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CN118620029B - 一种干腌火腿源dpp-iv抑制肽及其制备、鉴定方法和应用 - Google Patents

一种干腌火腿源dpp-iv抑制肽及其制备、鉴定方法和应用 Download PDF

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CN118620029B
CN118620029B CN202410662695.3A CN202410662695A CN118620029B CN 118620029 B CN118620029 B CN 118620029B CN 202410662695 A CN202410662695 A CN 202410662695A CN 118620029 B CN118620029 B CN 118620029B
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Abstract

本发明公开了一种干腌火腿源DPP‑IV抑制肽及其制备、鉴定方法和应用，属于DPP‑IV抑制肽技术领域。本发明提供的DPP‑IV抑制肽的鉴定方法可快速获得抑制活性最佳的DPP‑IV抑制肽，实现对多肽的高通量检测，耗时短，效率高，成本低，准确性好，检测更全面，实用性好，可以用于DPP‑IV抑制肽的鉴定；应用本发明提供的鉴定方法获得的干腌火腿源DPP‑IV抑制肽，具有疏水性、易于被小肠吸收、代谢速度快、无毒、与靶点蛋白匹配性好，可以形成稳定的复合物的优点，具有良好的降血糖应用前景。

Description

一种干腌火腿源DPP-IV抑制肽及其制备、鉴定方法和应用
技术领域
本发明涉及DPP-IV抑制肽技术领域，尤其是涉及一种干腌火腿源DPP-IV抑制肽及其制备、鉴定方法和应用。
背景技术
糖尿病是一种由于胰岛素分泌缺陷或胰岛素作用障碍所导致、以高血糖为特征的代谢性疾病。根据IDF糖尿病图谱(2021年)报告称，有10.5％的成年人口(20-79岁)患有糖尿病。据IDF预测，到2045年，每8个成年人中就有1人(约7.83亿人)患有糖尿病，增幅达46％。糖尿病的危害包括其引发的一系列并发症：失明、心脏病、肾衰竭、皮肤溃疡、足部麻木和痴呆症等。目前，糖尿病的主要治疗制剂包括：二甲双胍、噻唑烷二酮类、二肽基肽酶-4抑制剂、磺酰脲类、格列奈德、α-葡萄糖苷酶抑制剂、胰高血糖素样肽-1受体激动剂—GLP1RA。
目前2型糖尿病的一个主要治疗靶点是二肽基肽酶-IV(DPP-IV)，它能使肠促胰岛素激素--胰高血糖素样肽-1(GLP-1)发生分解。GLP-1可以增强葡萄糖诱导的胰岛素分泌并抑制胰高血糖素分泌，以此来调节人体的血糖水平。目前市面上常见的DPP-IV抑制类药物主要有：西格列汀、沙格列汀、维格列汀、利格列汀和阿格列汀等，但是以上抑制剂存在许多不良反应，如胃肠道不良症状、呼吸道感染、皮肤疾病等。
因此，开发源自于天然食物、无副作用或副作用较小的DPP-4抑制剂被广泛关注。已有研究从油菜籽，豌豆，鹰嘴豆和西兰花等植物中发掘出多条DPP-IV抑制肽，此外水生动物和鸡蛋中同样具有DPP-IV抑制潜力的多肽。但是这些食源性DPP-IV抑制肽需要使用蛋白酶酶解产生。
而干腌火腿中的多肽与其他天然食物中提取的多肽不同，在干腌火腿发酵成熟过程中，其中含有的蛋白质会在内源酶的作用下降解为天然小肽和氨基酸。因此，干腌火腿中活性肽的获得只需要简单的提取工艺。
目前，活性肽的制备和鉴定方法，是通过实验室实验逐步纯化活化肽，具有劳动密集、耗时、成本高的缺陷，很难以高通量的方式应用。因此，开发快速、高效的DPP-IV抑制肽鉴定方法具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种干腌火腿源DPP-IV抑制肽及其制备、鉴定方法和应用，以解决目前DPP-IV抑制肽的鉴定方法具有劳动密集、耗时、成本高的缺陷，并提供一种干腌火腿源的DPP-IV抑制肽。
为实现上述目的，本发明提供一种DPP-IV抑制肽的鉴定方法，具体步骤如下：
S1、将得到的多肽使用Web ofscience数据库检索和/或筛选；
S2、对步骤S1筛选出的肽段进行活性预测；
S3、对步骤S2筛选出的肽段进行疏水性预测；
S4、对步骤S3筛选出的肽段进行细胞穿透性预测；
S5、对步骤S4筛选出的肽段进行毒性预测；
S6、对步骤S5筛选出的肽段进行吸收性能、代谢性能预测；
S7、采用BIOPEP数据库Katedra Biochemii(uwm.edu.pl)对步骤S6获得的肽段进行综合模拟评分，选择综合模拟评分排名靠前的多肽为DPP-IV抑制肽；
S8、将步骤S7得到的DPP-IV抑制肽进行分子对接模拟，筛选获得活性最佳的DPP-IV抑制肽。
优选的，所述步骤S1中检索和/或筛选的条件为：N末端第二位氨基酸为Pro或Ala、长度为3-8个氨基酸的肽；所述步骤S2中对肽段进行活性预测的工具为Peptide Ranker或其他具有肽段活性预测功能的工具，选用Peptide Ranker评分>0.5的活性肽。
优选的，所述步骤S3中对肽段进行疏水性预测的工具为https://www.novopro.cn/tools/calc_peptide_property.html或其他具有肽段疏水性预测功能的工具，选留疏水性高的多肽；所述步骤S4中对肽段进行细胞穿透性预测的工具为CPPpred或其他具有肽段细胞穿透性预测功能的工具，选留细胞穿透性较好的肽段。
优选的，所述步骤S5中对肽段进行毒性预测的工具为https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred或其他具有肽段毒性预测功能的工具，选留无毒性的多肽。
优选的，所述步骤S6中对肽段进行吸收性能、代谢性能预测使用的工具为ADMET预测工具，所述ADMET预测工具的网址为http://lmmd.ecust.edu.cn/admetsar2，以人体小肠消化、CPY450和急性口服毒性作为预测指标，选留吸收性能和代谢性能均较好的多肽。
一种如上所述的鉴定方法在DPP-IV抑制肽鉴定中的应用。
利用上述鉴定方法获得的干腌火腿DPP-IV抑制肽，所述DPP-IV抑制肽为Leu-Pro-Pro-Asp-Tyr；Tyr-Ala-Asp-Phe-Lys；Leu-Pro-Val-His-Phe-Tyr；Arg-Pro-Pro-Trp-Val-Thr；Ala-Pro-Pro-His-Leu-Phe；Tyr-Pro-Leu-Ala-Lys-Gly。
一种如上所述的干腌火腿DPP-IV抑制肽在2型糖尿病治疗中的应用。
一种如上所述的干腌火腿DPP-IV抑制肽的制备方法，步骤如下：
(1)去除徽派干腌火腿中的肌肉脂肪和筋膜组织，将剩余部分绞碎后，加入盐酸，冰浴条件下匀浆，离心取上清，采用膜分离技术进行分离，将分子量<3kDa的截留物干燥即得粗肽粉；
(2)将粗肽粉复溶配置成粗肽液，依次用水相微孔滤膜过滤、大孔树脂层析柱分离纯化、葡聚糖凝胶排阻层析分离纯化，获得HPF-1、HPF-2和HPF-33种组分；
(3)选取HPF-2进行高分辨质谱鉴定多肽氨基酸组成，然后采用权利要求1-7任一项所述的鉴定方法进行鉴定，即可获得徽派干腌火腿DPP-IV抑制肽。
优选的，所述步骤(1)中的干燥采用冷冻干燥；所述步骤(2)中水相微孔滤膜的孔径为0.45μm，大孔径树脂层析柱分离纯化的条件为：上样体积为20mL，洗脱流速为5-10mL/min，洗脱组分时先用超纯水洗脱，待基线平稳时再用50％乙醇洗脱；采用葡聚糖凝胶排阻层析分离纯化的条件为：在分离纯化前将组分在超纯水中重新溶解，然后应用于SephadexG-30预装柱分离纯化，流速为24mL/h，上样体积2mL，在214nm波长下测量吸光度。
因此，本发明提供的一种干腌火腿源DPP-IV抑制肽及其制备、鉴定方法和应用，其具体技术效果如下：
(1)本发明提供的DPP-IV抑制肽的鉴定方法，通过将有效数据库与分子对接模拟DPP-IV抑制肽的主要作用靶点相结合，可快速获得抑制活性最佳的DPP-IV抑制肽，实现对多肽的快速、高通量检测，耗时短，效率高，成本低，准确性好，检测更全面，实用性好，可以用于DPP-IV抑制肽的鉴定；
(2)应用本发明提供的鉴定方法获得的徽派干腌火腿源DPP-IV抑制肽，具有很高的DPP-IV抑制活性，同时具有疏水性、易于被小肠吸收、代谢速度快、无毒、与靶点蛋白匹配性好，可以形成稳定的复合物的优点，具有良好的降血糖应用前景。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例的描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例一中徽州干腌火腿粗肽各组分的肽浓度和DPP-IV的IC50值；
图2是实施例一中用DA201-C树脂脱盐纯化<3kDa徽派干腌火腿粗肽粉的吸收峰(A)、凝胶过滤成分吸收峰(B)、凝胶纯化峰的肽浓度和DPP-IV抑制活性(C)；
图3是实施例一中HPF-2的Nano-HPLC-MS/MS分析和部分质谱，其中A为总离子源和从HPF-2中鉴定出的不同截留分子量的肽段数量示意图，B为筛选出的肽段的MS/MS图谱；
图4是实施例二中多肽RPPWVT(A)、APPHLF(B)、LPPDY(C)、LPVHFY(D)、YADFK(E)和YPLAKG(F)与DPP-IV的分子对接结果；
图5是实施例二中是分子动力学模拟结果，其中A为筛选肽的均方根偏差，B为回旋半径和C为氢键数；
图6是实施例三中DPP-IV抑制肽LPPDY(A)、APPHLF(B)、RPPWVT(C)、LPVHFY(D)、YADFK(E)、YPLAKG(F)的Lineweaver-Burk双折线图。
具体实施方式
以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
为了使得本申请的目的、技术方案及优点更加明确、透彻和完整，下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。以下详细说明均是实施例的说明，旨在对本发明提供进一步详细说明。除非另有指明，本发明所采用的所有技术术语与本申请所属领域的一般技术人员通常理解的含义相同。
以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买所得。
实施例一
以徽派干腌火腿为原料制备不同分子量的多肽，步骤如下：
1、制备粗肽，具体步骤如下：
去除徽派干腌火腿碎肉的肌肉脂肪和筋膜组织，然后称取20g，加入100mL 0.01MHCl中，冰浴均质，16000g匀浆6次，每次30s，然后于12000g、4℃条件下离心20min，取离心管中上清液采用膜分离技术进行分离，分别截留分子量>3kDa、<3kDa、1-3kDa、<1kDa的组分，将截留的组分冷冻干燥24h得到徽派干腌火腿粗肽粉，置于-20℃保存备用。
使用OPA法测定多肽含量，含有25mL、100mM的硼砂，2.5mL 20％(w/w)十二烷基硫酸钠、40mg邻苯二甲醛溶于1mL甲醇，100μLβ-巯基乙醇，用去离子水定容至50mL，用不同浓度的谷胱甘肽来制作标准曲线，50μL样品溶液与2mL试剂室温下反应2min，在340nm下比色，对比标准曲线即得多肽的含量。各组分中的多肽含量，结果见图1，>3kDa、<3kDa、1-3kDa、<1kDa多肽含量分别为42.53％、53.45％、37.83％和47.63％。
使用N-甘氨酰脯氨酰-对硝基苯胺盐酸盐作为底物，在405nm处检测吸收峰，参考赵谋明等人的方法。测定各个组分体外DPP-IV抑制活性，结果如图1所示，<3kDa组分具有最佳抑制活性，因此选用<3kDa组分进行后续实验。
2、对步骤1获得的多肽进行纯化，具体步骤如下：
a脱盐：称取5g步骤1制备的<3kDa徽派干腌火腿粗肽粉，加入10mL纯水中，复溶配置成500mg/mL粗肽液，用0.45μm的水相微孔滤膜进行过滤，上样体积为5mL，洗脱流速1.5mL/min，洗脱时先用超纯水洗脱，待基线平稳时再用50％乙醇洗脱，在波长214nm处检测吸收峰。结果如图2的A所示。
b凝胶纯化：将50mg脱盐后得到的徽派干腌火腿多肽粉溶解于2mL0.01M HCl中，再通过0.45μL的过滤器，以24mL/h的速度洗脱，洗脱液与溶剂相同，上样量为2mL。
使用蛋白质纯化系统在波长214nm处检测吸收峰，收集各峰对应的样品。结果如图2的B所示，共得到3个组分，分别命名为HPF-1、HPF-2和HPF-3，收集三个组分，采用步骤1的方法，检测获得的三个组分的多肽浓度，结果如图2的C所示，HPF-2相较于HPF-1和HPF-3多肽浓度更高，采用与步骤1相同的方法检测三个组分对DPP-IV的抑制能力，结果如图2的C所示，HPF-2对DPP-IV的抑制能力最强。
c高分辨质谱分析：
将HPF-2经由配备在线纳喷离子源的LC-MS/MS分析。整套系统为串联EASY-nanoLC1200的Orbitrap Q-Exactive Plus质谱仪(Thermo Fisher Scientific,MA,USA)。共上样5μL样品(分析柱：AcclaimPepMap C18,75μmx 25cm)，以60min的梯度分离样品，柱流量控制在300nL/min，柱温为40℃，电喷雾电压2kV，梯度从2％的B相起始，在47min以非线性梯度升高到35％，1min内升高到100％，维持12min。
质谱仪在数据依赖采集模式下运行，自动在MS和MS/MS采集间切换。质谱参数设置如下：(1)MS：扫描范围(m/z)：200-2000；分辨率：70,000；AGC target：3e6；最大注入时间：50ms；(2)HCD-MS/MS:分辨率；17,500；AGC target：1e5；最大注入时间：45ms；碰撞能量：28％,35％,48％；动态排除时间：30s。
结果如图3所示，整理质谱数据，去掉丰度为0和没有数据库蛋白来源的多肽。
对串联质谱图进行PEAKS Studio version 10.6(Bioinformatics SolutionsInc.,Waterloo,Canada)分析。PEAKSDB对uniprot-Sus_scrofa(version2023,22841entries)数据库搜库，设置None酶解。搜库参数碎片离子质量容许误差：0.02Da，母离子质量容许误差：10ppm，可变修饰：Oxidation(M)15.99,Deamination(NQ)0.98，蛋白卡值为至少含1unique peptide；肽段卡值为-10lgP≥20。结果如图3的A所示，共筛选出1075条肽，其中大部分分子质量在300Da-800 Da，占57.6％，进一步阐明了短肽的DPP-Ⅳ相对抑制活性较高。
实施例二
结合计算机方法筛选DPP-IV抑制肽，步骤如下：
(1)应用现存多肽数据库对鉴定出的肽序列进行in silico分析
使用Web ofscience数据库检索，筛选N末端第二位氨基酸为Pro/Ala的3-8个氨基酸的短肽。
(2)使用肽段活性预测工具Peptide Ranker对(1)筛选出的活性肽进行预测，选留评分>0.5的活性肽。
(3)使用疏水性预测工具https://www.novopro.cn/tools/calc_peptide_property.html对(2)获得的多肽疏水性进行预测，选留疏水性高的多肽。
(4)对(3)获得的多肽采用细胞穿透性预测工具CPPpred进行筛选，选留细胞穿透性较好的肽段。
(5)对(4)获得的肽段使用毒性预测工具https://webs.iiitd.edu.in/ragha va/toxinpred进行筛选，获得无毒性的多肽。
(6)使用ADMET预测工具http://lmmd.ecust.edu.cn/admetsar2对(5)获得的多肽进行吸收性能、代谢性能预测，使用人体小肠消化、CPY450和急性口服毒性作为预测指标，获得吸收性能和代谢性能均较好的多肽。
(7)采用BIOPEP数据库Katedra Biochemii(uwm.edu.pl)对(6)获得的肽段进行综合模拟评分，选择综合模拟评分排名靠前的10种肽为DPP-IV抑制肽，获得的10种DPP-IV抑制肽的具体预测评分信息见表1。
表1
由表1可以看出，获得的这10条肽的活性预测评分较高，普遍存在疏水性。HIA值为正，表型筛选出的肽可以在小肠被吸收。CPY450预测结果说明肽段在体内的代谢速度比较快。毒性结果显示均为III级毒性，毒性较低。
(2)分子对接
从RCSB数据库下载ID为1wcy的蛋白，利用Maestro 11.0软件对肽链进行建模。将肽链指定为配体，将DPP-Ⅳ蛋白指定为受体。PyMOL(4.3.0版)软件(https://pymol.org/)用于分离原始配体和蛋白质结构、脱水和去除有机物、AutodockTools(http://mgltools.scripps.edu/downloads)用于加氢，检查电荷，将原子类型指定为AD4类型，计算gasteiger，并构建蛋白质结构的对接网格盒，结果如图4所示。
利用Vina对接后，计算1wcy蛋白与肽链对接组合的得分，并使用Pymol和Discovery Studio软件进行三维和二维角度的作用力分析和可视化。对接能一般为负值，值越小表明对接结果得分越高，即配体与受体蛋白之间的结合越紧密，相互作用最强，越可能具有DPP-IV抑制活性。
分子对接评分从-6.9kcal/mol(LPVKYL)到-9.8kcal/mol(LPVHFY)，在其他研究中，分子对接Vina评分的绝对值与抑制活性呈现正相关，所以选取评分≤-7.8kcal/mol的肽，共6条。LPPDY的评分为-7.8kcal/mol，LPVHFY的评分为-9.8kcal/mol，YPLAKG的评分为-7.8kcal/mol，RPPWVT的评分为-8.6kcal/mol，APPHLF的评分为-8.8kcal/mol。均能够紧密结合在目标蛋白上。通过氢键以及疏水作用力结合在DPP-IV的活性位点(S1：Tyr547,Tyr631,Ser630,Tyr662,His740,Tyr666,Val656；S2：Glu206,Phe357,Tyr666，Tyr547,His740，Arg125和Ser630)。见表2。
表2
(3)分子动力学模拟
采用Gromacs 2020软件包对经筛选的受体蛋白-多肽复合物进行分子动力学模拟。蛋白使用AMBER99SB-ILDN力场参数，多肽配体使用gaff2通用力场参数，并使用sobtop程序构建多肽拓扑，然后利用RESP进行电荷拟合。配体和蛋白的结合自由能计算则采用Gromacs 2020程序的g_MMPBSA方法对结合自由能进行计算，结果如图5所示。
RMSD是计算在某一时刻的构象与初始构象所有原子位置偏差之和。监测蛋白质的RMSD可以在整个模拟过程中深入了解复合物的结构构象，衡量稳定性。RMSD值分布范围越广，表明分子构象的变化越丰富。结果如图5的A所示，6条肽与靶蛋白复合物基本在5ns左右即达到了动态平衡，表明这6条多肽与靶点蛋白匹配较好，能够形成稳定的复合物。
为了分析复合物在主次位点结合诱导的相对致密性和稳定性，测量了靶蛋白的回转半径(Rg)，即计算了受体原子与质心的质量加权位置距离，Rg图如图5的B所示，可以看出六个复合物蛋白的Rg在模拟过程中均出现一定程度的降低，这可能是分子动力学之后，蛋白与多肽的结合促使了蛋白维持了更多的疏水接触，蛋白内部形成更多的有效相互作用，以更好地匹配多肽，从而促进复合物的稳定性。
为了更直观的洞悉蛋白与多肽的结合情况，对蛋白与多肽的氢键数量在整个模拟过程中的变化进行了统计，结果如图5的C所示，多肽均能够与蛋白口袋氨基酸形成三个及以上的氢键相互作用，这些氢键在稳定的多肽与蛋白结合方面起到了重要作用。
实施例三
通过固相法按实施例二获得的多肽序列合成6条肽短，对6条短肽进行体外DPP-IV抑制活性检测，方法与实施例一相同，结果见表2。可以看出LPPDY和LPVHFY的DPP-IV抑制能力较强，最大半抑制浓度(IC50)分别达到197.38μM和41.44μM。
基于多肽的IC50值，确定不同确定肽的浓度，以不同浓度的Gly-Pro-pNA(0.2-1mM)制作Lineweaver-Burk双倒数曲线。结果如图6所示，DPP-IV抑制活性强的多肽具有竞争型抑制模式。
Lineweaver-Bur公式：
综上，本发明中鉴定出的徽派干腌火腿源DPP-IV抑制活性较高，主要通过氢键与疏水相互作用力结合在目标蛋白的活性位点，通过占据DPP-IV蛋白与GLP-1的结合位点，抑制DPP-IV的活性，从而降低血糖水平，具有很高的DPP-IV抑制活性
因此，本发明提供的DPP-IV抑制肽的鉴定方法可快速获得抑制活性最佳的DPP-IV抑制肽，实现对多肽的高通量检测，耗时短，效率高，成本低，准确性好，检测更全面，实用性好，可以用于DPP-IV抑制肽的鉴定；应用本发明提供的鉴定方法获得的徽派干腌火腿源DPP-IV抑制肽，具有疏水性、易于被小肠吸收、代谢速度快、无毒、与靶点蛋白匹配性好，可以形成稳定的复合物的优点，具有良好的降血糖应用前景。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (2)

1.干腌火腿DPP-IV抑制肽，其特征在于：所述DPP-IV抑制肽为Leu-Pro-Pro-Asp-Tyr；Tyr-Ala-Asp-Phe-Lys；Leu-Pro-Val-His-Phe-Tyr；Arg-Pro-Pro-Trp-Val-Thr或Tyr-Pro-Leu-Ala-Lys-Gly。
2.一种如权利要求1所述的干腌火腿DPP-IV抑制肽在制备2型糖尿病治疗药物中的应用。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN119529027B (zh) * 2025-01-16 2025-05-02 中国肉类食品综合研究中心 一种西式干腌火腿来源的抗炎肽及其制备方法与应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116355051A (zh) * 2023-03-27 2023-06-30 合肥工业大学 一种具有ace抑制活性和抗氧化活性的多肽、筛选方法和应用
CN117229354A (zh) * 2023-09-21 2023-12-15 中国海洋大学 一种金枪鱼源降尿酸混合物、组合物、制备方法及应用
CN117343129A (zh) * 2023-04-19 2024-01-05 合肥工业大学 一种干腌火腿源抗炎活性肽及其制备方法和鉴定方法

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1543023B1 (en) * 2002-09-18 2010-03-17 Prosidion Limited Secondary binding site of dipeptidyl peptidase iv (dp iv)
EP1546183A4 (en) * 2002-09-23 2008-06-18 Du Pont ISOLATION AND USE OF RYANODINE RECEPTORS
US8273710B2 (en) * 2004-12-23 2012-09-25 Campina Nederland Holding B.V. Protein hydrolysate enriched in peptides inhibiting DPP-IV and their use
US10611818B2 (en) * 2007-09-27 2020-04-07 Agilent Technologies, Inc. MHC multimers in tuberculosis diagnostics, vaccine and therapeutics
JP2011182742A (ja) * 2010-03-10 2011-09-22 Hiroshi Hara 血中ジペプチジルペプチダーゼ−ｉｖ阻害活性およびグルカゴン様ペプチド−１の分泌促進活性を併せ持つ組成物
JP5887630B2 (ja) * 2011-08-11 2016-03-16 岡山県 ジペプチジルペプチダーゼ−ｉｖ阻害剤の製造方法
US20140193463A1 (en) * 2013-01-04 2014-07-10 China Medical University Peptide for inhibiting dipeptidyl-peptidase iv
KR20170022562A (ko) * 2015-08-21 2017-03-02 초당약품공업 주식회사 당뇨 및 비만을 동반하는 복합 대사성 질환 치료 및 예방에 효과적인 물질의 스크리닝 방법
JP7680201B2 (ja) * 2020-11-17 2025-05-20 雪印メグミルク株式会社 Ｄｐｐ－４阻害用組成物
CN114621320B (zh) * 2020-12-14 2024-05-24 清华大学 一种可用于减缓glp-1酶解的短肽及其组合物
CN113480607B (zh) * 2021-08-09 2022-12-27 福建省水产研究所（福建水产病害防治中心） 一种活性小分子肽及其制备方法、应用
CN113480608B (zh) * 2021-08-16 2022-09-02 合肥工业大学 一种可缓解酒精性肝损伤的干腌火腿源多肽及其制备方法
CN116083257A (zh) * 2023-01-18 2023-05-09 安徽省农业科学院农产品加工研究所 用于猪火腿源活性肽制备的菌株、猪火腿源活性肽及其制备方法和应用
CN117384241B (zh) * 2023-10-16 2024-08-13 西北农林科技大学 一种含iap结构的小分子肽与应用
CN117912595A (zh) * 2023-12-04 2024-04-19 中国农业大学 机器学习辅助筛选及制备dpp-4抑制肽的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116355051A (zh) * 2023-03-27 2023-06-30 合肥工业大学 一种具有ace抑制活性和抗氧化活性的多肽、筛选方法和应用
CN117343129A (zh) * 2023-04-19 2024-01-05 合肥工业大学 一种干腌火腿源抗炎活性肽及其制备方法和鉴定方法
CN117229354A (zh) * 2023-09-21 2023-12-15 中国海洋大学 一种金枪鱼源降尿酸混合物、组合物、制备方法及应用

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