CN118652958A - 一种基于双重Pull down的DNA亲和纯化测序建库方法 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种基于双重Pull down的DNA亲和纯化测序建库方法，属于基因测序技术领域。本申请提供的方法是在生物体外，两种不同的蛋白相互结合之后，进一步与DNA结合，获得与两种蛋白复合体结合的DNA，再进行高通量测序。该方法与ChIP‑seq相比，可以解决抗体限制，重复性成功率低，需用到有毒试剂的问题；与普通DAP‑seq相比，可以对形成异源二聚体的转录因子进行结合位点检测，还能够检测两种转录因子之间的互作。

Description

一种基于双重Pull down的DNA亲和纯化测序建库方法

技术领域

本申请属于基因测序技术领域，尤其涉及一种基于双重Pull down的DNA亲和纯化测序建库方法。

背景技术

ChIP-seq是研究表观遗传学的重要手段之一，在抗体质量很好的情况下能够有效检测到转录因子结合位点。但是局限如下：体内实验，重复性和成功率都比较低；需要用到甲醛等有毒试剂；对抗体要求很高，难以对所有转录因子进行实验。

基于ChIP-seq的问题，衍生出了体外进行转录因子-DNA互作的方法，DNA亲和纯化测序即DAP-seq。DAP-seq解决了体内实验的不稳定以及实验对抗体的高要求，进行体外实验，且不需要转录因子高质量抗体。

但是DAP-seq目前的局限在于，只能进行单个转录因子的单体与DNA的亲和纯化测序，无法解决同源、异源二聚体或多聚体，与DNA的结合位点检测。

发明内容

为解决上述技术问题，本申请提供了一种基于双重Pull down的DNA亲和纯化测序建库方法，该方法为在生物体外，两种不同的蛋白相互结合之后，进一步与DNA结合，获得与两种蛋白复合体结合的DNA，再进行高通量测序。

为了实现上述发明目的，本申请提供以下技术方案：

本申请提供了一种基于双重Pull down的DNA亲和纯化测序建库方法，包括如下步骤：

(1)提取目标样本的基因组DNA；

(2)对所述基因组DNA进行DNA片段化，得到DNA片段；

(3)将所述DNA片段进行文库构建，得到DNA文库；

(4)获取带有不同标签的两种转录因子表达载体；

(5)将等量的两种转录因子表达载体置于同一体外蛋白表达体系中，进行体外蛋白表达，得到表达产物；

(6)使用不同标签蛋白纯化磁珠依次对所述表达产物进行纯化，得到纯化产物；

(7)将所述纯化产物与步骤(3)中的DNA文库结合，依次进行孵育、洗脱，得到洗脱后的DNA文库；

(8)将所述洗脱后的DNA文库进行PCR扩增，得到测序文库；

(9)对所述测序文库进行测序、分析，即可。

可选地，步骤(2)中，所述DNA片段的大小为200～400bp。

可选地，步骤(2)中，所述DNA片段的大小独立地选自200bp、250bp、300bp、350bp、400bp中的任意值或任意两者之间的范围值。

可选地，步骤(3)中，所述文库构建依次包括末端修复和接头连接。

可选地，所述末端修复的反应体系为：0.8～1.2μL的DNA片段，2.8～3.2μL的NEXTflex^TMEnd-Repair&Adenylation Enzyme Mix 2.0，2.8～3.2μL的NEXTflex^TMEnd-Repair&Adenylation Buffer Mix 2.0，NFW补至50μL。

优选地，所述末端修复的反应体系为：1μL的DNA片段，3μL的NEXTflex^TMEnd-Repair&Adenylation Enzyme Mix 2.0，3μL的NEXTflex^TMEnd-Repair&Adenylation BufferMix 2.0，NFW补至50μL。

可选地，所述末端修复的反应条件为：18～22℃，28～32min→64～66℃，28～32min→3～5℃，恒温孵育。

优选地，所述末端修复的反应条件为：20℃，30min→65℃，30min→4℃，恒温孵育。

可选地，所述接头连接的反应体系为：48～52μL的末端修复产物，2.8～3.2μL的genobaits接头，44～45μL的NEXTflex^TMLigase Enzyme Mix，2.8～3.2μL的NEXTflex^TMLigase Buffer Mix。

优选地，所述接头连接的反应体系为：50μL的末端修复产物，3μL的genobaits接头，44.5μL的NEXTflex^TMLigase Enzyme Mix，3μL的NEXTflex^TMLigase Buffer Mix。

可选地，所述接头连接的反应条件为：18～22℃，14～16min→3～5℃，恒温孵育。

优选地，所述接头连接的反应条件为：20℃，15min→4℃，恒温孵育。

可选地，步骤(4)包括：

S1、选取转录因子1和转录因子2；

S2、根据转录因子1和转录因子2的编码CDS序列分别设计PCR扩增引物；

S3、使用PCR扩增引物分别扩增转录因子1的编码CDS序列和转录因子2的编码CDS序列；

S4、将转录因子1的编码CDS序列和转录因子2的编码CDS序列分别构建到蛋白表达载体1和蛋白表达载体2上；

S5、将蛋白表达载体1和蛋白表达载体2分别转化到大肠杆菌中进行培养；

S6、挑取单克隆菌落进行测序，筛选出与转录因子1和转录因子2的编码CDS序列一致的表达载体，得到表达载体菌株；

S7、提取转录因子1的蛋白表达质粒和转录因子2的蛋白表达质粒，即得带有不同标签的两种转录因子表达载体；

步骤S1中，所述转录因子1和转录因子2之间存在相互作用关系，能共同调控同一基因的表达。

可选地，步骤S2中，转录因子1的编码CDS序列如SEQ ID No.1所示。

可选地，转录因子2的编码CDS序列如SEQ ID No.2所示。

可选地，步骤S3中，转录因子1的编码CDS序列的扩增引物如SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4所示。

可选地，转录因子2的编码CDS序列的扩增引物如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。

可选地，步骤S4中，所述蛋白表达载体1和蛋白表达载体2的初始表达载体独立地为pf3k。

可选地，所述蛋白表达载体1带有Flag标签；

所述Flag标签的上游序列如SEQ ID No.7所示；

所述Flag标签的下游序列如SEQ ID No.8所示。

可选地，所述蛋白表达载体2带有Myc标签；

所述Myc标签的上游序列如SEQ ID No.9所示；

所述Myc标签的下游序列如SEQ ID No.10所示。

可选地，步骤(5)中，所述体外蛋白表达的试剂包括：28～32μL的TNT mix，各0.8～1.2μL的两种转录因子表达载体，无酶水补至50μL。

优选地，步骤(5)中，所述体外蛋白表达的试剂包括：30μL的TNT mix，各1μL的两种转录因子表达载体，无酶水补至50μL。

可选地，所述体外蛋白表达的温度为28～32℃；

所述体外蛋白表达的时间为1.8～2.2h。

可选地，所述体外蛋白表达的温度独立地选自28℃、29℃、30℃、31℃、32℃中的任意值或任意两者之间的范围值。

可选地，所述体外蛋白表达的时间独立地选自1.8h、1.9h、2h、2.1h、2.2h中的任意值或任意两者之间的范围值。

可选地，步骤(6)中，所述不同标签蛋白纯化磁珠包括Flag标签纯化磁珠和Myc标签纯化磁珠。

可选地，步骤(7)中，所述孵育的时间为1.8～2.2h。

可选地，步骤(7)中，所述孵育的时间独立地选自1.8h、1.9h、2h、2.1h、2.2h中的任意值或任意两者之间的范围值。

可选地，步骤(8)中，所述PCR扩增的反应体系包括：14～16μL的洗脱后的DNA文库，0.8～1.2μL的Universal Primer，0.8～1.2μL的Index Primer，24～26μL的2×KAPA HIFImix，无酶水补至50μL。

优选地，步骤(8)中，所述PCR扩增的反应体系包括：15μL的洗脱后的DNA文库，1μL的Universal Primer，1μL的Index Primer，25μL的2×KAPA HIFI mix，无酶水补至50μL。

可选地，所述Universal Primer的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示；

所述Index Primer的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示。

可选地，步骤(8)中，所述PCR扩增的反应程序为：97～99℃，2.5～3.5min，1cycle→97～99℃，9～11s；58～62℃，28～32s；70～73℃，28～32s；28～32cycle→70～73℃，1.5～2.5min，1cycle→3～5℃，恒温备用。

优选地，步骤(8)中，所述PCR扩增的反应程序为：98℃，3min，1cycle→98℃，10s；60℃，30s；72℃，30s；30cycle→72℃，2min，1cycle→4℃，恒温备用。

可选地，步骤(9)中，所述测序的策略为PE150，测序量为5.8～6.2G。

可选地，步骤(9)中，测序量独立地选自5.8G、5.9G、6G、6.1G、6.2G中的任意值或任意两者之间的范围值。

与现有技术相比，本申请包括以下有益效果：

本申请提供的方法是在生物体外，两种不同的蛋白相互结合之后，进一步与DNA结合，获得与两种蛋白复合体结合的DNA，再进行高通量测序。该方法与ChIP-seq相比，可以解决抗体限制，重复性成功率低，需用到有毒试剂的问题；与普通DAP-seq相比，可以对形成异源二聚体的转录因子进行结合位点检测，还能够检测两种转录因子之间的互作。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本申请蛋白表达载体1(pf3k-flag)和蛋白表达载体2(pf3k-Myc)的质粒信息图；

图2为本申请的DNA提取结果；

图3为本申请的蛋白预表达结果；

图4为本申请的文库构建结果。

具体实施方式

下面结合具体的实施例，进一步阐述本申请。以下所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如下，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

如无特别说明，本申请的实施例中的原料均通过商业途径购买，不经任何特殊处理直接使用。

如无特别说明，实施例中的分析方法均采用仪器或设备的常规设置和常规分析方法。

实施例1

本实施例选取来自于杨树的WRKY和HSF转录因子来进行实验。

WRKY因其特殊的七肽保守序列WRKYGOK而得名，是植物中最大的转录因子家族之一，广泛参与植物对生物、非生物和激素胁迫的响应。WRKY TFs主要通过特异性结合靶基因启动子的顺式作用元件(W-box)来调控靶基因的表达和参与到植物响应不同生物、非生物和激素的信号通路中以及与多种蛋白发生相互作用来实现其在不同信号转导途径中的功能。HSF转录因子家族是植物热胁迫响应的关键组分之一，在植物热胁迫记忆中发挥重要作用。作为一种环境适应性响应，植物可以在适度热胁迫条件下获得耐热性，这种耐热性可以维持一段时间并且该过程涉及到记忆相关基因的持续诱导，从而提高其对后续再次发生的热胁迫的耐受性。

本实施例中选取的这两个转录因子能够相互作用，调控靶基因的表达。

一、引物设计

根据转录因子WRKY和HSF的编码CDS(Coding sequence)序列设计PCR扩增引物。其中，WRKY的编码CDS序列如SEQ ID No.1所示，HSF的编码CDS序列如SEQ ID No.2所示。

使用同源重组方法进行载体构建，初始载体为pf3k，蛋白表达载体插入位点上下游序列如下：

Flag标签载体的上游序列如SEQ ID No.7所示：ATTGCCTGACAAGCTGAGGGCCACCCTTCTATCCCCACCGCGCGATC GCG

下游序列如SEQ ID No.8所示：GACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGACTA CAA。

Myc标签载体的上游序列如SEQ ID No.9所示：ATTGCCTGACAAGCTGAGGGCCACCCTTCTATCCCCACCGCGCGATC GCG；

下游序列如SEQ ID No.10所示：GAGCAGAAACTCATCTCTGAAGAGGATCTGGAGCAGAAACTCATCT CTGA。

最终得到的蛋白表达载体1(pf3k-flag)和蛋白表达载体2(pf3k-Myc)的质粒信息图如图1所示。

结合基因序列分别设计WRKY转录因子和HSF转录因子的扩增引物，如表1所示。

表1

二、转录因子目的片段扩增

1、扩增模板含有转录因子目的基因的质粒，使用Qubit进行浓度定量后进行稀释，稀释液终浓度为～1ng/μl。扩增投入模板量1ng。

2、酶和Buffer从冰箱中拿出需立即插入冰上，其他试剂可放入双面板在常温下进行缓化。

3、配制目的片段PCR扩增反应体系置于冰上；

4、配置好体系后指弹或涡旋混匀，瞬时离心，保证反应液全部在PCR管底部，侧壁无液体残留，管内无气泡(少量气泡亦可)。

5、进行PCR扩增。

6、扩增完毕后，将PCR产物进行1.2％琼脂糖电泳，对照marker，使用手术刀片将含有预期大小的DNA片段的凝胶切下。

7、使用艾德莱胶回收试剂盒进行凝胶回收。

三、无缝克隆

使用诺唯赞无缝克隆试剂盒C112进行克隆连接。

根据试剂盒说明书进行体系配置：

线性化载体80ng

DNA目的片段60ng

5×CE buffer 2μl

重组酶1μl

ddH₂O to 10μl

加完体系后指弹或涡旋混匀，瞬时离心，保证反应液全部在PCR管底部，侧壁无液体残留，管内无气泡(少量气泡亦可)，置于PCR仪上37℃30min。

四、质粒转化

将感受态细胞从-80℃冰箱拿出，迅速插入冰中，在冰中融化。

向感受态细胞悬液中加入5μl连接反应液，轻轻转动离心管混匀内容物。混合后插入冰上静置30分钟。

将离心管置于42℃金属浴中放置45秒，然后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2分钟，此过程勿摇动离心管。

在无菌条件下(使用前超净工作台紫外开启灭菌15分钟，通风5分钟后)向每个离心管中加入900μl无菌的液体LB培养基(不加抗生素),混匀后置于浮漂上，放恒温摇床内37℃200rpm，震荡培养1h，使菌体复苏。

五、菌落培养

将步骤四复苏的菌体置于离心机，3000rpm、5min离心。

无菌条件下，弃上清，使用涂布棒将沉淀涂布到含有相应抗生素(所用载体抗性为Kan+)的LB固体培养基培养皿上，均匀涂开。

等培养皿的液体完全吸收后，用封口膜封口。

倒置培养皿，37℃过夜培养(16小时)。

六、单克隆菌落鉴定

在无菌条件下，准备好灭菌的8联排PCR管或1.5ml离心，用记号笔标明样品名称，加入10μl无酶水。

拿出长有菌落的培养皿，将外侧缠绕的封口膜去掉，打开培养皿盖子，对准较大的单个菌落，用10μl枪头轻轻挑出，在准备好的无酶水中吹吸搅动，每个培养皿取4个单克隆菌落。

取新的8联排配制菌落PCR反应体系：

模板(上一步无酶水)1μl

Tag酶(2×)5μl

引物(正向)1μl

引物(反向)1μl

ddH₂O 2μl

加完体系后指弹或涡旋混匀，瞬时离心，保证反应液全部在PCR管底部，侧壁无液体残留，管内无气泡(少量气泡亦可)，上PCR仪器进行扩增。

向剩余的9μl无酶水中加入100μl、kan抗性的液体LB，放入恒温摇床中，37℃、150rpm，孵育6小时。

PCR结束后，取5μl PCR产物进行1.8％琼脂糖电泳检测。

七、菌液测序

根据菌落PCR电泳，挑选符合预期大小的菌液进行一代测序。

返回测序结果后，使用DNAMAN软件，将测序结果和基因序列进行比对，得到测序成功的菌液样本。

八、质粒提取

序列比对结果符合后，将剩余菌液混匀后，取10μl放于10ml含有抗生素(Kan+)的LB液体培养基内，37℃200rpm过夜培养，以肉眼明显能看出浑浊为佳。

使用天根高纯度质粒小提中量试剂盒进行质粒提取。

提取结束后，对质粒进行Qubit浓度测定及1.8％琼脂糖电泳检测，得到质粒浓度。

九、蛋白预表达

使用promega公司麦胚无细胞蛋白表达系统进行蛋白表达。

配置反应体系如下：

TNT mix 6μl

蛋白表达载体Flag or Myc 400ng

无酶水to 10μl

将反应体系混匀后，置于恒温金属浴上，30℃培养2h。

孵育结束后，向表达体系中加入2μl 5x SDS loading，混匀，置于恒温金属浴上98℃孵育10min，将蛋白变性，备用wb检测。

蛋白预表达结果如图2所示。

十、预表达Wb检测

制作SDS-PAGE凝胶。

将变性后的蛋白上样到凝胶中，电泳。

电泳结束后进行转膜，使用bio-rad公司，trans-turbo半干式转膜仪，将检测样品及marker从PAGE胶上转印到PVDF膜上。

将带有待测样品的PVDF膜，分别使用对应抗体的一抗溶液进行赋予，本实验中WRKY及HSF转录因子分别对应FLAG及MYC标签。

一抗孵育结束后，使用溶液进行漂洗。

漂洗结束后，进行二抗孵育。二抗选择根据一抗物种，本申请中一抗为鼠源抗体，二抗选择为羊抗鼠抗体。

二抗孵育结束后，使用溶液进行漂洗。

二抗漂洗结束后，使用美仑ECL检测试剂盒进行检测。

使用凝胶成像仪进行拍摄，化学发光模式，检测待测蛋白条带大小是否符合预期。

十一、DNA提取

将预先装有钢珠的2.0ml离心管放于双面板上，每个组织材料至少需准备4个管。

从液氮中取出组织材料，迅速打开包装，用预冷的小号镊子夹出样品，尽快将样品切成碎段，迅速放入预先装有钢珠的2.0ml离心管内，盖好盖子，立刻将离心管放入液氮中。

将自动研磨仪自带的金属模块浸入液氮中预冷后，放置研磨仪上。将装有样品的2.0ml离心管，放入模块内，运行研磨仪。停止后取出样品迅速观察研磨后的样品是否符合标准(肉眼看不到大颗粒即可)。

取下离心管，在离心管内加入2％CTAB溶液900μl，将离心管置于金属浴中孵育，65℃40分钟。期间颠倒或涡旋混匀三次。

取出离心管放入台式离心机中离心，12000rmp 5分钟，离心期间准备新2.0ml离心管。

缓慢吸取700μl上清液于事先准备好的新离心管中，加入等体积DNA抽提试剂(金克隆EX-0128)，上下混匀，放入台式离心机中离心，12000rmp10分钟。

离心期间准备新1.5ml离心管，缓慢吸取500μl上清液于事先准备好的新离心管中，加入350μl预冷过后的异丙醇，颠倒或涡旋混匀，放入-20℃冰箱冷藏1小时。

将离心管取出，放入台式离心机中离心，12000rmp、5分钟。弃掉上清。在离心管沉淀中加入80％乙醇溶液600μl，上下颠倒几次，将同一样品沉淀转移至同一个离心管中，弃掉酒精，开盖将沉淀晾干。

待管内沉淀彻底晾干后，加入含有RNA酶的ddH₂O 80μl，将离心管置于金属浴中孵育，37℃、30分钟。待DNA溶解后，取1μl DNA进行Qubit定量，根据浓度取50ng进行琼脂糖电泳。DNA提取结果如图1所示。

十二、文库构建

使用Bioo Scientific公司DNA建库试剂盒，货号5188-03进行DNA文库构建。

取1μg提取完毕的基因组DNA，使用covaris s220仪器进行DNA片段化。DNA片段大小预期200～400bp，主带在300bp左右。

按照表2反应体系配置末端修复试剂：

表2

用移液器吹打混匀，瞬时离心收集，放入PCR仪器进行孵育，反应条件如表3所示：

表3

按照表4反应体系配置接头连接试剂：

表4

用移液器吹打混匀，瞬时离心收集，放入PCR仪器进行孵育，反应条件如表5所示：

表5

连接结束后，向离心管中加入65μl无酶水及35μl Cleanup Beads2.0，充分混匀，室温静置5min。

将离心管置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清，加入80％乙醇，漂洗两次。

弃尽乙醇，将离心管保持在磁力架上晾干，至磁珠表面无光泽。

加入35μl无酶水重悬磁珠，充分混匀后，室温静置5min。

将离心管置于磁力架上，待溶液澄清后，将上清转移至新的离心管中，即为DNA文库。文库构建结果如图3所示。

十三、DNA文库质检

将步骤十二所得文库取1μl稀释40000倍，剩余文库放-20℃冰箱保存。

按照表6反应体系配置质检试剂：

表6

反应程序如表7所示：

表7

十四、蛋白表达

按照表8反应体系配置蛋白表达试剂，两个表达载体在同一反应体系中进行蛋白表达：

表8

将反应体系混匀后，置于恒温金属浴上，30℃培养2h。

孵育结束后，取出10μl到新的EP管中，加入2μl 5x SDS loading，混匀，置于恒温金属浴上98℃孵育10min，将蛋白变性，备用wb检测。

剩余40μl蛋白，置于4℃冰箱备用。

十五、蛋白纯化

1、分别使用Myc及Flag标签蛋白纯化磁珠进行对应标签蛋白纯化。使用产品为Flag标签纯化磁珠(sigma-ANTI-FLAG M2 Magnetic Beads)和Myc标签纯化磁珠(Thermo-Pierce抗c-Myc磁珠)。

2、将标签磁珠从冰箱取出，室温混匀，取出20μl到新的1.5ml EP管中。

3、将离心管置于磁力架上吸附，待溶液澄清后，吸弃上清。

4、将离心管取出，加入100μl IP Buffer重悬磁珠，吹打混匀。

5、将离心管置于磁力架上吸附，待溶液澄清后，吸弃上清。

6、重复3-4步骤，总计洗涤3次；第三次洗涤完毕后，先不要吸弃上清，保持在磁力架上备用。

7、将Flag标签磁珠上清弃掉，加入步骤十四中剩余的40μl蛋白，放置于旋转混匀仪上，室温孵育2h。

8、孵育结束后，把离心管置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清，使用100μL IPbuffer洗涤磁珠三次。

9、使用100μL 3×FLAG peptide洗脱液重悬Flag磁珠，放置于旋转混匀仪上，室温孵育30min。

10、孵育结束后，把离心管置于磁力架上，待溶液澄清后，将上清转移至新的离心管中。

11、弃掉Myc磁珠的上清，使用上一步骤中Flag磁珠洗脱液重悬Myc磁珠，放置于旋转混匀仪上，室温孵育2h。

12、孵育结束后，把离心管置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清，使用100μL IPbuffer洗涤磁珠三次。

13、洗涤完毕后，使用100μL IP buffer重悬磁珠备用，完成蛋白纯化。

其中，IP buffer 10ml：

10ml PBS(PH 7.2)+50μl NP-40(1/100稀释液)+1片罗氏蛋白酶抑制剂片剂

3×FLAG peptide洗脱液(400μg/ml工作浓度)250μl：

230μl IP Buffer+20μl 3×FLAG peptide(浓度5mg/ml)。

十六、文库亲和纯化

将步骤十五纯化好的Myc磁珠+蛋白离心管，置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清。

使用步骤十三中质检合格的剩余DNA文库，重悬Myc磁珠，放置于旋转混匀仪上，室温孵育2h。

孵育结束后，把离心管置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清，使用100μL IPbuffer洗涤磁珠三次。

最后一次洗涤完毕后，弃尽上清，使用30μl 50mM Tris-Hcl重悬Myc磁珠。

将离心管金属浴上，98℃孵育10min，洗脱结合的DNA文库。

孵育结束后，立即将离心管置于磁力架上，待溶液澄清后，将上清转移至新的离心管中，即为洗脱下的亲和纯化后的DNA文库。

十七、亲和纯化后文库扩增

按照表9反应体系配置文库扩增试剂：

表9

其中，Universal Primer的核苷酸序列为5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACACTCTTTCCCTACAC GACGCTCTTCCGATC-3'(如SEQ ID No.11所示)；

Index Primer的核苷酸序列为5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXXXGTGACTGGAGTT CAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'(如SEQ ID No.12所示)，其中“XXXXXXXX”为8碱基index序列。

扩增程序如表10所示：

表10

PCR结束后，向离心管中加入45μl Cleanup Beads 2.0，充分混匀，室温静置5min。

将离心管置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清，加入80％乙醇，漂洗两次。

弃尽乙醇，将离心管保持在磁力架上晾干，至磁珠表面无光泽。

加入25μl无酶水重悬磁珠，充分混匀后，室温静置5min。

将离心管置于磁力架上，待溶液澄清后，将上清转移至新的离心管中，即为亲和纯化后测序文库。

十八、文库测序

使用illumina平台Novaseq 6000进行测序，测序策略为PE150，测序量6G。

具体生物信息学分析方法为：使用NovaSeq，经过高通量测序，获得PE150 bp的fq格式的原始数据，使用fastp(Shifu Chen et al.,2018)过滤原始数据获得高质量的测序数据用于下游分析。

以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

Claims (10)

1.一种基于双重Pull down的DNA亲和纯化测序建库方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取目标样本的基因组DNA；

(2)对所述基因组DNA进行DNA片段化，得到DNA片段；

(3)将所述DNA片段进行文库构建，得到DNA文库；

(4)获取带有不同标签的两种转录因子表达载体；

(5)将等量的两种转录因子表达载体置于同一体外蛋白表达体系中，进行体外蛋白表达，得到表达产物；

(6)使用不同标签蛋白纯化磁珠依次对所述表达产物进行纯化，得到纯化产物；

(7)将所述纯化产物与步骤(3)中的DNA文库结合，依次进行孵育、洗脱，得到洗脱后的DNA文库；

(8)将所述洗脱后的DNA文库进行PCR扩增，得到测序文库；

(9)对所述测序文库进行测序、分析，即可。

2.根据权利要求1所述的一种基于双重Pull down的DNA亲和纯化测序建库方法，其特征在于，步骤(2)中，所述DNA片段的大小为200～400bp。

3.根据权利要求1所述的一种基于双重Pull down的DNA亲和纯化测序建库方法，其特征在于，步骤(3)中，所述文库构建依次包括末端修复和接头连接；

优选地，所述末端修复的反应体系为：0.8～1.2μL的DNA片段，2.8～3.2μL的NEXTflex^TMEnd-Repair&Adenylation Enzyme Mix 2.0，2.8～3.2μL的NEXTflex^TMEnd-Repair&Adenylation Buffer Mix 2.0，NFW补至50μL；

优选地，所述末端修复的反应条件为：18～22℃，28～32min→64～66℃，28～32min→3～5℃，恒温孵育；

优选地，所述接头连接的反应体系为：48～52μL的末端修复产物，2.8～3.2μL的genobaits接头，44～45μL的NEXTflex^TMLigase Enzyme Mix，2.8～3.2μL的NEXTflex^TMLigase Buffer Mix；

优选地，所述接头连接的反应条件为：18～22℃，14～16min→3～5℃，恒温孵育。

4.根据权利要求1所述的一种基于双重Pull down的DNA亲和纯化测序建库方法，其特征在于，步骤(4)包括：

S1、选取转录因子1和转录因子2；

S2、根据转录因子1和转录因子2的编码CDS序列分别设计PCR扩增引物；

S3、使用PCR扩增引物分别扩增转录因子1的编码CDS序列和转录因子2的编码CDS序列；

S4、将转录因子1的编码CDS序列和转录因子2的编码CDS序列分别构建到蛋白表达载体1和蛋白表达载体2上；

S5、将蛋白表达载体1和蛋白表达载体2分别转化到大肠杆菌中进行培养；

S6、挑取单克隆菌落进行测序，筛选出与转录因子1和转录因子2的编码CDS序列一致的表达载体，得到表达载体菌株；

S7、提取转录因子1的蛋白表达质粒和转录因子2的蛋白表达质粒，即得带有不同标签的两种转录因子表达载体；

步骤S1中，所述转录因子1和转录因子2之间存在相互作用关系，能共同调控同一基因的表达。

5.根据权利要求4所述的一种基于双重Pull down的DNA亲和纯化测序建库方法，其特征在于，步骤S2中，转录因子1的编码CDS序列如SEQ ID No.1所示；

优选地，转录因子2的编码CDS序列如SEQ ID No.2所示；

优选地，步骤S3中，转录因子1的编码CDS序列的扩增引物如SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4所示；

优选地，转录因子2的编码CDS序列的扩增引物如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。

6.根据权利要求4所述的一种基于双重Pull down的DNA亲和纯化测序建库方法，其特征在于，步骤S4中，所述蛋白表达载体1和蛋白表达载体2的初始表达载体独立地为pf3k；

优选地，所述蛋白表达载体1带有Flag标签；

所述Flag标签的上游序列如SEQ ID No.7所示；

所述Flag标签的下游序列如SEQ ID No.8所示；

优选地，所述蛋白表达载体2带有Myc标签；

所述Myc标签的上游序列如SEQ ID No.9所示；

所述Myc标签的下游序列如SEQ ID No.10所示。

7.根据权利要求1所述的一种基于双重Pull down的DNA亲和纯化测序建库方法，其特征在于，步骤(5)中，所述体外蛋白表达的试剂包括：28～32μL的TNT mix，各0.8～1.2μL的两种转录因子表达载体，无酶水补至50μL；

优选地，所述体外蛋白表达的温度为28～32℃；

所述体外蛋白表达的时间为1.8～2.2h。

8.根据权利要求1所述的一种基于双重Pull down的DNA亲和纯化测序建库方法，其特征在于，步骤(6)中，所述不同标签蛋白纯化磁珠包括Flag标签纯化磁珠和Myc标签纯化磁珠；

优选地，步骤(7)中，所述孵育的时间为1.8～2.2h。

9.根据权利要求1所述的一种基于双重Pull down的DNA亲和纯化测序建库方法，其特征在于，步骤(8)中，所述PCR扩增的反应体系包括：14～16μL的洗脱后的DNA文库，0.8～1.2μL的Universal Primer，0.8～1.2μL的Index Primer，24～26μL的2×KAPA HIFI mix，无酶水补至50μL；

优选地，所述Universal Primer的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示；

所述Index Primer的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；

优选地，步骤(8)中，所述PCR扩增的反应程序为：97～99℃，2.5～3.5min，1cycle→97～99℃，9～11s，58～62℃，28～32s，70～73℃，28～32s，28～32cycle→70～73℃，1.5～2.5min，1cycle→3～5℃，恒温备用。

10.根据权利要求1所述的一种基于双重Pull down的DNA亲和纯化测序建库方法，其特征在于，步骤(9)中，所述测序的策略为PE150，测序量为5.8～6.2G。