以术语PSC可以包括术语ESC和iPSC，以及术语胚胎生殖干细胞(EGSC)，其是PSC的另一个实例。PSC可以是已建立的细胞系的形式，它们可以直接从原代胚胎组织获得，或者可以衍生自体细胞。
本公开内容的实施方案涉及使用ESC用于生成胰腺β细胞或其前体。“胚胎干细胞”(ESC)可以意指从胚胎，通常从胚泡的内细胞团分离的PSC。ESC细胞系在NIH人类胚胎干细胞注册表(NIH Human Embryonic Stem Cell Registry)中列出，例如，hESBGN-01、hESBGN-02、hESBGN-03、hESBGN-04(BresaGen，Inc.)；HES-1、HES-2、HES-3、HES-4、HES-5、HES-6(ESCell International)；Miz-hES1(MizMedi Hospital-Seoul National University)；HSF-1、HSF-6(University of California at San Francisco)；以及H1、H7、H9、H13、H14(Wisconsin Alumni Research Foundation(WiCell Research Institute))。感兴趣的干细胞还包括来自其他灵长类动物的胚胎干细胞，诸如恒河猴干细胞和狨猴干细胞。干细胞可以从任何哺乳动物物种获得，例如，人类、马科动物、牛科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠)、灵长类动物，等等(Thomson等人,(1998)Science282:1145；Thomson等人,(1995)Proc.Natl.Acad.Sci USA92:7844；Thomson等人,(1996)Biol.Reprod.55:254；Shamblott等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:13726,1998)。在培养中，ESC可以生长为具有大的核质比、明确边界和突出核仁的扁平集落。此外，ESC可以表达SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81和碱性磷酸酶，但不表达SSEA-1。生成和表征ESC的方法的实例可见于，例如，美国专利第7,029,913号、美国专利第5,843,780号和美国专利第6,200,806号，其中的每一项以其整体并入本文。用于使未分化形式的hESC增殖的方法描述于WO 99/20741、WO 01/51616和WO 03/020920中，其中的每一项以其整体并入本文。
“胚胎生殖干细胞”(EGSC)或“胚胎生殖细胞”或“EG细胞”意指衍生自生殖细胞和/或生殖细胞祖细胞，例如原始生殖细胞，例如可以变成精子和卵子的那些细胞的PSC。胚胎生殖细胞(EG细胞)被认为具有与上述胚胎干细胞相似的性质。产生和表征EG细胞的方法的实例可见于例如，美国专利第7,153,684号；Matsui,Y.等人,(1992)Cell 70:841；Shamblott,M.等人,(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:113；Shamblott,M.等人,(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:13726；和Koshimizu,U.等人,(1996)Development,122:1235，其中的每一项以其整体并入本文。
本公开内容的实施方案涉及使用iPSC用于生成胰腺α、β和/或δ细胞或其前体。“诱导多能干细胞”或“iPSC”意指衍生自非PSC的细胞的PSC(例如，衍生自相对于PSC是分化了的细胞)。iPSC可以衍生自多种不同的细胞类型，包括终末分化的细胞。iPSC可以具有ES细胞样的形态，生长为具有大核质比、明确边界和突出核仁的扁平集落。此外，iPSC可以表达一种或更多种本领域普通技术人员已知的关键多能性标志物，包括但不限于碱性磷酸酶、SSEA3、SSEA4、Sox2、Oct3/4、Nanog、TRA160、TRA181、TDGF 1、Dnmt3b、FoxD3、GDF3、Cyp26a1、TERT和zfp42。生成和表征iPSC的方法的实例可见于例如，美国专利公布第US20090047263号、第US20090068742号、第US20090191159号、第US20090227032号、第US20090246875号和第US20090304646号，其中的每一项以其整体并入本文。通常，为了产生iPSC，向体细胞提供本领域已知的重编程因子(例如，Oct4、SOX2、KLF4、MYC、Nanog、Lin28等)，以将体细胞重编程为多能干细胞。
在一些实施方案中，该细胞群体从干细胞在体外衍生。在一些实施方案中，干细胞是被遗传修饰的。在一些实施方案中，所述干细胞相对于未被遗传修饰的干细胞具有β-2微球蛋白、CIITA、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR中的一种或更多种的表达减少。在一些实施方案中，所述干细胞相对于未被遗传修饰的干细胞具有CD47、PDL1、HLA-G、CD46、CD55、CD59和/或CTLA中的一种或更多种的表达增加。
本公开内容的实施方案涉及使用体细胞用于生成胰腺α、β和/或δ细胞或其前体。“体细胞”意指生物体中在没有实验操纵的情况下通常不产生生物体中所有类型的细胞的任何细胞。换句话说，体细胞可以是已经充分分化的细胞，它们不能天然地生成身体的所有三个胚层(例如外胚层、中胚层和内胚层)的细胞。例如，体细胞可以包括神经元细胞和神经祖细胞，后者能够天然产生中枢神经系统的所有或一些细胞类型，但无法产生中胚层或内胚层谱系的细胞。
在某些实例中，根据本文公开的方法，在暴露于至少一种分化因子或组合物之前，干细胞可以是未分化的(例如，细胞未定型至特定谱系)，而在其他实例中，可能期望在暴露于本文描述的至少一种分化因子或组合物之前，使干细胞分化为一种或更多种中间细胞类型。例如，干细胞可显示未分化细胞的形态、生物学或物理特性，这些特性可用于将它们与胚胎或成体来源的分化细胞区分开。在一些实例中，未分化的细胞可以出现在具有高核/质比和突出核仁的细胞集落的二维显微视图中。干细胞可以是干细胞本身(例如，基本上不存在任何分化的细胞)，也可以在存在分化的细胞的情况下使用。在某些实例中，可以在合适的营养物和任选地其他细胞的存在下培养干细胞，使得该干细胞可以生长并任选地分化。例如，在培养物中可以存在胚胎成纤维细胞或成纤维细胞样细胞，以帮助干细胞的生长。成纤维细胞可以在干细胞生长的一个阶段期间存在，但不必在所有阶段存在。例如，可以在第一培养阶段将成纤维细胞添加到干细胞培养物，而在一个或更多个随后的培养阶段不添加到干细胞培养物。
在本公开内容的所有方面中使用的干细胞可以是衍生自任何种类的组织(例如，胚胎组织，诸如胎儿或胎儿前组织或成体组织)的任何细胞，该干细胞可以具有在适当条件下能够产生不同细胞类型(例如，所有3个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)或其中至少一种的衍生物)的后代的特性。这些细胞类型可以以已建立的细胞系的形式提供，或者可以直接从原代胚胎组织获得并立即用于分化。包括在NIH人类胚胎干细胞注册表中列出的细胞，例如，hESBGN-01、hESBGN-02、hESBGN-03、hESBGN-04(BresaGen，Inc.)；HES-1、HES-2、HES-3、HES-4、HES-5、HES-6(ES Cell International)；Miz-hES1(MizMedi Hospital-SeoulNational University)；HSF-1、FISF-6(University of California at San Francisco)；以及H1、H7、H9、H13、H14(Wisconsin Alumni Research Foundation(WiCell ResearchInstitute))。在一些实施方案中，用于化学诱导分化为成熟胰岛素阳性细胞的人类干细胞或多能干细胞的来源不涉及破坏人类胚胎。在一些实施方案中，用于化学诱导分化为成熟胰岛素阳性细胞的人类干细胞或多能干细胞的来源不涉及破坏人类胚胎。
在另一个实例中，可以从包括实体组织在内的组织分离干细胞。在一些实施方案中，该组织是皮肤、脂肪组织(fat tissue)((例如，脂肪组织(adipose tissue))、肌肉组织、心或心脏组织。在其他实施方案中，该组织是例如，但不限于脐带血、胎盘、骨髓或软骨。
可用于本文提供的方法中的干细胞还可包括各种类型的胚胎细胞，例如人类胚胎干细胞(hES)细胞，如由Thomson等人,(1998)Science 282:1145描述的；来自其他灵长类动物的胚胎干细胞，诸如恒河猴干细胞(Thomson等人,(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:7844)；狨猴干细胞(Thomson等人,(1996)Biol.Reprod.55:254)；和人类胚胎生殖(hEG)细胞(Shambloft等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:13726,1998)。也可应用于本文提供的方法的是谱系定向干细胞，诸如中胚层干细胞和其它早期心源性细胞(参见Reyes等人,(2001)Blood 98:2615-2625；Eisenberg&Bader(1996)Circ Res.78(2):205-16；等等)。干细胞可以从任何哺乳动物物种获得，例如，人类、马科动物、牛科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠)、灵长类动物，等等。在一些实施方案中，对于用于本文公开的方法和组合物的多能细胞的来源，人类胚胎未曾被破坏。在一些实施方案中，对于用于本文公开的方法和组合物的多能细胞来源，人类胚胎不被破坏。
为了本公开内容的目的，可以从哺乳动物供体收获来自内皮、肌肉和/或神经干细胞的合适来源的细胞的混合物。合适的来源是造血微环境。例如，可以从受试者中移取循环外周血，优选动员的(例如，募集的)循环外周血。在实施方案中，干细胞可以是重编程干细胞，诸如衍生自体细胞或分化细胞的干细胞。在这样的实施方案中，去分化的干细胞可以是例如，但不限于赘生性细胞、肿瘤细胞和癌细胞，或者可选地为诱导重编程细胞，诸如诱导多能干细胞或iPS细胞。
在一些实施方案中，本文描述的胰腺α、β和/或δ细胞可以衍生自以下一种或更多种：毛状细胞(trichocyte)、角质形成细胞、促性腺激素细胞、促肾上腺皮质激素细胞、促甲状腺激素细胞、促生长激素细胞(somatotrope)、催乳素细胞、嗜铬细胞、滤泡旁细胞、球细胞、黑素细胞、痣细胞、梅克尔细胞、成牙本质细胞、成牙骨质细胞、角膜角质细胞、视网膜Muller细胞、视网膜色素上皮细胞、神经元、神经胶质(例如，少突胶质细胞、星形胶质细胞)、室管膜细胞、松果体细胞、肺细胞(例如，I型肺细胞和II型肺细胞)、克拉拉细胞、杯形细胞、G细胞、D细胞、ECL细胞、胃主细胞、壁细胞、小凹细胞(foveolar cell)、K细胞、D细胞、I细胞、杯形细胞、帕内特细胞、肠细胞、微褶细胞、肝细胞、肝星状细胞(例如，来自中胚层的Kupffer细胞)、胆囊细胞、泡心细胞、胰腺星状细胞、胰腺α细胞、胰腺β细胞、胰腺δ细胞、胰腺F细胞(例如，PP细胞)、胰腺ε细胞、甲状腺(例如，滤泡细胞)、甲状旁腺(例如，甲状旁腺主细胞)、嗜酸性细胞、尿道上皮细胞、成骨细胞、骨细胞、成软骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞、纤维细胞、成肌细胞、肌细胞、肌卫星细胞、腱细胞、心肌细胞、成脂肪细胞、脂肪细胞、cajal间质细胞、成血管细胞、内皮细胞、系膜细胞(例如，肾小球内系膜细胞和肾小球外系膜细胞)、肾小球旁细胞、致密斑细胞、基质细胞、间质细胞、特络细胞(telocyte)、简单上皮细胞、足细胞、肾近端小管刷状缘细胞、塞托利细胞、莱迪希细胞、颗粒细胞、栓细胞、生殖细胞、精子、卵子、淋巴细胞、髓样细胞、内皮祖细胞、内皮干细胞、成血管细胞、中胚层成血管细胞(mesoangioblast)、周细胞、壁细胞、脾细胞(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、树突细胞、小噬细胞、白细胞)、滋养层干细胞或其任何组合。
重编程
如本文使用的，术语“重编程”可以指改变或逆转体细胞的分化状态的过程。在重编程之前，该细胞可以是部分分化的或是终末分化的。重编程可以涵盖将体细胞的分化状态完全逆转为多能细胞。分化的这种完全逆转可以产生诱导多能(iPS)细胞。如本文使用的，重编程还可以包括细胞分化状态的部分逆转，例如逆转至多潜能状态，或者逆转至体细胞，体细胞既不多能也不多潜能，而是失去了其来源的分化细胞特征性的一个或更多个特定特性的细胞，例如分化细胞直接重编程为不同的体细胞类型。重编程可以涉及在随着合子发育为成体的细胞分化过程中发生的核酸修饰(例如，甲基化)、染色质凝聚、表观遗传变化、基因组印记等可遗传模式中至少一些的改变(例如，逆转)。
如本文使用的，术语“重编程因子”可以指与细胞“重编程”(即分化和/或去分化和/或转分化)相关的分子，使得细胞转化为不同的细胞类型或表型。重编程因子通常影响与细胞分化、去分化和/或转分化相关的基因的表达。转录因子是重编程因子的实例。
如本文使用的，术语“分化”及其语法等同物可以指特化程度较低的细胞(例如，具有较高细胞潜能的较初始(naive)的细胞)藉以变为特化程度较高的细胞类型(例如，具有较低细胞潜能的较不初始的细胞)的过程；并且术语“去分化”可以指特化程度较高的细胞变为特化程度较低的细胞类型(例如，具有较高细胞潜能的较初始的细胞)的过程；并且术语“转分化”是指特定细胞类型的细胞在不显著改变其“细胞潜能(cell potency)”或“初始”水平的情况下转化为另一种细胞类型的过程。不希望受理论的束缚，认为细胞在从一种谱系定型的细胞类型或终末分化的细胞类型转化为另一种谱系定型的细胞类型或终末分化的细胞类型时“转分化”，而没有显著改变其“细胞潜能”或“初始”水平。
如本文使用的，术语“细胞潜能”应理解为是指细胞分化为不同谱系的细胞的能力。例如，多能细胞(例如干细胞)具有分化为三种胚层(即内胚层(胃内壁、胃肠道、肺)、中胚层(肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖道)或外胚层(表皮组织和神经系统))中任何一种的潜能，并因此具有高细胞潜能；多潜能细胞(例如某种类型的干细胞或诱导型干细胞)具有产生多于一个但数量有限的谱系的细胞的能力(诸如造血干细胞、心脏干细胞或神经细胞)，相比多能细胞具有较低的细胞潜能。定型于特定谱系或终末分化的细胞可能具有较低的细胞潜能。本领域已知的转分化的特定实例包括例如，从胰腺外分泌细胞至β细胞的转化等。
因此，可以使细胞分化为更初始的细胞(例如，可以使终末分化的细胞分化为多潜能或多能的)；或者可以使该细胞去分化为较不初始的细胞(例如，可以使多潜能或多能细胞分化为谱系定型细胞或终末分化细胞)。然而，在实施方案中，可以使细胞从一种细胞类型(或表型)转化或转分化为例如具有相似的细胞潜能水平的另一种细胞类型(或表型)。因此，在本公开内容的实施方案中，本公开内容的诱导步骤可以将本公开内容的细胞重编程以分化、去分化和/或转分化。在本公开内容的实施方案中，本公开内容的诱导步骤可以将细胞重编程以进行转分化。
重编程或诱导特定类型的细胞成为另一类型的细胞的方法，例如，通过使用一种或更多种外源多核苷酸或多肽重编程因子进行分化、去分化和/或转分化，是本领域技术人员已知的。这样的方法可依赖于引入编码一种或更多种转录因子或与细胞重编程相关的其他多肽的遗传物质。例如，已知PDX1、Ngn3和MafA或其功能片段编码可以诱导本公开内容细胞的细胞分化、去分化和/或转分化的肽。在本领域技术人员已知的一些方法中，使由重编程基因(诸如上述基因)编码的外源多肽(例如重组多肽)与细胞接触，以诱导例如本公开内容的细胞。本领域技术人员将理解，其他基因也可能与细胞的重编程有关，并且编码这些基因(或其功能片段)的外源分子和所编码的多肽也被认为是多核苷酸或多肽重编程因子(例如多核苷酸或多肽继而影响与细胞重编程相关的另一个基因的表达水平)。例如，已经显示，减少p53失活的外源性多核苷酸或多肽表观遗传基因沉默子的引入提高了诱导诱导多能干细胞(iPSC)的效率。因此，编码表观遗传沉默子和可以直接或间接参与细胞重编程或提高细胞编程效率的其他基因或蛋白质的外源性多核苷酸或多肽将被认为构成外源性多核苷酸或多肽重编程因子。本领域技术人员将理解，存在其他影响细胞重编程的方法，诸如引入RNAi分子(或编码RNAi分子的遗传物质)，可以敲低参与抑制细胞重编程的基因的表达。因此，任何与细胞重编程有关或增强细胞重编程的外源性多核苷酸分子或多肽分子应被理解为本文描述的外源性多核苷酸或多肽重编程因子。
相应地，在实施方案中，本公开内容不涉及使用一种或更多种外源性多核苷酸或多肽重编程因子的细胞培养步骤。相应地，在实施方案中，本公开内容的方法不涉及例如通过引入转座子、病毒转基因载体(诸如逆转录病毒载体)、质粒、mRNA、miRNA、肽或任何这些分子的片段(其涉及产生诱导α、β和/或δ细胞，或以其他方式诱导本公开内容的细胞分化、去分化和/或转分化)而引入一种或更多种外源性多核苷酸或多肽重编程因子。
也就是说，在一种实施方案中，该方法在不存在一种或更多种外源多核苷酸或多肽重编程因子(例如，激活素A)的情况下发生。因此，应当理解，在实施方案中，本公开内容的方法利用小分子来对细胞重编程，而不添加多肽转录因子；与诱导分化、去分化和/或转分化特异性相关的其他多肽因子；编码多肽转录因子的多核苷酸序列，编码与诱导分化、去分化和/或转分化特异性相关的其他多肽因子的多核苷酸序列；mRNA；干扰RNA；微小RNA及其片段。
产生干细胞衍生的胰岛细胞的方法
本文提供了产生SC-胰岛细胞(例如，非天然胰腺β细胞)的方法。从干细胞产生内分泌细胞以提供至少一种SC-胰岛细胞(例如SC-β细胞)的详细方案的实例描述于美国专利申请公布第US20150240212号、第US20150218522号、第US20210198632号和第US20220090020号、PCT公布WO2022/147056和WO2022192300以及美国专利第11,466,256号中，其中的每一项通过引用以其整体并入本文。
内胚层可以形成消化道和呼吸道、甲状腺、肝和胰腺。内胚层谱系的代表性疾病是由产生胰岛素的β细胞的破坏引起的1型糖尿病。由人类多能干细胞(hPSC)体外产生功能性β细胞可能是用于1型糖尿病的置换细胞治疗的实用的、可再生细胞来源。由胚泡期胚胎的内细胞团产生的胚胎干(ES)细胞代表了用于任何受损细胞的移植或基于细胞的治疗的有希望的细胞来源。它们可以在培养物中维持、自我更新、并作为未分化的ES细胞无限增殖。ES细胞能够分化为体内的所有细胞类型，如外胚层、中胚层和内胚层谱系细胞或组织。ES细胞的主要益处是在培养物中稳定的自我更新和分化潜力。
可以通过胚胎发生的原肠胚形成过程从内细胞团体内产生定形内胚层，其中上胚层细胞被指示形成三个胚层。定形内胚层可以产生不同的细胞和组织，这些细胞和组织对重要器官如胰腺β细胞、肝细胞、肺泡细胞、甲状腺、胸腺以及消化道和呼吸道的上皮内膜有贡献。它不同于胚外组织的原始内胚层，后者可以形成脏壁内胚层和腔壁内胚层。源自ES细胞的定形内胚层理论上能够成为任何内胚层衍生物，并且指导ES细胞成为内胚层谱系是产生治疗性内胚层衍生物的先决条件。
定形内胚层的前后轴的精确模式最终可以形成原始肠管。定形内胚层来源的原始肠管沿前后轴诱导咽、食道、胃、十二指肠、小肠和大肠以及相关器官，包括胰腺、肺、甲状腺、胸腺、甲状旁腺和肝。原始肠管前肠的前部变为肺、甲状腺、食道和胃。胰腺、肝和十二指肠起源于前肠的后部。原始肠管的中肠和后肠产生小肠和大肠。前肠前部表达发育标志物NK2同源框1(NKX2-1)和SRY(性别决定区Y)-框2(SOX2)；前肠后部表达造血表达的同源框(HHEX)、胰腺和十二指肠同源框1(PDX1)、一个切割的同源框1(ONECUT1，称为HNF6)和肝细胞核因子4α(HNF4A)；以及中肠/后肠表达尾型同源框1(CDX1)、尾型同源框2(CDX2)以及运动神经元和胰腺同源框1(MNX1)(3,19,20)。
成功分化为胰腺α、β和/或δ细胞可以涉及分化的细胞合成并分泌生理上适当量的胰岛素。已开发出指导hPSC细胞分化的示例性分步方案，其需要重演正常胰腺内分泌发育主要阶段的分化过程。hPSC细胞向表达激素的胰腺内分泌细胞的分化是通过使hPSC细胞转变通过胚胎发育的主要阶段进行的；分化为中胚层和定形内胚层，建立原始肠内胚层、前肠后部模式化，以及胰腺内胚层和内分泌前体的特化和成熟化。通过这些阶段，hPSC细胞可以获得胰腺内分泌表型和体外葡萄糖响应性胰岛素分泌能力。
通常，至少一种胰腺α、β和/或δ细胞或其前体，例如，根据本文公开的方法产生的胰腺祖细胞可以包含不同细胞的混合物或组合，例如，细胞诸如PDX1阳性胰腺祖细胞、共表达PDX1和NKX6-1的胰腺祖细胞、Ngn3阳性内分泌祖细胞、胰岛素阳性内分泌细胞(例如，NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞或β样细胞)和/或其他多能细胞或干细胞的混合物。
可以根据任何合适的培养方案来产生至少一种胰腺α、β和/或δ细胞或其前体，以使干细胞或多能细胞分化为期望的分化阶段。在一些实施方案中，通过在适合于使至少一种多能细胞分化为至少一种胰腺α、β和/或δ细胞或其前体的条件下将至少一种多能细胞培养一段时间来产生至少一种胰腺α、β和/或δ细胞或其前体。
在一些实施方案中，至少一种胰腺α、β和/或δ细胞或其前体是基本上纯的胰腺α、β和/或δ细胞或其前体的群体。在一些实施方案中，胰腺α、β和/或δ细胞或其前体的群体包含多能细胞或分化的细胞的混合物。在一些实施方案中，胰腺α、β和/或δ细胞或其前体的群体基本上不含或缺少胚胎干细胞或多能细胞或iPS细胞。
在一些实施方案中，可以例如以组织活检(例如皮肤活检)从受试者分离体细胞，例如成纤维细胞，并重编程为诱导多能干细胞，以进一步分化从而产生用于本文描述的组合物和方法中的至少一种SC-β细胞或其前体。在一些实施方案中，通过本领域普通技术人员已知的方法将体细胞(例如成纤维细胞)维持在培养物中，并且在一些实施方案中，在通过本文公开的方法将其转化为胰腺α、β和/或δ细胞之前进行增殖。
在一些实施方案中，通过本领域普通技术人员已知的方法将至少一种胰腺α、β和/或δ细胞或其前体维持在培养物中，并且在一些实施方案中，在通过本文公开的方法将其转化为胰腺α、β和/或δ细胞之前进行增殖。
此外，至少一种胰腺α、β和/或δ细胞或其前体(例如胰腺祖细胞)可以来自任何哺乳动物物种，非限制性实例包括鼠科动物、牛科动物、猿、猪科动物、马科动物、绵羊或人类细胞。为了清楚和简单起见，本文方法的描述是指哺乳动物的至少一种胰腺α、β和/或δ细胞或其前体，但是应当理解，本文描述的所有方法可以容易地应用于至少一种胰腺α、β和/或δ细胞或其前体的其他细胞类型。在一些实施方案中，至少一种胰腺α、β和/或δ细胞或其前体源自人类个体。
分化阶段
在一些实施方案中，本文公开的胰腺分化以逐步方式进行。在逐步进展中，“阶段1”或“S1”是指分化过程中的第一步，即多能干细胞分化成表达定形内胚层细胞特征性标志物的细胞(“DE”、“阶段1细胞”或“S1细胞”)。“阶段2”是指第二步，即表达定形内胚层细胞的特征性标志物的细胞分化为表达肠管细胞的特征性标志物的细胞(“GT”、“阶段2细胞”或“S2细胞”)。“阶段3”是指第三步，即表达肠管细胞的特征性标志物的细胞分化为表达胰腺祖细胞1细胞(pancreatic progenitor 1cells)的特征性标志物的细胞(“PP1”、“阶段3细胞”或“S3细胞”)。“阶段4”是指第四步，即表达胰腺祖细胞1细胞的特征性标志物的细胞分化为表达胰腺祖细胞2细胞(pancreatic progenitor 2cells)的特征性标志物的细胞(“PP2”、“阶段4细胞”或“S4细胞”)。“阶段5”是指第五步，即表达胰腺祖细胞2细胞的特征性标志物的细胞(例如，PDX.1+、NKX6.1+)分化为表达胰腺内胚层细胞和/或胰腺内分泌祖细胞的特征性标志物的细胞(例如，胰岛素+)(“EN”、“阶段5细胞”或“S5细胞”)。“阶段6”是指表达胰腺内分泌祖细胞的特征性标志物(例如，胰岛素)的细胞分化为表达胰腺内分泌β细胞(“SC-β细胞”)或胰腺内分泌α细胞(“SC-α细胞”)的特征性标志物的细胞。然而，应该理解的是，并非特定群体中的所有细胞都以相同的速度通过这些阶段，即，一些细胞可能比群体中存在的大多数细胞在分化途径上进展得更少或更多。例如，在一些实施方案中，可以在阶段5期间、阶段5结束时、阶段6开始时等鉴定SC-β细胞。制备阶段1-6中任一个的细胞的方法的实例提供于例如，美国专利第10,030,229号；美国专利第10,443,042号；美国专利第11,466,256号，公布的申请US20200332262、US20150240212、US20150218522、US20210198632和US20220090020；以及PCT公布WO2022/147056和WO2022192300，其中的每一个通过引用以其整体并入。
定形内胚层细胞
本公开内容的方面涉及定形内胚层细胞。本文中使用的定形内胚层细胞可以衍生自任何来源或根据任何合适的方案产生。在一些方面，多能干细胞(例如，iPSC或hESC)分化为内胚层细胞。在一些方面，内胚层细胞(阶段1)进一步分化为例如，原始肠管细胞(阶段2)、PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞(阶段3)、NKX6.1阳性胰腺祖细胞(阶段4)或者Ngn3阳性内分泌祖细胞或胰岛素阳性内分泌细胞(阶段5)，随后诱导或成熟为SC-β细胞(阶段6)。
在一些情况下，定形内胚层细胞可以通过使群体中的至少一些多能细胞分化为定形内胚层细胞来获得，例如，通过使多能细胞群体与i)至少一种来自TGF-β超家族的生长因子和ii)WNT信号通路激活剂接触，以诱导至少一些多能细胞分化为定形内胚层细胞，其中定形内胚层细胞表达至少一种定形内胚层特征性的标志物。
可以在本文提供的方法中使用任何能够诱导多能干细胞分化为定形内胚层细胞的来自TGF-β超家族的生长因子(例如，单独地或与WNT信号通路激活剂组合)。在一些情况下，来自TGF-β超家族的生长因子包含激活素A。在一些情况下，来自TGF-β超家族的生长因子包含生长分化因子8(GDF8)。可以在本文提供的方法中使用任何能够诱导多能干细胞分化为定形内胚层细胞的WNT信号通路激活剂(例如，单独地或与来自TGF-β超家族的生长因子组合)。在一些情况下，WNT信号通路激活剂包括CHIR99021、3F8、A1070722、AR-A014418、BIO、BIO-丙酮肟、FRATide、10Z-Hymenialdisine、靛玉红-3’-肟、kenpaullone、L803、L803-mts、碳酸锂、NSC 693868、SB 216763、SB 415286、TC-G 24、TCS2002、TCS21311或TWS119。在一些实施方案中，WNT信号通路激活剂包括CHIR99021。在一些情况下，WNT信号通路激活剂包括Wnt3a重组蛋白。
在一些情况下，通过使多能细胞群体与i)激活素A和ii)CHIR99021接触合适的时间段，例如，约2天、约3天、约4天或约5天以诱导群体中的至少一些多能细胞分化为定形内胚层细胞的过程，实现群体中的至少一些多能细胞分化为定形内胚层细胞，其中定形内胚层细胞表达至少一种定形内胚层特征性的标志物。在一些实施方案中，使多能细胞群体与来自TGF-β超家族(例如，激活素A)和WNT信号通路激活剂(例如，CHIR99021)的生长因子接触1天、2天或3天(例如，1天)，并且在不存在WNT信号通路激活剂(例如，CHIR99021)的情况下，使多能细胞群体进一步与TGF-β超家族(例如，激活素A)接触1天、2天、3天或4天(例如，2天)。
在一些实例中，该方法包括通过使多能细胞群体与合适浓度，诸如约10ng/mL、约20ng/mL、约50ng/mL、约75ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约95ng/mL、约100ng/mL、约110ng/mL、约120ng/mL、约130ng/mL、约140ng/mL、约150ng/mL、约175ng/mL、约180ng/mL、约200ng/mL、约250ng/mL或约300ng/mL的来自TGF-β超家族的生长因子(例如，激活素A)接触，使多能细胞分化为定形内胚层细胞。在一些情况下，该方法包括使用约100ng/mL的激活素A使多能细胞分化为定形内胚层细胞。在一些情况下，该方法包括使用约200ng/mL的激活素A使多能细胞分化为定形内胚层细胞。
在一些实例中，该方法包括通过使多能细胞群体与合适浓度，诸如约0.01μM、约0.05μM、约0.1μM、约0.2μM、约0.5μM、约0.8μM、约1μM、约1.5μM、约2μM、约2.5μM、约3μM、约3.5μM、约4μM、约5μM、约8μM、约10μM、约12μM、约15μM、约20μM、约30μM、约50μM、约100μM或约200μM的WNT信号通路激活剂(例如，CHIR99021)接触，使多能细胞分化为定形内胚层细胞。在一些情况下，该方法包括使用约2μM的CHIR99021使多能细胞分化为定形内胚层细胞。在一些情况下，该方法包括使用约5μM的CHIR99021使多能细胞分化为定形内胚层细胞。
在一些情况下，通过如本文公开的方法产生的定形内胚层细胞表达至少一种选自由以下组成的组的标志物：Nodal、Tmprss2、Tmem30b、St14、Spink3、Sh3gl2、Ripk4、Rab1S、Npnt、Clic6、Cldn5、Cacna1b、Bnip1、Anxa4、Emb、FoxA1、Sox17和Rbm35a，其中至少一种标志物的表达在定形内胚层细胞中相对于其来源的多能干细胞是统计学显著量上调的。在一些情况下，通过如本文公开的方法产生的定形内胚层细胞相对于其来源的多能干细胞不表达统计学显著量的选自由以下组成的组的至少一种标志物：Gata4、SPARC、AFP和Dab2。在一些情况下，通过如本文公开的方法产生的定形内胚层细胞相对于其来源的多能干细胞不表达统计学显著量的选自由以下组成的组的至少一种标志物：Zic1、Pax6、Flk1和CD31。在一些情况下，通过如本文公开的方法产生的定形内胚层细胞相对于其来源的多能干细胞具有统计上显著量的较高水平的Smad2磷酸化。在一些情况下，通过如本文公开的方法产生的定形内胚层细胞具有在体内形成肠管的能力。在一些情况下，通过如本文公开的方法产生的定形内胚层细胞可以分化为具有肠细胞特征性的形态的细胞，并且其中具有肠细胞特征性的形态的细胞表达FoxA2和/或Claudin6。在一些情况下，通过如本文公开的方法产生的定形内胚层细胞可以进一步分化为内胚层起源的细胞。
在一些情况下，在任何分化之前或在分化的第一阶段期间，在存在至少一种β细胞分化因子的情况下培养多能干细胞群体。人们可以使用任何多能干细胞，诸如人类多能干细胞，或人类iPS细胞或本文讨论的任何多能干细胞或其他合适的多能干细胞。在一些情况下，如本文描述的β细胞分化因子可以存在于多能干细胞群体的培养基中，或者可以在多能干细胞群体的生长(例如，复制或增殖)期间以团注或定期添加。在某些实例中，多能干细胞群体可以在任何分化之前暴露于至少一种β细胞分化因子。在其他实例中，多能干细胞群体可以在分化的第一阶段期间暴露于至少一种β细胞分化因子。
原始肠管细胞
本公开内容的方面涉及原始肠管细胞。本文使用的原始肠管细胞可以衍生自任何来源或者根据任何合适的方案产生。在一些方面，定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞。在一些方面，原始肠管细胞进一步分化为例如，PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞、NKX6.1阳性胰腺祖细胞、Ngn3阳性内分泌祖细胞、胰岛素阳性内分泌细胞，随后被诱导或成熟为SC-β细胞。
在一些情况下，原始肠管细胞可以通过使群体中的定形内胚层细胞中的至少一些分化为原始肠管细胞来获得，例如，通过使定形内胚层细胞与至少一种来自成纤维细胞生长因子(FGF)家族的生长因子接触，以诱导定形内胚层细胞中的至少一些分化为原始肠管细胞，其中原始肠管细胞表达至少一种原始肠管细胞特征性的标志物。
可以在本文提供的方法中使用任何能够诱导定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞的来自FGF家族的生长因子(例如，单独地或与其他因子组合)。在一些情况下，至少一种来自FGF家族的生长因子包括角质形成细胞生长因子(KGF)。在一些情况下，至少一种来自FGF家族的生长因子包括FGF2。在一些情况下，至少一种来自FGF家族的生长因子包括FGF8B。在一些情况下，至少一种来自FGF家族的生长因子包括FGF10。在一些情况下，至少一种来自FGF家族的生长因子包括FGF21。
在一些情况下，原始肠管细胞可以通过使群体中的至少一些定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞来获得，例如，通过使定形内胚层细胞与KGF接触一段时间，例如，约1天、约2天、约3天、约4天或约5天，以诱导定形内胚层细胞中的至少一些分化为原始肠管细胞。
在一些情况下，该方法包括通过使定形内胚层细胞与合适浓度，诸如约10ng/mL、约20ng/mL、约50ng/mL、约75ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约95ng/mL、约100ng/mL、约110ng/mL、约120ng/mL、约130ng/mL、约140ng/mL、约150ng/mL、约175ng/mL、约180ng/mL、约200ng/mL、约250ng/mL或约300ng/mL的来自FGF家族的生长因子(例如，KGF)接触，使定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞。在一些情况下，该方法包括使用约50ng/mL的KGF使定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞。在一些情况下，该方法包括使用约100ng/mL的KGF使定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞。
PDX1阳性胰腺祖细胞
本公开内容的方面涉及PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞。本文使用的PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞可以衍生自任何来源或者根据任何合适的方案产生。在一些方面，原始肠管细胞分化为PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞。在一些方面，PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞进一步分化为例如，NKX6.1阳性胰腺祖细胞、Ngn3阳性内分泌祖细胞、胰岛素阳性内分泌细胞，随后被诱导或成熟为胰腺α、β和/或δ细胞。
在一些方面，PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞可以通过使群体中的至少一些原始肠管细胞分化为PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞来获得，例如，通过使原始肠管细胞与以下接触：i)至少一种BMP信号通路抑制剂、ii)来自TGF-β超家族的生长因子、iii)至少一种来自FGF家族的生长因子、iv)至少一种SHH通路抑制剂、v)至少一种视黄酸(RA)信号通路激活剂、vi)至少一种蛋白激酶C激活剂以及vii)ROCK抑制剂，以诱导至少一些原始肠管细胞分化为PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞，其中该PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞表达PDX1。
在一些方面，PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞可以通过使群体中的至少一些原始肠管细胞分化为PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞来获得，例如，通过使原始肠管细胞与以下接触：i)至少一种BMP信号通路抑制剂、ii)来自TGF-β超家族的生长因子、iii)至少一种来自FGF家族的生长因子、iv)至少一种SHH通路抑制剂、v)至少一种视黄酸(RA)信号通路激活剂以及vi)至少一种蛋白激酶C激活剂，以诱导至少一些原始肠管细胞分化为PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞，其中该PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞表达PDX1。
在一些情况下，PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞可以通过使群体中的至少一些原始肠管细胞分化为PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞来获得，例如，通过使原始肠管细胞与以下接触：i)至少一种BMP信号通路抑制剂、ii)至少一种来自FGF家族的生长因子、iii)至少一种SHH通路抑制剂、iv)至少一种视黄酸(RA)信号通路激活剂以及v)至少一种蛋白激酶C激活剂，以诱导至少一些原始肠管细胞分化为PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞，其中该PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞表达PDX1。
在一些情况下，PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞可以通过使群体中的至少一些原始肠管细胞分化为PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞来获得，例如，通过使原始肠管细胞与以下接触：i)至少一种SHH通路抑制剂、ii)至少一种视黄酸(RA)信号通路激活剂以及iii)至少一种蛋白激酶C激活剂，其中该PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞表达PDX1。
在一些情况下，PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞可以通过使群体中的至少一些原始肠管细胞分化为PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞来获得，例如，通过使原始肠管细胞与以下接触：i)至少一种来自FGF家族的生长因子和ii)至少一种视黄酸(RA)信号通路激活剂，以诱导至少一些原始肠管细胞分化为PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞，其中该PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞表达PDX1。
可以在本文提供的方法中使用任何能够诱导原始肠管细胞分化为PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞的BMP信号通路抑制剂(例如，单独地，或与来自TGF-β超家族的生长因子、至少一种来自FGF家族的生长因子、至少一种SHH通路抑制剂、至少一种视黄酸信号通路激活剂、至少一种蛋白激酶C激活剂和ROCK抑制剂进行任何组合)。在一些情况下，BMP信号通路抑制剂包括LDN193189或DMH-1。在一些实例中，该方法包括使原始肠管细胞与一定浓度，诸如约30nM、约40nM、约50nM、约60nM、约70nM、约80nM、约90nM、约100nM、约110nM、约120nM、约130nM、约140nM、约150nM、约160nM、约170nM、约180nM、约190nM、约200nM、约210nM、约220nM、约230nM、约240nM、约250nM、约280nM、约300nM、约400nM、约500nM或约1μM的BMP信号通路抑制剂(例如，LDN1931189)接触。在一些实例中，该方法包括使原始肠管细胞与一定浓度，诸如约0.01μM、约0.02μM、约0.05μM、约0.1μM、约0.2μM、约0.5μM、约0.8μM、约1μM、约1.2μM、约1.5μM、约1.75μM、约2μM、约2.2μM、约2.5μM、约2.75μM、约3μM、约3.25μM、约3.5μM、约3.75μM、约4μM、约4.5μM、约5μM、约8μM、约10μM、约15μM、约20μM、约30μM、约40μM、约50μM或约100μM的BMP信号通路抑制剂(例如，DMH-1)接触。
可以使用任何能够诱导原始肠管细胞分化为PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞的来自TGF-β超家族的生长因子(例如，单独地，或与至少一种BMP信号通路抑制剂、来自FGF家族的生长因子、至少一种SHH通路抑制剂、至少一种视黄酸信号通路激活剂、至少一种蛋白激酶C激活剂和ROCK抑制剂进行任何组合)。在一些情况下，来自TGF-β家族的生长因子包含激活素A。在一些情况下，来自TGF-β家族的生长因子包含激活素A或GDF8。在一些实例中，该方法包括使原始肠管细胞与一定浓度，诸如约5ng/mL、约7.5ng/mL、约8ng/mL、约9ng/mL、约10ng/mL、约11ng/mL、约12ng/mL、约13ng/mL、约14ng/mL、约15ng/mL、约16ng/mL、约17ng/mL、约18ng/mL、约19ng/mL、约20ng/mL、约21ng/mL、约22ng/mL、约23ng/mL、约24ng/mL、约25ng/mL、约26ng/mL、约27ng/mL、约28ng/mL、约29ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL或约100ng/mL的来自TGF-β超家族的生长因子(例如，激活素A)接触。
可以使用任何能够诱导原始肠管细胞分化为PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞的来自FGF家族的生长因子(例如，单独地，或与至少一种BMP信号通路抑制剂、来自TGF-β超家族的生长因子、至少一种SHH通路抑制剂、至少一种视黄酸信号通路激活剂、至少一种蛋白激酶C激活剂和ROCK抑制剂进行任何组合)。在一些情况下，至少一种来自FGF家族的生长因子包括角质形成细胞生长因子(KGF)。在一些情况下，至少一种来自FGF家族的生长因子选自由以下组成的组：FGF2、FGF8B、FGF 10和FGF21。在一些实例中，该方法包括使原始肠管细胞与一定浓度，诸如约10ng/mL、约20ng/mL、约50ng/mL、约75ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约95ng/mL、约100ng/mL、约110ng/mL、约120ng/mL、约130ng/mL、约140ng/mL、约150ng/mL、约175ng/mL、约180ng/mL、约200ng/mL、约250ng/mL或约300ng/mL的来自FGF家族的生长因子(例如，KGF)接触。在一些实例中，该方法包括使原始肠管细胞与一定浓度，诸如10ng/mL-200ng/mL、10ng/mL-150ng/mL、10ng/mL-100ng/mL、25ng/mL-75ng/mL、40ng/mL-60ng/mL或45ng/mL-55ng/mL的来自FGF家族的生长因子(例如，KGF)接触。
可以使用任何能够诱导原始肠管细胞分化为PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞的SHH通路抑制剂(例如，单独地，或与至少一种BMP信号通路抑制剂、至少一种来自FGF家族的生长因子、来自TGF-β超家族的生长因子、至少一种视黄酸信号通路激活剂、至少一种蛋白激酶C激活剂和ROCK抑制剂进行任何组合)。在一些情况下，SHH通路抑制剂包括Sant1。在一些实例中，该方法包括使原始肠管细胞与一定浓度，诸如约0.001μM、约0.002μM、约0.005μM、约0.01μM、约0.02μM、约0.03μM、约0.05μM、约0.08μM、约0.1μM、约0.12μM、约0.13μM、约0.14μM、约0.15μM、约0.16μM、约0.17μM、约0.18μM、约0.19μM、约0.2μM、约0.21μM、约0.22μM、约0.23μM、约0.24μM、约0.25μM、约0.26μM、约0.27μM、约0.28μM、约0.29μM、约0.3μM、约0.31μM、约0.32μM、约0.33μM、约0.34μM、约0.35μM、约0.4μM、约0.45μM、约0.5μM、约0.6μM、约0.8μM、约1μM、约2μM或约5μM的SHH通路抑制剂(例如，Sant1)接触。在一些实例中，该方法包括使原始肠管细胞与一定浓度，诸如50nM-1000nM、50nM-500nM、50nM-300nM、100nM-300nM、200nM-300nM、200nM-500nM或225nM-275nM的SHH通路抑制剂(例如，Sant1)接触。
可以使用任何能够诱导原始肠管细胞分化为PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞的RA信号通路激活剂(例如，单独地，或与至少一种BMP信号通路抑制剂、至少一种来自FGF家族的生长因子、至少一种SHH通路抑制剂、至少一种蛋白激酶C激活剂和ROCK抑制剂进行任何组合)。在一些情况下，RA信号通路激活剂包括视黄酸。在一些实例中，该方法包括使原始肠管细胞与一定浓度，诸如约0.02μM、约0.1μM、约0.2μM、约0.25μM、约0.3μM、约0.4μM、约0.45μM、约0.5μM、约0.55μM、约0.6μM、约0.65μM、约0.7μM、约0.75μM、约0.8μM、约0.85μM、约0.9μM、约1μM、约1.1μM、约1.2μM、约1.3μM、约1.4μM、约1.5μM、约1.6μM、约1.7μM、约1.8μM、约1.9μM、约2μM、约2.1μM、约2.2μM、约2.3μM、约2.4μM、约2.5μM、约2.6μM、约2.7μM、约2.8μM、约3μM、约3.2μM、约3.4μM、约3.6μM、约3.8μM、约4μM、约4.2μM、约4.4μM、约4.6μM、约4.8μM、约5μM、约5.5μM、约6μM、约6.5μM、约7μM、约7.5μM、约8μM、约8.5μM、约9μM、约9.5μM、约10μM、约12μM、约14μM、约15μM、约16μM、约18μM、约20μM、约50μM或约100μM的RA信号通路激活剂(例如，视黄酸)接触。在一些实例中，该方法包括使原始肠管细胞与一定浓度，诸如0.2μM-5μM、0.8μM-3μM、0.8μM-2.5μM、1μM-2.5μM、1.5μM-2.5μM、1.8μM-2.2μM或1.9μM-2.1μM的RA信号通路激活剂(例如，视黄酸)接触。
可以使用任何能够诱导原始肠管细胞分化为PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞的PKC激活剂(例如，单独地，或与至少一种BMP信号通路抑制剂、至少一种来自FGF家族的生长因子、至少一种SHH通路抑制剂、至少一种RA信号通路激活剂和ROCK抑制剂进行任何组合)。在一些情况下，PKC激活剂包括PdBU。在一些情况下，PKC激活剂包括TPPB。在一些实例中，该方法包括使原始肠管细胞与一定浓度，诸如约10nM、50nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM、500nM、550nM、600nM、650nM、700nM、750nM、800nM、850nM、900nM、950nM、1μM、10μM、约20μM、约50μM、约75μM、约80μM、约100μM、约120μM、约140μM、约150μM、约175μM、约180μM、约200μM、约210μM、约220μM、约240μM、约250μM、约260μM、约280μM、约300μM、约320μM、约340μM、约360μM、约380μM、约400μM、约420μM、约440μM、约460μM、约480μM、约500μM、约520μM、约540μM、约560μM、约580μM、约600μM、约620μM、约640μM、约660μM、约680μM、约700μM、约750μM、约800μM、约850μM、约900μM、约1mM、约2mM、约3mM、约4mM或约5mM的PKC激活剂(例如，PdBU或TPPB)接触。在一些实施方案中，该方法包括使原始肠管细胞与10nM-1mM、10nM-500μM、10nM-1μM、10nM-800nM、100nM-900nM、300nM-800nM、300nM-600nM、400nM-600nM、450nM-550nM或约500nM的浓度的PKC激活剂(例如，PdBU或TPPB)接触。在一些实施方案中，未用PKC激活剂(例如，PDBU)处理原始肠管细胞。
可以使用任何能够诱导原始肠管细胞分化为PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞的ROCK抑制剂(例如，单独地，或与至少一种BMP信号通路抑制剂、至少一种来自FGF家族的生长因子、至少一种SHH通路抑制剂、PKC激活剂和至少一种RA信号通路激活剂进行任何组合)。在一些情况下，ROCK抑制剂包括Thiazovivin、Y-27632、法舒地尔/HA1077或H-1152。在一些情况下，ROCK抑制剂包括Y-27632。在一些情况下，ROCK抑制剂包括Thiazovivin。在一些实例中，该方法包括使原始肠管细胞与一定浓度，诸如约0.2μM、约0.5μM、约0.75μM、约1μM、约2μM、约3μM、约4μM、约5μM、约6μM、约7μM、约7.5μM、约8μM、约9μM、约10μM、约11μM、约12μM、约13μM、约14μM、约15μM、约16μM、约17μM、约18μM、约19μM、约20μM、约21μM、约22μM、约23μM、约24μM、约25μM、约26μM、约27μM、约28μM、约29μM、约30μM、约35μM、约40μM、约50μM或约100μM的ROCK抑制剂(例如，Y-27632或Thiazovivin)接触。在一些实例中，该方法包括使原始肠管细胞与一定浓度，诸如0.2μM-5μM、0.8μM-3μM、1μM-4μM、1.5μM-4μM、1.8μM-3.5μM、2μM-3μM、2.4μM-2.6μM的ROCK抑制剂(例如，Y-27632或Thiazovivin)接触。
在一些情况下，PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞可以通过使群体中的至少一些原始肠管细胞分化为PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞来获得，例如，通过使原始肠管细胞与视黄酸、KGF、Sant1、DMH-1、PdBU、Thiazovivin和激活素A接触合适的时间段，例如，约1天、约2天、约3天或约4天。在一些情况下，PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞可以通过使群体中的至少一些原始肠管细胞分化为PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞来获得，例如，通过使原始肠管细胞与视黄酸、KGF、Sant1、DMH-1、PdBU、Thiazovivin和激活素A接触约2天。
在一些实施方案中，PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞可以通过使群体中的至少一些原始肠管细胞分化为PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞来获得，例如通过使原始肠管细胞与i)至少一种BMP信号通路抑制剂(例如，DMH-1)、ii)来自TGF-β超家族的生长因子(例如，激活素A)、iii)至少一种来自FGF家族的生长因子(例如，KGF)、iv)至少一种SHH通路抑制剂(例如，Sant1)、v)至少一种视黄酸(RA)信号通路激活剂(例如，视黄酸)；vi)至少一种蛋白激酶C活化剂(例如，PDBU)，和vii)至少一种ROCK抑制剂(例如，thiazovivin)接触1天、2天、3天、4天或5天(例如，1天)，并且然后在不存在BMP信号通路抑制剂(例如，DMH-1)的情况下与i)来自TGF-β超家族的生长因子(例如，激活素A)、ii)至少一种来自FGF家族的生长因子(例如，KGF)、iii)至少一种SHH通路抑制剂(例如，Sant1)、iv)至少一种视黄酸(RA)信号通路活化剂(例如，视黄酸)；v)至少一种蛋白激酶C活化剂(例如，PDBU)和vi)至少一种ROCK抑制剂(例如，thiazovivin)接触1天、2天、3天、4天或5天(例如，1天)。
NKX6.1阳性胰腺祖细胞
本公开内容的方面涉及PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞。本文使用的PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞可以衍生自任何来源或者根据任何合适的方案产生。在一些方面，PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞分化为PDX-1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞。在一些方面，PDX-1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞进一步分化为，例如，Ngn3阳性内分泌祖细胞或胰岛素阳性内分泌细胞，随后被诱导或成熟为SC-β细胞。
在一些方面，从PDX-1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞产生PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的方法包括使包含PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞的细胞群体(例如，在促进细胞簇集和/或促进细胞存活的条件下)与包含以下的至少两种β细胞分化因子接触：a)至少一种来自成纤维细胞生长因子(FGF)家族的生长因子，b)音猬信号通路抑制剂，和任选地c)视黄酸(RA)信号通路激活剂，以诱导群体中至少一个PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞分化为PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞，其中PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞表达NKX6.1。
在一些情况下，PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞通过使PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞与以下接触来获得：i)至少一种来自FGF家族的生长因子、ii)至少一种SHH通路抑制剂以及任选地iii)RA信号通路激活剂，以诱导PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞中的至少一些分化为PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞，其中该PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞表达PDX1和NKX6.1。
在一些情况下，PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞通过使PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞与以下接触来获得：i)至少一种来自FGF家族的生长因子、ii)至少一种SHH通路抑制剂、以及任选地iii)RA信号通路激活剂、iv)ROCK抑制剂和v)至少一种来自TGF-β超家族的生长因子，以诱导PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞中的至少一些分化为PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞。在一些实施方案中，PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞通过使PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞与以下接触3天、4天或5天来获得：i)至少一种来自FGF家族的生长因子、ii)至少一种SHH通路抑制剂、和任选地iii)RA信号通路激活剂、iv)ROCK抑制剂和v)至少一种来自TGF-β超家族的生长因子；然后使细胞与以下接触：i)至少一种来自FGF家族的生长因子、ii)至少一种SHH通路抑制剂、和任选地iii)RA信号通路激活剂、iv)ROCK抑制剂、和v)至少一种来自TGF-β超家族的生长因子、以及vi)PKC激活剂和任选地γ-分泌酶抑制剂。在一些情况下，PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞通过使PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞与来自FGF家族的至少一种生长因子接触而获得。在一些情况下，来自FGF家族的生长因子是KGF
可以在本文提供的方法中使用任何能够诱导PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞分化为PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的来自FGF家族的生长因子(例如，单独地，或与至少一种SHH通路抑制剂、ROCK抑制剂、来自TGF-β超家族的生长因子和至少一种视黄酸信号通路激活剂进行任何组合)。在一些情况下，至少一种来自FGF家族的生长因子包括角质形成细胞生长因子(KGF)。在一些情况下，至少一种来自FGF家族的生长因子选自由以下组成的组：FGF8B、FGF10和FGF21。在一些实例中，该方法包括使PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞与一定浓度，诸如约10ng/mL、约20ng/mL、约50ng/mL、约75ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约95ng/mL、约100ng/mL、约110ng/mL、约120ng/mL、约130ng/mL、约140ng/mL、约150ng/mL、约175ng/mL、约180ng/mL、约200ng/mL、约250ng/mL或约300ng/mL的来自FGF家族的生长因子(例如，KGF)接触。在一些实例中，该方法包括使PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞与一定浓度，诸如10ng/mL-200ng/mL、10ng/mL-150ng/mL、10ng/mL-100ng/mL、25ng/mL-75ng/mL、40ng/mL-60ng/mL或45ng/mL-55ng/mL的来自FGF家族的生长因子(例如，KGF)接触。
可以在本文提供的方法中使用任何能够诱导PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞分化为PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的SHH通路抑制剂(例如，单独地，或与至少一种来自FGF家族的生长因子、至少一种视黄酸信号通路激活剂、ROCK抑制剂和至少一种来自TGF-β超家族的生长因子进行任何组合)。在一些情况下，SHH通路抑制剂包括Sant1。在一些实例中，该方法包括使PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞与一定浓度，诸如约0.001μM、约0.002μM、约0.005μM、约0.01μM、约0.02μM、约0.03μM、约0.05μM、约0.08μM、约0.1μM、约0.12μM、约0.13μM、约0.14μM、约0.15μM、约0.16μM、约0.17μM、约0.18μM、约0.19μM、约0.2μM、约0.21μM、约0.22μM、约0.23μM、约0.24μM、约0.25μM、约0.26μM、约0.27μM、约0.28μM、约0.29μM、约0.3μM、约0.31μM、约0.32μM、约0.33μM、约0.34μM、约0.35μM、约0.4μM、约0.45μM、约0.5μM、约0.6μM、约0.8μM、约1μM、约2μM或约5μM的SHH通路抑制剂(例如，Sant1)接触。在一些实例中，该方法包括使PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞与一定浓度，诸如50nM-1000nM、50nM-500nM、50nM-300nM、100nM-300nM、200nM-300nM、200nM-500nM或225nM-275nM的SHH通路抑制剂(例如，Sant1)接触。
可以使用任何能够诱导PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞分化为PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的RA信号通路激活剂(例如，单独地，或与至少一种来自FGF家族的生长因子、至少一种SHH通路抑制剂、ROCK抑制剂和至少一种来自TGF-β超家族的生长因子进行任何组合)。在一些情况下，RA信号通路激活剂包括视黄酸。在一些实例中，该方法包括使PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞与一定浓度，诸如约0.02μM、约0.1μM、约0.2μM、约0.25μM、约0.3μM、约0.4μM、约0.45μM、约0.5μM、约0.55μM、约0.6μM、约0.65μM、约0.7μM、约0.75μM、约0.8μM、约0.85μM、约0.9μM、约1μM、约1.1μM、约1.2μM、约1.3μM、约1.4μM、约1.5μM、约1.6μM、约1.7μM、约1.8μM、约1.9μM、约2μM、约2.1μM、约2.2μM、约2.3μM、约2.4μM、约2.5μM、约2.6μM、约2.7μM、约2.8μM、约3μM、约3.2μM、约3.4μM、约3.6μM、约3.8μM、约4μM、约4.2μM、约4.4μM、约4.6μM、约4.8μM、约5μM、约5.5μM、约6μM、约6.5μM、约7μM、约7.5μM、约8μM、约8.5μM、约9μM、约9.5μM、约10μM、约12μM、约14μM、约15μM、约16μM、约18μM、约20μM、约50μM或约100μM的RA信号通路激活剂(例如，视黄酸)接触。在一些实例中，该方法包括使PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞与一定浓度，诸如1nM-500nM、50nM-400nM、50nM-250nM、50nM-150nM、80nM-200nM、75nM-125nM或90nM-110nM的RA信号通路激活剂(例如，视黄酸)接触。
可以使用任何能够诱导PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞分化为PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的ROCK抑制剂(例如，单独地，或与至少一种来自FGF家族的生长因子、至少一种SHH通路抑制剂、RA信号通路激活剂和至少一种来自TGF-β超家族的生长因子进行任何组合)。在一些情况下，ROCK抑制剂包括Thiazovivin、Y-27632、法舒地尔/HA1077或14-1152。在一些实例中，该方法包括使PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞与一定浓度，诸如，约0.2μM、约0.5μM、约0.75μM、约1μM、约2μM、约3μM、约4μM、约5μM、约6μM、约7μM、约7.5μM、约8μM、约9μM、约10μM、约11μM、约12μM、约13μM、约14μM、约15μM、约16μM、约17μM、约18μM、约19μM、约20μM、约21μM、约22μM、约23μM、约24μM、约25μM、约26μM、约27μM、约28μM、约29μM、约30μM、约35μM、约40μM、约50μM或约100μM的ROCK抑制剂(例如，Y-27632或Thiazovivin)接触。在一些实例中，该方法包括使PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞与一定浓度，诸如0.2μM-5μM、0.8μM-3μM、1μM-4μM、1.5μM-4μM、1.8μM-3.5μM、2μM-3μM、2.4μM-2.6μM的ROCK抑制剂(例如，Y-27632或Thiazovivin)接触。
可以使用任何能够诱导PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞分化为PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的来自TGF-β超家族的激活剂(例如，单独地，或与至少一种来自FGF家族的生长因子、至少一种SHH通路抑制剂、RA信号通路激活剂和ROCK抑制剂进行任何组合)。在一些情况下，来自TGF-β超家族的激活剂包含激活素A或GDF8。在一些实例中，该方法包括使PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞与一定浓度，诸如约0.1ng/mL、约0.2ng/mL、约0.3ng/mL、约0.4ng/mL、约0.5ng/mL、约0.6ng/mL、约0.7ng/mL、约0.8ng/mL、约1ng/mL、约1.2ng/mL、约1.4ng/mL、约1.6ng/mL、约1.8ng/mL、约2ng/mL、约2.2ng/mL、约2.4ng/mL、约2.6ng/mL、约2.8ng/mL、约3ng/mL、约3.2ng/mL、约3.4ng/mL、约3.6ng/mL、约3.8ng/mL、约4ng/mL、约4.2ng/mL、约4.4ng/mL、约4.6ng/mL、约4.8ng/mL、约5ng/mL、约5.2ng/mL、约5.4ng/mL、约5.6ng/mL、约5.8ng/mL、约6ng/mL、约6.2ng/mL、约6.4ng/mL、约6.6ng/mL、约6.8ng/mL、约7ng/mL、约8ng/mL、约9ng/mL、约10ng/mL、约20ng/mL、约30ng/mL或约50ng/mL的来自TGF-β超家族的生长因子(例如，激活素A)接触。在一些实例中，该方法包括使PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞与一定浓度，诸如约5ng/mL的来自TGF-β超家族的生长因子(例如，激活素A)接触。在一些实施方案中，来自TGF-β超家族的生长因子(例如，激活素A)的浓度为1ng/mL-15ng/mL、3ng/mL-12ng/mL、5ng/mL-12ng/mL、5ng/mL-20ng/mL、8ng/mL-20ng/mL、8ng/mL-15ng/mL、9ng/mL-11ng/mL或8ng/mL-12ng/mL。
在一些情况下，PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞通过使PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞与KGF、Sant1和RA接触5天或6天的时间段而获得。在一些情况下，PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞通过使PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞与KGF、Sant1、RA、Thiazovivin和激活素A接触5或6天的时间段而获得。在一些情况下，PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞通过使PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞与KGF接触5天的时间段而获得。在一些情况下，PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞通过使PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞与以下接触1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天或9天(例如，5或6天)而获得：i)至少一种来自FGF家族的生长因子(例如，KGF)、ii)至少一种SHH通路抑制剂(例如，Sant1)、iii)至少一种RA信号通路激活剂(例如，视黄酸)、iv)至少一种ROCK抑制剂(例如，thiazovivin)和v)至少一种来自TGF-β超家族的生长因子(例如，激活素A)。
胰岛素阳性内分泌细胞
本公开内容的方面涉及胰岛素阳性内分泌细胞(例如，NKX6.1阳性细胞、ISL1阳性细胞或β样细胞)。本文使用的胰岛素阳性内分泌细胞可以源自任何来源或根据任何合适的方案产生。在一些方面，PDX-1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞(例如，NKX6.1阳性细胞、ISL1阳性细胞或β样细胞)。在一些方面，胰岛素阳性内分泌细胞进一步分化，例如，通过诱导或成熟为SC-β细胞。
在一些方面，从PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞产生胰岛素阳性内分泌细胞的方法包括使包含PDX1阳性、NKX6-1阳性胰腺祖细胞的细胞群体(例如，在促进细胞簇集的条件下)与以下接触：a)TGF-β信号通路抑制剂、b)甲状腺激素信号通路激活剂、c)γ-分泌酶抑制剂、和/或d)蛋白激酶抑制剂，以诱导群体中的至少一个PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞，其中该胰岛素阳性内分泌细胞表达胰岛素。在一些情况下，该胰岛素阳性内分泌细胞表达PDX1、NKX6.1、ISL1、NKX2.2、Mafb、glis3、Sur1、Kir6.2、Znt8、SLC2A1、SLC2A3和/或胰岛素。
可以使用任何能够诱导PDX-1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的TGF-β信号通路抑制剂(例如，单独地，或与其他β细胞分化因子例如，甲状腺激素信号通路激活剂进行组合)。在一些情况下，TGF-β信号通路包括TGF-β受体I型激酶信号通路。在一些情况下，TGF-β信号通路抑制剂包括Alk5抑制剂II。
可以使用任何能够诱导PDX-1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的甲状腺激素信号通路激活剂(例如，单独地，或与其他β细胞分化因子例如，TGF-β信号通路抑制剂进行组合)。在一些情况下，甲状腺激素信号通路激活剂包括三碘甲腺原氨酸(T3)。在一些情况下，甲状腺激素信号通路激活剂包括GC-1。
在一些情况下，该方法包括使细胞群体(例如，PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞)与至少一种另外的因子接触。在一些情况下，该方法包括使PDX-1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞与以下中的至少一种接触：i)SHH通路抑制剂、ii)RA信号通路激活剂、iii)γ-分泌酶抑制剂、iv)至少一种来自表皮生长因子(EGF)家族的生长因子、v)蛋白激酶抑制剂、vi)TGF-β信号通路抑制剂或vii)甲状腺激素信号通路激活剂。在一些实施方案中，该方法包括使细胞群体(例如，PDX-1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞)与至少一种另外的因子接触。在一些情况下，该方法包括使PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞与以下中的至少一种接触：i)SHH通路抑制剂、ii)RA信号通路激活剂、iii)γ-分泌酶抑制剂、iv)来自表皮生长因子(EGF)家族的生长因子、v)蛋白激酶抑制剂、vi)TGF-β信号通路抑制剂、vii)甲状腺激素信号通路激活剂或viii)PKC激活剂。
在一些情况下，该方法包括使PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞与以下中的至少一种接触：i)SHH通路抑制剂、ii)RA信号通路激活剂、iii)γ-分泌酶抑制剂、iv)至少一种来自表皮生长因子(EGF)家族的生长因子、v)至少一种骨形态发生蛋白(BMP)信号通路抑制剂、vi)TGF-β信号通路抑制剂、vii)甲状腺激素信号通路激活剂、viii)蛋白激酶抑制剂或ix)ROCK抑制剂。
在一些情况下，该方法包括使PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞与以下中的至少一种接触：i)SHH通路抑制剂、ii)RA信号通路激活剂、iii)γ-分泌酶抑制剂、iv)至少一种来自表皮生长因子(EGF)家族的生长因子、v)至少一种骨形态发生蛋白(BMP)信号通路抑制剂、vi)TGF-β信号通路抑制剂、vii)甲状腺激素信号通路激活剂、viii)表观遗传修饰化合物、ix)蛋白激酶抑制剂或x)ROCK抑制剂。
在一些情况下，该方法包括使PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞与以下中的至少一种接触：i)SHH通路抑制剂、ii)RA信号通路激活剂、iii)γ-分泌酶抑制剂、iv)至少一种来自表皮生长因子(EGF)家族的生长因子、v)至少一种骨形态发生蛋白(BMP)信号通路抑制剂、vi)TGF-β信号通路抑制剂、vii)甲状腺激素信号通路激活剂、viii)表观遗传修饰化合物、ix)蛋白激酶抑制剂或x)ROCK抑制剂。
在一些实施方案中，在从PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞产生胰岛素阳性内分泌细胞的方法中，一些分化因子仅在分化步骤期间的前1天、2天、3天、4天或5天存在。
可以使用任何能够诱导NKX6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的TGF-β信号通路抑制剂(例如，单独地，或与其他β细胞分化因子例如，甲状腺激素信号通路激活剂进行组合)。在一些实施方案中，TGF-β信号通路包括TGF-β受体I型激酶信号通路。在一些实施方案中，TGF-β信号通路抑制剂包括Alk5抑制剂II。在一些实例中，该方法包括使NKX6.1阳性内分泌细胞与一定浓度，诸如约0.1μM、约0.5μM、约1μM、约1.5μM、约2μM、约2.5μM、约3μM、约3.5μM、约4μM、约4.5μM、约5μM、约5.5μM、约6μM、约6.5μM、约7μM、约7.5μM、约8μM、约8.5μM、约9μM、约9.5μM、约10μM、约10.5μM、约11μM、约11.5μM、约12μM、约12.5μM、约13μM、约13.5μM、约14μM、约14.5μM、约15μM、约15.5μM、约16μM、约16.5μM、约17μM、约17.5μM、约18μM、约18.5μM、约19μM、约19.5μM、约20μM、约25μM、约30μM、约35μM、约40μM、约45μM或约50μM的TGF-β信号通路抑制剂(例如，Alk5抑制剂，例如，Alk5抑制剂II)接触。在一些实例中，该方法包括使NKX6.1阳性胰腺祖细胞与一定浓度，诸如约7μM-13μM、约8μM-12μM、约9μM-11μM的TGF-β信号通路抑制剂(例如，Alk5抑制剂，诸如Alk5抑制剂II)接触。在一些实例中，该方法包括使NKX6.1阳性胰腺祖细胞与浓度为诸如约10μM的TGF-β信号通路抑制剂(例如，Alk5抑制剂，诸如Alk5抑制剂II)接触。
可以使用任何能够诱导NKX6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的甲状腺激素信号通路激活剂(例如，单独地，或与其他β细胞分化因子例如，TGF-β信号通路抑制剂进行组合)。在一些实施方案中，甲状腺激素信号通路激活剂包括三碘甲腺原氨酸(T3)。在一些实施方案中，甲状腺激素信号通路激活剂包括GC-1。在一些实例中，该方法包括使NKX6.1阳性胰腺祖细胞与一定浓度，诸如约0.1μM、约0.12μM、约0.13μM、约0.14μM、约0.15μM、约0.16μM、约0.17μM、约0.18μM、约0.19μM、约0.2μM、约0.21μM、约0.22μM、约0.23μM、约0.24μM、约0.25μM、约0.26μM、约0.27μM、约0.28μM、约0.29μM、约0.3μM、约0.31μM、约0.32μM、约0.33μM、约0.34μM、约0.35μM、约0.4μM、约0.45μM、约0.5μM、约0.6μM、约0.8μM、约1μM、约2μM或约5μM的甲状腺激素信号通路激活剂(例如，GC-1)接触。在一些实例中，该方法包括使NKX6.1阳性胰腺祖细胞与一定浓度，诸如约0.7μM-1.3μM、约0.8μM-1.2μM或约0.9μM-1.1μM的甲状腺激素信号通路激活剂(例如，GC-1)接触。在一些实例中，该方法包括使NKX6.1阳性胰腺祖细胞与一定浓度，诸如约1μM的甲状腺激素信号通路激活剂(例如，GC-1)接触。
可以使用任何能够诱导群体中的PDX-1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的γ-分泌酶抑制剂(例如，单独地，或与TGF-β信号通路抑制剂和/或甲状腺激素信号通路激活剂中的任何一种进行组合)。在一些情况下，γ-分泌酶抑制剂包括XXI。在一些情况下，γ-分泌酶抑制剂包括DAPT。在一些实例中，该方法包括使PDX-1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞与一定浓度，诸如，约0.01μM、约0.02μM、约0.05μM、约0.075μM、约0.1μM、约0.2μM、约0.3μM、约0.4μM、约0.5μM、约0.6μM、约0.7μM、约0.8μM、约0.9μM、约1μM、约1.1μM、约1.2μM、约1.3μM、约1.4μM、约1.5μM、约1.6μM、约1.7μM、约1.8μM、约1.9μM、约2μM、约2.1μM、约2.2μM、约2.3μM、约2.4μM、约2.5μM、约2.6μM、约2.7μM、约2.8μM、约2.9μM、约3μM、约3.2μM、约3.4μM、约3.6μM、约3.8μM、约4μM、约4.2μM、约4.4μM、约4.6μM、约4.8μM、约5μM、约5.2μM、约5.4μM、约5.6μM、约5.8μM、约6μM、约6.2μM、约6.4μM、约6.6μM、约6.8μM、约7μM、约8μM、约9μM、约10μM、约20μM、约30μM或约50μM的γ-分泌酶抑制剂(例如，XXI)接触。在一些实例中，该方法包括使NKX6.1阳性胰腺祖细胞与一定浓度诸如约1.7μM-2.3μM、约1.8μM-2.2μM或约1.9μM-2.1μM的γ-分泌酶抑制剂(例如，XXI)接触。在一些实例中，该方法包括使NKX6.1阳性胰腺祖细胞与一定浓度诸如约2μM的γ-分泌酶抑制剂(例如，XXI)接触。
可以使用任何能够诱导群体中的PDX-1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的来自EGF家族的生长因子(例如，单独地，或与TGF-β信号通路抑制剂和/或甲状腺激素信号通路激活剂中的任何一种进行组合)。在一些情况下，至少一种来自EGF家族的生长因子包括β细胞素。在一些情况下，至少一种来自EGF家族的生长因子包括EGF。在一些实例中，该方法包括使PDX-1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞与一定浓度，诸如，约1ng/mL、约2ng/mL、约4ng/mL、约6ng/mL、约8ng/mL、约10ng/mL、约12ng/mL、约14ng/mL、约16ng/mL、约18ng/mL、约20ng/mL、约22ng/mL、约24ng/mL、约26ng/mL、约28ng/mL、约30ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约75ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约95ng/mL、约100ng/mL、约150ng/mL、约200ng/mL、约250ng/mL或约300ng/mL的来自EGF家族的生长因子(例如，β细胞素)接触。在一些实例中，该方法包括使NKX6.1阳性胰腺祖细胞与一定浓度诸如约17ng/ml-23ng/ml、约18ng/ml-22ng/ml或约19ng/ml-21ng/ml的来自EGF家族的生长因子(例如，β细胞素)接触。在一些实例中，该方法包括使NKX6.1阳性胰腺祖细胞与一定浓度诸如约20ng/ml的来自EGF家族的生长因子(例如，β细胞素)接触。
可以使用任何能够诱导PDX-1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的RA信号通路激活剂(例如，单独地，或与TGF-β信号通路抑制剂和/或甲状腺激素信号通路激活剂中的任何一种进行组合)。在一些情况下，RA信号通路激活剂包含RA。在一些实例中，该方法包括使PDX-1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞与一定浓度，诸如约0.02μM、约0.1μM、约0.2μM、约0.25μM、约0.3μM、约0.4μM、约0.45μM、约0.5μM、约0.55μM、约0.6μM、约0.65μM、约0.7μM、约0.75μM、约0.8μM、约0.85μM、约0.9μM、约1μM、约1.1μM、约1.2μM、约1.3μM、约1.4μM、约1.5μM、约1.6μM、约1.7μM、约1.8μM、约1.9μM、约2μM、约2.1μM、约2.2μM、约2.3μM、约2.4μM、约2.5μM、约2.6μM、约2.7μM、约2.8μM、约3μM、约3.2μM、约3.4μM、约3.6μM、约3.8μM、约4μM、约4.2μM、约4.4μM、约4.6μM、约4.8μM、约5μM、约5.5μM、约6μM、约6.5μM、约7μM、约7.5μM、约8μM、约8.5μM、约9μM、约9.5μM、约10μM、约12μM、约14μM、约15μM、约16μM、约18μM、约20μM、约50μM或约100μM的RA信号通路激活剂(例如，视黄酸)接触。在一些实例中，该方法包括使NKX6.1阳性胰腺祖细胞与一定浓度诸如约20nM-80nM、约30nM-70nM或约40nM-60nM的RA信号通路激活剂(例如，视黄酸)接触。在一些实例中，该方法包括将NKX6.1阳性胰腺祖细胞与一定浓度诸如约50nM的RA信号通路激活剂(例如，视黄酸)接触。
可以在本文提供的方法中使用任何能够诱导PDX-1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的SHH通路抑制剂(例如，单独地，或与TGF-β信号通路抑制剂和/或甲状腺激素信号通路激活剂中的任何一种进行组合)。在一些情况下，SHH通路抑制剂包括Sant1。在一些实例中，该方法包括使PDX-1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞与一定浓度，诸如约0.001μM、约0.002μM、约0.005μM、约0.01μM、约0.02μM、约0.03μM、约0.05μM、约0.08μM、约0.1μM、约0.12μM、约0.13μM、约0.14μM、约0.15μM、约0.16μM、约0.17μM、约0.18μM、约0.19μM、约0.2μM、约0.21μM、约0.22μM、约0.23μM、约0.24μM、约0.25μM、约0.26μM、约0.27μM、约0.28μM、约0.29μM、约0.3μM、约0.31μM、约0.32μM、约0.33μM、约0.34μM、约0.35μM、约0.4μM、约0.45μM、约0.5μM、约0.6μM、约0.8μM、约1μM、约2μM或约5μM的SHH通路抑制剂(例如，Sant1)接触。在一些实例中，该方法包括使NKX6.1阳性胰腺祖细胞与一定浓度诸如约220nM-280nM、约230nM-270nM、约240nM-260nM或约245nM-255nM的SHH通路抑制剂(例如，Sant1)接触。在一些实例中，该方法包括将NKX6.1阳性胰腺祖细胞与一定浓度诸如约250nM的SHH通路抑制剂(例如，Sant1)接触。
可以使用任何能够诱导PDX-1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的BMP信号通路抑制剂(例如，单独地，或与TGF-β信号通路抑制剂和/或甲状腺激素信号通路激活剂中的任何一种进行组合)。在一些情况下，BMP信号通路抑制剂包括LDN193189或DMH-1。在一些实例中，该方法包括使PDX-1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞与一定浓度，诸如约30nM、约40nM、约50nM、约60nM、约70nM、约80nM、约90nM、约100nM、约110nM、约120nM、约130nM、约140nM、约150nM、约160nM、约170nM、约180nM、约190nM、约200nM、约210nM、约220nM、约230nM、约240nM、约250nM、约280nM、约300nM、约400nM、约500nM或约1μM的BMP信号通路抑制剂(例如，LDN1931189)接触。在一些实例中，该方法包括使NKX6.1阳性胰腺祖细胞与一定浓度诸如约70nM-130nM、约80nM-120nM、约90nM-110nM的BMP信号通路抑制剂(例如，LDN193189)接触。在一些实例中，该方法包括使NKX6.1阳性胰腺祖细胞与一定浓度诸如约100nM的BMP信号通路抑制剂(例如，LDN193189)接触。
可以使用任何能够诱导群体中的PDX-1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的ROCK抑制剂(例如，单独地，或与TGF-β信号通路抑制剂和/或甲状腺激素信号通路激活剂中的任何一种进行组合)。在一些情况下，ROCK抑制剂包括Thiazovivin、Y-27632、法舒地尔/HA1077或H-1152。在一些情况下，ROCK抑制剂包括Y-27632。在一些情况下，ROCK抑制剂包括Thiazovivin。在一些实例中，该方法包括使PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞与一定浓度，诸如，约0.2μM、约0.5μM、约0.75μM、约1μM、约2μM、约3μM、约4μM、约5μM、约6μM、约7μM、约7.5μM、约8μM、约9μM、约10μM、约11μM、约12μM、约13μM、约14μM、约15μM、约16μM、约17μM、约18μM、约19μM、约20μM、约21μM、约22μM、约23μM、约24μM、约25μM、约26μM、约27μM、约28μM、约29μM、约30μM、约35μM、约40μM、约50μM或约100μM的ROCK抑制剂(例如，Y-27632或Thiazovivin)接触。在一些实施方案中，ROCK抑制剂包括Thiazovivin。在一些实例中，该方法包括使PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞与一定浓度诸如约2.2μM-2.8μM、约2.3μM-2.7μM或约2.4μM-2.6μM的ROCK抑制剂(例如，Y-27632或Thiazovivin)接触。在一些实施方案中，ROCK抑制剂包括Thiazovivin。在一些实例中，该方法包括使PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞与一定浓度诸如约2.5μM的ROCK抑制剂(例如，Y-27632或Thiazovivin)接触。
可以使用任何能够诱导群体中的PDX-1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的表观遗传修饰化合物(例如，单独地，或与TGF-β信号通路抑制剂和/或甲状腺激素信号通路激活剂中的任何一种进行组合)。在一些情况下，表观遗传修饰化合物包括组蛋白甲基转移酶抑制剂或HDAC抑制剂。在一些情况下，表观遗传修饰化合物包括组蛋白甲基转移酶抑制剂，例如，DZNep。在一些情况下，表观遗传修饰化合物包括HDAC抑制剂，例如，KD5170。在一些实例中，该方法包括使PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞与一定浓度，诸如，约0.01μM、约0.025μM、约0.05μM、约0.075μM、约0.1μM、约0.15μM、约0.2μM、约0.5μM、约0.75μM、约1μM、约2μM、约3μM、约4μM、约5μM、约6μM、约7μM、约7.5μM、约8μM、约9μM、约10μM、约15μM、约20μM、约25μM、约30μM、约35μM、约40μM、约50μM或约100μM的表观遗传修饰化合物(例如，DZNep或KD5170)接触。在一些实例中，该方法包括使PDX1阳性、NKX6.1阳性的胰腺祖细胞与一定浓度诸如，约70nM-130nM、约80nM-120nM或约90nM-110nM的表观遗传修饰化合物(例如，DZNep或KD5170)接触。在一些实例中，该方法包括使PDX1阳性、NKX6.1阳性的胰腺祖细胞与一定浓度诸如，约100nM的表观遗传修饰化合物(例如，DZNep或KD5170)接触。
在一些情况下，细胞群体任选地与蛋白激酶抑制剂接触。在一些情况下，细胞群体不与蛋白激酶抑制剂接触。在一些情况下，细胞群体与蛋白激酶抑制剂接触。可以使用任何能够诱导群体中的PDX-1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的蛋白激酶抑制剂(例如，单独地，或与TGF-β信号通路抑制剂和/或甲状腺激素信号通路激活剂中的任何一种进行组合)。在一些情况下，蛋白激酶抑制剂包括星形孢菌素。在一些实例中，方法包括将NKX6.1阳性胰腺祖细胞与一定浓度诸如约0.1nM、约0.2nM、约0.3nM、约0.4nM、约0.5nM、约0.6nM、约0.7nM、约0.8nM、约0.9nM、约1nM、约1.1nM、约1.2nM、约1.3nM、约1.4nM、约1.5nM、约1.6nM、约1.7nM、约1.8nM、约1.9nM、约2.0nM、约2.1nM、约2.2nM、约2.3nM、约2.4nM、约2.5nM、约2.6nM、约2.7nM、约2.8μM、约2.9nM、约3nM、约3.1nM、约3.2nM、约3.3nM、约3.4nM、约3.5nM、约3.6nM、约3.7nM、约3.8nM、约3.9nM、约4.0nM、约4.1nM、约4.2nM、约4.3nM、约4.4nM、约4.5nM、约4.6nM、约4.7nM、约4.8μM、约4.9nM或约5nM的蛋白激酶抑制剂(例如，星形孢菌素)接触。在一些实例中，该方法包括使NKX6.1阳性胰腺祖细胞与一定浓度诸如约1nM-5nM、约2nM-4nM或约2.5nM-3.5nM的蛋白激酶抑制剂(例如，星形孢菌素)接触。在一些实例中，该方法包括使NKX6.1阳性胰腺祖细胞与一定浓度诸如约3nM的蛋白激酶抑制剂(例如，星形孢菌素)接触。
在一些情况下，该方法包括使细胞群体(例如，PDX-1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞)与XXI、Alk5i、T3或GC-1、RA、Sant1和β细胞素接触7天的时间段，以诱导群体中的至少一个PDX-1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞，其中该胰岛素阳性内分泌细胞表达胰岛素。在一些情况下，该方法包括使细胞群体(例如，PDX-1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞)与XXI、Alk5i、T3或GC-1、RA、Sant1、β细胞素和LDN193189接触7天的时间段，以诱导群体中的至少一个PDX-1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞，其中该胰岛素阳性内分泌细胞表达胰岛素。在一些实施方案中，在阶段5的一部分中，例如，仅在阶段5的时间段的前1天、2天、3天、4天、5天或6天或在阶段5的时间段的最后1天、2天、3天、4天、5天或6天添加一种或更多种分化因子。在一个实例中，仅在阶段5期间的前2天、3天、4天或5天使细胞与SHH通路抑制剂接触，随后将SHH信号通路抑制剂从培养基去除。在另一个实例中，仅在阶段5期间的前1、2或3天使细胞与BMP信号通路抑制剂接触，随后将BMP信号通路抑制剂从培养基去除。在一些实施方案中，使PDX-1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞与以下接触1天、2天、3天、4天、5天或6天(例如，2天或3天)：i)SHH通路抑制剂(例如，Sant1)、ii)RA信号通路激活剂(例如，视黄酸)、iii)γ-分泌酶抑制剂(例如，XXI)、iv)来自表皮生长因子(EGF)家族的生长因子(例如，β细胞素)、v)至少一种骨形态发生蛋白(BMP)信号通路抑制剂(例如，LDN-193189)、vi)TGF-β信号通路抑制剂(例如，Alk5i)、vii)甲状腺激素信号通路激活剂(例如，GC-1)、viii)表观遗传修饰化合物(例如，DZNEP)、ix)蛋白激酶抑制剂(例如，星形孢菌素)，和/或x)ROCK抑制剂(例如，thiazovivin)；然后在不存在i)SHH通路抑制剂(例如，Sant1)、ii)RA信号通路激活剂(例如，视黄酸)和iii)来自表皮生长因子(EGF)家族的生长因子(例如，β细胞素)的情况下，使细胞与以下接触1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天(例如，4天或5天)：i)γ-分泌酶抑制剂(例如，XXI)、ii)至少一种骨形态发生蛋白(BMP)信号通路抑制剂(例如，LDN-193189)、iii)TGF-β信号通路抑制剂(例如，Alk5i)、iv)甲状腺激素信号通路激活剂(例如，GC-1)、v)表观遗传修饰化合物(例如，DZNEP)、vi)蛋白激酶抑制剂(例如，星形孢菌素)和/或vii)ROCK抑制剂(例如，thiazovivin)。
在一些情况下，该方法包括在BE5培养基中培养细胞群体(例如，PDX-1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞)，以诱导群体中的至少一个PDX-1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞，其中该胰岛素阳性内分泌细胞表达胰岛素。
本公开内容的方面涉及用PKC激活剂处理包含PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的细胞群体，其可导致根据本文公开的方法产生的胰腺内分泌细胞的细胞群体中的胰腺α细胞百分比增加、胰腺δ细胞百分比增加、胰腺β细胞百分比增加、EC细胞百分比减少或其任何组合。
在一些情况下，该方法包括使包含PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的细胞群体与包含PKC激活剂、ROCK抑制剂、来自TGF-β超家族的生长因子、来自FGF家族的生长因子、RA信号通路激活剂和SHH通路抑制剂的第一组合物接触1天至2天，从而获得包含PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的第一转化细胞群体；以及使包含PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的第一转化细胞群体与包含PKC激活剂、TGF-β信号通路抑制剂、TH信号通路激活剂和表观遗传修饰化合物的第二组合物接触1天至2天，从而获得包含NKX6.1阳性、ISL1阳性内分泌细胞的第二转化细胞群体。
在一些情况下，该方法包括(1)使PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞与以下接触约2天至6天，以诱导PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞中的至少一些分化为PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞：i)至少一种来自FGF家族的生长因子、ii)至少一种SHH通路抑制剂、和任选地iii)RA信号通路激活剂、iv)ROCK抑制剂、和v)至少一种来自TGF-β超家族的生长因子；和(2)在(1)之后，使包含PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的群体与以下接触1至2天，从而产生包含PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的第一转化细胞群体：i)至少一种来自FGF家族的生长因子、ii)至少一种SHH通路抑制剂、iii)RA信号通路激活剂、iv)ROCK抑制剂、v)至少一种来自TGF-β超家族的生长因子和vi)PKC激活剂。
在一些情况下，该方法还包括：(3)使包含PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的第一转化细胞群体与以下接触1天至2天，从而产生第二转化细胞群体：i)SHH通路抑制剂、ii)RA信号通路激活剂、iii)γ-分泌酶抑制剂、iv)至少一种来自表皮生长因子(EGF)家族的生长因子、v)至少一种骨形态发生蛋白(BMP)信号通路抑制剂、vi)TGF-β信号通路抑制剂、vii)甲状腺激素信号通路激活剂、viii)表观遗传修饰化合物、ix)蛋白激酶抑制剂、x)ROCK抑制剂和xi)PKC激活剂；和(4)使第二转化细胞群体与以下接触，从而产生包含NKX6.1阳性、ISL1阳性内分泌细胞的细胞群体：i)SHH通路抑制剂、ii)RA信号通路激活剂、iii)γ-分泌酶抑制剂、iv)至少一种来自表皮生长因子(EGF)家族的生长因子、v)至少一种骨形态发生蛋白(BMP)信号通路抑制剂、vi)TGF-β信号通路抑制剂、vii)甲状腺激素信号通路激活剂、viii)表观遗传修饰化合物、ix)蛋白激酶抑制剂和x)ROCK抑制剂。
胰腺β细胞
本公开内容的方面涉及产生胰腺β细胞(例如，非天然胰腺β细胞)。在一些情况下，非天然胰腺β细胞在形式和功能上类似于内源性成熟β细胞，但仍与天然β细胞不同。
在一些情况下，使用本文提供的方法产生的胰岛素阳性胰腺内分泌细胞可以单独地或与其他类型的细胞(例如，其前体，例如，干细胞、定形内胚层细胞、原始肠管细胞、PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞或NKX6.1阳性胰腺祖细胞)一起形成细胞簇。
在一些情况下，包含胰岛素阳性内分泌细胞的细胞群体可以被直接诱导成熟为SC-β细胞，而不添加任何外源性分化因子(诸如TGF-β信号通路的抑制剂、甲状腺激素信号通路激活剂、PKC激活剂、来自TGF-β超家族、FGF家族或EGF家族的生长因子、SHH信号通路抑制剂、γ-分泌酶抑制剂、ROCK抑制剂或BMP信号通路抑制剂)。在一些实施方案中，本文提供的方法包括使包含NKX6.1阳性、ISL1阳性内分泌细胞的细胞群体与以下接触：血清白蛋白、TGF-β信号通路抑制剂、SHH通路抑制剂、甲状腺激素信号通路激活剂、蛋白激酶抑制剂、ROCK抑制剂、BMP信号通路抑制剂和/或表观遗传修饰化合物。在一些实施方案中，本文提供的方法包括使包含NKX6.1阳性、ISL1阳性内分泌细胞的细胞群体与人类血清白蛋白接触。在一些实施方案中，本文提供的方法包括使包含NKX6.1阳性、ISL1阳性内分泌细胞的细胞群体与PKC激活剂接触。
在一些实例中，可以在NS-GFs培养基、MCDB131培养基、DMEM培养基或CMRL培养基中使胰岛素阳性内分泌细胞成熟。在一些情况下，可以在补充有10％ FBS的CMRL培养基中使胰岛素阳性内分泌细胞成熟。在一些情况下，可以在补充有0.01％-1％ HSA(例如0.05％HSA)的DMEM/F12培养基中使胰岛素阳性内分泌细胞成熟。在其他情况下，可以通过在可补充2％ BSA的MCDB131培养基中培养含有胰岛素阳性内分泌细胞的细胞群体来获得SC-β细胞。在一些情况下，用于使胰岛素阳性内分泌细胞成熟为SC-β细胞的含有2％ BSA的MCDB131培养基可以不包含如本文描述的小分子因子。在一些情况下，用于使胰岛素阳性内分泌细胞成熟为SC-β细胞的含有2％ BSA的MCDB131培养基可以不包含血清(例如，无FBS)。在其他情况下，SC-β细胞可以通过在可以补充0.05％ HSA和维生素C的MCDB131培养基中培养包含胰岛素阳性内分泌细胞的细胞群体来获得。在一些实施方案中，细胞不与维生素C接触。在一些情况下，SC-β细胞可以通过在可以补充0.05％ HSA、ITS-X、维生素C和谷氨酰胺(Gln，例如，4mM)的MCDB131培养基中培养包含胰岛素阳性内分泌细胞的细胞群体来获得。在一些情况下，在S6期间，培养基的类型可以改变。例如，S6细胞在最初2天至4天在可补充0.05％ HSA和维生素C的MCDB131培养基中培养，并且然后在补充有1％HSA的DMEM/F12培养基中培养。在一些情况下，将另外的因子引入培养基中。例如，S6细胞可以在可以补充0.05％ HSA、ITS-X、维生素C和谷氨酰胺(Gln，例如，4mM)的MCDB131培养基中培养整个10-12天，在此期间ZnSO4从S6的第4天引入。
在一些方面，本公开内容提供了一种从多能细胞产生SC-β细胞的方法，该方法包括：a)通过使多能干细胞与至少一种来自TGFβ超家族的因子和WNT信号通路激活剂接触3天的时间段，将群体中的多能干细胞分化为定形内胚层细胞；b)通过使定形内胚层细胞与至少一种来自FGF家族的因子接触3天的时间段的过程，将定形内胚层细胞中的至少一些分化为原始肠管细胞；c)通过使原始肠管细胞与以下接触的过程，将原始肠管细胞中的至少一些分化为PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞：i)视黄酸信号通路激活剂、ii)至少一种来自FGF家族的因子、iii)SHH通路抑制剂、iv)BMP信号通路抑制剂(例如，DMH-1或LDN193189)、v)PKC激活剂、和vi)ROCK抑制剂；d)通过使PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞与以下接触5天的时间段的过程，将PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞中的至少一些分化为PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞：i)至少一种来自FGF家族的生长因子、ii)至少一种SHH通路抑制剂、和任选地iii)RA信号通路激活剂、和任选地iv)ROCK抑制剂和v)至少一种来自TGF-β超家族的因子；e)通过使PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞与以下接触5天与7天之间的时间段的过程，将PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞中的至少一些分化为PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞：i)TGF-β信号通路抑制剂、ii)TH信号通路激活剂、iii)至少一种SHH通路抑制剂、iv)RA信号通路激活剂、v)γ-分泌酶抑制剂、任选地vi)至少一种来自表皮生长因子(EGF)家族的生长因子、和任选地vii)BMP信号通路抑制剂；以及f)通过在无外源性分化因子的培养基(例如，NS-GFs培养基、补充有BSA的MCDB培养基、MCDB131培养基或DMEM/F12培养基)中培养PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞7天和14天之间的时间段，以诱导PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞中的至少一些在体外成熟为SC-β细胞的过程，使PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞中的至少一些分化为SC-β细胞，其中该SC-β细胞在体外和/或体内表现出GSIS响应。在一些情况下，GSIS响应类似于内源性成熟β细胞的GSIS响应。在优选的实施方案中，用于在本文公开的任何方法中使用的细胞不是尸体胰岛细胞。在一些实施方案中，用于在本文公开的任何方法中使用的组合物包含至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活细胞(即，不是死亡或垂死的细胞)。
在一些方面，本公开内容提供了一种从多能细胞产生SC-β细胞的方法，该方法包括：a)通过使多能干细胞与至少一种来自TGFβ超家族的因子和WNT信号通路激活剂接触3天的时间段，将群体中的多能干细胞分化为定形内胚层细胞；b)通过使定形内胚层细胞与至少一种来自FGF家族的因子接触3天的时间段的过程，将定形内胚层细胞中的至少一些分化为原始肠管细胞；c)通过使原始肠管细胞与以下接触2天的时间段的过程，将原始肠管细胞中的至少一些分化为PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞：i)视黄酸信号通路激活剂、ii)至少一种来自FGF家族的因子、iii)SHH通路抑制剂、iv)BMP信号通路抑制剂、v)PKC激活剂、vi)ROCK抑制剂、和vii)来自TGFβ超家族的生长因子；d)通过使PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞与以下接触5天的时间段的过程，将PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞中的至少一些分化为PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞：i)至少一种来自FGF家族的生长因子、ii)至少一种SHH通路抑制剂、和任选地iii)RA信号通路激活剂、和任选地iv)ROCK抑制剂和v)至少一种来自TGFβ超家族的因子；e)通过使PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞与以下接触5天与7天之间的时间段的过程，将PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞中的至少一些分化为PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞：i)TGF-β信号通路抑制剂、ii)TH信号通路激活剂、iii)至少一种SHH通路抑制剂、iv)RA信号通路激活剂、v)γ-分泌酶抑制剂、任选地vi)至少一种来自表皮生长因子(EGF)家族的生长因子、和任选地vii)BMP信号通路抑制剂；以及f)通过在无外源性分化因子的培养基(例如，NS-GFs培养基、补充有BSA的MCDB培养基、MCDB131培养基或DMEM/F12培养基)中培养PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞7天和14天之间的时间段，以诱导PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞中的至少一些在体外成熟为SC-β细胞的过程，使PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞中的至少一些分化为SC-β细胞，其中该SC-β细胞在体外和/或体内表现出GSIS响应。在一些情况下，GSIS响应类似于内源性成熟β细胞的GSIS响应。
在一些方面，本公开内容提供了一种从多能细胞产生SC-β细胞的方法，该方法包括：a)通过使多能干细胞与至少一种来自TGFβ超家族的因子和WNT信号通路激活剂接触3天的时间段，将群体中的多能干细胞分化为定形内胚层细胞；b)通过使定形内胚层细胞与至少一种来自FGF家族的因子接触3天的时间段的过程，将定形内胚层细胞中的至少一些分化为原始肠管细胞；c)通过使原始肠管细胞与以下接触的过程，将原始肠管细胞中的至少一些分化为PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞：i)视黄酸信号通路激活剂、ii)至少一种来自FGF家族的因子、iii)SHH通路抑制剂、iv)PKC激活剂和v)ROCK抑制剂；d)通过使PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞与以下接触5天的时间段的过程，将PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞中的至少一些分化为PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞：i)至少一种来自FGF家族的生长因子、ii)至少一种SHH通路抑制剂、和任选地iii)RA信号通路激活剂、和任选地iv)ROCK抑制剂和v)至少一种来自TGFβ超家族的因子；e)通过使PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞与以下接触5天与7天之间的时间段的过程，将PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞中的至少一些分化为PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞：i)TGF-β信号通路抑制剂、ii)TH信号通路激活剂、iii)至少一种SHH通路抑制剂、iv)RA信号通路激活剂、v)γ-分泌酶抑制剂、和任选地vi)至少一种来自表皮生长因子(EGF)家族的生长因子；以及f)通过在培养基(例如，NS-GFs培养基、补充有BSA的MCDB培养基、MCDB131培养基或DMEM/F12培养基)中培养PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞7天和14天之间的时间段，以诱导PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞中的至少一些在体外成熟为SC-β细胞的过程，使PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞中的至少一些分化为SC-β细胞，其中该SC-β细胞在体外和/或体内表现出GSIS响应。在一些情况下，GSIS响应类似于内源性成熟β细胞的GSIS响应。
在一些方面，本公开内容提供了一种从多能细胞产生SC-β细胞的方法，该方法包括：a)通过使多能干细胞与至少一种来自TGFβ超家族的因子和WNT信号通路激活剂接触3天的时间段，使群体中的多能干细胞分化为定形内胚层细胞；b)通过使定形内胚层细胞与至少一种来自FGF家族的因子接触3天的时间段的过程，将定形内胚层细胞中的至少一些分化为原始肠管细胞；c)通过使原始肠管细胞与以下接触的过程，将原始肠管细胞中的至少一些分化为PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞：i)视黄酸信号通路激活剂、ii)至少一种来自FGF家族的因子、iii)SHH通路抑制剂、iv)BMP信号通路抑制剂(例如，DMH-1或LDN193189)、v)PKC激活剂和vi)ROCK抑制剂；d)通过使PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞与以下接触5天或6天的时间段的过程，将PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞中的至少一些分化为PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞：i)至少一种来自FGF家族的生长因子、ii)至少一种SHH通路抑制剂、和任选地iii)RA信号通路激活剂、和任选地iv)ROCK抑制剂和v)至少一种来自TGFβ超家族的因子；e)通过使PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞与以下接触5天和7天之间的时间段的过程，使PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞中的至少一些分化为PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞：i)SHH通路抑制剂、ii)RA信号通路激活剂、iii)γ-分泌酶抑制剂、iv)至少一种来自表皮生长因子(EGF)家族的生长因子、v)至少一种骨形态发生蛋白(BMP)信号通路抑制剂、vi)TGF-β信号通路抑制剂、vii)甲状腺激素信号通路激活剂、viii)表观遗传修饰化合物(例如，DZNep或KD5170)、ix)蛋白激酶抑制剂、和x)ROCK抑制剂；以及f)通过在培养基(例如，补充有HSA的培养基、NS-GFs培养基、补充有BSA的MCDB培养基、MCDB131培养基或DMEM/F12培养基)中培养PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞7天和14天之间的时间段，以诱导PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞中的至少一些在体外成熟为SC-β细胞的过程，使PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞中的至少一些分化为SC-β细胞，其中该SC-β细胞在体外和/或体内表现出GSIS响应。在一些情况下，GSIS响应类似于内源性成熟β细胞的GSIS响应。
在一些方面，本公开内容提供了一种从多能细胞产生SC-β细胞的方法，该方法包括：a)通过使多能干细胞与至少一种来自TGFβ超家族的因子和WNT信号通路激活剂接触3天的时间段，将群体中的多能干细胞分化为定形内胚层细胞；b)通过使定形内胚层细胞与至少一种来自FGF家族的因子接触3天的时间段的过程将定形内胚层细胞中的至少一些分化为原始肠管细胞；c)通过使原始肠管细胞与i)视黄酸信号通路激活剂、ii)至少一种来自FGF家族的因子、iii)SHH通路抑制剂、iv)BMP信号通路抑制剂(例如，DMH-1或LDN193189)、v)PKC活化剂和vi)ROCK抑制剂接触的过程，使至少一些原始肠管细胞分化为PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞；d)通过使PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞与i)至少一种来自FGF家族的生长因子、ii)至少一种SHH通路抑制剂、和任选地iii)RA信号通路激活剂、和任选地iv)ROCK抑制剂和v)至少一种来自TGFβ超家族的因子接触5天或6天的时间段的过程，将PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞中的至少一些分化为PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞；e)通过以下过程将PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞中的至少一些分化成PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞：使PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞与i)γ-分泌酶抑制剂、ii)至少一种骨形态发生蛋白(BMP)信号通路抑制剂、iii)TGF-β信号通路抑制剂、iv)甲状腺激素信号通路激活剂、v)表观遗传修饰化合物(例如，DZNep或KD5170)、vi)蛋白激酶抑制剂和vii)ROCK抑制剂接触5天和7天之间的时间段，并且在5天和7天之间的时间段的前3天内，使PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞与SHH通路抑制剂、RA信号通路激活剂和来自EGF家族的至少一种生长因子接触，所述生长因子此后从PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞中除去；和f)通过在培养基(例如，含有HSA的培养基、NS-GFs培养基、补充有BSA的MCDB培养基、MCDB131培养基或DMEM/F12培养基)中培养PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞7天和14天之间的时间段的过程将PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞中的至少一些分化为SC-β细胞，以在体外诱导PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞中的至少一些分化为SC-β细胞，其中该SC-β细胞在体外和/或体内表现出GSIS响应。在一些情况下，GSIS响应类似于内源性成熟β细胞的GSIS响应。
在一些方面，本公开内容提供了一种从多能细胞产生SC-β细胞的方法，该方法包括：a)通过使多能干细胞与至少一种来自TGFβ超家族的因子和WNT信号通路激活剂接触3天的时间段，将群体中的多能干细胞分化为定形内胚层细胞；b)通过使定形内胚层细胞与至少一种来自FGF家族的因子接触3天的时间段的过程将定形内胚层细胞中的至少一些分化为原始肠管细胞；c)通过使原始肠管细胞与以下接触的过程，将至少一些原始肠管细胞分化为PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞：i)视黄酸信号通路激活剂、ii)至少一种来自FGF家族的因子、iii)SHH通路抑制剂、iv)BMP信号通路抑制剂(例如，DMH-1或LDN193189)、v)PKC活化剂和vi)ROCK抑制剂；d)通过以下过程将PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞中的至少一些分化为PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞：使PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞与i)至少一种来自FGF家族的生长因子、ii)至少一种SHH通路抑制剂、和任选地iii)RA信号通路激活剂、和任选地iv)ROCK抑制剂和v)至少一种来自TGFβ超家族的因子接触3或4天的时间段，然后与i)至少一种来自FGF家族的生长因子、ii)至少一种SHH通路抑制剂、和任选地iii)RA信号通路激活剂、和任选地iv)ROCK抑制剂、v)至少一种来自TGFβ超家族的因子、和vi)PKC激活剂、和任选地vii)γ分泌酶抑制剂接触1天至2天；e)通过以下过程将PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞中的至少一些分化为PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞：使PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞与i)SHH通路抑制剂、ii)RA信号通路激活剂、iii)γ-分泌酶抑制剂、iv)至少一种来自表皮生长因子(EGF)家族的生长因子、v)至少一种骨形态发生蛋白(BMP)信号通路抑制剂、vii)TGFβ信号通路抑制剂、vii)甲状腺激素信号通路激活剂、viii)表观遗传修饰化合物(例如，DZNep或KD5170)、ix)蛋白激酶抑制剂、x)ROCK抑制剂和xi)PKC激活剂接触1天至2天，然后与i)SHH通路抑制剂、ii)RA信号通路激活剂、iii)γ-分泌酶抑制剂、iv)至少一种来自表皮生长因子(EGF)家族的生长因子、v)至少一种骨形态发生蛋白(BMP)信号通路抑制剂、vi)TGF-β信号通路抑制剂、vii)甲状腺激素信号通路激活剂、viii)表观遗传修饰化合物(例如，DZNep或KD5170)、ix)蛋白激酶抑制剂、和x)ROCK抑制剂接触3天和6天之间的时间段；和f)将PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞中的至少一些分化成SC-β细胞。
在一些方面，本公开内容提供了一种从多能细胞产生SC-β细胞的方法，该方法包括：a)通过使多能干细胞与至少一种来自TGFβ超家族的因子和WNT信号通路激活剂接触一天，然后使细胞与来自TGF-β超家族的因子接触另外两天，将群体中的多能干细胞分化为定形内胚层细胞；b)通过使定形内胚层细胞与至少一种来自FGF家族的因子接触3天的时间段的过程将定形内胚层细胞中的至少一些分化为原始肠管细胞；c)通过以下过程将原始肠管细胞中的至少一些分化为PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞：使原始肠管细胞与i)视黄酸信号通路激活剂、ii)至少一种来自FGF家族的因子、iii)SHH通路抑制剂、iv)PKC激活剂、v)ROCK抑制剂和BMP通路抑制剂接触1天，然后使原始肠管细胞与i)视黄酸信号通路激活剂、ii)至少一种来自FGF家族的因子、iii)SHH通路抑制剂、iv)PKC激活剂、v)ROCK抑制剂接触另一天；d)通过以下过程将PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞中的至少一些分化为PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞：使PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞与i)至少一种来自FGF家族的生长因子、ii)至少一种SHH通路抑制剂、和任选地iii)RA信号通路激活剂，和任选地iv)ROCK抑制剂和v)至少一种来自TGF-β超家族的因子接触5天的时间段；e)通过以下过程将PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞中的至少一些分化为PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞：使PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞与i)TGF-β信号通路抑制剂(例如，Alk5i)、ii)TH信号通路激活剂(例如，GC-1)、iii)至少一种SHH通路抑制剂(例如，Sant1)、iv)RA信号通路激活剂(例如，视黄酸)、v)γ-分泌酶抑制剂(例如，XXI)、vi)至少一种来自表皮生长因子(EGF)家族的生长因子(例如，β细胞素)、vii)BMP通路抑制剂(例如，LDN193189)、viii)ROCK抑制剂(例如，thiazovivin)、ix)蛋白激酶抑制剂(例如，星形孢菌素)，和x)表观遗传修饰剂(例如，DZNEP)接触2天或3天，然后使PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞与i)TGF-β信号通路抑制剂(例如，Alk5i)、ii)TH信号通路激活剂(例如，GC-1)、iii)γ-分泌酶抑制剂(例如，XXI)、iv)BMP通路抑制剂(例如，LDN193189)、v)ROCK抑制剂(例如，thiazovivin)、vi)蛋白激酶抑制剂(例如，星形孢菌素)和vii)表观遗传修饰剂(例如DZNEP)接触四天或五天的时间段；和f)通过在培养基(例如，包含HSA的培养基)中培养PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞7天和14天之间的时间段，以在体外诱导所述PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞中的至少一些成熟为SC-β细胞的过程，将PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性内分泌细胞中的至少一些分化为SC-β细胞，其中该SC-β细胞在体外和/或体内表现出GSIS响应。在一些情况下，GSIS响应类似于内源性成熟β细胞的GSIS响应。
用于培养从第一细胞簇解离的细胞的培养基可以是无异源物质的(xeno-free)。用于培养源自动物的细胞和/或细胞簇的无异源物质培养基可以不具有来自其他动物的产物。在一些情况下，用于培养人类细胞和/或细胞簇的无异源物质培养基可以不具有来自任何非人类动物的产物。例如，用于培养人类细胞和/或细胞簇的无异源物质培养基可以包含人类血小板裂解物(PLT)而不是胎牛血清(FBS)。例如，培养基可以包含约1％至约20％、约5％至约15％、约8％至约12％、约9％至约11％的血清。在一些情况下，培养基可以包含约10％的血清。在一些情况下，培养基可以不含小分子和/或FBS。例如，培养基可以包括补充有2％ BSA的MCDB131基础培养基。在一些情况下，培养基是无血清的。在一些实例中，培养基可以不包含外源性小分子或者信号通路激动剂或拮抗剂，诸如来自成纤维细胞生长因子家族(FGF，诸如FGF2、FGF8B、FGF 10或FGF21)的生长因子、音猬拮抗剂(诸如Sant1、Sant2、Sant4、Sant4、Cur61414、毛喉素、番茄碱、AY9944、曲帕拉醇、环巴胺或其衍生物)、视黄酸信号通路激动剂(例如，视黄酸、CD1530、AM580、ΤΤHΡΒ、CD437、Ch55、BMS961、AC261066、AC55649、AM80、BMS753、他扎罗汀、阿达帕林或CD2314)、Rho相关的含卷曲螺旋的蛋白激酶(ROCK)的抑制剂(例如，Thiazovivin、Y-27632、法舒地尔/HA1077或14-1152)、蛋白激酶C(PKC)的激活剂(例如，佛波醇12,13-二丁酸酯(PDBU)、TPB、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯、苔藓虫素1或其衍生物)、TGFβ超家族的拮抗剂(例如，Alk5抑制剂II(CAS 446859-33-2)、A83-01、SB431542、D4476、GW788388、LY364947、LY580276、SB505124、GW6604、SB-525334、SD-208、SB-505124或其衍生物)、骨形态发生蛋白(BMP)1型受体的抑制剂(例如，LDN193189或其衍生物)、甲状腺激素信号通路激活剂(例如，T3、GC-1或其衍生物)、γ-分泌酶抑制剂(例如，XXI、DAPT或其衍生物)、TGF-β信号通路的激活剂(例如，WNT3a或激活素A)、来自表皮生长因子(EGF)家族的生长因子(例如，β细胞素或EGF)、广泛激酶(例如，星形孢菌素或其衍生物)、非必需氨基酸、维生素或抗氧化剂(例如，环巴胺、维生素D、维生素C、维生素A或其衍生物)、或者其他添加物，如N-乙酰半胱氨酸、硫酸锌或肝素。在一些情况下，重新聚集培养基可以不包含外源细胞外基质分子。在一些情况下，重新聚集培养基不包含MatrigelTM。在一些情况下，重新聚集培养基不包含其他细胞外基质分子或物质，诸如胶原蛋白、明胶、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、玻连蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、PLO层粘连蛋白、纤维蛋白、凝血酶和RetroNectin及其混合物，例如，裂解的细胞膜制品。
本领域普通技术人员将理解，补充到培养基的血清白蛋白浓度可以变化。例如，培养基(例如，MCDB131)可以包含约0.01％、0.05％、0.1％、1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％或约15％的BSA。在其他情况下，培养基可以包含约0.01％、0.05％、0.1％、1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％或约15％的HSA。所使用的培养基(例如，MCDB131培养基)可以包含传统基础培养基中未发现的组分，诸如微量元素、腐胺、腺嘌呤、胸苷以及更高水平的一些氨基酸和维生素。这些添加物可以允许培养基补充非常低水平的血清或确定的组分。培养基可以不含蛋白质和/或生长因子，并且可以补充EGF、氢化可的松和/或谷氨酰胺。培养基可以包含一种或更多种细胞外基质分子(例如，细胞外蛋白)。培养基中使用的非限制性示例性细胞外基质分子可以包括胶原蛋白、胎盘基质、纤连蛋白、层粘连蛋白、merosin、生腱蛋白、肝素、硫酸肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、聚集蛋白聚糖(aggrecan)、双糖链蛋白聚糖(biglycan)、血小板反应蛋白、玻连蛋白和饰胶蛋白聚糖(decorin)。在一些情况下，培养基包含层粘连蛋白，诸如LN-332。在一些情况下，培养基包含肝素。
培养基可以在培养中定期更换，例如，以向培养基中的细胞提供最佳环境。当培养从第一细胞簇解离的细胞以进行重新聚集时，培养基可以至少或约每4小时、12小时、24小时、48小时、3天或4天更换。例如，培养基可以约每48小时更换。
在一些情况下，细胞可以在动态条件下(例如，在其中细胞在悬浮培养的同时经历持续的移动或搅拌的条件下)培养。对于细胞的动态培养，细胞可以在容器(例如，非黏附性容器，诸如转瓶(例如，200ml至3000ml的转瓶，例如，250ml的转瓶；100ml的转瓶；或125ml锥形瓶(Erlenmeyer))中培养，该容器可以连接至控制单元，并从而呈现受控的培养系统。在一些情况下，可以在非动态条件(例如，静态培养)下培养细胞，同时保持其增殖能力。对于细胞的非动态培养，细胞可以在黏附培养器皿中培养。黏附培养器皿可以涂覆有任何用于细胞黏附的基底诸如细胞外基质(ECM)以改善器皿表面与细胞的黏附性。用于细胞黏附的基底可以是任何旨在黏附干细胞或饲养细胞(若使用)的物质。用于细胞黏附的基底包括胶原蛋白、明胶、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、玻连蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、PLO层粘连蛋白、纤维蛋白、凝血酶和RetroNectin及其混合物，例如，MatrigelTM和裂解的细胞膜制品。
可以搅拌(例如，通过搅拌器)动态细胞培养容器(例如，转瓶)中的培养基。旋转速度可以与重新聚集的第二细胞簇的大小相关。可以控制旋转速度以使得第二细胞簇的大小可以类似于内源性胰岛。在一些情况下，控制旋转速度以使得第二细胞簇的大小可以为约75μm至约250μm。动态细胞培养器皿(例如，转瓶)的旋转速度可以是约20转/分钟(rpm)至约100rpm，例如，约30rpm至约90rpm、约40rpm至约60rpm、约45rpm至约50rpm。在一些情况下，旋转速度可以为约50rpm。
如本文提供的阶段6细胞可以经历或可以不经历如本文描述的解离和重新聚集过程。在一些情况下，包含胰岛素阳性内分泌细胞的细胞簇可以重新聚集。细胞簇重新聚集可以富集胰岛素阳性内分泌细胞。在一些情况下，细胞簇中的胰岛素阳性内分泌细胞可以进一步成熟为胰腺β细胞。例如，在重新聚集后，第二细胞簇可以表现出类似于天然胰岛的体外GSIS。例如，在重新聚集后，第二细胞簇可以包含表现出体外GSIS的非天然胰腺β细胞。在一些实施方案中，可以根据US20200332262的公开内容进行重新聚集过程，该申请通过引用以其整体并入本文。
根据本文提供的方法获得的阶段6细胞在冷冻保存和重新聚集程序后可以具有高的回收率。在一些情况下，在涉及在阶段3的BMP信号通路抑制剂(例如，DMH-1或LDN)和来自TGF-β超家族的生长因子(例如，激活素A)的处理，以及在阶段5的表观遗传修饰化合物(例如，组蛋白甲基转移酶抑制剂，例如，EZH2抑制剂，例如，DZNep)的处理的分化过程中获得的阶段6细胞与未进行这种处理的相应细胞群体相比，在阶段5后的冷冻保存后，可以具有更高的回收率。在一些情况下，在涉及在阶段3的BMP信号通路抑制剂(例如，DMH-1或LDN)和来自TGF-β超家族的生长因子(例如，激活素A)的处理，以及在阶段5的表观遗传修饰化合物(例如，组蛋白甲基转移酶抑制剂，例如，EZH2抑制剂，例如，DZNep)的处理的分化过程中获得的阶段6细胞与在阶段3未经BMP信号通路抑制剂(例如，DMH-1或LDN)和来自TGF-β超家族的生长因子(例如，激活素A)处理的相应细胞群体相比，在阶段5后的冷冻保存后，可以具有更高的回收率。在一些情况下，在涉及在阶段3的BMP信号通路抑制剂(例如，DMH-1或LDN)和来自TGF-β超家族的生长因子(例如，激活素A)的处理，以及在阶段5的表观遗传修饰化合物(例如，组蛋白甲基转移酶抑制剂，例如，EZH2抑制剂，例如，DZNep)的处理的分化过程中获得的阶段6细胞在阶段5后的冷冻保存后，可以具有至少为约35％、37.5％、40％、42.5％、45％、47.5％、48％、49％或50％的回收率。回收率可以计算为与冷冻保存前的细胞相比，在冷冻保存、解冻和恢复以及重新聚集程序后存活并形成重新聚集的细胞簇的细胞百分比。
在一些实施方案中，本公开内容涉及使用本文提供的方法获得的非天然胰腺β细胞或其前体(例如，在阶段5之后获得的NKX6.1阳性、PDX1阳性、胰岛素阳性细胞)的冷冻保存。在一些实施方案中，包含非天然胰腺β细胞的细胞群体可以经由冷冻保存来储存。例如，包含非天然胰腺β细胞(例如，在一些情况下为第6阶段细胞)的细胞群体可以解离到细胞悬浮液，例如单细胞悬浮液中，并可以将细胞悬浮液冷冻保存，例如，冷冻在冷冻保存溶液中。细胞的解离可以通过本文所提供的任何技术进行，例如，通过酶处理。细胞可以在最高-20℃、最高-30℃、最高-40℃、最高-50℃、最高-60℃、最高-70℃、最高-80℃、最高-90℃、最高-100℃、最高-110℃、最高-120℃、最高-130℃、最高-140℃、最高-150℃、最高-160℃、最高-170℃、最高-180℃、最高-190℃或最高-200℃的温度冷冻。在一些实施方案中，细胞在约-80℃的温度冷冻。在一些实施方案中，细胞在约-195℃的温度冷冻。任何冷却方法都可以用于提供冷冻保存所需的低温，诸如但不限于电冷冻机、固体二氧化碳和液氮。在一些情况下，可以使用本领域技术人员可获得的任何冷冻保存溶液(包括定制溶液和商业溶液)来孵育用于在低温储存的细胞。例如，可以使用包含冷冻保护剂的溶液。冷冻保护剂可以是被配置为保护细胞免受冷冻伤害的剂。例如，冷冻保护剂可以是能够降低冷冻保存溶液的玻璃化转变温度的物质。可以使用的示例性冷冻保护剂包括DMSO(二甲基亚砜)、二醇类(例如，乙二醇、丙二醇和甘油)、右旋糖酐(例如，右旋糖酐-40)和海藻糖。可以将其他试剂添加至冷冻保存溶液用于其他效果。在一些情况下，可在本文提供的方法中使用商业上可获得的冷冻保存溶液，例如FrostaLifeTM、pZerveTM、Gibco Synth-a- FreezeCryopreservationMedium、Freezing Media、HypoFRS Preservation Media和Stem Cells Media。
在分化过程中，可以对细胞进行如本文所提供的辐照处理。在特定实施方案中，细胞不经受辐照处理。在一些情况下，阶段6的细胞群体，例如，具有从胰岛素阳性内分泌细胞分化为胰腺β细胞的细胞的细胞群体或细胞簇，被辐照一段时间。在一些情况下，阶段6的细胞群体从冷冻保存中恢复后，在重新聚集后被辐照一段时间。在一些情况下，冷冻保存的细胞(例如，在阶段5结束时冷冻保存的细胞)在解冻和恢复以进行随后的分化过程之前被辐照一定的时间段。
在一些实施方案中，阶段6的细胞包括NKX6.1阳性、胰岛素阳性细胞。在一些实施方案中，阶段6的细胞包括NKX6.1阳性、胰岛素阴性细胞。在一些实施方案中，阶段6的细胞包括C-肽阳性细胞。在一些实施方案中，阶段6的细胞或具有阶段6的细胞特征的细胞在NS-GFs培养基、MCDB131培养基、DMEM培养基或CMRL培养基中孵育。在一些实施方案中，阶段6细胞或具有阶段6细胞特征的细胞与以下任一种或更多种接触：维生素或抗氧化剂(例如，维生素C)、白蛋白(例如，人类血清白蛋白)、TGF-β通路抑制剂(例如，ALK5抑制剂II)、骨形态发生蛋白(BMP)1型受体抑制剂(例如，LDN193189)、Rho相关的含卷曲螺旋的蛋白激酶(ROCK)抑制剂(例如，thiazovivin)、组蛋白甲基转移酶抑制剂(例如，DZNEP)和蛋白激酶抑制剂(例如，星形孢菌素)。在一些实施方案中，使阶段6的细胞与PKC激活剂接触(参见，例如，US20210214690A1，其通过引用以其整体并入本文)。在一些实施方案中，第6阶段的细胞不与PKC激活剂接触。
在一些实施方案中，本公开内容提供了一种包含胰岛素阳性细胞群体和脂质的组合物。在一些实施方案中，本公开内容提供了一种使胰岛素阳性细胞群体与脂质接触的方法。在一些实施方案中，脂质是饱和脂肪酸。在一些实施方案中，饱和脂肪酸是棕榈酸酯。在一些实施方案中，脂质是不饱和脂肪酸。在一些实施方案中，不饱和脂肪酸是油酸、亚油酸或棕榈油酸。
在一些实施方案中，本公开内容提供了一种包含胰岛素阳性细胞群体和MCDB 131的组合物。在一些实施方案中，本公开内容提供了一种使胰岛素阳性细胞群体与MCDB 131接触的方法。在一些实施方案中，本公开内容提供了一种包含胰岛素阳性细胞群体和DMEM/F12的组合物。在一些实施方案中，本公开内容提供了一种使胰岛素阳性细胞群体与DMEM/F12接触的方法。在一些实施方案中，本公开内容提供了一种包含胰岛素阳性细胞群体和锌的组合物。在一些实施方案中，本公开内容提供了一种使胰岛素阳性细胞群体与锌接触的方法。在一些实施方案中，本公开内容提供了一种包含胰岛素阳性细胞群体和ZnSO4的组合物。在一些实施方案中，本公开内容提供了一种使胰岛素阳性细胞群体与ZnSO4接触的方法。
在一些实施方案中，本公开内容提供了一种包含胰岛素阳性细胞群体和至少一种代谢物的组合物。在一些实施方案中，本公开内容提供了一种使胰岛素阳性细胞群体与至少一种代谢物接触的方法。在一些实施方案中，至少一种代谢物是谷氨酸、乙酸、b-羟基丁酸、L-肉碱、牛磺酸、甲酸或生物素。在一些实施方案中，本公开内容提供了一种包含胰岛素阳性细胞群体和谷氨酸、乙酸、b-羟基丁酸、L-肉碱、牛磺酸、甲酸或生物素中的一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种的组合物。在一些实施方案中，本公开内容提供了一种使胰岛素阳性细胞群体与谷氨酸、乙酸、b-羟基丁酸、L-肉碱、牛磺酸、甲酸或生物素中的一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种接触的方法。
在一些实施方案中，本公开内容提供了一种包含胰岛素阳性细胞群体和至少一种氨基酸的组合物。在一些实施方案中，本公开内容提供了一种使胰岛素阳性细胞群体与至少一种氨基酸接触的方法。在一些实施方案中，至少一种氨基酸是丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、苏氨酸或色氨酸。在一些实施方案中，至少一种氨基酸是精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸(glutamic acid)、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸(glutamate)、甘氨酸、脯氨酸、苏氨酸或色氨酸。在一些实施方案中，本公开内容提供了一种包含胰岛素阳性细胞群体和至少一种维生素的组合物。在一些实施方案中，本公开内容提供了一种使胰岛素阳性细胞群体与至少一种维生素接触的方法。在一些实施方案中，至少一种维生素是生物素或核黄素。
在一些实施方案中，本公开内容提供了包含胰岛素阳性细胞群体和单甘油酯脂肪酶(MGLL)抑制剂的组合物。在一些实施方案中，本公开内容提供了一种使胰岛素阳性细胞群体与至少一种维生素接触的方法。在一些实施方案中，MGLL抑制剂是JJKK048、KML29、NF1819、JW642、JZL184、JZL195、JZP361、扁塑藤素(pristimerin)或URB602中或其衍生物的任何一种。
分化因子
本公开内容的方面涉及使祖细胞(例如，干细胞、例如，iPS细胞、定形内胚层细胞、原始肠管细胞、PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞、PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞、胰岛素阳性内分泌细胞)与一种或更多种β细胞分化因子接触，例如，以诱导胰岛素阳性内分泌细胞成熟或诱导其他祖细胞分化为SC-β细胞(例如，成熟胰腺β细胞)。在一些实施方案中，分化因子可以例如，根据本文描述的方法诱导多能细胞(例如，iPSC或hESC)分化为定形内胚层细胞。在一些实施方案中，分化因子可以例如，根据本文描述的方法诱导定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞。在一些实施方案中，分化因子可以例如，根据本文描述的方法诱导原始肠管细胞分化为PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞。在一些实施方案中，分化因子可以例如，根据本文描述的方法诱导PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞分化为NKX6-1阳性胰腺祖细胞。在一些实施方案中，分化因子可以例如，根据本文描述的方法诱导NKX6-1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞。在一些实施方案中，分化因子可以例如，根据本文描述的方法诱导胰岛素阳性内分泌细胞成熟为SC-β细胞。
根据本文公开的方法，本文描述的至少一种分化因子可以单独使用或与其他分化因子组合使用，以产生SC-β细胞。在一些实施方案中，在产生SC-β细胞的方法中使用至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或至少十种本文描述的分化因子。
转化生长因子-β(TGF-β)超家族
本公开内容的方面涉及使用来自转化生长因子β(TGF-β)超家族的生长因子作为分化因子。“TGF-β超家族”是指具有已知TGFβ家族成员的结构和功能特性的蛋白。TGF-β蛋白家族可以包括TGF-β系列蛋白、抑制素(包括抑制素A和抑制素B)、激活素(包括激活素A、激活素B和激活素AB)、MIS(米勒管抑制物质)、BMP(骨形态发生蛋白)、dpp(decapentaplegic)、Vg-1、MNSF(单克隆非特异性抑制因子)及其他。该蛋白家族的活性可以基于与各种细胞类型上的某些受体的特异性结合。该家族的成员可以共享与其功能相关的序列同一性区域，尤其是在C末端。TGFβ家族可以包括多于一百种不同的蛋白，全部共享至少一个氨基酸序列同一性的区域。可在本文公开的方法中使用的家族的成员可以包括但不限于如通过其GenBank登录号标识的以下蛋白质：P07995、P18331、P08476、Q04998、P03970、P43032、P55102、P27092、P42917、P09529、P27093、P04088、Q04999、P17491、P55104、Q9WUK5、P55103、O88959、O08717、P58166、O61643、P35621、P09534、P48970、Q9NR23、P25703、P30884、P12643、P49001、P21274、O46564、O19006、P22004、P20722、Q04906、Q07104、P30886、P18075、P23359、P22003、P34821、P49003、Q90751、P21275、Q06826、P30885、P34820、Q29607、P12644、Q90752、O46576、P27539、P48969、Q26974、P07713、P91706、P91699、P27091、O42222、Q24735、P20863、O18828、P55106、Q9PTQ2、O14793、O08689、O42221、O18830、O18831、O18836、O35312、O42220、P43026、P43027、P43029、O95390、Q9R229、O93449、Q9Z1W4、Q9BDW8、P43028、Q7Z4P5、P50414、P17246、P54831、P04202、P01137、P09533、P18341、O19011、Q9Z1Y6、P07200、Q9Z217、O95393、P55105、P30371、Q9MZE2、Q07258、Q96S42、P97737、AAA97415.1、NP-776788.1、NP-058824.1、EAL24001.1、1 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989197.1、NP-571434.1、EAL41229.1、AAT07302.1、CAI19472.1、NP-031582.1、AAA40548.1、XP-535880.1、NP-1-037239.1、AAT72007.1、XP-418956.1、CAA41634.1、BAC30864.1、CAA38850.1、CAB81657.2、CAA45018.1、CAA45019.1、BAC28247.1、NP-031581.1、NP-990479.1、NP-999820.1、AAB27335.1、S45355、CAB82007.1、XP-534351.1、NP-058874.1、NP-031579.1、1REW、AAB96785.1、AAB46367.1、CAA05033.1、BAA89012.1、IES7、AAP20870.1、BAC24087.1、AAG09784.1、BAC06352.1、AAQ89234.1、AAM27000.1、AAH30959.1、CAGO1491.1、NP-571435.1、1REU、AAC60286.1、BAA24406.1、A36193、AAH55959.1、AAH54647.1、AAH90689.1、CAG09422.1、BAD16743.1、NP-032134.1、XP-532179.1、AAB24876.1、AAH57702.1、AAA82616.1、CAA40222.1、CAB90273.2、XP-342592.1、XP-534896.1、XP-534462.1、1LXI、XP-417496.1、AAF34179.1、AAL73188.1、CAF96266.1、AAB34226.1、AAB33846.1、AAT12415.1、AA033819.1、AAT72008.1、AAD38402.1、BAB68396.1、CAA45021.1、AAB27337.1、AAP69917.1、AATI2416.1、NP-571396.1、CAA53513.1、AA033820.1、AAA48568.1、BAC02605.1、BAC02604.1、BAC02603.1、BAC02602.1、BAC02601.1、BAC02599.1、BAC02598.1、BAC02597.1、BAC02595.1、BAC02593.1、BAC02592.1、BAC02590.1、AAD28039.1、AAP74560.1、AAB94786.1、NP-001483.2、XP-528195.1、NP-571417.1、NP-001001557.I、AAH43222.1、AAM33143.1、CAG10381.1、BAA31132.1、EAL39680.1、EAA12482.2、P34820、AAP88972.1、AAP74559.1、CAI16418.1、AAD30538.1、XP-345502.1、NP-1-038554.1、CAG04089.1、CAD60936.2、NP-031584.1、B55452、AAC60285.1、BAA06410.1、AAH52846.1、NP-031580.1、NP-1-036959.1、CAA45836.1、CAA45020.1、Q29607、AAB27336.1、XP-547817.1、AAT12414.1、AAM54049.1、AAH78901.1、AA025745.1、NP-570912.1、XP-392194.1、AAD20829.1、AAC97113.1、AAC61694.1、AAH60340.1、AAR97906.1、BAA32227.1、BAB68395.1、BAC02895.1、AAWS 1451.1、AAF82188.1、XP-544189.1、NP-990568.1、BAC80211.1、AAW82620.1、AAF99597.1、NP-571062.1、CAC44179.1、AAB97467.1、AAT99303.1、AAD28038.1、AAH52168.1、NP-001004122.1、CAA72733.1、NP-032133.2、XP-394252.1、XP-224733.2、JH0801、AAP97721.1、NP-989669.1、S43296、P43029、A55452、AAH32495.1、XP-542974.1、NP-032135.1、AAK30842.1、AAK27794.1、BAC30847.1、EAA12064.2、AAP97720.1、XP-525704.1、AAT07301.1、BAD07014.1、CAF94356.1、AAR27581.1、AAG13400.1、AAC60127.1、CAF92055.1、XP-540103.1、AA020895.1、CAF97447.1、AAS01764.1、BAD08319.1、CAA10268.1、NP-998140.1、AAR03824.1、AAS48405.1、AAS48403.1、AAK53545.1、AAK84666.1、XP-395420.1、AAK56941.1、AAC47555.1、AAR88255.1、EAL33036.1、AAW47740.1、AAW29442.1、NP-722813.1、AARO8901.1、AAO 15420.2、CAC59700.1、AAL26886.1、AAK71708.1、AAK71707.1、CAC51427.2、AAK67984.1、AAK67983.1、AAK28706.1、P07713、P91706、P91699、CAG02450.1、AAC47552.1、NP-005802.1、XP-343149.1、AW34055.1、XP-538221.1、AAR27580.1、XP-125935.3、AAF21633.1、AAF21630.1、AAD05267.1、Q9Z1 W4、NP-1-031585.2、NP-571094.1、CAD43439.1、CAF99217.1、CAB63584.1、NP-722840.1、CAE46407.1、XP-1-417667.1、BAC53989.1、BAB19659.1、AAM46922.1、AAA81169.1、AAK28707.1、AAL05943.1、AAB17573.1、CAH25443.1、CAG10269.1、BAD16731.1、EAA00276.2、AAT07320.1、AAT07300.1、AAN15037.1、CAH25442.1、AAK08152.2、2009388A、AAR12161.1、CAGO1961.1、CAB63656.1、CAD67714.1、CAF94162.1、NP-477340.1、EAL24792.1、NP-1-001009428.1、AAB86686.1、AAT40572.1、AAT40571.1、AAT40569.1、NP-033886.1、AAB49985.1、AAG39266.1、Q26974、AAC77461.1、AAC47262.1、BAC05509.1、NP-055297.1、XP-546146.1、XP-525772.1、NP-060525.2、AAH33585.1、AAH69080.1、CAG12751.1、AAH74757.2、NP-034964.1、NP-038639.1、042221、AAF02773.1、NP-062024.1、AAR18244.1、AAR14343.1、XP-228285.2、AAT40573.1、AAT94456.1、AAL35278.1、AAL35277.1、AAL17640.1、AAC08035.1、AAB86692.1、CAB40844.1、BAC38637.1、BAB16046.1、AAN63522.1、NP-571041.1、AAB04986.2、AAC26791.1、AAB95254.1、BAA11835.1、AAR18246.1、XP-538528.1、BAA31853.1、AAK18000.1、XP-1-420540.1、AAL35276.1、AAQ98602.1、CAE71944.1、AAW50585.1、AAV63982.1、AAW29941.1、AAN87890.1、AAT40568.1、CAD57730.1、AAB81508.1、AAS00534.1、AAC59736.1、BAB79498.1、AAA97392.1、AAP85526.1、NP-999600.2、NP-878293.1、BAC82629.1、CAC60268.1、CAG04919.1、AAN10123.1、CAA07707.1、AAK20912.1、AAR88254.1、CAC34629.1、AAL35275.1、AAD46997.I、AAN03842.1、NP-571951.2、CAC50881.1、AAL99367.1、AAL49502.1、AAB71839.1、AAB65415.1、NP-624359.1、NP-990153.1、AAF78069.1、AAK49790.1、NP-919367.2、NP-001192.1、XP-544948.1、AAQ18013.1、AAV38739.1、NP-851298.1、CAA67685.1、AAT67171.1、AAT37502.1、AAD27804.1、AAN76665.1、BAC11909.1、XP-1-421648.1、CAB63704.1、NP-037306.1、A55706、AAF02780.1、CAG09623.1、NP-067589.1、NP-035707.1、AAV30547.1、AAP49817.1、BAC77407.1、AAL87199.1、CAG07172.1、B36193、CAA33024.1、NP-1-001009400.1、AAP36538.1、XP-512687.1、XP-510080.1、AAH05513.1、1KTZ、AAH14690.1、AAA31526.1。
本文提供的方法和组合物中来自TGF-β超家族的生长因子可以是天然获得的或重组的。在一些实施方案中，来自TGF-β超家族的生长因子包含激活素A。术语“激活素A”可包括激活素A的片段和衍生物。激活素A的非限制性示例性序列列于表2中。在一些实施方案中，来自TGF-β超家族的生长因子可以包括具有与SEQ ID NO:1的序列至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％或更多相同的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，来自TGF-β超家族的生长因子可包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，来自TGF-β超家族的生长因子可以包括具有与SEQ ID NO:2-15的任何一项的序列至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％或更多相同的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方案中，来自TGF-β超家族的生长因子包括生长分化因子8(GDF8)。术语“GDF8”可以包括GDF8的片段和衍生物。GDF8多肽的序列是本领域技术人员可获得的。在一些实施方案中，来自TGF-β超家族的生长因子包括具有与人类GDF8多肽序列(GenBank登录号EAX10880)至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％或更多相同的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方案中，来自TGF-β超家族的生长因子包括与GDF8密切相关的生长因子，例如，生长分化因子11(GDF11)。在一些实施方案中，来自TGF-β超家族的生长因子包括具有与人类GDF11多肽序列(GenBank登录号AAF21630)至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％或更多相同的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方案中，可以用模拟至少一种来自TGF-β超家族的生长因子的剂代替来自TGF-β超家族的生长因子。示例性的模拟至少一种来自TGF-β超家族的生长因子的剂包括但不限于IDE1和IDE2。
骨形态发生蛋白(BMP)信号通路抑制剂
本公开内容的方面涉及使用BMP信号通路抑制剂作为β细胞分化因子。BMP信号家族是TGF-β超家族的不同亚型(Sebald等人.Biol.Chem.385:697-710,2004)。超过二十种已知的BMP配体被三种不同的II型受体(BMPRII、ActRIIa和ActRIIb)和至少三种I型受体(ALK2、ALK3和ALK6)识别。二聚体配体促进受体异聚体的组装，从而允许组成型活性的II型受体丝氨酸/苏氨酸激酶使I型受体丝氨酸/苏氨酸激酶磷酸化。活化的I型受体使BMP响应性(BR-)SMAD效应子(SMAD 1、SMAD 5和SMAD 8)磷酸化，以促进核易位与SMAD4复合，SMAD4是同样促进TGF信号传导的co-SMAD。此外，BMP信号可以以SMAD非依赖性方式激活细胞内效应物如MAPK p38(Nohe等人.Cell Signal 16:291-299,2004)。可溶性BMP拮抗剂(诸如头蛋白(noggin)、腱蛋白(chordin)、gremlin和促卵泡素抑释素)通过配体螯合来限制BMP信号传导。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的BMP信号通路抑制剂包括DMH-1或其衍生物、类似物或变体。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的BMP信号通路抑制剂包括以下化合物或以下化合物的衍生物、类似物或变体：
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的BMP信号通路抑制剂包含LDN193189(也称为LDN193189、1062368-24-4、LDN-193189、DM 3189、DM-3189，IUPAC名称：4-[6-(4-哌嗪-1-基苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹诺酮)。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的BMP信号通路抑制剂包括以下化合物或以下化合物的衍生物、类似物或变体：
在一些情况下，与LDN193189相比，DMH-1可以更具选择性。在本公开内容的一些实施方案中，DMH-1对于本文提供的方法可以特别有用。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物不包括使用LDN193189。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物不包括使用LDN193189或其衍生物、类似物或变体用于从原始肠管细胞产生PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物涉及使用DMH-1或其衍生物、类似物或变体用于从原始肠管细胞产生PDX1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的BMP信号通路抑制剂包括LDN193189的类似物或衍生物，例如，LDN193189的盐、水合物、溶剂化物、酯或前体药物。在一些实施方案中，LDN193189的衍生物(例如，盐)包括LDN193189盐酸盐。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的BMP信号通路抑制剂包括来自美国专利公布号2011/0053930的式I化合物。
TGF-β信号通路抑制剂
本公开内容的方面涉及使用TGF-β信号通路抑制剂作为β细胞分化因子。
在一些实施方案中，TGF-β信号通路包括TGF-β受体I型激酶(TGF-βRI)信号通路。在一些实施方案中，TGF-β信号通路抑制剂包含ALK5抑制剂II(CAS 446859-33-2，TGF-B RI激酶的ATP竞争性抑制剂，也称为“ALK5i”、RepSox，IUPAC名称：2-[5-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基]-1,5-萘啶。在一些实施方案中，TGF-β信号通路抑制剂是ALK5抑制剂II的类似物或衍生物。
在一些实施方案中，ALK5抑制剂II的类似物或衍生物是如美国专利公布号2012/0021519中描述的式I化合物，其通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的TGF-β信号通路抑制剂是在美国专利公布号2010/0267731中描述的TGF-β受体抑制剂。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的TGF-β信号通路抑制剂包括在美国专利公布号2009/0186076和2007/0142376中描述的ALK5抑制剂。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的TGF-β信号通路抑制剂是A83-01。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的TGF-β信号通路抑制剂不是A83-01。在一些实施方案中，本文描述的组合物和方法不包括A 83-01。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的TGF-β信号通路抑制剂是SB 431542。在一些实施方案中，TGF-β信号通路抑制剂不是SB 431542。在一些实施方案中，本文描述的组合物和方法不包括SB 431542。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的TGF-β信号通路抑制剂是D 4476。在一些实施方案中，TGF-β信号通路抑制剂不是D 4476。在一些实施方案中，本文描述的组合物和方法不包括D 4476。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的TGF-β信号通路抑制剂是GW 788388。在一些实施方案中，TGF-β信号通路抑制剂不是GW788388。在一些实施方案中，本文描述的组合物和方法不包括GW 788388。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的TGF-β信号通路抑制剂是LY 364947。在一些实施方案中，TGF-β信号通路抑制剂不是LY 364947。在一些实施方案中，本文描述的组合物和方法不包括LY 364947。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的TGF-β信号通路抑制剂是LY580276。在一些实施方案中，TGF-β信号通路抑制剂不是LY 580276。在一些实施方案中，本文描述的组合物和方法不包括LY 580276。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的TGF-β信号通路抑制剂是SB 525334。在一些实施方案中，TGF-β信号通路抑制剂不是SB525334。在一些实施方案中，本文描述的组合物和方法不包括SB 525334。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的TGF-β信号通路抑制剂是SB 505124。在一些实施方案中，TGF-β信号通路抑制剂不是SB 505124。在一些实施方案中，本文描述的组合物和方法不包括SB 505124。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的TGF-β信号通路抑制剂是SD 208。在一些实施方案中，TGF-β信号通路抑制剂不是SD 208。在一些实施方案中，本文描述的组合物和方法不包括SD 208。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的TGF-β信号通路抑制剂是GW 6604。在一些实施方案中，TGF-β信号通路抑制剂不是GW 6604。在一些实施方案中，本文描述的组合物和方法不包括GW 6604。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的TGF-β信号通路抑制剂是GW 788388。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的TGF-β信号通路抑制剂不是GW 788388。在一些实施方案中，本文描述的组合物和方法不包括GW 788388。
从上述化合物的集合中，可以从多种来源获得以下化合物：LY-364947、SB-525334、SD-208和SB-505124购自Sigma,P.O.Box 14508,St.Louis,Mo.,63178-9916；616452和616453，购自Calbiochem(EMD Chemicals，Inc.)，480S.Democrat Road，Gibbstown，NJ，08027；GW788388和GW6604购自GlaxoSmithKline，980Great West Road，Brentford，Middlesex，TW8 9GS，United Kingdom；LY580276购自Lilly Research,Indianapolis,Ind.46285；和SM16，购自Biogen Idec，P.O.Box 14627,5000Davis Drive,Research Triangle Park,N.C.,27709-4627。
WNT信号通路
本公开内容的方面涉及使用WNT信号通路的激活剂作为β细胞分化因子。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的WNT信号通路激活剂包括CHIR99021。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的WNT信号通路激活剂包括CHIR99021的衍生物，例如，CHIR99021的盐，例如，CHIR99021的三盐酸盐、盐酸盐。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的WNT信号通路激活剂包括Wnt3a重组蛋白。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的WNT信号通路激活剂包括糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂。示例性的GSK3抑制剂包括但不限于3F8、A 1070722、AR-A 014418、BIO、BIO-丙酮肟、FRATide、10Z-Hymenialdisine、靛玉红-3’-肟、kenpaullone、L803、L803-mts、碳酸锂、NSC 693868、SB 216763、SB 415286、TC-G 24、TCS2002、TCS21311、TWS119和这些中任一种的类似物或衍生物。在某些实施方案中，本文公开的方法、组合物和药盒不包括WNT信号通路激活剂。
成纤维细胞生长因子(FGF)家族
本公开内容的方面涉及使用来自FGF家族的生长因子作为β细胞分化因子。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的来自FGF家族的生长因子包括角质形成细胞生长因子(KGF)。KGF的多肽序列是本领域技术人员可获得的。在一些实施方案中，来自FGF家族的生长因子包括具有与人类FGF2多肽序列(GenBank登录号AAB21431)至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％或更多相同的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，来自FGF家族的生长因子包括具有与SEQ ID NO:16的序列至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％或更多相同的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的来自FGF家族的生长因子包括FGF2。FGF2的多肽序列是本领域技术人员可获得的。在一些实施方案中，来自FGF家族的生长因子包括具有与人类FGF2多肽序列(GenBank登录号NP_001997)至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％或更多相同的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的至少一种来自FGF家族的生长因子包括FGF8B。FGF8B的多肽序列是本领域技术人员可获得的。在一些实施方案中，来自FGF家族的生长因子包括具有与人类FGF8B多肽序列(GenBank登录号AAB40954)至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％或更多相同的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的至少一种来自FGF家族的生长因子包括FGF10。FGF10的多肽序列是本领域技术人员可获得的。在一些实施方案中，来自FGF家族的生长因子包括具有与人类FGF10多肽序列(GenBank登录号CAG46489)至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％或更多相同的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的至少一种来自FGF家族的生长因子包括FGF21。FGF21的多肽序列是本领域技术人员可获得的。在一些实施方案中，来自FGF家族的生长因子包括具有与人类FGF21多肽序列(GenBank登录号AAQ89444.1)至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％或更多相同的氨基酸序列的多肽。
音猬(SHH)信号通路
本公开内容的方面涉及使用SHH信号通路抑制剂作为β细胞分化因子。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的SHH信号通路抑制剂包括Sant1。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的SHH信号通路抑制剂包括SANT2。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的SHH信号通路抑制剂包括SANT3。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的SHH信号通路抑制剂包括SANT4。在一些实施方案中，SHH信号通路抑制剂包括Cur61414。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的SHH信号通路抑制剂包括毛喉素。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的SHH信号通路抑制剂包括番茄碱。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的SHH信号通路抑制剂包括AY9944。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的SHH信号通路抑制剂包括曲帕拉醇。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的SHH信号通路抑制剂包括化合物A或化合物B(如美国公布第2004/0060568号中所公开的)。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的SHH信号通路抑制剂包括如美国公布第2006/0276391号中所公开的拮抗音猬信号通路的甾体生物碱(例如，环巴胺或其衍生物)。在某些实施方案中，本文公开的方法、组合物和药盒不包括SHH信号通路抑制剂。
Rho激酶(ROCK)信号通路
本公开内容的方面涉及使用ROCK信号通路抑制剂(ROCK抑制剂)作为β细胞分化因子。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的ROCK抑制剂包括Y-27632或Thiazovivin。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的ROCK抑制剂包括Thiazovivin。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的ROCK抑制剂包括Y-27632。在一些情况下，本文提供的方法和组合物中的ROCK抑制剂包括以下化合物或其衍生物：
在一些情况下，本文提供的方法和组合物中的ROCK抑制剂包括以下化合物或其衍生物：
可以用于本文提供的方法和组合物中的ROCK抑制剂的非限制性实例包括Thiazovivin、Y-27632、法舒地尔/HA1077、H-1152、瑞舒地尔(Ripasudil)、Y39983、Wf-536、SLx-2119、氮杂苯并咪唑-氨基呋咱、DE-104、烯烃、异喹啉、吲唑和吡啶烯烃衍生物、ROKα抑制剂、XD-4000、HMN-1152、4-(1-氨基烷基)-N-(4-吡啶基)环己烷-羧酰胺、Rhostatin、BA-210、BA-207、BA-215、BA-285、BA-1037、Ki-23095、VAS-012和喹唑啉。
视黄酸信号通路
本公开内容的方面涉及使用视黄酸信号通路的调节剂作为β细胞分化因子。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的视黄酸信号通路的调节剂包括视黄酸信号通路的激活剂。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的RA信号通路激活剂包括视黄酸。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的RA信号通路激活剂包括视黄酸受体激动剂。本文提供的方法和组合物中的示例性视黄酸受体激动剂包括但不限于CD 1530、AM 580、TTNPB、CD 437、Ch 55、BMS 961、AC 261066、AC 55649、AM 80、BMS753、他扎罗汀、阿达帕林和CD 2314。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的视黄酸信号通路的调节剂包括视黄酸信号通路的抑制剂。在一些实施方案中，视黄酸信号通路抑制剂包含DEAB(IUPAC名称：2-[2-(二乙氨基)乙氧基]-3-丙-2-烯基苯甲醛)。在一些实施方案中，视黄酸信号通路抑制剂包括DEAB的类似物或衍生物。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的视黄酸信号通路抑制剂包括视黄酸受体拮抗剂。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的视黄酸受体拮抗剂包括(E)-4-[2-(5,6-二氢-5,5-二甲基-8-苯基-2-萘基)乙烯基]苯甲酸、(E)-4-[[(5,6-二氢-5,5-二甲基-8-苯基乙炔基)-2-萘基]乙烯基]苯甲酸、(E)-4-[2-[5,6-二氢-5,5-二甲基-8-(2-萘基)-2-萘基]乙烯基]-苯甲酸和(E)-4-[2-[5,6-二氢-5,5-二甲基-8-(4-甲氧基苯基)-2-萘基]乙烯基]苯甲酸。在一些实施方案中，视黄酸受体拮抗剂包括BMS195614(CAS#253310-42-8)、ER 50891(CAS#187400-85-7)、BMS 493(CAS#170355-78-9)、CD 2665(CAS#170355-78-9)、LE 135(CAS#155877-83-1)、BMS 453(CAS#166977-43-1)或MM 11253(CAS#345952-44-5)。
在某些实施方案中，本文公开的方法、组合物和药盒不包括视黄酸信号通路的调节剂。在某些实施方案中，本文公开的方法、组合物和药盒不包括视黄酸信号通路激活剂。在某些实施方案中，本文公开的方法、组合物和药盒不包括视黄酸信号通路抑制剂。
蛋白激酶C激活剂
本公开内容的方面涉及使用蛋白激酶C激活剂作为β细胞分化因子。蛋白激酶C是蛋白激酶最大的家族之一，并包括多种异形体。传统的异形体包括a、βI、βII、γ；新的异形体包括δ、ε、η、Θ；并且非典型的异形体包括ξ和ι/λ。PKC酶主要是胞质的，但在被激活时会转运到膜。在细胞质中，PKC被其他激酶磷酸化或自我磷酸化。为了被激活，一些PKC异形体(例如，PKC-ε)需要分子结合至二酰基甘油(“DAG”)结合位点或磷脂酰丝氨酸(“PS”)结合位点。其他异形体能够在完全没有任何第二结合信使的情况下被激活。与DAG位点结合的PKC激活剂包括但不限于苔藓虫素、picologue、佛波酯、海兔毒素(aplysiatoxin)和格尼迪木灵(gnidimacrin)。与PS位点结合的PKC激活剂包括但不限于多不饱和脂肪酸及其衍生物。设想了可以在本文描述的方法、组合物和药盒中使用能够单独地或与一种或更多种其他β细胞分化因子组合地诱导至少一种产生胰岛素的内分泌细胞或其前体分化为SC-β细胞的任何蛋白激酶C激活剂。
在一些实施方案中，本文公开的任何PKC激活剂是能够与PKC上的DAG结合位点结合的PKC激活剂。在一些实施方案中，PKC激活剂能够与PKC的C1结构域结合。在一些实施方案中，PKC激活剂是苯并内酰胺衍生物。在一些实施方案中，苯并内酰胺衍生物是((2S,5S)-(E,E)-8-(5-(4-(三氟甲基)苯基)-2,4-戊二烯酰氨基)苯并内酰胺)，其在本文中可被称为TPPB或TPB。在一些实施方案中，与未用苯并内酰胺衍生物PKC激活剂处理的细胞群体相比，使细胞群体与苯并内酰胺衍生物PKC激活剂(例如，TPPB)接触增加了细胞产量。在一些实施方案中，PKC激活剂是佛波酯。在一些实施方案中，佛波酯是佛波醇12,13-二丁酸酯，其在本文中可以称为PDBU或PdbU。在一些实施方案中，与用佛波酯PKC激活剂(例如，PdbU)处理的细胞群体相比，使细胞群体与苯并内酰胺衍生物PKC激活剂(例如，TPPB)接触增加了细胞产量。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的PKC激活剂包括PdbU。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的PKC激活剂包括TPB。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的PKC激活剂包括环丙烷化多不饱和脂肪酸、环丙烷化单不饱和脂肪酸、环丙烷化多不饱和脂肪醇、环丙烷化单不饱和脂肪醇、环丙烷化多不饱和脂肪酸酯、环丙烷化单不饱和脂肪酸酯、环丙烷化多不饱和脂肪酸硫酸酯、环丙烷化单不饱和脂肪酸硫酸酯、环丙烷化多不饱和脂肪酸磷酸酯、环丙烷化单不饱和脂肪酸磷酸酯、大环内酯、DAG衍生物、类异戊二烯、辛基吲哚内酰胺V、格尼迪木灵(gnidimacrin)、伊利帕利达(iripallidal)、巨大戟二萜醇(ingenol)、萘磺酰胺(napthalenesulfonamide)、二酰甘油激酶抑制剂、成纤维细胞生长因子18(FGF-18)、胰岛素生长因子、激素和生长因子激活剂，如WIPO公布第WO/2013/071282号中所描述的。在一些实施方案中，苔藓虫素包括苔藓虫素-1、苔藓虫素-2、苔藓虫素-3、苔藓虫素-4、苔藓虫素-5、苔藓虫素-6、苔藓虫素-7、苔藓虫素-8、苔藓虫素-9、苔藓虫素-10、苔藓虫素-11、苔藓虫素-12、苔藓虫素-13、苔藓虫素-14、苔藓虫素-15、苔藓虫素-16、苔藓虫素-17或苔藓虫素-18。在某些实施方案中，本文公开的方法、组合物和药盒不包括蛋白激酶C激活剂。
γ-分泌酶抑制剂
本公开内容的方面涉及使用γ-分泌酶抑制剂作为β细胞分化因子。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的γ-分泌酶抑制剂包括XXI。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的γ-分泌酶抑制剂包括DAPT。在本文提供的方法和组合物中的另外的示例性γ-分泌酶抑制剂包括但不限于美国专利第7,049,296号、第8,481,499号、第8,501,813号和WIPO公布WO/2013/052700中描述的γ-分泌酶抑制剂。在某些实施方案中，本文公开的方法(或其具体步骤)、组合物和药盒不包含γ-分泌酶抑制剂。
甲状腺激素信号通路激活剂
本公开内容的方面涉及使用甲状腺激素信号通路激活剂作为β细胞分化因子。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的甲状腺激素信号通路激活剂包括三碘甲腺原氨酸(T3)。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的甲状腺激素信号通路激活剂包括GC-1。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的甲状腺激素信号通路激活剂包括T3或GC-1的类似物或衍生物。本文提供的方法和组合物中的T3的示例性类似物包括但不限于选择性和非选择性的拟甲状腺素(thyromimetic)、TRβ选择性激动剂-GC-1、GC-24、4-羟基-PCB 106、MB07811、MB07344、3,5-二碘甲腺丙酸(DITPA)；选择性TR-β激动剂GC-1；3-碘类甲腺质(3-Iodothyronamine)(T(1)AM)和3,3’,5-三碘甲腺乙酸(Triac)(激素甲状腺素的生物活性代谢物(T(4))；KB-2115和KB-141；类甲腺质；SKF L-94901；DIBIT；3’-AC-T2；四碘甲腺乙酸(Tetrac)和三碘甲腺乙酸(Triac)(通过甲状腺素[T4]和三碘甲腺原氨酸[T3]丙氨酸链的氧化脱氨和脱羧)、3,3’,5’-三碘甲腺原氨酸(rT3)(通过T4和T3脱碘)、3,3’-二碘甲腺原氨酸(3,3’-T2)和3,5-二碘甲腺原氨酸(T2)(通过T4、T3和rT3脱碘)以及3-碘类甲腺质(T1AM)和类甲腺质(T0AM)(通过T4和T3脱碘和氨基酸脱羧)，以及TH结构类似物，诸如3,5,3’-三碘甲腺丙酸(Triprop)、3,5-二溴-3-哒嗪酮-1-甲腺原氨酸(L-940901)、N-[3,5-二甲基-4-(4’-羟基-3’-异丙基苯氧基)-苯基]-草氨酸(CGS23425)、3,5-二甲基-4-[(4’-羟基-3’-异丙基苄基)-苯氧基]乙酸(GC-1)、3,5-二氯-4-[(4-羟基-3-异丙基苯氧基)苯基]乙酸(KB-141)和3,5-二碘甲腺丙酸(DITPA)。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的甲状腺激素信号通路激活剂包括T3的前体药物或激素原，诸如T4甲状腺激素(例如，甲状腺素或L-3,5,3’,5’-四碘甲腺原氨酸)。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的甲状腺激素信号通路激活剂是美国专利第7,163,918号中描述的碘甲腺原氨酸组合物。
表皮生长因子(EGF)家族
本公开内容的方面涉及使用来自EGF家族的生长因子作为β细胞分化因子。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的至少一种来自EGF家族的生长因子包括β细胞素。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的至少一种来自EGF家族的生长因子包括EGF。表皮生长因子(EGF)是一种53个氨基酸的细胞因子，其从大的整合膜蛋白前体蛋白水解裂解。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的来自EGF家族的生长因子包括变体EGF多肽，例如，在美国专利第7,084,246号中所公开的与人类野生型EGF多肽序列具有至少90％氨基酸同一性的分离的表皮生长因子多肽。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的来自EGF家族的生长因子包括在美国专利第8,247,531号中所公开的结合并激动EGF受体的工程化EGF突变体。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的来自EGF家族的至少一种生长因子被激活EGF家族中的信号通路的剂替代。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的来自EGF家族的生长因子包括模拟EGF的化合物。在某些实施方案中，本文公开的方法、组合物和药盒不包括来自EGF家族的生长因子。在一些实施方案中，在本文描述的组合物和方法中使用的来自EGF家族的生长因子包含与人类β细胞素氨基酸序列(GenBank：AAB25452.1)至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文描述的组合物和方法中使用的来自EGF家族的生长因子包含与SEQ ID NO:17的氨基酸序列至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列或其功能片段。在一些实施方案中，本文描述的组合物和方法中使用的来自EGF家族的生长因子包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。
表2.分化因子的示例性氨基酸序列
表观遗传修饰化合物
本公开内容的方面涉及使用表观遗传修饰化合物作为β细胞分化因子。
术语“表观遗传修饰化合物”可指可以使表观遗传改变基因(即改变基因表达而不改变DNA序列)的化合物。表观遗传改变可以帮助决定基因是开启还是关闭，并可以影响某些细胞(例如，β细胞)中蛋白质的产生。表观遗传修饰(诸如DNA甲基化和组蛋白修饰)可改变DNA的可及性和染色质结构，从而调节基因表达的模式。这些过程对于成年生物体中不同细胞谱系的正常发育和分化可以至关重要。它们可以通过外源性影响进行修饰，并且因此，可以促进表型或病理表型的环境改变或可以是表型或病理表型的环境改变的结果。重要的是，表观遗传修饰在多能性基因的调节中可以起着至关重要的作用，多能性基因在分化过程中失活。非限制性示例性表观遗传修饰化合物包括DNA甲基化抑制剂、组蛋白乙酰转移酶抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、组蛋白甲基转移酶抑制剂、布罗莫结构域抑制剂或其任何组合。
在实施方案中，组蛋白甲基转移酶抑制剂是zeste同源物增强子2(EZH2)的抑制剂。EZH2是一种组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶。可在本文提供的方法中使用的EZH2抑制剂的非限制性实例包括3-去氮腺嘌呤A(DZNep)、EPZ6438、EPZ005687(S-腺苷甲硫氨酸(SAM)竞争性抑制剂)、EI1、GSK126和UNC1999。DZNep可抑制S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)的水解，SAH是所有蛋白质甲基转移酶的基于产物的抑制剂，导致SAH的细胞浓度升高，继而抑制EZH2。DZNep对EZH2可能没有特异性，并且还可抑制其他DNA甲基转移酶。GSK126是一种具有SAM竞争性的EZH2抑制剂，其选择性是对EZH1的150倍。UNC1999是GSK126的类似物，并且它的选择性比其对应物GSK126小。
在实施方案中，组蛋白甲基转移酶抑制剂是DZNep。在实施方案中，HDAC抑制剂是I类HDAC抑制剂、II类HDAC抑制剂或其组合。在实施方案中，HDAC抑制剂是KD5170(基于巯基酮的HDAC抑制剂)、MC1568(IIa类HDAC抑制剂)、TMP195(IIa类HDAC抑制剂)或其任何组合。在一些实施方案中，HDAC抑制剂是伏林司他、罗米地辛(Istodax)、西达本胺、帕比司他(farydak)、贝林司他(PXD101)、帕比司他(LBH589)、丙戊酸、莫替司他(mocetinostat，MGCD0103)、艾贝司他(PCI-24781)、恩替司他(entinostat，MS-275)、SB939、瑞诺司他(4SC-201)、吉维司他(ITF2357)、奎诺司他(quisinostat，JNJ-26481585)、HBI-8000(一种苯甲酰胺HDI)、kevetrin、CUDC-101、AR-42、CHR-2845、CHR-3996、4SC-202、CG200745、ACY-1215、ME-344、莱菔硫烷或其任何变体。
蛋白激酶抑制剂
本公开内容的方面涉及使用蛋白激酶抑制剂作为β细胞分化因子。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的蛋白激酶抑制剂包括星形孢菌素。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的蛋白激酶抑制剂包括星形孢菌素的类似物。本文提供的方法和组合物中的星形孢菌素的示例性类似物包括但不限于Ro-31-8220、双吲哚基马来酰亚胺(Bis)化合物、10’-{5”-[(甲氧羰基)氨基]-2”-甲基}-苯基氨基羰基星形孢菌素、staralog(参见，例如，Lopez等人,“Staurosporine-derived inhibitorsbroaden the scope of analog-sensitive kinase technology”,J.Am.Chem.Soc.2013；135(48):18153-18159)和cgp41251。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的蛋白激酶抑制剂是PKCβ的抑制剂。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的蛋白激酶抑制剂是具有以下结构的PKCβ抑制剂或如下化合物的衍生物、类似物或变体：
在一些实施方案中，PKCβ的抑制剂是具有以下结构的GSK-2化合物或如下化合物的衍生物、类似物或变体：
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的PKC抑制剂是双吲哚基马来酰亚胺。示例性的双吲哚基马来酰亚胺包括但不限于双吲哚基马来酰亚胺I、双吲哚基马来酰亚胺II、双吲哚基马来酰亚胺III、其盐酸盐、或衍生物、类似物或变体。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的PKC抑制剂是伪金丝桃素或其衍生物、类似物或变体。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中的PKC抑制剂是indorublin-3-单肟、5-Iodo或其衍生物、类似物或变体。在某些实施方案中，本文公开的方法、组合物和药盒不包括蛋白激酶抑制剂。
包封组合物和装置
在一些方面，本公开内容提供了包含本文公开的任何细胞的包封组合物或装置。各种包封装置、可降解凝胶和网络可用于本公开内容的药物组合物。例如，特别适合于缓释制剂的可降解材料包括生物相容性聚合物，诸如聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、甲基纤维素、透明质酸、胶原蛋白等。
在一些实施方案中，将细胞递送到可生物降解的(优选可生物再吸收的或可生物吸收的)支架或基质之上或之内可能是合意的或适当的。这些典型的三维生物材料包含附着于支架、分散在支架内或并入包埋在支架中的细胞外基质中的活细胞。在植入身体的靶区域后，这些植入物与宿主组织整合，其中移植的细胞逐渐建立。可以在本公开内容中使用的支架或基质(有时统称为“框架”)材料的实例包括非织造垫、多孔泡沫或自组装肽。例如，非织造垫可以使用包含以下的纤维来形成：合成的可吸收的乙醇酸和乳酸的共聚物(PGA/PLA)、泡沫和/或者聚(ε-己内酯)/聚(乙醇酸)(PCL/PGA)共聚物。
在一些实施方案中，框架是毡状物(felt)，其可以包含由可生物吸收的材料(例如，PGA、PLA、PCL共聚物或共混物、或者透明质酸)制成的复丝纱线(multifilament yarn)。使用由卷曲(crimping)、切割、梳理(carding)和针织(needling)组成的标准纺织加工技术将纱线制成毡状物。在另一实施方案中，将细胞接种到泡沫支架上，该泡沫支架可以是复合结构。在上述许多情况下，框架可以模塑成有用的形状。此外，应当理解，非天然胰腺β细胞可以在预先成形的不可降解的手术或可植入装置上培养。
在一些实施方案中，基质、支架或装置可以在接种细胞之前进行处理，以增强细胞附着。例如，在接种前，可以用0.1M的乙酸处理尼龙基质，并在聚赖氨酸、PBS和/或胶原蛋白中孵育以包覆尼龙。可以用硫酸对聚苯乙烯进行类似处理。框架的外表面也可以进行修饰，以改善细胞的附着或生长以及组织的分化，诸如通过血浆包覆框架或者添加一种或更多种蛋白质(例如，胶原蛋白、弹性纤维、网状纤维)、糖蛋白、糖胺聚糖(例如，硫酸肝素、4-硫酸软骨素、6-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角蛋白)、细胞基质和/或其他材料，诸如但不限于，明胶、藻酸盐、琼脂、琼脂糖和植物胶等。
在一些方面，本文公开内容提供了包含本文描述的体外分化的细胞群体的装置。在一些实施方案中，本文描述的体外分化的细胞群体形成细胞簇。装置可以被配置成容纳本文描述的细胞，在特定的实施方案中，当被植入受试者时，该细胞产生和并释放胰岛素。在一些实施方案中，装置还可以包含一个或更多个半透膜。半透膜可以被配置为将细胞簇保留在装置中，并允许细胞分泌的胰岛素通过。在装置的一些实施方案中，细胞可以被半透膜包封。包封可以通过本领域技术人员可用的任何技术进行。半透膜也可以由本领域技术人员将理解和验证的任何合适的材料制成。例如，半透膜可以由多糖或聚阳离子制成。在一些实施方案中，半透膜可以由以下制成：聚(丙交酯)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和其他聚羟基酸、聚(己内酯)、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酐、聚磷腈、聚氨基酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、可生物降解的聚氨酯、白蛋白、胶原蛋白、纤维蛋白、聚氨基酸、谷醇溶蛋白、藻酸盐、琼脂糖、琼脂糖与明胶(agarose with gelatin)、右旋糖酐、聚丙烯酸酯、乙烯-乙酸乙烯酯聚合物及其他酰基取代的乙酸纤维素及其衍生物、聚氨酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯、聚(乙烯基咪唑)、氯磺化聚烯烃、聚氧化乙烯或其任何组合。在一些实施方案中，半透膜包含藻酸盐。在一些实施方案中，细胞被包封在微囊中，该微囊包含被半透膜包围的藻酸盐核心。在一些实施方案中，对藻酸盐核心进行修饰，例如，以产生包含藻酸盐核心的支架，藻酸盐核心具有与RGD序列(精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸)共价缀合的寡肽。在一些实施方案中，对藻酸盐核心进行修饰，例如，以产生具有稳定性增强的化学酶促工程化的藻酸盐的共价加强的微囊。在一些实施方案中，对藻酸盐核心进行修饰，例如，以产生通过丙烯酸酯官能化磷脂的原位聚合而组装的模拟膜的薄层。在一些实施方案中，微囊包含使用差向异构酶酶促修饰的藻酸盐。在一些实施方案中，微囊包含微囊膜的相邻层之间的共价连接。在一些实施方案中，微囊包含亚筛粒度的胶囊，其包含与酚部分偶联的藻酸盐。在一些实施方案中，微囊包含支架，支架包含藻酸盐-琼脂糖。在一些实施方案中，细胞在被包封在藻酸盐中之前用PEG修饰。在一些实施方案中，细胞被包封在光反应性脂质体和藻酸盐中。应当理解，微囊中使用的藻酸盐可以用其他合适的生物材料代替，包括但不限于，聚乙二醇(PEG)、壳聚糖、聚酯中空纤维、胶原蛋白、透明质酸、右旋糖酐与ROD、BHD和聚乙二醇-二丙烯酸酯(PEGDA)、聚(MPC-共-甲基丙烯酸正丁酯-共-4-乙烯基苯基硼酸)(PMBV)和聚(乙烯醇)(PVA)、琼脂糖、琼脂糖与明胶以及这些的多层情况。在一些实施方案中，本文提供的装置包含体外区段，例如，当将装置植入到受试者中时，装置的一部分可以在受试者体外。体外区段可以包括装置的任何具有或不具有本文提供的细胞或细胞簇的功能组件。
本文还提供了用于治疗或预防受试者的疾病的方法。可以将包含本文描述的体外分化的细胞群体的组合物施用至受试者体内，以恢复受试者一定程度的胰腺功能。在一些实施方案中，这样的组合物被移植到受试者中。术语“移植”可以指将细胞或细胞簇、细胞或其细胞簇的任何部分、包含细胞、细胞簇或其任何部分的任何组合物通过导致引入的细胞或细胞簇(例如，在装置内)至少部分地定位在期望部位的方法或途径置于受试者体内。在一些实施方案中，期望的部位是胰腺。在一些实施方案中，期望的部位是非胰腺位置，诸如在肝脏中或皮下或在腹膜前区域中，例如，在被膜(例如，微囊)中，以将植入的细胞保持在植入位置并避免迁移。在一些实施方案中，移植细胞释放的胰岛素量足以降低受试者的血糖水平。
在一些实施方案中，包含本文描述的体外分化的细胞群体的组合物被容纳在植入受试者体内的装置中。在一些实施方案中，包含本文描述的体外分化的细胞群体的组合物被容纳在适合植入受试者的装置中。在一些实施方案中，装置在植入受试者体内时释放胰岛素，同时将细胞保留在装置中，并促进装置内和装置周围的组织血管化。例如在美国专利第11,471,398号、美国公布第2020-0289407号、第2021-0016073号、第2022-0175511号和PCT申请WO2018232180、WO2019068059、WO2019178134、WO2020/206150和WO2020/206157中描述了示例性装置，这些申请中的每一项通过引用整体并入。在一些实施方案中，在装置的植入或血管化期间，受试者不被施用免疫抑制剂。在一些实施方案中，在装置植入后的前1、2、3、4、5、6或7个月向受试者施用免疫抑制剂(例如，胸腺球蛋白(ATG)、西罗莫司、依那西普、他克莫司或霉酚酸酯)，但在装置植入后的6、7、8、9、10、11、12、13、15、24或36个月不向受试者施用免疫抑制剂(例如，胸腺球蛋白(ATG)、西罗莫司、依那西普、他克莫司或霉酚酸酯)。在一些实施方案中，该装置具有至少约300pm的厚度。在一些实施方案中，该装置包含膜，该膜包含多于一个由多于一个原纤维相互连接的节点。
在一些实施方案中，本公开内容的装置可以包含多层膜。这些多层膜中的至少一个外部膜(exterior membrane)可以是半透性的。然而，也考虑了其中每个膜是半透性的或者其中装置内的至少一个膜基本上是不可渗透的实施方案。此外，装置可以包括两个堆叠的膜、三个堆叠的膜和/或任何其他适当数量的膜，因为本公开内容不限于这种方式。例如，在包含两个膜的一个实施方案中，任一个膜可以是半透性的，并且另一个膜是不可渗透的，或者两者都可以是半透性的。因此，应当理解，本公开内容不限于堆叠结构内的膜的任何特定组合。
在一些实施方案中，装置可以包含设置在装置的内部容积内的至少一个细胞群体。例如，细胞群体可以设置在装置的两个或更多个相对的外部膜之间形成的内部容积内，其中内部容积的外边缘可以由围绕膜或膜的其他适当部分的至少一部分(以及在一些情况下，整个周边)延伸的一个或更多个键限定。在这样的实施方案中，至少装置的外部膜可以被配置成阻断一个或更多个细胞群体离开装置。因此，一个或更多个细胞群体可以保留在装置的内部容积内。虽然注意到使用形成单个内部容积的两个外部膜，但是也可以设想使用位于装置的外部膜和/或装置内的多于一个未连接的内部容积之间的多于一个中间膜。另外，还考虑了单个膜折叠并结合到自身以提供两个相对的膜以形成内部容积的情况。
为了提供期望的选择性，与本文公开的任何装置一起使用的多孔膜可以具有平均孔径大于或等于约1nm、5nm、10nm、15nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、200nm、300nm和/或任何其他合适的尺寸范围的开放多孔结构。相应地，本文描述的各种膜的平均孔径可以具有小于或等于2500nm、2000nm、1700nm、1500nm、1400nm、1300nm、1200nm、1100nm、1000nm、900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm、100nm、90nm、80nm、70nm、60nm、50nm、40nm、30nm、20nm和/或任何其他合适尺寸范围的平均孔径。预期前述的组合，包括例如在1nm和20nm、1nm和2500nm之间或等于1nm和20nm、1nm和2500nm的平均孔径，和/或任何其他合适的组合。虽然上文描述了具体的平均孔径，但是应当理解，任何合适的平均孔径可用于本文描述的各种膜，包括大于和小于上述那些的平均孔径。
为了为大包封(macroencapsulation)装置提供足够的强度和/或刚性，各种膜和框架可以由足够刚性的材料制成。可以通过材料的杨氏模量(也称为弹性模量)、厚度和可与装置的期望渗透性平衡的整体结构的适当组合来提供期望的刚度。本文描述的各种膜和框架的适当杨氏模量可以是至少105Pa、106Pa、107Pa、108Pa、109Pa和/或1010Pa。可以使用用于本文描述的各种膜和框架的其他合适的杨氏模量，包括大于和小于这些范围的模量。预期前述杨氏模量之间的范围包括例如杨氏模量在或等于约106Pa和1010Pa之间。
在一些实施方案中，可以期望包含在大包封装置内的一个或更多个膜是亲水性的，以促进将细胞装载到大包封装置中和/或促进一种或更多种流体、生物化合物、治疗剂、细胞营养物、细胞废物和/或其他材料流过装置的膜。另外，当装置定位在体内时，亲水性外膜(hydrophilic outer membrane)还可以减少纤维化的发生。因此，大包封装置的膜可以由亲水性材料制成和/或用亲水性涂层处理。合适的亲水性涂层可包括但不限于聚羟基丙烯酸酯、PEG、pHPA、羧甲基纤维素、藻酸盐、琼脂糖和/或溶质浸渍的热塑性涂层。合适的亲水性材料还可包括但不限于合适的亲水性聚合物、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚多巴胺、其任何组合和/或能够在膜上形成涂层或膜可由其制成的任何其他合适的亲水性材料。
在一些实施方案中，该装置包含第一膜和第二膜，该第一膜具有包含多于一个通道的第一表面和与第一表面相对的多于一个第二表面；所述第二膜与第一膜的多于一个第二表面相对并附接至第一膜的多于一个第二表面；其中第一膜和第二膜形成具有至少约40cm-l的表面积与体积比的封闭隔室，并且其中封闭隔室提供用于在装置内容纳细胞的容积。
在一些实施方案中，封闭隔室包含单个连续的开放室。在一些实施方案中，容积为约8μL至约1,000μL。在一些实施方案中，装置具有约0.25cm至约3cm的长度和宽度中的至少一个。在一些实施方案中，装置具有至少约300pm的厚度。
在一些实施方案中，多于一个通道通常相对于第一膜垂直。在一些实施方案中，多于一个通道排列成直线阵列。在一些实施方案中，多于一个通道排列成极性阵列。在一些实施方案中，通道具有约400pm至约3,000pm的平均直径。在一些实施方案中，在通道中的最窄点测量直径。在一些实施方案中，每个通道的中心与另一个通道的中心相隔约75pm至约500pm的距离。在一些实施方案中，通道具有至少约0.2的高度直径比。在一些实施方案中，该装置沿横断面的每个区域具有许多个通道，并且在一些实施方案中，数量大于约50/cm2。
在某些实施方案中，可以期望在垂直于装置的最大横向尺寸所在的平面的方向上限制装置的最大厚度。因此，设置在框架内的第一膜和第二膜的一个或更多个内部部分可以黏合在一起以限制膜可以相对于彼此移位的程度。膜的这些黏合部分可以均匀地分散在位于框架内的膜的内部部分内。这些黏合部分可以具有任何合适的形状，包括例如点、线、曲线或任何其他合适的形状。虽然黏合的内部部分可以具有用于所需应用的任何合适的尺寸，但是在使用黏合点的一个实施方案中，黏合点的直径可以大于或等于约0.5mm、0.75mm、1mm、1.25mm、1.5mm和/或任何其他合适的直径。相应地，点的直径可以小于或等于约3mm、2.75mm、2.5mm、2.25mm、2.0mm和/或任何其他合适的直径。考虑了上述范围的组合，包括例如在0.5mm和3mm之间或等于0.5mm和3mm的直径。虽然上面提供了具体的形状和尺寸范围，但是应当理解，考虑了比上面提到的那些更小和更大的其他形状和尺寸，因为本公开内容不限于这种方式。
在一些实施方案中，相邻膜的一个或更多个部分可以黏合在一起，使得装置内的内部容积被细分成多于一个互连的通道，在一些实施方案中，这些通道可以成形为类似管腔，但是也可以使用通道的任何适当的形状或配置。通道可以具有大于或等于40μm、50μm、100μm、200μm、300μm和/或400μm的内部最大横向尺寸，诸如内径。相应地，通道可以具有小于或等于800μm、700μm、600μm、500μm和/或400μm的内部最大横向尺寸。预期前述的组合，包括例如在40μm和800μm之间或等于40μm和800μm的多于一个通道的内部最大横向尺寸。此外，形成装置的各种隔室的互连通道的密度可以在装置的横向平面内具有大于或等于约10个通道/cm2、15个通道/cm2、20个通道/cm2、25个通道/cm2、30个通道/cm2、35个通道/cm2、40个通道/cm2、45个通道/cm2、50个通道/cm2、60个通道/cm2、70个通道/cm2、80个通道/cm2、90个通道/cm2、100个通道/cm2、110个通道/cm2、120个通道/cm2、130个通道/cm2、140个通道/cm2、150个通道/cm2、175个通道/cm2或200个通道/cm2的单位面积密度。还设想了在任何上述通道密度之间延伸的范围，包括例如在约10个通道/cm2和200个通道/cm2之间或等于约10个通道/cm2和200个通道/cm2的通道密度。但是也设想了大于和小于上述范围的密度。
如本文描述的装置可以具有内部容积、外部尺寸和/或其他适当物理参数的任何适当组合。例如，由大包封装置的外膜包围的内部容积可以在40μL和250μL之间或等于40μL和250μL。大包封装置的宽度或最大横向尺寸也可以在约20mm和80mm之间。另外，为了提供所需的氧扩散到大包封装置的内部以支持其中包含的细胞，从装置的外部到包括细胞群体的装置的内部部分的最大氧扩散距离可以小于50μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm或500μm。在一些实施方案中，从装置的外部到包含细胞群体的装置的内部部分的最大氧扩散距离小于或等于150μm。在一些实施方案中，从装置的外部到包含细胞群体的装置的内部部分的最大氧扩散距离小于或等于200μm。在一些实施方案中，从装置的外部到包含细胞群体的装置的内部部分的最大氧扩散距离小于或等于250μm。相应地，整个装置和/或位于装置内的内部容积的最大厚度或垂直于最大横向尺寸的尺寸可以小于50μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm或500μm。在一些实施方案中，整个装置和/或位于装置内的内部容积的最大厚度或垂直于最大横向尺寸的尺寸小于或等于500μm。此外，在一些实施方案中，装置的外表面积与体积比可以大于或等于约20cm-1、40cm-1、60cm-1、80cm-1、100cm-1、120cm-1或150cm-1。还考虑了在各种尺寸和参数的任何前述值之间延伸的范围以及大于和小于上述那些的范围。
在一些实施方案中，第一膜和第二膜中的至少一个包含多于一个由多于一个原纤维相互连接的节点。在一些实施方案中，第一膜和第二膜中的至少一个包括PVDF、PTFE、ePTFE、PCL、PE/PES、PP、PS、PMMA、PLGA、PLLA或其任何组合。在一些实施方案中，该装置还包含穿过通道内的第一膜和/或第二膜的开口。在一些实施方案中，开口相对于通道的同心度至多为通道直径的约25％。在一些实施方案中，存在被配置成接收本文描述的装置的框架。在一些实施方案中，框架被配置成接收多于一个细胞容纳装置。在一些实施方案中，框架包含屈伸机构，该屈伸机构被配置成防止细胞容纳装置屈曲。
在一些实施方案中，所述装置包含多孔聚合物膜，所述多孔聚合物膜包含多于一个开孔，其中所述开孔具有等于或小于1um的平均孔径，其中所述膜具有在10um和150um之间的平均厚度，并且其中所述膜具有至少1MPa的拉伸强度；和细胞群体，其中所述细胞群体包含选自胰腺祖细胞、内分泌细胞、α细胞、δ细胞和β细胞的组中的至少一种，其中所述膜被配置为表现出等于或大于2且小于或等于50的Dfirst/Dsecond比率，其中Dfirst是具有在50Da和10kDa之间或等于50Da和10kDa的第一分子量的第一分子的第一扩散系数，其中Dsecond是具有在50kDa和500kDa之间或等于50kDa和500kDa的第二分子量的第二分子的第二扩散系数，并且其中所述第二分子量与所述第一分子量的比率等于或大于10。在一些实施方案中，该装置包含具有第一表面和与第一表面相对的第二表面的第一膜；以及与第一膜的第二表面相对并附接至第一膜的第二表面的第二膜；其中所述第一膜和所述第二膜形成被配置为容纳细胞群体的封闭隔室，并且其中所述第一膜和所述第二膜中的至少一个被烧结。在一些实施方案中，第一膜和第二膜两者都是烧结的。膜的烧结可用于改变膜的孔隙率和通量性质。例如，烧结可以增加膜的孔隙率，同时保持其孔结构。烧结还可以改进膜的机械稳定性和扩散通量。因此，烧结可用于改变膜的孔隙率和/或机械性能，这又可用于调节大包封装置的孔隙率和通量性能。因此，在一些实施方案中，可以使用烧结和/或未烧结膜的任何期望组合。例如，装置的两个外部膜可以结合在一起，其中烧结膜和未烧结膜结合在一起，两个烧结膜结合在一起，或者两个未烧结膜结合在一起。此外，可以使用位于这些外部膜之间的任何数量的中间膜，其中这些中间膜可以是烧结的或未烧结的。
在一些实施方案中，可植入包封装置包含内部容积，该内部容积包含设置在其中的体外分化的细胞群体或包含本文描述的体外分化的细胞群体的组合物。在一些实施方案中，可植入包封装置包含至少一个膜，该膜至少部分限定了内部容积。在一些实施方案中，至少一个膜包括第一膜和第二膜，其中第一膜和第二膜结合在一起以形成密封件，该密封件至少部分地围绕设置在第一膜和第二膜之间的内部容积延伸。在一些实施方案中，至少一个膜包括选自PVDF、PTFE、ePTFE、PCL、PE/PES、PP、PS、PMMA、PLGA和PLLA的至少一种。在一些实施方案中，至少一个膜包括ePTFE。
在一些实施方案中，在大包封装置的制造过程期间，装置的至少一个、并且在一些情况下至少两个或更多个柔性膜可以变形以至少部分地配合在框架内并随后黏合到框架以形成大包封装置。框架可以将膜保持在期望的构型中，其中膜具有在框架的相对部分之间延伸的期望量的松弛。例如，在一种实施方案中，第一膜和设置在第一膜上的第二膜的外周可以在与框架黏合之前从第一最大横向尺寸变形到小于第一最大横向尺寸的第二最大横向尺寸。这种变形和随后将膜保持在变形构型中可以导致膜以期望的松弛量保持在框架中以容纳包含在框架内的多余材料，并且可以以多种不同的方式实现。
本文描述的大包封装置的各种实施方案中描述的膜可以使用任何适当的黏合方法彼此结合，因为本公开内容不限于这种方式。例如，相邻的膜可以使用黏合剂、环氧树脂、焊接或其他基于熔融的技术(例如，超声黏合、激光黏合、物理黏合、热黏合等)、使用框架或夹具的机械夹紧和/或任何其他适当的黏合方法彼此黏合。在一个具体实施方案中，相邻膜可以使用加热工具结合，所述加热工具用于以预定的压力和/或力将两个或更多个膜彼此按压或撞击设定的融合时间。鉴于上述，应当理解，本公开内容不限于使用用于将膜黏合在一起的任何特定方法。
在一些实施方案中，本公开内容提供了一种包含至少50×106个细胞的装置。在一些实施方案中，本公开内容提供了一种包含不多于800×106个细胞的装置。在一些实施方案中，本公开内容提供了一种包含40×106个细胞和100×106个细胞之间、50×106个细胞和90×106个细胞之间、60×106个细胞和80×106个细胞之间或70×106个细胞和80×106个细胞之间的装置。在一些实施方案中，该装置包含约75×106个细胞。在一些实施方案中，在装置中的10×106个和60×106个之间、10×106个和50×106个之间、10×106个和40×106个之间、10×106个和30×106个之间、25×106个和60×106个之间或25×106个和40×106个之间的细胞是NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞。在一些实施方案中，本公开内容提供了向患者施用一个或更多个装置，其中一个或更多个装置包含至少50×106个细胞。在一些实施方案中，本公开内容提供了向患者施用一个或更多个装置，其中一个或更多个装置包含不多于120×107个细胞。在一些实施方案中，本公开内容提供了向患者施用一个或更多个装置，其中一个或更多个装置包含50×106个细胞和120×107个细胞之间、50×106个细胞和500×106个细胞之间、50×106个细胞和300×106个细胞之间、100×106个细胞和900×106个细胞之间、100×106个细胞和600×106个细胞之间、100×106个细胞和500×106个细胞之间、250×106个细胞和900×106个细胞之间、250×106个细胞和500×106个细胞之间、350×106个细胞和900×106个细胞之间、350×106个细胞和500×106个细胞之间、400×106个细胞和500×106个细胞之间、150×106个细胞和700×106个细胞之间、130×106个细胞和470×106个细胞之间、450×106个细胞和900×106个细胞之间、800×106个细胞和1000×106个细胞之间或450×106个细胞和600×106个细胞之间。在特定实施方案中，本公开内容提供了向患者施用一个或更多个装置，其中一个或更多个装置包含250×106个细胞和500×106个之间的细胞。在一些实施方案中，在一个或更多个装置中的50×106个和800×106个之间、50×106个和400×106个之间、50×106个和300×106个之间、50×106个和800×106个之间、50×106个和200×106个之间、150×106个和800×106个之间、150×106个和500×106个之间、50×106个和250×106个之间、200×106个和800×106个之间、200×106个和500×106个之间、200×106个和300×106个之间、300×106个和800×106个之间或500×106个和800×106个之间的细胞是NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞。在特定实施方案中，在一个或更多个装置中的150×106个和250×106个之间的细胞是NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞。在一些实施方案中，本公开内容提供了向患者施用1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个装置。在一些实施方案中，本公开内容提供了向患者施用2个、4个、6个或8个装置。在一些实施方案中，本公开内容提供了施用4个装置。在一些实施方案中，本公开内容提供了施用6个装置。在一些实施方案中，本公开内容提供了施用2-8个、3-7个或4-6个装置。
本文公开的任何装置中的细胞组合物包含一种或更多种药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，药学上可接受的载体是表面活性剂。在一些实施方案中，药学上可接受的载体是缓冲剂。在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂是DMEM。在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂是DMEM/F12。在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂包含人类血清白蛋白。
在一些实施方案中，例如，本文公开的任何装置经由植入施用至受试者。在一些实施方案中，本文公开的任何装置经肝外施用至受试者。在一些实施方案中，经皮下施用一个或更多个装置。在一些实施方案中，经腹下施用一个或更多个装置。在一些实施方案中，经腹膜施用一个或更多个装置。在一些实施方案中，经腹膜前施用一个或更多个装置。在一些实施方案中，一个或更多个装置被施用至腹壁的腹膜前空间中。在一些实施方案中，一个或更多个装置被施用至前腹壁的腹膜前空间中。
在一些实施方案中，向装置填充细胞直至完成，这允许基于装置的体积容量进行体积剂量计算。例如，可以基于使用例如融合点的单独测量从实体模型的外推来计算装置体积，以考虑装置的不可填充区域。其次，可以使用输出平均直径的自动细胞计数仪器来评估药物物质中每个单个细胞的体积。第三，可以基于经验测试将包封期间细胞的堆积分数估计为特定百分比(例如，80％、80％、90％或在一些实施方案中，88％)。这些测量值可以一起用于通过将装置的体积除以由例如88％的最大容量调整的每个单独细胞的体积来计算填充到装置中的细胞的数量。
在一些实施方案中，在包封之后，需要评估装载到装置中的总细胞的数量以进行剂量计算(该计算可以被称为DCN或装置细胞数量)。在一些实施方案中，对于每个包封的装置计算装置的内部装置体积，类似于在临床胰岛输注中评估的堆积细胞体积的计算。装置细胞数量可以从两个主要输入确定，即可用于容纳细胞的内部装置体积(装置体积)和被包封的单个细胞的体积(细胞体积)。
在一些实施方案中，除了装置(例如，本文公开的任何装置)的融合直径(在各个通道之间黏合的膜)之外，还可以根据制造规格计算机模拟评估装置体积，包括松弛(装置PEEK框架内径与膜外径的关系在装置制造期间保持恒定)。细胞体积从细胞半径计算，细胞半径可以从细胞计数和活力评估报告，所述细胞计数和活力评估由LUNA FX细胞计数器产生，其中每个单独的细胞制备物在包封过程中被加载到装置中。
在一些实施方案中，装置细胞数量(DCN)评估是体积计算，以测量作为装置和细胞体积的函数以恒定填充分数(PF)加载到装置中的细胞数量。
药盒
在一些方面，本公开内容提供了药盒。例如，本公开内容提供了用于在有发展此类疾病的风险的受试者中治疗、改善和/或预防以长时间段内高血糖水平为特征的疾病(例如，糖尿病，例如，1型糖尿病或2型糖尿病)的药盒。在一些实施方案中，药盒包含(a)本文描述的药物组合物，和任选地(b)信息材料。在一些实施方案中，药盒包含(a)本文描述的液体悬浮液中的细胞群体，和任选地(b)信息材料。在一些实施方案中，本公开内容提供了容纳本文公开的任何装置和细胞组合物的容器。在一些实施方案中，容器包含装置和细胞组合物浸入在其中的介质。信息材料可以是与本文描述的方法和/或使用药物组合物进行本文描述的方法相关的描述性、指导性、营销性或其他材料。药物组合物可包含用于单次施用的材料(例如，单剂型)，或可包含用于多次施用的材料(例如，“多剂量”药盒)。
药盒的信息材料的形式不受限制。在一种实施方案中，信息材料可以包括关于药物组合物的生产、有效期、批次或生产地点信息等的信息。在一种实施方案中，信息材料涉及用于施用药物组合物的剂型的方法。
除了本文描述的药物组合物的剂型之外，药盒可以包含其他成分，诸如用于治疗本文描述的疾病的第二药剂。可选地，其他成分可以包含在药盒中，但包含在与本文描述的药物组合物不同的组合物或容器中。在这样的实施方案中，药盒可包含用于混合本文描述的药物组合物和其它成分或用于将本文描述的药物组合物与其它成分一起使用的说明书。
在一些情况下，本文公开的药盒还包含本文公开的免疫应答调节剂，例如用于减少受试者针对输注细胞的移植排斥。在一些实施方案中，免疫应答调节剂不是类固醇或不包含类固醇。在一些情况下，免疫应答调节剂包括类固醇，诸如皮质类固醇。可用于该方法中的免疫应答调节剂的实例可包括嘌呤合成抑制剂如硫唑嘌呤和霉酚酸、嘧啶合成抑制剂如来氟米特和特立氟胺、抗叶酸剂如甲氨蝶呤、他克莫司、环孢素、吡美莫司、阿贝莫司、胍立莫司、来那度胺、泊马度胺、沙利度胺、PDE4抑制剂、阿普斯特、阿那白滞素、西罗莫司、依维莫司、利罗莫司(Ridaforolimus)、坦罗莫司、优美莫司(Umirolimus)、佐他莫司、抗胸腺细胞球蛋白抗体、抗淋巴细胞球蛋白抗体、CTLA-4、其片段及其融合蛋白如阿巴西普和贝拉西普、TNF抑制剂如依那西普和培那西普(Pegsunercept)、阿柏西普、阿法西普、利纳西普、针对补体组分5的抗体如依库珠单抗、抗TNF抗体如阿达木单抗、阿非莫单抗、培塞妥珠单抗、戈利木单抗、英夫利昔单抗和奈瑞莫单抗、针对白介素5的抗体如美泊利单抗、抗IgE抗体如奥马珠单抗、抗干扰素抗体如法拉莫单抗、抗IL-6抗体如艾西莫单抗、针对IL-12和IL-23的抗体如来金珠单抗(Lebrikizumab)和乌司奴单抗、抗IL-17A抗体如苏金单抗、抗CD3抗体如莫罗单抗-CD3、奥昔珠单抗、替利珠单抗和维西珠单抗、抗CD4抗体如克立昔单抗(Clenoliximab)、凯利昔单抗(Keliximab)和扎木单抗(Zanolimumab)、抗CD11a抗体如依法珠单抗、抗CD18抗体如厄利珠单抗(Erlizumab)、抗CD20抗体如奥妥珠单抗、利妥昔单抗、奥瑞珠单抗(Ocrelizumab)和帕考珠单抗(Pascolizumab)、抗CD23抗体如Gomiliximab和鲁昔单抗、抗CD40抗体如替奈昔单抗和托利珠单抗(Toralizumab)、针对CD62L/L-选择素的抗体如阿塞珠单抗、抗CD80抗体如加利昔单抗、抗CD147/基础免疫球蛋白(Basigin)抗体如加维莫单抗(Gavilimomab)、抗CD154抗体如芦利珠单抗(Ruplizumab)、抗BLyS抗体如贝利木单抗和Blisibimod、抗CTLA-4抗体如伊匹木单抗和曲美木单抗、抗CAT抗体如柏替木单抗、乐德木单抗(Lerdelimumab)和美替木单抗(Metelimumab)、抗整合素抗体如那他珠单抗、针对白介素-6受体的抗体如托珠单抗、抗LFA-1抗体如奥度莫单抗、针对IL-2受体/CD25的抗体如巴利昔单抗、达克珠单抗和伊诺莫单抗、针对T-淋巴细胞的抗体(阿佐莫单抗(Zolimomabaritox))如阿托木单抗(Atorolimumab)、西地珠单抗(Cedelizumab)、芳妥珠单抗(Fontolizumab)、马司莫单抗、莫罗木单抗(Morolimumab)、培克珠单抗、瑞利珠单抗、罗维珠单抗(Rovelizumab)、西利珠单抗(Siplizumab)、他利珠单抗、阿替莫单抗(Telimomabaritox)、伐利昔单抗和维帕莫单抗、针对CD25的抗体如阿仑单抗、肌苷一磷酸脱氢酶(IMPDH)的阻断剂如霉酚酸酯、细胞迁移的抑制剂如FTY720。在一些实施方案中，免疫应答调节剂选自由以下组成的组：胸腺球蛋白、依那西普、巴利昔单抗、他克莫司、西罗莫司和霉酚酸酯或其任何组合。
药盒可包含一个或更多个用于含有本文描述的剂型的组合物的容器。在一些实施方案中，药盒包含用于组合物和信息材料的单独容器、分隔物或隔室。例如，药物组合物可以包含在瓶、小瓶或注射器中，并且信息材料可以包含在塑料套管或包装中。在其他实施方案中，药盒的单独元件包含在单个未分开的容器内。例如，本文描述的药物组合物的剂型包含在瓶、小瓶或注射器中，瓶、小瓶或注射器上附有标签形式的信息材料。
实施例
提供以下实施例以进一步说明本公开内容的一些实施方案，但不意图限制本公开内容的范围；通过其示例性性质将理解，可选地使用本领域技术人员已知的其他程序、方法或技术。
实施例1.输注非天然胰腺细胞以治疗人类受试者中糖尿病
本实施例说明了根据本公开内容的一些实施方案通过输注非天然胰腺细胞(下文中也称为“干细胞衍生的胰岛细胞”或“SC-胰岛细胞”)来治疗患有I型糖尿病的人类受试者。以下临床功效和安全性数据说明，示例性制剂被人类受试者良好耐受，并导致血糖控制和胰岛细胞功能恢复的稳健改善。
SC-胰岛细胞，包括能够在体外响应于葡萄糖刺激释放胰岛素的成熟非天然β细胞是由体外分化过程产生的。分化过程遵循6个阶段的逐步方案，从人类胚胎干细胞开始到成熟β细胞的产生，如下文表3中列出的。在第5阶段(S5)之后，将细胞解离并冷冻保存。在第6阶段(S6)之前将冷冻保存的细胞解冻。
表3
输注剂量各自制备为在透气袋中的中的无菌细胞悬浮液，含有共约4×108个悬浮在200mLFRS中的SC-胰岛细胞。
在本研究中，三名受试者接受了SC-胰岛组合物：受试者A1、受试者A2/B2和受试者B2。
受试者A1是一名64岁男性，在22岁时被诊断为患有T1D，具有低血糖意识受损和SHE病史(筛查前1年内报告了3起事件，并且筛查期间报告了另外2起事件)。在筛查时，受试者表现出无残留的内源性β细胞功能，如在4小时MMTT期间检测不到的C-肽所指示的(判定为7pmol/L[0.02ng/mL])。受试者的基线HbA1c为8.6％，并且基线每日胰岛素总剂量为34U/天。
受试者A2/B2是一名35岁女性，在24岁时被诊断为患有T1D，具有低血糖意识受损和SHE病史(筛查前1年内报告了3起事件)。在筛查时，受试者表现出无残留的内源性β细胞功能，如在4小时MMTT期间检测不到的C-肽所指示的(判定为7pmol/L[0.02ng/mL])。受试者的基线HbA1c为7.5％，并且基线每日胰岛素总剂量为25.9U/天。
受试者B1是一名46岁男性，在27岁时被诊断为患有T1D，具有血糖意识受损和SHE病史(筛查前1年内报告了2起事件)。在筛查时，受试者表现出无残留的内源性β细胞功能，如在4小时MMTT期间检测不到的C-肽所指示的(判定为7pmol/L[0.02ng/mL])。受试者的基线HbA1c为7.6％，并且基线每日胰岛素总剂量为45.1U/天。
受试者A1接受1次总计0.4×109个SC-胰岛细胞的VX-880输注。在输注之前，受试者A1接受胸腺球蛋白(ATG)和西罗莫司。受试者A1还在服用依那西普。输注后，受试者A1在第2天和第3天接受一剂量ATG，并在整个研究期间接受他克莫司与西罗莫司或霉酚酸酯作为维持免疫抑制。
受试者A2首先接受“A部分”中总计0.4×109个SC-胰岛细胞的输注。受试者A2随后接受总计0.4×109个SC-胰岛细胞的第二次输注，并且作为受试者B2纳入在“B部分”中，并且因此该受试者被称为“受试者A2/B2”。输注前，受试者A2/B2接受胸腺球蛋白(ATG)和西罗莫司。受试者A2/B2在输注前后还接受了依那西普。输注后，受试者A2/B2在第2天和第3天接受一剂量ATG，并在整个研究期间接受他克莫司和西罗莫司作为维持免疫抑制。
受试者B1接受1次总计0.8×109个SC-胰岛细胞的输注。输注经由肝门静脉被施用。输注前，受试者B1接受胸腺球蛋白(ATG)和西罗莫司。受试者B1在输注前后还接受了依那西普。输注后，受试者B1在第2天和第3天接受一剂量ATG，并且在整个研究期间接受他克莫司和西罗莫司作为维持免疫抑制。
截至数据截止日期，受试者A1在VX-880输注后至第15个月完成随访访视，并且受试者A2/B2在第二次输注后第29天后完成随访访视(第二次输注发生在第一次输注后第269天)。受试者B1在SC胰岛输注后至第180天完成访视。
对MMTT的C-肽和葡萄糖响应
在筛查时和输注后指定时间点使用混合膳食耐受性测试(MMTT)评估胰岛细胞功能，如图1A、图1B和图1C中示出的。筛查时，所有3名受试者的空腹C-肽和刺激C-肽(内源性胰岛素分泌的标志物)均低于检测限，表明无内源性胰岛素产生。在第90天，所有3名受试者均有显著的、具有临床意义的MMTT刺激的峰值C-肽改善，MMTT刺激的峰值C-肽≥200pmol/L(0.60ng/mL)，同时伴随血糖波动降低，表明内源性胰岛素分泌显著(图1A、图1B和图1C)。受试者A1和受试者B1在第180天评估时，MMTT刺激的峰值C-肽水平进一步升高，>1000pmol/L(3.02ng/mL)(图1A、图1B和图1C)；第180天是受试者B1截至数据截止日期的最后一次MMTT评估。对于受试者A1，MMTT刺激的峰值C-肽水平与基线相比的显著增加和血糖波动降低持续到第365天(截至数据截止日期的最后一次MMTT评估)(图1A)。
受试者A1：
在SC胰岛输注前筛查时进行的MMTT期间，空腹C-肽和刺激C-肽低于检测限，并且葡萄糖水平在多个时间点超过400mg/dL(22.2mmol/L)，峰值葡萄糖水平为483mg/dL(26.8mmol/L)。在第90天MMTT，空腹C-肽水平为280pmol/L(0.85ng/mL)，空腹葡萄糖水平为174mg/dL(9.7mmol/L)。MMTT刺激后的C-肽水平增加至560pmol/L(1.69ng/mL)的峰值，同时在4小时MMTT评估期间内，伴随葡萄糖水平不超过214mg/dL(11.9mmol/L)。在第180天还观察到，空腹C-肽和刺激C-肽水平进一步改善，同时伴随刺激葡萄糖水平降低，在此期间C-肽峰值为1146pmol/L(3.46ng/mL)，同时在4小时MMTT评估期间，伴随葡萄糖水平不超过197mg/dL(10.9mmol/L)，并在90分钟至240分钟内持续保持在160mg/dL(8.9mmol/L)以下(图1A)。值得注意的是，在第90天MMTT期间观察到的葡萄糖水平的降低反映了内源性胰岛素的产生；受试者在第90天MMTT之前的一周内连续5天未施用任何外源性胰岛素，并且在第90天MMTT的前一天和当天未施用任何外源性胰岛素。在第180天，在进行MMTT之前的一周内期间，受试者的外源性胰岛素的平均每日剂量仅为1.4U/天。在第270天并持续到第365天，受试者A1被认为符合胰岛素非依赖性标准，即能够滴定退出(titrate off)胰岛素治疗至少1周，HbA1c≤7％，MMTT期间90分钟餐后血清葡萄糖≤180mg/dL(10.0mmol/L)，MMTT期间空腹血清葡萄糖≤126mg/dL(7.0mmol/L)(在-10分钟或0分钟)，以及至少1次MMTT空腹C-肽或刺激C-肽≥166pmol/L(0.50ng/mL)。
受试者A2/B2：
在SC胰岛输注前筛查时进行的MMTT期间，空腹C-肽和刺激C-肽低于检测限，并且葡萄糖水平在多个时间点超过400mg/dL(22.2mmol/L)，峰值葡萄糖水平为452mg/dL(25.1mmol/L)。在第一次输注MMTT后第90天，空腹C-肽水平为45pmol/L(0.14ng/mL)，空腹葡萄糖水平为199mg/dL(11.0mmol/L)。MMTT刺激后的C-肽增加至202pmol/L(0.61ng/mL)的峰值。在4小时MMTT评估期间，伴随葡萄糖水平不超过365mg/dL(20.3mmol/L)(图1B)。在第一次输注后第180天观察到相似的空腹C-肽和刺激C-肽水平和葡萄糖水平。受试者A2/B2在第一次输注后第269天接受了第二次SC胰岛输注，并在第二次输注后随访至第29天。截至数据截止日期，第二次输注后未进行MMTT。
受试者B1：
在SC胰岛输注前筛查时进行的MMTT期间，空腹C-肽和刺激C-肽低于检测限，并且葡萄糖水平在几个时间点超过350mg/dL(19.4mmol/L)，峰值葡萄糖水平为372mg/dL(20.6mmol/L)。在第90天MMTT时，空腹C-肽水平为271pmol/L(0.82ng/mL)，空腹葡萄糖水平为195mg/dL(10.8mmol/L)。MMTT刺激后的C-肽水平增加至659pmol/L(1.99ng/mL)的峰值，同时在4小时MMTT评估期间，伴随葡萄糖水平不超过334mg/dL(18.5mmol/L)(图1C)。在第180天MMTT时，空腹C-肽水平为427pmol/L(1.29ng/mL)，空腹葡萄糖水平为107mg/dL(5.9mmol/L)。MMTT刺激后的C-肽增加至1308pmol/L(3.95ng/mL)的峰值。在4小时MMTT评估期间，伴随葡萄糖水平不超过137mg/dL(7.6mmol/L)。在第180天，受试者B1被认为符合胰岛素非依赖性标准。
HbA1c随时间的变化
受试者在接受SC-胰岛治疗后接受频繁的HbA1c评估(图2A、图2B和图2C)。所有受试者早在第29天就出现了具有临床意义的HbA1c降低，所有3名受试者在某些时间点均达到HbA1c<7％的目标。受试者A1和B1的HbA1c在HbA1c数据截止点的最后一次评估中保持<7％(受试者A1在第15个月为5.4％，并且受试者B1在第180天为6.0％)。受试者A2/B2的HbA1c在第一次输注后第240天增加至8％，并且然后在输注第二剂SC胰岛后第29天降低至6.9％。
受试者A1：
受试者A1在第150天达到了<7％的HbA1c目标(美国糖尿病协会，2020)，并且HbA1c随着时间的推移继续逐渐下降至第270天的5.2％(较基线变化-3.4％)。HbA1c在第270天后稳定，并且与基线相比的下降持续至第15个月的评估，当时HbA1c为5.4％(图2A和表4)。
受试者A2/B2：
对于受试者A2/B2，在基线时观察到HbA1c为7.5％，并且在第29天观察到临床意义的HbA1c减少至<7％，并且在第一次输注SC-胰岛后持续至第120天(图2B和表4)。对于受试者A2/B2，从第150天直至第269天的第二次输注观察到HbA1c>7％。
受试者B1：
对于受试者B1，HbA1c在基线时为7.6％，并且在输注SC-胰岛后逐渐降低。在第180天，HbA1c为6.0％，较基线变化-1.6％(图2C和表4)。
表4HbA1c随时间较基线的变化
HbA1c：血红蛋白A1c；INF2：第二次输注SC-胰岛；N/A：不适用
CGM衍生的参数
受试者被要求在从SC胰岛输注前约4周(基线)和SC胰岛输注后至少365天持续佩戴申办方提供的连续葡萄糖监测(CGM)装置。截至数据截止日期所有受试者的数据总结在图3A、图3B和图3C中。与基线相比，受试者A1和受试者B1的通过CGM测量的处于范围内的时间(time-in-range)增加(70mg/dL至180mg/dL[3.9mmol/L至10.0mmol/L])，高于范围的时间(time-above-range)减少(>180mg/dL[>10.0mmol/L])；对于受试者A2，处于范围内的时间在第一次SC胰岛输注后第29天增加，并保持高于基线至第一次输注后第210天。对于受试者A1，低于范围的时间(time-below-range)(<70mg/dL[<3.9mmol/L])在第56天后降低；对于受试者B1，低于范围的时间在SC胰岛输注后降低。
受试者A1：
受试者A1的处于范围内的时间进行性增加(图3A)。从第270天到第365天，受试者A1的处于范围内的时间>99％。在第56天后还观察到<54mg/dL(3.0mmol/L)的时间进行性并且有意义的减少，这与第35天后不存在SHE相关。
受试者A2/B2：
处于范围内的时间从基线时的35.9％增加到第一次输注后第29天的69.8％，并且保持在高于基线至第一次输注后第210天(图3B)。在第一次输注后第29天，高于范围的时间(>180mg/dL[>10.0mmol/L])减少，并且保持与基线相比的减少至第一次输注后第210天。
受试者B1：
处于范围内的时间从基线时的53.8％增加至第180天的97.3％，同时伴随高于范围的时间和低于范围的时间减少(图3C)。
外源性胰岛素每日总剂量的变化
从基线开始，对所有受试者定期进行外源性胰岛素剂量评估，如图4A、图4B和图4C中示出的。在所有3名受试者中，在SC-胰岛治疗后第90天，每日外源性胰岛素剂量均有临床显著减少。在受试者A1和受试者B1中，每日外源性胰岛素剂量降至零，伴随血糖控制改善，并且两名受试者被认为均符合胰岛素非依赖性的定义。
受试者A1：
在基线的每日外源性胰岛素总剂量(连续7天的平均值[当可用时])为34U/天，在给药SC-胰岛后随时间降低。从第210天开始并持续到第15个月，受试者A1的平均每日胰岛素总剂量为0U/天(从基线减少100％；图4A)。
受试者A2/B2：
受试者A2/B2的每日胰岛素总剂量在基线时为25.9U/天，并且逐渐降低直至第一次SC-胰岛输注后第120天(与基线相比变化-35.9％)。在第一次输注后至第240天的后续随访访视中，受试者A2/B2的每日胰岛素总剂量增加，并且在第240天与基线值相似(图4B)。
受试者B1：
受试者B1的每日胰岛素总剂量在基线时为45.1U/天，并且在第180天降低至0.0U/天(从基线减少100％；图4C)。
本研究令人惊讶地展示，本文公开的SC-胰岛细胞在比本领域建议的更低的细胞剂量是有效的。例如，在Ramzy等人(2021,Cell Stem Cell,28,2047-2061)的独立研究中，被施用高达5×108的干细胞衍生的胰腺内胚层细胞(“PEC”)的受试者即使在植入后26或52个月后也未能示出大于40pM左右的最大峰值刺激C-肽，而受试者A1和A2用4.0×108的SC-胰岛细胞治疗后在仅90天分别示出560pM和202pM的最大峰值刺激C-肽。此外，虽然Ramzy等人的治疗受试者的HbA1c平均稳定，但受试者A1在270天示出HbA1c降低3.9％，而受试者A2在270天示出HbA1c降低0.6％。此外，虽然Ramzy等人的治疗受试者示出胰岛素需求仅平均减少20％，受试者A1在第210天示出胰岛素需求减少100％，并且受试者B2(接受单次剂量的8.0×108的SC-胰岛细胞)在第180天不依赖胰岛素。Ramzy等人假设植入更多的PEC可以增强结果，而本研究令人惊讶地展示本文描述的SC胰岛在低至4.0×108的SC-胰岛细胞的剂量是有效的。
本研究还表明，与基于尸体胰岛的疗法相比，疗效需要更少的SC胰岛细胞。人类尸体胰岛以基于150mm直径的胰岛的“胰岛当量”或“IEQ”测量。在施用至受试者A1、A2/B2和B1的组合物中，基于β-细胞数量/IEQ和基于簇中β-细胞的百分比(“IEQ”)，0.4×109的剂量和0.8×109的SC-胰岛细胞对于70kg个体，可以分别类似于大约4300IEQ/kg和8600IEQ/kg。先前的尸体胰岛研究建议使用高于4300IEQ/kg或8600IEQ/kg剂的剂量来治疗糖尿病患者。例如，Hering等人(2016,Diabetes Care,39:1230-40)涉及接受中位数为11,972IEQ/kg(范围为5,227IEQ/kg-25,553IEQ/kg)的尸体胰岛细胞的患者。同样地，Ramzy等人(引用Shapiro等人.2000,N.Engl.J.Med.343，230-238)表明，总胰岛剂量>11,000IEQ/kg体重的胰岛移植接受者具有更好的结果。本SC-胰岛研究使用远低于11,000IEQ/kg的细胞剂量令人惊讶地显示出强临床功效。
虽然本文已经示出和描述了本公开内容的优选的实施方案，但是对于本领域技术人员将明显的是，这样的实施方案仅以实例的方式提供。在不偏离本公开内容的情况下，本领域技术人员现将想到许多变化、改变和替代。应理解，在实践本公开内容时可以采用本公开内容的实施方案的各种替代方案。所附权利要求旨在限定本公开内容的范围，并且从而涵盖在这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (169)

1.一种治疗有相应需要的受试者的方法，所述方法包括：经由输注将包含液体悬浮液中的细胞群体的第一药物组合物施用至所述受试者，其中所述细胞群体包含1×108个至10×108个、3×108个至8.5×108个、4×108个至8.5×108个或5×108个至8.5×108个细胞，并且其中所述细胞群体包含表达C-肽和ISL1的非天然细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中当在所述施用后至少约1、2、3、4、5或6个月使用混合膳食耐受性测试测量时，所述方法将所述受试者的刺激血液C-肽水平升高至：
a)至少450pmol/L、460pmol/L、470pmol/L、480pmol/L、490pmol/L、500pmol/L、510pmol/L、520pmol/L、530pmol/L、540pmol/L、550pmol/L、700pmol/L、800pmol/L、900pmol/L、1000pmol/L、1400pmol/L和/或
b)150pmol/L-350pmol/L、250pmol/L-400pmol/L、400pmol/L-1400pmol/L、400pmol/L-1200pmol/L、400pmol/L-1000pmol/L、400pmol/L-800pmol/L、400pmol/L-600pmol/L、600pmol/L-800pmol/L、600pmol/L-1400pmol/L或900pmol/L-1200pmol/L之间。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法将所述受试者的刺激血液C-肽水平升高至至少
a)至少450pmol/L、460pmol/L、470pmol/L、480pmol/L、490pmol/L、500pmol/L、510pmol/L、520pmol/L、530pmol/L、540pmol/L、550pmol/L、700pmol/L、800pmol/L、900pmol/L、1000pmol/L、1400pmol/L和/或
b)150pmol/L-350pmol/L、250pmol/L-400pmol/L、400pmol/L-1400pmol/L、400pmol/L-1200pmol/L、400pmol/L-1000pmol/L、400pmol/L-800pmol/L、400pmol/L-600pmol/L、600pmol/L-800pmol/L、600pmol/L-1400pmol/L或900pmol/L-1200pmol/L之间；
c)当在所述施用后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月使用混合膳食耐受性测试测量时。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法将所述受试者的刺激血液C-肽水平升高至：
a)至少200pmol/L、300pmol/L、450pmol/L、460pmol/L、470pmol/L、480pmol/L、490pmol/L、500pmol/L、510pmol/L、520pmol/L、530pmol/L、540pmol/L、550pmol/L、600pmol/L或650pmol/L和/或
b)150pmol/L-350pmol/L、200pmol/L-700pmol/L、150pmol/L-700pmol/L、300pmol/L-650pmol/L或500pmol/L-700pmol/L之间；
c)当在所述施用后约3个月使用混合膳食耐受性测试测量时。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法将所述受试者的刺激血液C-肽水平升高至：
a)至少450pmol/L、460pmol/L、470pmol/L、480pmol/L、490pmol/L、500pmol/L、510pmol/L、520pmol/L、530pmol/L、540pmol/L、550pmol/L、560pmol/L、700pmol/L、800pmol/L、900pmol/L、1000pmol/L、1400pmol/L和/或
b)150pmol/L-350pmol/L、250pmol/L-400pmol/L、400pmol/L-1400pmol/L、400pmol/L-1200pmol/L、400pmol/L-1000pmol/L、400pmol/L-800pmol/L、400pmol/L-600pmol/L、600pmol/L-800pmol/L、600pmol/L-1400pmol/L或900pmol/L-1200pmol/L之间；
c)当在所述施用后约6个月使用混合膳食耐受性测试测量时。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中当在所述施用后至少约1、2、3、4、5或6个月测量时，所述方法将所述受试者在空腹条件下的血液C-肽水平升高至至少100pmol/L、120pmol/L、130pmol/L、150pmol/L、160pmol/L、180pmol/L、200pmol/L、210pmol/L、220pmol/L、230pmol/L、240pmol/L、250pmol/L、260pmol/L、270pmol/L或280pmol/L。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中当在所述施用后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月测量时，所述方法将所述受试者在空腹条件下的血液C-肽水平升高至至少100pmol/L、120pmol/L、130pmol/L、150pmol/L、160pmol/L、180pmol/L、200pmol/L、210pmol/L、220pmol/L、230pmol/L、240pmol/L、250pmol/L、260pmol/L、270pmol/L或280pmol/L。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中当在所述施用后约3个月测量时，所述方法将所述受试者在空腹条件下的血液C-肽水平升高至至少100pmol/L、120pmol/L、130pmol/L、150pmol/L、160pmol/L、180pmol/L、200pmol/L、210pmol/L、220pmol/L、230pmol/L、240pmol/L、250pmol/L、260pmol/L、270pmol/L或280pmol/L。
9.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中当在所述施用后约3个月测量时，所述方法将所述受试者在空腹条件下的血液C-肽水平升高至约200pmol/L、220pmol/L、240pmol/L、260pmol/L或280pmol/L。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中在所述施用之前，当使用混合膳食耐受性测试测量时，所述受试者具有少于100pmol/L、80pmol/L、60pmol/L、40pmol/L、30pmol/L、20pmol/L或10pmol/L的刺激血液C-肽水平。
11.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中在所述施用之前，当使用混合膳食耐受性测试测量时，所述受试者具有检测不到的刺激血液C-肽水平。
12.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中在所述施用之前，当在空腹条件下测量时，所述受试者具有检测不到的刺激血液C-肽水平。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中当在所述施用后至少约1、2、3、4、5或6个月使用HbA1c测试测量时，所述方法将所述受试者的血红蛋白A1c水平(Hb1Ac)水平降低至：
a)少于8％、7.5％、7.0％、6.5％、6.0％或5.5％，和/或
b)5％-8％、5％-7.5％、5％-7％、5％-6.5％、5％-5.5％、5.5％-8％、5.5％-7％、5.5％-6.5％、6％-8％、6％-7％或6％-6.5％之间。
14.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中当在所述施用后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月使用HbA1c测试测量时，所述方法将所述受试者的Hb1Ac水平降低至：
a)少于8％、7.5％、7.0％、6.5％、6.0％、5.5％或5％和/或
b)5％-8％、5％-7.5％、5％-7％、5％-6.5％、5％-5.5％、5.5％-8％、5.5％-7％、5.5％-6.5％、6％-8％、6％-7％或6％-6.5％之间。
15.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中当在所述施用后约3个月测量时，所述方法将所述受试者的Hb1Ac水平降低至：
a)少于8％、7.5％、7.0％或6.75％和/或
b)5％-8.0％、6.5％-8.0％、6.5％-7.5％、6.5％-7.0％或7％-8％之间。
16.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中当在所述施用后约9个月测量时，所述方法将所述受试者的Hb1Ac水平降低至：
a)少于8％、7.5％、7.0％、6.5％、6.0％、5.5％或5％，和/或
b)4.5％-8％、5％-8％、5％-7.5％、5％-7％、5％-6.5％、5％-5.5％、5.5％-8％、5.5％-7％、5.5％-6.5％、6％-8％、6％-7％或6％-6.5％之间。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中在所述施用之前，所述受试者具有多于7.0％、7.3％、7.8％、8.0％、8.1％、8.2％、8.3％、8.4％、8.5％、8.6％、8.8％或9.0％的基线Hb1Ac水平。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中在所述施用之前，所述受试者以至少约20U/天、22U/天、24U/天、26U/天、28U/天、30U/天、32U/天或34U/天的水平接受胰岛素输注。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中在所述施用之前，所述受试者具有严重低血糖事件的病史。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中在所述施用之前，所述受试者具有低血糖意识受损的病史。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中在所述施用之前，所述受试者具有无残留的内源性胰岛细胞功能。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述无残留的内源性胰岛细胞功能由在混合膳食耐受性测试中检测不到的空腹C-肽和检测不到的刺激C-肽指示。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述无残留的内源性胰岛细胞功能由在混合膳食耐受性测试中大于350mg/dL、400mg/dL、450mg/dL、475mg/dL或500mg/dL的持续刺激葡萄糖水平指示。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中在所述施用之前，所述受试者具有大于7.7％、8％、8.2％或8.5％的HbA1c水平。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中在所述施用之前，所述受试者接受大于10单位/天、15单位/天、20单位/天、25单位/天、30单位/天或35单位/天的胰岛素。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述受试者患有以延长时间段内高血糖水平为特征的疾病。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述疾病是糖尿病。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述糖尿病是1型糖尿病。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述细胞群体包含至多约10×108个、8×108个、7×108个、6.5×108个、6×108个、5.5×108个、5×108个、4.5×108个、4×108个、3.5×108个、3×108个、2.5×108个或2×108个细胞。
30.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述细胞群体包含约1×108个至约7×108个、约1×108个至约6×108个、约1×108个至约5×108个、约1×108个至约4×108个、约1×108个至约3×108个、约1×108个至约2×108个、约1.5×108个至约6.5×108个、约2×108个至约7×108个、约2×108个至约6×108个、约2×108个至约5×108个、约2×108个至约4×108个、约2×108个至约3×108个、约2.5×108个至约5.5×108个、约3×108个至约7×108个、约3×108个至约6×108个、约3×108个至约5×108个、约3×108个至约4×108个、约3.5×108个至约4.5×108个或约3.8×108个至约4.2×108个细胞。
31.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述细胞群体包含约3.5×108个至约4.5×108个细胞。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述细胞群体包含约3.5×108个至约8.5×108个细胞。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中经由输注将包含液体悬浮液中的细胞群体的第二药物组合物施用至所述受试者，其中所述细胞群体包含1×108个至10×108个、3×108个至8.5×108个、4×108个至8.5×108个或5×108个至8.5×108个细胞，并且其中所述细胞群体包含表达C-肽和ISL1的非天然细胞，其中所述第二药物组合物在比所述第一药物组合物晚的时间点施用至所述受试者。
34.根据权利要求33所述的方法，其中在向所述受试者施用所述第一药物组合物之后至少3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、15个月或3-12个月、3-10个月、3-9个月、3-7个月、3-5个月、5-12个月、8-10个月、7-12个月、9-15个月或9-12个月之间向所述受试者施用所述第二药物组合物。
35.根据权利要求33或34所述的方法，其中所述第一药物组合物包含3.5×108个至约8.5×108个细胞，并且其中所述第二药物组合物包含3.5×108个至约8.5×108个细胞。
36.根据权利要求33或34所述的方法，其中所述第一药物组合物包含3.5×108个至约8.5×108个细胞，并且其中所述第二药物组合物包含3.5×108个至约4.5×108个细胞。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的方法，其中所述受试者还被施用至少一种免疫抑制剂。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述至少一种免疫抑制剂选自由以下组成的组：胸腺球蛋白、依那西普、巴利昔单抗、他克莫司、西罗莫司和霉酚酸酯。
39.根据权利要求1-36中任一项所述的方法，其中所述受试者还被施用胸腺球蛋白和依那西普。
40.根据权利要求1-36中任一项所述的方法，其中所述受试者还被施用胸腺球蛋白和巴利昔单抗。
41.根据权利要求1-36中任一项所述的方法，其中所述受试者还被施用他克莫司和西罗莫司。
42.根据权利要求1-36中任一项所述的方法，其中所述受试者还被施用他克莫司和巴利昔单抗。
43.根据权利要求1-36中任一项所述的方法，其中所述受试者还被施用西罗莫司和霉酚酸酯。
44.根据权利要求1-43中任一项所述的方法，其中所述第一药物组合物包含糖。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述糖是蔗糖或葡萄糖。
46.根据权利要求44或45所述的方法，其中所述液体悬浮液包含浓度在约0.05％和约1.5％之间的糖。
47.根据权利要求1-46中任一项所述的方法，其中所述第一药物组合物包含CMRL培养基。
48.根据权利要求1-46中任一项所述的方法，其中所述第一药物组合物包含FRS Preservation Media。
49.根据权利要求1-48中任一项所述的方法，其中所述第一药物组合物中的所述细胞群体还包含表达胰高血糖素但不表达生长抑素的非天然细胞和表达生长抑素但不表达胰高血糖素的非天然细胞。
50.根据权利要求49所述的方法，其中：
(a)所述第一药物组合物中的所述细胞群体中30％-90％、30％-80％、30％-70％、30％-60％、30％-50％、30％-40％、40％-90％、40％-80％、40％-70％、40％-60％、40％-50％、50％-90％、50％-80％、50％-70％、50％-60％、60％-90％、60％-80％、60％-70％、70％-90％、70％-80％、70％-90％、70％-80％或80％-90％的细胞表达C-肽和ISL1但不表达VMAT1；
(b)所述第一药物组合物中的所述细胞群体中3％-40％、3％-35％、3％-30％、3％-25％、3％-20％、3％-15％、3％-10％、5％-40％、5％-35％、5％-30％、5％-25％、5％-20％、5％-15％、5％-10％、10％-40％、10％-35％、10％-30％、10％-25％、10％-20％、10％-15％、15％-40％、15％-35％、15％-30％、15％-25％、15％-20％、20％-40％、20％-35％、20％-30％、20％-25％、25％-40％、25％-35％、25％-30％、30％-40％、30％-35％或35％-40％的细胞表达胰高血糖素但不表达生长抑素；和/或
(c)所述第一药物组合物中的所述细胞群体中1％-20％、1％-15％、1％-12％、1％-10％、1％-8％、1％-5％、2％-20％、2％-15％、2％-12％、2％-10％、2％-8％、2％-5％、3％-20％、3％-15％、3％-12％、3％-10％、3％-8％、3％-5％、4％-20％、4％-15％、4％-12％、4％-10％、4％-8％、4％-5％、5％-20％、5％-15％、5％-12％、5％-10％、5％-8％、7％-20％、7％-15％、7％-12％、7％-10％、9％-20％、9％-15％、9％-12％、8％-10％、8％-12％、8％-15％、8％-20％、10％-20％、10％-12％、10％-15％、12％-20％、12％-15％或15％-20％的细胞表达生长抑素但不表达胰高血糖素。
51.根据权利要求49所述的方法，其中：
(a)所述细胞群体中30％-90％、30％-80％、30％-70％、30％-60％、30％-50％、30％-40％、40％-90％、40％-80％、40％-70％、40％-60％、40％-50％、50％-90％、50％-80％、50％-70％、50％-60％、60％-90％、60％-80％、60％-70％、70％-90％、70％-80％、70％-90％、70％-80％或80％-90％的细胞表达C-肽和ISL1但不表达VMAT1；
(b)所述细胞群体中3％-40％、3％-35％、3％-30％、3％-25％、3％-20％、3％-15％、3％-10％、5％-40％、5％-35％、5％-30％、5％-25％、5％-20％、5％-15％、5％-10％、10％-40％、10％-35％、10％-30％、10％-25％、10％-20％、10％-15％、15％-40％、15％-35％、15％-30％、15％-25％、15％-20％、20％-40％、20％-35％、20％-30％、20％-25％、25％-40％、25％-35％、25％-30％、30％-40％、30％-35％或35％-40％的细胞表达胰高血糖素但不表达生长抑素；和
(c)所述细胞群体中1％-20％、1％-15％、1％-12％、1％-10％、1％-8％、1％-5％、2％-20％、2％-15％、2％-12％、2％-10％、2％-8％、2％-5％、3％-20％、3％-15％、3％-12％、3％-10％、3％-8％、3％-5％、4％-20％、4％-15％、4％-12％、4％-10％、4％-8％、4％-5％、5％-20％、5％-15％、5％-12％、5％-10％、5％-8％、7％-20％、7％-15％、7％-12％、7％-10％、9％-20％、9％-15％、9％-12％、8％-10％、8％-12％、8％-15％、8％-20％、10％-20％、10％-12％、10％-15％、12％-20％、12％-15％或15％-20％的细胞表达生长抑素但不表达胰高血糖素。
52.根据权利要求49所述的方法，其中：
(a)所述细胞群体中35％-60％的细胞表达C-肽和ISL1但不表达VMAT1；
(b)所述细胞群体中4％-25％的细胞表达胰高血糖素但不表达生长抑素；和
(c)所述细胞群体中1％-10％的细胞表达生长抑素但不表达胰高血糖素。
53.根据权利要求49所述的方法，其中：
(a)所述细胞群体中40％-60％的细胞表达C-肽和ISL1但不表达VMAT1；
(b)所述细胞群体中10％-25％的细胞表达胰高血糖素但不表达生长抑素；和
(c)所述细胞群体中4％-10％的细胞表达生长抑素但不表达胰高血糖素。
54.根据权利要求1-53中任一项所述的方法，其中所述细胞群体中少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于18％、少于15％、少于12％或少于10％的细胞表达VMAT1但不表达C-肽。
55.根据权利要求1-54中任一项所述的方法，其中根据流式细胞术确定，所述第一药物组合物中不少于50％、40％、30％或20％的细胞是NKX6.1+/ISL1+细胞。
56.根据权利要求55所述的方法，其中根据流式细胞术确定，所述第一药物组合物中不少于20％的细胞是NKX6.1+/ISL1+细胞。
57.根据权利要求1-56中任一项所述的方法，其中根据流式细胞术确定，所述第一药物组合物中不少于40％、35％、30％、26％、25％或20％的细胞是NKX6.1-/ISL1+细胞。
58.根据权利要求57所述的方法，其中根据流式细胞术确定，所述第一药物组合物中不少于26％的细胞是NKX6.1-/ISL1+细胞。
59.根据权利要求1-58中任一项所述的方法，其中根据流式细胞术确定，所述第一药物组合物中5％-25％、5％-40％、5％-35％或8％-20％之间的细胞是NKX6.1-/ISL1+细胞。
60.根据权利要求1-59中任一项所述的方法，其中根据流式细胞术确定，所述第一药物组合物中不多于50％、45％、40％、35％、30％或25％的细胞是NKX6.1+/ISL1-细胞。
61.根据权利要求60所述的方法，其中根据流式细胞术确定，所述第一药物组合物中不多于50％的细胞是NKX6.1+/ISL1-细胞。
62.根据权利要求1-61中任一项所述的方法，其中根据流式细胞术确定，所述药物组合物中20％-60％、20％-50％、20％-45％、20％-40％、20％-35％、20％-30％、20％-25％、25％-50％、25％-40％、25％-35％、30％-60％、30％-50％、30％-40％、30％-35％、35％-50％、40％-50％的细胞是NKX6.1+/ISL1+细胞。
63.根据权利要求1-62中任一项所述的方法，其中根据流式细胞术确定，所述药物组合物中20％-60％、20％-50％、20％-45％、20％-40％、20％-35％、20％-30％、20％-25％、25％-50％、25％-40％、25％-35％、30％-60％、30％-50％、30％-40％、30％-35％、35％-50％或40％-50％的细胞是NKX6.1-/ISL1+细胞。
64.根据权利要求1-62中任一项所述的方法，其中根据流式细胞术确定，所述药物组合物中20％-50％、20％-45％、20％-40％、20％-35％、20％-30％、20％-25％、25％-50％、25％-40％、25％-35％、30％-60％、30％-50％、30％-40％、30％-35％、35％-50％、40％-50％、10％-20％或10％-25％之间的细胞是NKX6.1+/ISL1-细胞。
65.根据权利要求1-64中任一项所述的方法，其中：
a)所述组合物中至少30％的细胞是NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞；
b)所述组合物中至少25％的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阳性细胞；
c)所述组合物中少于12％的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阴性细胞；和/或
d)所述组合物中9％-25％之间的细胞是NKX6.1阳性、ISL1阴性细胞。
66.根据权利要求1-65中任一项所述的方法，其中所述组合物包含在体外显示GSIS的NKX6.1+/ISL1+细胞。
67.根据权利要求1-66中任一项所述的方法，其中所述组合物包含在体内显示GSIS的NKX6.1+/ISL1+细胞。
68.根据权利要求1-67中任一项所述的方法，其中所述细胞群体在体外从干细胞产生。
69.根据权利要求1-68中任一项所述的方法，其中所述细胞群体中表达C-肽和ISL1但不表达VMAT1的非天然细胞在体外表现出葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。
70.根据权利要求69所述的方法，其中由表达C-肽和ISL1但不表达VMAT1的非天然细胞响应于葡萄糖刺激分泌的胰岛素与所述葡萄糖刺激的葡萄糖浓度成比例。
71.根据权利要求69或70所述的方法，其中所述表达C-肽和ISL1但不表达VMAT1的非天然细胞分泌的胰岛素响应于第一葡萄糖刺激、第二葡萄糖刺激和第三葡萄糖刺激分泌胰岛素，其中所述第一葡萄糖刺激、所述第二葡萄糖刺激和所述第三葡萄糖刺激顺序地施加。
72.根据权利要求1-71中任一项所述的方法，其中所述细胞群体中的所述细胞的至少一部分以多于一个细胞簇存在。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述细胞簇的直径为约50μm至约500μm、约50μm至约400μm、约50μm至约300μm、约60μm至约400μm、约60μm至约300μm、约60μm至约250μm、约75μm至约400μm、约75μm至约300μm、约75μm至约250μm、约125μm至约225μm、约130μm至约160μm、约170μm至约225μm、约140μm至约200μm、约140μm至约170μm、约160μm至约220μm、约170μm至约215μm或约170μm至约200μm。
74.根据权利要求1-71中任一项所述的方法，其中所述细胞群体作为单细胞悬浮液存在于所述第一药物组合物中。
75.根据权利要求1-74中任一项所述的方法，其中在所述第一药物组合物中，所述细胞群体悬浮在无血清溶液中。
76.根据权利要求1-75中任一项所述的方法，还包括向所述受试者施用免疫应答调节剂。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述免疫应答调节剂与所述第一药物组合物同时施用。
78.根据权利要求76所述的方法，其中所述免疫应答调节剂在所述第一药物组合物之前或之后施用。
79.根据权利要求76-78中任一项所述的方法，其中所述免疫应答调节剂不是类固醇。
80.根据权利要求76-79中任一项所述的方法，其中所述免疫应答调节剂包括硫唑嘌呤、霉酚酸、来氟米特、特立氟胺、甲氨蝶呤、他克莫司、环孢素、吡美莫司、阿贝莫司、胍立莫司、来那度胺、泊马度胺、沙利度胺、PDE4抑制剂、阿普斯特、阿那白滞素、西罗莫司、依维莫司、利罗莫司、坦罗莫司、优美莫司、佐他莫司、抗胸腺细胞球蛋白抗体、抗淋巴细胞球蛋白抗体、CTLA-4、阿巴西普、贝拉西普、依那西普、培那西普、阿柏西普、阿法西普、利纳西普、依库珠单抗、阿达木单抗、阿非莫单抗、培塞妥珠单抗、戈利木单抗、英夫利昔单抗、奈瑞莫单抗、美泊利单抗、奥马珠单抗、法拉莫单抗、艾西莫单抗、来金珠单抗、乌司奴单抗、苏金单抗、莫罗单抗-CD3、奥昔珠单抗、替利珠单抗、维西珠单抗、克立昔单抗、凯利昔单抗、扎木单抗、依法珠单抗、厄利珠单抗、奥妥珠单抗、利妥昔单抗、奥瑞珠单抗、帕考珠单抗、gomiliximab、鲁昔单抗、替奈昔单抗、托利珠单抗、阿塞珠单抗、加利昔单抗、加维莫单抗、芦利珠单抗、贝利木单抗、blisibimod、伊匹木单抗、曲美木单抗、柏替木单抗、乐德木单抗、美替木单抗、那他珠单抗、托珠单抗、奥度莫单抗、巴利昔单抗、达克珠单抗、伊诺莫单抗、阿托木单抗、西地珠单抗、芳妥珠单抗、马司莫单抗、莫罗木单抗、培克珠单抗、瑞利珠单抗、罗维珠单抗、西利珠单抗、他利珠单抗、阿替莫单抗、伐利昔单抗、维帕莫单抗、阿仑单抗、霉酚酸酯、FTY720或其任何组合。
81.根据权利要求76-79中任一项所述的方法，其中所述免疫应答调节剂包括他克莫司、环孢素、霉酚酸酯、硫唑嘌呤、依维莫司、西罗莫司、阿巴西普、贝拉西普、抗胸腺细胞球蛋白、阿仑单抗、利妥昔单抗、巴利昔单抗、达克珠单抗、莫罗单抗-CD3、依法珠单抗、FTY720或其任何组合。
82.根据权利要求76-78中任一项所述的方法，其中所述免疫应答调节剂包括皮质类固醇。
83.根据权利要求1-82中任一项所述的方法，其中所述第一药物组合物被输注到所述受试者的门静脉中。
84.根据权利要求1-83中任一项所述的方法，其中所述受试者接受单剂量的所述第一药物组合物。
85.根据权利要求1-84中任一项所述的方法，其中所述表达C-肽和ISL1的非天然细胞获自包含PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性细胞的细胞培养物，所述细胞培养物用以下处理：i)TGF-β信号通路抑制剂(例如，Alk5i)、ii)甲状腺激素信号通路激活剂(例如，GC-1)、iii)BMP通路抑制剂(例如，LDN193189)、iv)ROCK抑制剂(例如，thiazovivin)、v)蛋白激酶抑制剂(例如，星形孢菌素)和/或vi)表观遗传修饰剂(例如，DZNEP)。
86.根据权利要求1-85中任一项所述的方法，其中所述表达C-肽和ISL1的非天然细胞获自包含PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性细胞的细胞培养物，所述细胞培养物用以下处理至少3天：i)TGF-β信号通路抑制剂(例如，Alk5i)、ii)甲状腺激素信号通路激活剂(例如，GC-1)、iii)BMP通路抑制剂(例如，LDN193189)、iv)ROCK抑制剂(例如，thiazovivin)、v)蛋白激酶抑制剂(例如，星形孢菌素)和/或vi)表观遗传修饰剂(例如，DZNEP)。
87.根据权利要求85或86所述的方法，其中所述PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性细胞还用人类血清白蛋白处理。
88.根据权利要求85-87中任一项所述的方法，其中所述PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性细胞还用人类血清白蛋白处理至少6天。
89.根据权利要求85-87中任一项所述的方法，其中所述PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性细胞获自包含PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阴性细胞的细胞培养物，所述细胞培养物用以下处理：i)TGF-β信号通路抑制剂(例如，Alk5i)、ii)TH信号通路激活剂(例如，Sant1)、iii)至少一种SHH通路抑制剂(例如，Sant1)、iv)RA信号通路激活剂(例如，视黄酸)、v)γ-分泌酶抑制剂(例如，XXI)、vi)至少一种来自表皮生长因子(EGF)家族的生长因子(例如，β细胞素)、vii)BMP通路抑制剂(例如，LDN193189)、viii)ROCK抑制剂(例如，thiazovivin)、ix)蛋白激酶抑制剂(例如，星形孢菌素)、和/或x)表观遗传修饰剂(例如，DZNEP)。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性细胞获自包含PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阴性细胞的细胞培养物，所述细胞培养物用以下处理2天或3天：i)TGF-β信号通路抑制剂(例如，Alk5i)、ii)TH信号通路激活剂(例如，GC-1)、iii)至少一种SHH通路抑制剂(例如，Sant1)、iv)RA信号通路激活剂(例如，视黄酸)、v)γ-分泌酶抑制剂(例如，XXI)、vi)至少一种来自表皮生长因子(EGF)家族的生长因子(例如，β细胞素)、vii)BMP通路抑制剂(例如，LDN193189)、viii)ROCK抑制剂(例如，thiazovivin)、ix)蛋白激酶抑制剂(例如，星形孢菌素)、和/或x)表观遗传修饰剂(例如，DZNEP)，然后使所述PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞与以下接触四天或五天的时间段：i)TGF-β信号通路抑制剂(例如，Alk5i)、ii)TH信号通路激活剂(例如，GC-1)、iii)γ-分泌酶抑制剂(例如，XXI)、iv)BMP通路抑制剂(例如，LDN193189)、v)ROCK抑制剂(例如，thiazovivin)、vi)蛋白激酶抑制剂(例如，星形孢菌素)、和vii)表观遗传修饰剂(例如DZNEP)。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阳性细胞获自包含PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阴性细胞的细胞培养物，所述细胞培养物用以下处理2天或3天：i)TGF-β信号通路抑制剂(例如，Alk5i)、ii)TH信号通路激活剂(例如，GC-1)、iii)至少一种SHH通路抑制剂(例如，Sant1)、iv)RA信号通路激活剂(例如，视黄酸)、v)γ-分泌酶抑制剂(例如，XXI)、vi)至少一种来自表皮生长因子(EGF)家族的生长因子(例如，β细胞素)、vii)BMP通路抑制剂(例如，LDN193189)、viii)ROCK抑制剂(例如，thiazovivin)、ix)蛋白激酶抑制剂(例如，星形孢菌素)、和/或x)表观遗传修饰剂(例如，DZNEP)，然后在不存在i)SHH通路抑制剂(例如，Sant1)、ii)RA信号通路激活剂(例如，视黄酸)、和iii)来自表皮生长因子(EGF)家族的生长因子(例如，β细胞素)的情况下使所述PDX1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞与以下接触四天或五天的时间段：i)TGF-β信号通路抑制剂(例如，Alk5i)、ii)TH信号通路激活剂(例如，GC-1)、iii)γ-分泌酶抑制剂(例如，XXI)、iv)BMP通路抑制剂(例如，LDN193189)、v)ROCK抑制剂(例如，thiazovivin)、vi)蛋白激酶抑制剂(例如，星形孢菌素)、和vii)表观遗传修饰剂(例如，DZNEP)。
92.根据权利要求89-91中任一项所述的方法，其中所述PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阴性细胞获自包含PDX1阳性、NKX6.1阴性细胞的细胞培养物，所述细胞培养物用以下处理：i)至少一种来自FGF家族的生长因子(例如，KGF)、ii)至少一种SHH通路抑制剂(例如，Sant1)、iii)RA信号通路激活剂(例如，视黄酸)、iv)ROCK抑制剂(例如，thiazovivin)和v)至少一种来自TGF-β超家族的因子(例如，激活素A)。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所述PDX1阳性、NKX6.1阳性、胰岛素阴性细胞获自包含PDX1阳性、NKX6.1阴性细胞的细胞培养物，所述细胞培养物用以下处理5天的时间段：i)至少一种来自FGF家族的生长因子(例如，KGF)、ii)至少一种SHH通路抑制剂(例如，Sant1)、iii)RA信号通路激活剂(例如，视黄酸)、iv)ROCK抑制剂(例如，thiazovivin)和v)至少一种来自TGFβ超家族的因子(例如，激活素A)。
94.根据权利要求92或93所述的方法，其中所述PDX1阳性、NKX6.1阴性细胞获自包含PDX1阴性原始肠道细胞的细胞培养物，所述细胞培养物用以下处理：i)视黄酸信号通路激活剂、ii)至少一种来自FGF家族的因子(例如，KGF)、iii)SHH通路抑制剂(例如，Sant1)、iv)PKC激活剂(例如，PDBU)、v)ROCK抑制剂(例如，thiazovivin)和vi)BMP通路抑制剂(例如，DMH-1)。
95.根据权利要求94所述的方法，其中所述PDX1阳性、NKX6.1阴性细胞获自包含PDX1阴性原始肠细胞的细胞培养物，所述细胞培养物用以下处理1天：i)视黄酸信号通路激活剂、ii)至少一种来自FGF家族的因子(例如，KGF)、iii)SHH通路抑制剂(例如，Sant1)、iv)PKC激活剂(例如，PDBU)、v)ROCK抑制剂(例如，thiazovivin)和vi)BMP通路抑制剂(例如，DMH-1)，然后使所述细胞与以下接触另外一天：i)视黄酸信号通路激活剂、ii)至少一种来自FGF家族的因子(例如，KGF)、iii)SHH通路抑制剂(例如，Sant1)、iv)PKC激活剂(例如，PDBU)、v)ROCK抑制剂(例如，thiazovivin)。
96.根据权利要求95所述的方法，其中所述PDX1阳性、NKX6.1阴性细胞获自包含PDX1阴性原始肠细胞的细胞培养物，所述细胞培养物用以下处理1天：i)视黄酸信号通路激活剂、ii)至少一种来自FGF家族的因子(例如，KGF)、iii)SHH通路抑制剂(例如，Sant1)、iv)PKC激活剂(例如，PDBU)、v)ROCK抑制剂(例如，thiazovivin)和vi)BMP通路抑制剂(例如，DMH-1)，然后在不存在BMP通路抑制剂的情况下使所述细胞与以下接触另外的一天：i)视黄酸信号通路激活剂、ii)至少一种来自FGF家族的因子(例如，KGF)、iii)SHH通路抑制剂(例如，Sant1)、iv)PKC激活剂(例如，PDBU)、v)ROCK抑制剂(例如，thiazovivin)。
97.根据权利要求94-96中任一项所述的方法，其中所述PDX1阴性原始肠细胞获自用来自FGF家族的因子(例如，KGF)处理的包含定形内胚层细胞的培养物。
98.根据权利要求97所述的方法，其中所述PDX1阴性原始肠细胞获自用来自FGF家族的因子(例如，KGF)处理3天的时间段的包含定形内胚层细胞的培养物。
99.根据权利要求97或98所述的方法，其中所述定形内胚层细胞获自用来自TGFβ超家族的因子(例如，激活素A)和WNT信号通路激活剂(例如，CHIR99021)处理的包含多能干细胞的培养物。
100.根据权利要求99所述的方法，其中所述定形内胚层细胞获自包含多能干细胞的培养物，所述细胞培养物用来自TGFβ超家族的因子(例如，激活素A)和WNT信号通路激活剂(例如，CHIR99021)处理一天，然后使所述细胞与来自TGF-β超家族的因子(例如，激活素A)接触另外的两天。
101.一种药物组合物，所述药物组合物被配制用于输注，所述药物组合物包含液体悬浮液中的细胞群体，其中所述细胞群体包含约1×108个至约10×108个、3×108个至8.5×108个、4×108个至8.5×108个或5×108个至8.5×108个细胞，并且其中所述细胞群体包含表达C-肽和ISL1的非天然细胞。
102.根据权利要求101所述的药物组合物，其中所述细胞群体包含至多约8×108个、7×108个、6.5×108个、6×108个、5.5×108个、5×108个、4.5×108个、4×108个、3.5×108个、3×108个、2.5×108个或2×108个细胞。
103.根据权利要求101所述的药物组合物，其中所述细胞群体包含约1×108个至约7×108个、约1×108个至约6×108个、约1×108个至约5×108个、约1×108个至约4×108个、约1×108个至约3×108个、约1×108个至约2×108个、约1.5×108个至约6.5×108个、约2×108个至约7×108个、约2×108个至约6×108个、约2×108个至约5×108个、约2×108个至约4×108个、约2×108个至约3×108个、约2.5×108个至约5.5×108个、约3×108个至约7×108个、约3×108个至约6×108个、约3×108个至约5×108个、约3×108个至约4×108个、约3.5×108个至约4.5×108或约3.8×108个至约4.2×108个细胞。
104.根据权利要求101所述的药物组合物，其中所述细胞群体包含约3.5×108个至约4.5×108个细胞。
105.根据权利要求101所述的药物组合物，其中所述细胞群体包含约3.5×108个至约8.5×108个细胞。
106.根据权利要求101-105中任一项所述的药物组合物，其中所述细胞群体还包含表达胰高血糖素但不表达生长抑素的非天然细胞和表达生长抑素但不表达胰高血糖素的非天然细胞。
107.根据权利要求106所述的药物组合物，其中：
(a)所述细胞群体中30％-90％、30％-80％、30％-70％、30％-60％、30％-50％、30％-40％、40％-90％、40％-80％、40％-70％、40％-60％、40％-50％、50％-90％、50％-80％、50％-70％、50％-60％、60％-90％、60％-80％、60％-70％、70％-90％、70％-80％、70％-90％、70％-80％或80％-90％的细胞表达C-肽和ISL1但不表达VMAT1；
(b)所述细胞群体中3％-40％、3％-35％、3％-30％、3％-25％、3％-20％、3％-15％、3％-10％、5％-40％、5％-35％、5％-30％、5％-25％、5％-20％、5％-15％、5％-10％、10％-40％、10％-35％、10％-30％、10％-25％、10％-20％、10％-15％、15％-40％、15％-35％、15％-30％、15％-25％、15％-20％、20％-40％、20％-35％、20％-30％、20％-25％、25％-40％、25％-35％、25％-30％、30％-40％、30％-35％或35％-40％的细胞表达胰高血糖素但不表达生长抑素；和/或
(c)所述细胞群体中1％-20％、1％-15％、1％-12％、1％-10％、1％-8％、1％-5％、2％-20％、2％-15％、2％-12％、2％-10％、2％-8％、2％-5％、3％-20％、3％-15％、3％-12％、3％-10％、3％-8％、3％-5％、4％-20％、4％-15％、4％-12％、4％-10％、4％-8％、4％-5％、5％-20％、5％-15％、5％-12％、5％-10％、5％-8％、7％-20％、7％-15％、7％-12％、7％-10％、9％-20％、9％-15％、9％-12％、8％-10％、8％-12％、8％-15％、8％-20％、10％-20％、10％-12％、10％-15％、12％-20％、12％-15％或15％-20％的细胞表达生长抑素但不表达胰高血糖素。
108.根据权利要求106所述的药物组合物，其中：
(a)所述细胞群体中30％-90％、30％-80％、30％-70％、30％-60％、30％-50％、30％-40％、40％-90％、40％-80％、40％-70％、40％-60％、40％-50％、50％-90％、50％-80％、50％-70％、50％-60％、60％-90％、60％-80％、60％-70％、70％-90％、70％-80％、70％-90％、70％-80％或80％-90％的细胞表达C-肽和ISL1但不表达VMAT1；
(b)所述细胞群体中3％-40％、3％-35％、3％-30％、3％-25％、3％-20％、3％-15％、3％-10％、5％-40％、5％-35％、5％-30％、5％-25％、5％-20％、5％-15％、5％-10％、10％-40％、10％-35％、10％-30％、10％-25％、10％-20％、10％-15％、15％-40％、15％-35％、15％-30％、15％-25％、15％-20％、20％-40％、20％-35％、20％-30％、20％-25％、25％-40％、25％-35％、25％-30％、30％-40％、30％-35％或35％-40％的细胞表达胰高血糖素但不表达生长抑素；和
(c)所述细胞群体中1％-20％、1％-15％、1％-12％、1％-10％、1％-8％、1％-5％、2％-20％、2％-15％、2％-12％、2％-10％、2％-8％、2％-5％、3％-20％、3％-15％、3％-12％、3％-10％、3％-8％、3％-5％、4％-20％、4％-15％、4％-12％、4％-10％、4％-8％、4％-5％、5％-20％、5％-15％、5％-12％、5％-10％、5％-8％、7％-20％、7％-15％、7％-12％、7％-10％、9％-20％、9％-15％、9％-12％、8％-10％、8％-12％、8％-15％、8％-20％、10％-20％、10％-12％、10％-15％、12％-20％、12％-15％或15％-20％的细胞表达生长抑素但不表达胰高血糖素。
109.根据权利要求106所述的药物组合物，其中：
(a)所述细胞群体中35％-60％的细胞表达C-肽和ISL1但不表达VMAT1；
(b)所述细胞群体中4％-25％的细胞表达胰高血糖素但不表达生长抑素；和
(c)所述细胞群体中1％-10％的细胞表达生长抑素但不表达胰高血糖素。
110.根据权利要求106所述的药物组合物，其中：
(a)所述细胞群体中40％-60％的细胞表达C-肽和ISL1但不表达VMAT1；
(b)所述细胞群体中10％-25％的细胞表达胰高血糖素但不表达生长抑素；和
(c)所述细胞群体中4％-10％的细胞表达生长抑素但不表达胰高血糖素。
111.根据权利要求101-110中任一项所述的药物组合物，其中所述细胞群体中少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于18％、少于15％、少于12％或少于10％的细胞表达VMAT1但不表达C-肽。
112.根据权利要求101-111中任一项所述的药物组合物，其中根据流式细胞术确定，所述药物组合物中不少于50％、40％、30％或20％的细胞是NKX6.1+/ISL1+细胞。
113.根据权利要求112所述的药物组合物，其中根据流式细胞术确定，所述药物组合物中不少于20％的细胞是NKX6.1+/ISL1+细胞。
114.根据权利要求101-113中任一项所述的药物组合物，其中根据流式细胞术确定，所述药物组合物中不少于40％、35％、30％、26％、25％或20％的细胞是NKX6.1-/ISL1+细胞。
115.根据权利要求114所述的药物组合物，其中根据流式细胞术确定，所述药物组合物中不少于26％的细胞是NKX6.1-/ISL1+细胞。
116.根据权利要求101-115中任一项所述的药物组合物，其中根据流式细胞术确定，所述药物组合物中5％-25％、5％-40％、5％-35％或8％-20％之间的细胞是NKX6.1-/ISL1+细胞。
117.根据权利要求101-116中任一项所述的药物组合物，其中根据流式细胞术确定，所述药物组合物中不多于50％、45％、40％、35％、30％或25％的细胞是NKX6.1+/ISL1-细胞。
118.根据权利要求117所述的药物组合物，其中根据流式细胞术确定：
a)所述组合物中至少30％的细胞是NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞；
b)所述组合物中至少25％的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阳性细胞；
c)所述组合物中少于12％的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阴性细胞；和/或
d)所述组合物中9％-25％之间的细胞是NKX6.1阳性、ISL1阴性细胞。
119.根据权利要求101-118中任一项所述的药物组合物，其中所述细胞群体在体外从干细胞产生。
120.根据权利要求101-119中任一项所述的药物组合物，其中所述表达C-肽和ISL1但不表达VMAT1的非天然细胞在体外表现出葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。
121.根据权利要求120所述的药物组合物，其中由所述表达C-肽和ISL1但不表达VMAT1的非天然细胞响应于葡萄糖刺激分泌的胰岛素与所述葡萄糖刺激的葡萄糖浓度成比例。
122.根据权利要求120或121所述的药物组合物，其中由所述表达C-肽和ISL1但不表达VMAT1的非天然细胞分泌的胰岛素响应于第一葡萄糖刺激、第二葡萄糖刺激和第三葡萄糖刺激分泌胰岛素，其中所述第一葡萄糖刺激、所述第二葡萄糖刺激和所述第三葡萄糖刺激顺序地施加。
123.根据权利要求101-122中任一项所述的药物组合物，其中所述细胞群体中的至少一部分细胞以多于一个细胞簇存在。
124.根据权利要求123所述的药物组合物，其中所述细胞簇的直径为约50μm至约500μm、约50μm至约400μm、约50μm至约300μm、约60μm至约400μm、约60μm至约300μm、约60μm至约250μm、约75μm至约400μm、约75μm至约300μm、约75μm至约250μm、约125μm至约225μm、约130μm至约160μm、约170μm至约225μm、约140μm至约200μm、约140μm至约170μm、约160μm至约220μm、约170μm至约215μm或约170μm至约200μm。
125.根据权利要求101-122中任一项所述的药物组合物，其中所述细胞群体作为单细胞悬浮液存在于所述药物组合物中。
126.根据权利要求101-125中任一项所述的药物组合物，其中所述细胞群体悬浮在无血清溶液中。
127.一种药盒，所述药盒包含：
(a)根据权利要求101-126中任一项所述的药物组合物，和
(b)用于向有相应需要的受试者施用所述药物组合物的说明书。
128.一种药盒，所述药盒包含：
(a)被配制用于输注的药物组合物，其中所述药物组合物包含悬浮液中的细胞群体，其中所述细胞群体包含至少约1×108个细胞，并且其中所述细胞群体包含表达C-肽和ISL1的非天然细胞；和
(b)用于向有相应需要的受试者施用所述药物组合物的说明书。
129.根据权利要求127或128所述的药盒，还包含免疫应答调节剂。
130.根据权利要求129所述的药盒，其中所述免疫应答调节剂不是类固醇。
131.根据权利要求129所述的药盒，其中所述免疫应答调节剂包括硫唑嘌呤、霉酚酸、来氟米特、特立氟胺、甲氨蝶呤、他克莫司、环孢素、吡美莫司、阿贝莫司、胍立莫司、来那度胺、泊马度胺、沙利度胺、PDE4抑制剂、阿普斯特、阿那白滞素、西罗莫司、依维莫司、利罗莫司、坦罗莫司、优美莫司、佐他莫司、抗胸腺细胞球蛋白抗体、抗淋巴细胞球蛋白抗体、CTLA-4、阿巴西普、贝拉西普、依那西普、培那西普、阿柏西普、阿法西普、利纳西普、依库珠单抗、阿达木单抗、阿非莫单抗、培塞妥珠单抗、戈利木单抗、英夫利昔单抗、奈瑞莫单抗、美泊利单抗、奥马珠单抗、法拉莫单抗、艾西莫单抗、来金珠单抗、乌司奴单抗、苏金单抗、莫罗单抗-CD3、奥昔珠单抗、替利珠单抗、维西珠单抗、克立昔单抗、凯利昔单抗、扎木单抗、依法珠单抗、厄利珠单抗、奥妥珠单抗、利妥昔单抗、奥瑞珠单抗、帕考珠单抗、Gomiliximab、鲁昔单抗、替奈昔单抗、托利珠单抗、阿塞珠单抗、加利昔单抗、加维莫单抗、芦利珠单抗、贝利木单抗、blisibimod、伊匹木单抗、曲美木单抗、柏替木单抗、乐德木单抗、美替木单抗、那他珠单抗、托珠单抗、奥度莫单抗、巴利昔单抗、达克珠单抗、伊诺莫单抗、阿托木单抗、西地珠单抗、芳妥珠单抗、马司莫单抗、莫罗木单抗、培克珠单抗、瑞利珠单抗、罗维珠单抗、西利珠单抗、他利珠单抗、阿替莫单抗、伐利昔单抗、维帕莫单抗、阿仑单抗、霉酚酸酯、FTY720或其任何组合。
132.根据权利要求129所述的药盒，其中所述免疫应答调节剂包括他克莫司、环孢素、霉酚酸酯、硫唑嘌呤、依维莫司、西罗莫司、阿巴西普、贝拉西普、抗胸腺细胞球蛋白、阿仑单抗、利妥昔单抗、巴利昔单抗、达克珠单抗、莫罗单抗-CD3、依法珠单抗、FTY720或其任何组合。
133.根据权利要求129所述的药盒，其中所述免疫应答调节剂包括皮质类固醇。
134.根据权利要求127-133中任一项所述的药盒，其中所述药盒包含用于向具有严重低血糖事件病史的受试者施用所述药物组合物的说明书。
135.根据权利要求127-134中任一项所述的药盒，其中所述药盒包含用于向具有低血糖意识受损的病史的受试者施用所述药物组合物的说明书。
136.根据权利要求127-135中任一项所述的药盒，其中所述药盒包含用于将所述药物组合物施用至具有无残留的内源性胰岛细胞功能的受试者的说明书。
137.根据权利要求136所述的药盒，其中所述无残留的内源性胰岛细胞功能由在混合膳食耐受性测试中检测不到的空腹C-肽和检测不到的刺激C-肽指示。
138.根据权利要求136或137所述的药盒，其中所述无残留的内源性胰岛细胞功能由在混合膳食耐受性测试中大于350mg/dL、400mg/dL、450mg/dL、475mg/dL或500mg/dL的持续刺激葡萄糖水平指示。
139.根据权利要求127-138中任一项所述的药盒，其中所述药盒包含用于向具有大于7.7％、8％、8.2％或8.5％的HbA1c水平的受试者施用所述药物组合物的说明书。
140.根据权利要求127-139中任一项所述的药盒，其中所述药盒包含用于将所述药物组合物施用至已接受大于10单位/天、15单位/天、20单位/天、25单位/天、30单位/天或35单位/天胰岛素的受试者的说明书。
141.根据权利要求127-140中任一项所述的药盒，其中所述药盒包含用于将所述药物组合物施用至患有以延长时间段内高血糖水平为特征的疾病的受试者的说明书。
142.根据权利要求141所述的药盒，其中所述疾病是糖尿病。
143.根据权利要求141所述的药盒，其中所述疾病是1型糖尿病。
144.一种包封组合物，所述包封组合物包含40×106个细胞和100×106个细胞之间、50×106个细胞和90×106个细胞之间、60×106个细胞和80×106个细胞之间、70×106个细胞和80×106个细胞之间的SC-胰岛细胞。
145.根据权利要求144所述的包封组合物，其中所述装置中10×106个和60×106个之间、10×106个和50×106个之间、10×106个和40×106个之间、10×106个和30×106个之间、25×106个和60×106个之间或25×106个和40×106个之间的细胞是NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞。
146.根据权利要求144或145所述的包封组合物，其中所述包封组合物是特别适合用于持续释放制剂的可降解材料。
147.根据权利要求146所述的包封组合物，其中所述可降解材料包括生物相容性聚合物，诸如聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、甲基纤维素、透明质酸或胶原蛋白。
148.根据权利要求144或145所述的包封组合物，其中所述包封组合物是装置。
149.根据权利要求148所述的包封组合物，其中所述装置包含一个或更多个半透膜。
150.根据权利要求149所述的包封组合物，其中所述一个或更多个半透膜包括由以下制成的一个或更多个：聚(丙交酯)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和其他聚羟基酸、聚(己内酯)、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酐、聚磷腈、聚氨基酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、可生物降解的聚氨酯、白蛋白、胶原蛋白、纤维蛋白、聚氨基酸、谷醇溶蛋白、藻酸盐、琼脂糖、琼脂糖与明胶、右旋糖酐、聚丙烯酸酯、乙烯-乙酸乙烯酯聚合物及其他酰基取代的乙酸纤维素及其衍生物、聚氨酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯、聚(乙烯基咪唑)、氯磺化聚烯烃、聚氧化乙烯或其任何组合。
151.根据权利要求149或150所述的包封组合物，其中所述半透膜是亲水性的或包含亲水性涂层。
152.根据权利要求148-151中任一项所述的包封组合物，其中所述装置包含多于一个孔，其中所述孔包含：a)大于或等于约1nm、5nm、10nm、15nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、200nm、300nm和/或任何其他合适尺寸范围的平均孔径；和/或小于或等于2500nm、2000nm、1700nm、1500nm、1400nm、1300nm、1200nm、1100nm、1000nm、900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm、100nm、90nm、80nm、70nm、60nm、50nm、40nm、30nm、20nm的平均孔径。
153.根据权利要求148-151中任一项所述的包封组合物，其中所述装置包含多孔聚合物膜，所述多孔聚合物膜包含多于一个开孔，其中所述开孔具有等于或小于1um的平均孔径，其中所述膜具有在10um和150um之间的平均厚度，并且其中所述膜具有至少1MPa的拉伸强度；其中所述膜被配置为表现出等于或大于2且小于或等于50的Dfirst/Dsecond比率，其中Dfirst是具有在50Da与10kDa之间或等于50Da与10kDa的第一分子量的第一分子的第一扩散系数，其中Dsecond是具有在50kDa与500kDa之间或等于50kDa与500kDa的第二分子量的第二分子的第二扩散系数，并且其中所述第二分子量与所述第一分子量的比率等于或大于10。
154.根据权利要求148-152中任一项所述的包封组合物，其中所述装置包含具有第一表面和与所述第一表面相对的第二表面的第一膜；以及与所述第一膜的所述第二表面相对并附接至所述第一膜的所述第二表面的第二膜；其中所述第一膜和所述第二膜形成被配置为容纳细胞群体的封闭隔室，并且其中所述第一膜和所述第二膜中的一个或两者是被烧结的。
155.根据权利要求144-154中任一项所述的包封组合物，其中所述组合物包含DMEM。
156.根据权利要求144-155中任一项所述的包封组合物，其中所述组合物包含人类血清白蛋白。
157.一种治疗患有I型糖尿病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用一个或更多个权利要求144-156中任一项所述的装置。
158.根据权利要求157所述的方法，其中，所述一个或更多个装置包含50×106个细胞和120×106个细胞之间、50×106个细胞和500×106个细胞之间、50×106个细胞和300×106个细胞之间、100×106个细胞和900×106个细胞之间、100×106个细胞和600×106个细胞之间、100×106个细胞和500×106个细胞之间、250×106个细胞和900×106个细胞之间、250×106个细胞和500×106个细胞之间、350×106个细胞和900×106个细胞之间、350×106个细胞和500×106个细胞之间、400×106个细胞和500×106个细胞之间、150×106个细胞和700×106个细胞之间、130×106个细胞和470×106个细胞之间、450×106个细胞和900×106个细胞之间或450×106个细胞和600×106个细胞之间的细胞。
159.根据权利要求157或158所述的方法，其中所述一个或更多个装置中50×106个和800×106个之间、50×106个和400×106个之间、50×106个和300×106个之间、50×106个和800×106个之间、50×106个和200×106个之间、150×106个和800×106个之间、150×106个和500×106个之间、50×106个和250×106个之间、200×106个和800×106个之间、200×106个和500×106个之间、200×106个和300×106个之间、300×106个和800×106个之间或500×106个和800×106个之间的细胞是NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞。
160.根据权利要求157和159中任一项所述的方法，其中所述患者被施用1-8个、2-6个或4-6个之间的装置。
161.根据权利要求157和159中任一项所述的方法，其中所述患者被施用1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个装置。
162.根据权利要求157-159中任一项所述的方法，其中所述一个或更多个装置经肝外被施用至所述受试者。
163.根据权利要求157-160中任一项所述的方法，其中所述一个或更多个装置经皮下被施用至所述受试者。
164.根据权利要求157-163中任一项所述的方法，其中所述一个或更多个装置经腹膜前被施用至所述受试者。
165.根据权利要求157-164中任一项所述的方法，其中所述受试者不被施用选自由以下组成的组的免疫抑制剂：胸腺球蛋白、依那西普、巴利昔单抗、他克莫司、西罗莫司和霉酚酸酯。
166.根据权利要求1-100中任一项所述的方法，其中所述组合物中35％-55％的细胞是NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞；其中所述组合物中25％-45％的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阳性细胞；并且其中所述多于一个细胞中1％-12％的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阴性细胞。
167.根据权利要求101-126所述的组合物，其中所述组合物中35％-55％的细胞是NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞；其中所述组合物中25％-45％的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阳性细胞；并且其中所述多于一个细胞中1％-12％的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阴性细胞。
168.根据权利要求144-156所述的包封组合物，其中所述包封组合物中35％-55％的细胞是NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞；其中所述包封组合物中25％-45％的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阳性细胞；并且其中所述多于一个细胞中1％-12％的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阴性细胞。
169.根据权利要求157-165所述的方法，其中所述包封组合物中35％-55％的细胞是NKX6.1阳性、ISL1阳性细胞；其中所述包封组合物中25％-45％的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阳性细胞；并且其中所述多于一个细胞中1％-12％的细胞是NKX6.1阴性、ISL1阴性细胞。
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