CN118620846B

CN118620846B - 一株针对耐药豚鼠气单胞菌的噬菌体及其在水产养殖中的应用

Info

Publication number: CN118620846B
Application number: CN202410342891.2A
Authority: CN
Inventors: 王喜亮; 田甲; 黄金梅; 张圣海; 程刘梦莹; 张秀玲; 张晓东
Original assignee: Wuhan Grenon Biotechnology Co ltd
Current assignee: Wuhan Grenon Biotechnology Co ltd
Priority date: 2024-03-25
Filing date: 2024-03-25
Publication date: 2024-12-03
Anticipated expiration: 2044-03-25
Also published as: CN118620846A

Abstract

本发明提供一株针对耐药豚鼠气单胞菌噬菌体及其在水产养殖中的应用，属于微生物技术领域，噬菌体于2024年2月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2024325。该噬菌体ACP2401001对水产养殖过程中的致病性豚鼠气单胞菌具有裂解作用，另外豚鼠气单胞菌噬菌体ACP2401001对耐药性豚鼠气单胞菌具有裂解谱广特性；噬菌体ACP2401001具备增值效价高、安全高效、对温度和pH值的耐受能力较好的生物学特性优势。本发明能有效预防水产养殖过程中致病性豚鼠气单胞菌引发的疾病，为水产豚鼠气单胞菌问题的噬菌体疗法提供优良的菌株资源和大规模发酵生产的生物预防措施。

Description

一株针对耐药豚鼠气单胞菌的噬菌体及其在水产养殖中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体为一株针对耐药豚鼠气单胞菌的噬菌体及其在水产养殖中的应用。

背景技术

豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)隶属豚鼠气单胞菌科、气单胞菌属，是革兰氏阴性菌。豚鼠气单胞菌可存在于食物、饮用水、污水和环境水体中。豚鼠气单胞菌是一种人畜共患病原体，也是水产重要的致病菌，易导致免疫力正常或低下的宿主出现感染并发症。豚鼠气单胞菌可以感染多种水生动物,随着我国水产养殖的规模及密度越来越大，但是养殖的快速发展以及不科学运作、对病害问题的重视程度不够、养殖技术水平的参差不齐，不可避免的导致水产病害问题愈发严重，造成养殖户巨大的经济损失，也对该产业的稳定发展造成了严重影响。

细菌耐药性一直是全球公共卫生领域的重要问题。随着抗生素的广泛应用和滥用,细菌耐药性问题日益突出,对世界范围内的人类健康和医疗系统产生了严重的影响。根据文献报道，有在红鲫分离出的1份豚鼠气单胞菌，对红霉素、四环素、新霉素、氨苄西林和环丙沙星耐药(张建等，2023)；另外在罗氏沼虾分离出的1份豚鼠气单胞菌，其对对四环素、环丙沙星、诺氟沙星、乙酰螺旋霉素、羧苄西林、青霉素、头孢噻吩、红霉素、多粘菌素及利福平均有耐药性(王雨辰等，2023)。

目前水产养殖的气单胞菌防控主要是以抗生素及疫苗(如嗜水气单胞菌疫苗)进行治疗，但是疗效均具有一定局限性。因此开发一款应用于豚鼠气单胞菌的绿色安全，针对性强的抑菌噬菌体产品很有必要；基于此，本发明提供一株针对耐药性豚鼠气单胞菌噬菌体及其在水产养殖中的应用。

发明内容

为了预防由豚鼠气单胞菌引起的水产养殖问题，降低由该问题引起的死亡率，本发明目的之一是提供一株针对抑制豚鼠气单胞菌的噬菌体。

本发明的目的之二在于提供了豚鼠气单胞菌噬菌体ACP2401001在制备治疗或预防豚鼠气单胞菌或/和耐药性豚鼠气单胞菌感染引起的疾病的药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：一株针对耐药豚鼠气单胞菌的噬菌体，该噬菌体的分类命名为豚鼠气单胞菌噬菌体Aeromonas caviae phageACP2401001，申请人自广东省某地周边海域水体中分离出一株豚鼠气单胞菌噬菌体Aeromonas caviae phage ACP2401001，该噬菌体已于2024年2月26日送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址为：中国武汉武汉大学；保藏编号为CCTCC NO：M 2024325。

进一步的，还包括豚鼠气单胞菌噬菌体ACP2401001复配物。

一种上述噬菌体或噬菌体ACP2401001复配物的应用，应用于水产养殖和环境消毒等行业中，制备豚鼠气单胞菌的抑菌剂。

进一步的，还应用于制备治疗或预防豚鼠气单胞菌感染引起的疾病的药物。

进一步的，还应用于制备拮抗豚鼠气单胞菌的饲料或饲料添加剂。

本发明的有益效果：

1.该针对耐药豚鼠气单胞菌的噬菌体ACP2401001对耐药性豚鼠气单胞菌具有高裂解率，该株噬菌体ACP2401001在对不同豚鼠气单胞菌的抑制卓有成效，对今后海参养殖或水产养殖养的豚鼠气单胞菌防控及治疗具有重大参考意义。

2.该豚鼠气单胞菌噬菌体ACP2401001具有高发酵率，在最佳感染复数MOI＝1时，发酵6h，效价可达6.6×10¹¹PFU/mL；在工业发酵过程中，试验发酵至6h时，发酵效价可达9.4×10¹¹PFU/mL。

3.该具有裂解谱多价性的豚鼠气单胞菌噬菌体ACP2401001具有良好的环境耐受性，豚鼠气单胞菌噬菌体ACP2401001在pH为4-11范围内处理2h至24h其效价无明显数量级变化；豚鼠气单胞菌噬菌体ACP2401001在温度为45℃及以下存活时间较长，在4℃及25℃条件下噬菌体效价在16W后效价无明显数量级差异，在4-37℃具有良好的稳定性，在37℃条件下，噬菌体效价在4W无明显数量级变化。

附图说明

图1为豚鼠气单胞菌噬菌体ACP2401001的噬菌斑；

图2为不同感染复数条件下的豚鼠气单胞菌噬菌体ACP2401001的效价；

图3为豚鼠气单胞菌噬菌体ACP2401001在不同pH值下稳定性的测试结果；

图4为豚鼠气单胞菌噬菌体ACP2401001在不同温度下稳定性的测试结果；

图5为豚鼠气单胞菌噬菌体ACP2401001的发酵动态示意图。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。

请参阅图1至图5，本发明提供以下技术方案：

实施例1：

豚鼠气单胞菌噬菌体ACP2401001的分离纯化

在广东省某地养殖区域水体采集水样30份，每份30mL，6000rpm离心10min，取上清用0.22μm滤器除菌，取5mL滤液与0.5mL豚鼠气单胞菌(浓度约为5×10⁸CFU/mL)混合均匀，于37℃摇床中200rpm振荡培养过夜发酵。发酵液6000rpm离心10min，取上清用0.22μm滤器除菌，取滤液100μL与300μL豚鼠气单胞菌(浓度约为1×10⁸CFU/mL)混合均匀，加入1％氯化钠TSB半固体(含0.65％琼脂)，轻轻颠倒均匀后浇筑于1％氯化钠TSA底板上，待凝固后，将培养皿放置于37℃培养箱中培养过夜。挑取透而亮的噬菌斑斑点，于1mL SM液中振荡解吸附后过0.22μm的微孔滤膜除菌得噬菌体滤液，将其接种于5mL 1％氯化钠TSB液体培养基中，加入500μL相应的宿主豚鼠气单胞菌菌液并混匀，37℃条件下200rpm震荡培养过夜，6000rpm离心10min取上清过0.22μm的微孔滤膜除菌得噬菌体滤液，采用双层平板法观察噬菌斑形态。重复操作3-5次后，即可得形状和大小一致的噬菌斑。

采集水样中分离出一株豚鼠气单胞菌噬菌体Aeromonas caviae phageACP2401001，如图1所示，其与宿主菌形成的噬菌斑透亮、圆形、直径为0.5mm。该噬菌体已于2024年2月26日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：豚鼠气单胞菌噬菌体Vibrioparahaemolyticus phage ACP2401001，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M2024325。

实施例2：

不同感染复数条件下豚鼠气单胞菌噬菌体ACP2401001的效价测定

将豚鼠气单胞菌噬菌体ACP2401001的宿主菌豚鼠气单胞菌ACGD001接种于有3mL1％氯化钠TSB的EP管，在37℃条件下振荡培养5-8h，得到ACDC001菌液。按2％接种量接种菌液至100mL TSB培养基中，待ACDC001生长至对数初始期，接种噬菌体ACP2401001，按照不同的感染复数(multiplicity of infection，MOI；MOI＝噬菌体数量/细菌数量，具体可见图2)，每组实验3个平行。在37℃摇床中200rpm振荡培养12h。

结果见图2，当MOI＝1时，发酵效价最高达6.6×10¹¹PFU/mL。

实施例3：

豚鼠气单胞菌噬菌体ACP2401001的pH稳定性试验

将1mL豚鼠气单胞菌噬菌体ACP2401001发酵液分别加入9mL pH为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0的TSB液体培养基中(稀释后效价为5×10⁸pfu/mL)，放入25℃培养箱共孵育0h、2h、24h后取样，用盐酸和氢氧化钠溶液分别将pH调至原培养基Ph＝7.4后，进行倍比稀释，用双层平板法测定噬菌体效价；各点均作双份培养取平均值，实验重复3次。

结果如图3所示，豚鼠气单胞菌噬菌体ACP2401001在pH为4-11范围内处理24h其效价无明显数量级变化。

实施例4：

豚鼠气单胞菌噬菌体ACP2401001的温度稳定性试验

将豚鼠气单胞菌噬菌体ACP2401001发酵液离心过滤，取1mL分装到1.5mL离心管中(初始效价为5×10⁸pfu/mL)。将装有噬菌体的离心管分别放入4、25、37、45、55、65、75℃的条件下恒温0h、1h、24h、48h、92h、1w、2w、4w、8w、12w、16w。作用时间结束后取出样品管并立即置于冰浴中冷却，经适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。各点均作双份培养取平均值，实验重复3次。

结果如图4所示，豚鼠气单胞菌噬菌体ACP2401001在温度为45℃及以下存活时间较长，在4℃条件下噬菌体效价在16W后效价无明显数量级差异，在25℃条件下噬菌体效价在8W后效价无明显数量级差异，在37℃条件下噬菌体效价在4W后效价无明显数量级差异；在4-37℃具有良好的稳定性，可有效保存。

实施例5：

噬菌体ACP2401001的宿主范围

实验各挑取20株豚鼠气单胞菌，所选豚鼠气单胞菌均含tetA基因(耐四环素类基因)和ermb(耐大环内脂类基因)，所选20株豚鼠气单胞菌均对四环素耐药，耐药率100％，对新霉素耐药率为65％，对氨苄西林耐药率为85％；分别接种这20株豚鼠气单胞菌于3mL的1％氯化钠TSB的EP管中，37℃恒温200rpm振荡8h，得到豚鼠气单胞菌菌液；准备好足量的TSA底板，将0.5ml豚鼠气单胞菌菌液与50℃左右的6mL 2％氯化钠TSB半固体培养基(含0.65％琼脂)混合均匀，缓慢平铺于1％氯化钠TSA底板之上；待平板培养基凝固至常温后，分别取效价为5×10⁸PFU/ml的噬菌体ACP2401001体积5μL滴于平板上，待风干后，平板倒置于37℃恒温生化培养箱中培养8h左右，观察结果。每组实验重复3次。

如表1所示，豚鼠气单胞菌噬菌体ACP2401001能裂解20株耐药豚鼠气单胞菌中的18株，裂解率为90％；实验结果证实该株噬菌体在应对耐药豚鼠气单胞菌的抑制有非常突出的效果，对今后水产养殖业的豚鼠气单胞菌防控及治疗具有重大价值。

表1噬菌体ACP2401001裂解效果

注：“-”表示不裂解，“+”表示裂解，噬菌斑较透亮；“++”表示裂解，噬菌斑透亮。

实施例6：

豚鼠气单胞菌噬菌体ACP2401001的发酵制备

平板上挑取豚鼠气单胞菌ACGD001单菌落，接种于3mL的1％氯化钠TSB培养基中，在37℃下200rpm培养8h，得到宿主菌液。将菌悬液以2％接种量接种于120mL的1％氯化钠TSB培养基中，在37℃下150rpm培养至对数期前期，菌液OD600值为0.1。

工业发酵为10L发酵罐，发酵体系为6L，所使用培养基为TSB，初始PH值为7.4，采用火焰法按1％接种量接种豚鼠气单胞菌，以最佳感染条件MOI＝1向发酵体系加入噬菌体ACP2401001，发酵过程中通入无菌空气，并加入3‰消泡剂，发酵制备时间为12h。自发酵开始，在1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h从取样口取20ml发酵液于无菌容器中，6000rpm离心10min，取上清液过0.22μm的微孔滤膜除菌得到含有噬菌体的滤液并测定其效价，方法参照实施例2。

待发酵结束后，将噬菌体与宿主菌的全部混合液自取样口取出接入无菌容器中，6000rpm离心10min，取上清液经真空抽气泵抽滤至无菌过滤器装置内，得到噬菌体发酵液并于4℃下保存。

由图5可知，豚鼠气单胞菌噬菌体ACP2401001在发酵制备6h时，效价达到最高9.4×10¹¹PFU/mL，在6h至12h时间段，效价稳定在10¹¹PFU/mL；由结果可知，采用发酵方法进行工业生产噬菌体是可行的，为噬菌体产品的制备提供了有效的参考数据。

实施例7：

豚鼠气单胞菌噬菌体ACP2401001对凡纳滨对虾中豚鼠气单胞菌感染的预防实验

实验南美白对虾由广东珠海某凡纳滨对虾养殖场提供，所选凡纳滨对虾外观正常健康，个体大小约在6.5公分长度，个头在80头/500g左右；实验前将凡纳滨对虾统一放置于250L水族箱中适应饲养7d，水体pH值为7.3±0.1，温度为25℃，溶解氧为6.6±0.1mg/L，待虾死亡率稳定在0％～2％以内时，准备进行实验。本实施例所用到的豚鼠气单胞菌为ACGD002，所选噬菌体为本发明的豚鼠气单胞菌噬菌体ACP2401001。

实验设计如下，将凡纳滨对虾平均分为5个组，每组对虾100只，实验持续7d：

1)对照组：每只凡纳滨对虾注射等体积生理盐水(在靠近尾扇第3腹节处注射)；

2)攻毒组：每只凡纳滨对虾注入浓度为1×10⁶CFU/mL的菌液100μL。

3)治疗组：每只凡纳滨对虾注入浓度为1×10⁶CFU/mL的菌液100μL；待6h后，注射噬菌体ACP24010011×10⁶PFU/只进行治疗；

4)预防组：在实验开始前1天，注射噬菌体ACP24010011×10⁶PFU/只，后每只凡纳滨对虾注入1×10⁶CFU/mL的菌液100μL；

5)四环素治疗组：每只凡纳滨对虾注入终浓度为1×10⁶CFU/mL的菌液100μL。待12h后，按说明用量加入四环素进行治疗；

5)恩诺沙星治疗组：每只凡纳滨对虾注入终浓度为1×10⁶CFU/mL的菌液100μL。待12h后，按说明用量加入恩诺沙星进行治疗。

实验持续7天，记录凡纳滨对虾的症状及死亡数量情况，待观察日期结束后，分别取每组凡纳滨对虾的组织混合研磨，用RS平板(气单胞菌筛选平板)进行豚鼠气单胞菌总计数。每组计算凡纳滨对虾的存活率，计算方式如下所示。

A总：实验每组凡纳滨对虾的总数，只；

A死：实验每组凡纳滨对虾死亡的总数，只；

C：实验每组凡纳滨对虾存活率，％。

实验结果如表3所示，空白组存活率为96％，攻毒组凡纳滨对虾存活率为0％；治疗组存活率为91％，预防组存活率为93％，四环素组存活率为24％，恩诺沙星组88％。实验结果揭示，豚鼠气单胞菌噬菌体ACP2401001可有效杀灭豚鼠气单胞菌，预防及治疗组均有效降低豚鼠气单胞菌的含量，提高了凡纳滨对虾的存活率，本实例对今后对虾豚鼠气单胞菌的预防和治疗提供了重要参考价值，可以作为一种生物抗菌剂应用于凡纳滨对虾及其它水产动物的豚鼠气单胞菌疾病的预防和治疗。

表2噬菌体ACP2401001对凡纳滨对虾中豚鼠气单胞菌的防控效果

本实施例，以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims

1.一株针对耐药豚鼠气单胞菌的噬菌体，其特征在于：该噬菌体的分类命名为豚鼠气单胞菌噬菌体（Aeromonas caviae phage ACP2401001），申请人自广东省某地周边海域水体中分离出一株豚鼠气单胞菌噬菌体（Aeromonas caviae phage ACP2401001），该噬菌体已于2024年2月26日送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址为：中国武汉武汉大学；保藏编号为CCTCC NO：M 2024325。

2.一种如权利要求1所述的针对耐药豚鼠气单胞菌的噬菌体的应用，其特征在于：应用于水产养殖和环境消毒行业中。

3.一种如权利要求1所述的针对耐药豚鼠气单胞菌的噬菌体的应用，其特征在于：应用于制备豚鼠气单胞菌的抑菌剂。

4.一种如权利要求1所述的针对耐药豚鼠气单胞菌的噬菌体的应用，其特征在于：应用于制备治疗或预防豚鼠气单胞菌感染引起的疾病的药物。

5.一种如权利要求1所述的针对耐药豚鼠气单胞菌的噬菌体的应用，其特征在于：应用于制备拮抗豚鼠气单胞菌的饲料或饲料添加剂。