CN118598974B

CN118598974B - 通过高碘酸盐氧化提取蛋白质多级结构的方法

Info

Publication number: CN118598974B
Application number: CN202410934204.6A
Authority: CN
Inventors: 刘培文; 刘斐; 王海全; 姚丁丁; 彭罗根; 赵志明; 陶攀
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2024-07-12
Filing date: 2024-07-12
Publication date: 2025-03-18
Anticipated expiration: 2044-07-12
Also published as: CN118598974A

Abstract

本发明公开了一种通过高碘酸盐氧化提取蛋白质多级结构的方法，涉及蛋白质分离提取领域。所述方法的步骤包括：将生物基原料和高碘酸混合；用碱液调节反应液pH；室温下避光进行氧化反应；将反应液进行透析、过滤、沉降、离心得到多级结构的蛋白质产物。本发明提供的方法不需要对生物基原料进行复杂的前处理和脱脂处理，反应条件温和，操作简单，通过对氧化反应时间进行调控，就可以得到不同层次的蛋白质生物结构，该方法具有高效性、可控性和环境友好性。

Description

通过高碘酸盐氧化提取蛋白质多级结构的方法

技术领域

本发明涉及蛋白质分离提取领域，具体涉及高碘酸盐氧化提取蛋白质多级结构的方法。

背景技术

蛋白质是天然生物中最丰富的有机分子之一，其种类和功能繁多。由于蛋白质基生物材料具有优异的生物活性、生物相容性、降解性和吸收性，被广泛用于组织工程、生物电子工程、药物递送、伤口修复和制药等领域。利用天然蛋白质制作生物功能性材料的第一步就是将蛋白质完整的从生物基原料中提取出来，提取过程中蛋白质的完整性直接决定了下游蛋白质样品分析所得数据的质量以及影响后续生物材料的性能。

提取蛋白质常用的方法，如物理法、化学法、生物酶降解法等，都会不可避免地破坏细胞稳态，导致蛋白质降解或不稳定，使得大部分提取得到的蛋白质结构尺寸较小。特别是含有复杂和稳定的多级蛋白质结构的生物组织或结构，使得其蛋白质的提取和功能材料的制备变得非常具有挑战性。例如，含有角蛋白的生物结构（如毛发、羽毛、指甲、犄角、蹄等），具有较强的机械强度，不易溶解和分解，因此，从中提取完整的角蛋白极具挑战性。物理法常用高压水解、微波辐射、过热水解等方式，使毛发纤维中的角蛋白分子间甚至分子内的二硫键断裂、水解，从而使毛发中的角蛋白变成可溶性的角蛋白；化学法通常利用酸、碱、氧化剂或还原剂等化学试剂与毛发中的二硫键发生化学反应，来增大角蛋白分子的溶解性；生物法主要是利用角蛋白酶将角蛋白降解和水解为肽来获取角蛋白。但是，以上大部分方法在破坏角蛋白的生物结构中二硫键的同时，也会破坏肽键，导致初级蛋白质结构的破坏，使获得的是一些肽混合物，甚至有些方法使用高温处理生物结构，会导致损失部分氨基酸。

因此，本发明旨在提供一种能够剥离提取不同级别蛋白质结构的方法，采用温和、可选择性氧化的高碘酸作为氧化剂，在室温避光条件下进行氧化反应来提取蛋白质，通过控制反应时间来获取不同级别结构的蛋白质，为蛋白质的提取方法提供全新的思路和途径。

发明内容

针对以上现有技术的不足，本发明提供通过高碘酸盐氧化提取蛋白质多级结构的方法，采用温和、可选择性氧化的高碘酸作为氧化剂，在室温避光条件下进行氧化反应来提取蛋白质，通过控制反应时间来获取不同级别结构的蛋白质，采用本发明提供的方法，有望实现对蛋白质多级结构的精确分离和提取，进一步推动蛋白质在功能材料制备领域的应用。

为了实现上述目的，本发明的具体技术方案如下：

通过高碘酸盐氧化提取蛋白质多级结构的方法，包括以下步骤：

步骤一、高碘酸盐的氧化反应

（1）将破碎的生物基原料、纯水和高碘酸混合，搅拌将高碘酸溶解并保持搅拌状态，加碱液调节反应液pH。其中，在中性条件下，反应中高碘酸盐离子形态是H₂I₂O₁₀ ^4-，该离子具有更多的负电荷以及更大的离子半径。

（2）在1000 rpm转速下，室温下避光搅拌进行氧化反应。

步骤二、蛋白质多级结构的纯化与分离

（1）氧化反应结束后，加入适量乙二醇以淬灭未反应完的高碘酸，然后将反应液进行透析和过滤，收集滤液。

（2）将滤液静置沉降24小时，缓慢地将静置后的样品转出，分别收集沉淀物P1和上部混浊液P2。

（3）将沉淀物P1多次水洗并离心、将上部混浊液P2进行离心水洗，干燥后得到蛋白质的多级结构。

优选地，所述蛋白质包括角蛋白。

优选地，所述破碎的生物基原料长度＜1cm。

优选地，所述生物基原料、纯水、高碘酸的比例为1∶（20~100）：（1~7）；进一步优选地，所述生物基原料、纯水、高碘酸的比例为1∶（20~100）：4。

优选地，所述碱液为LiOH溶液或氨水，调节pH为6.5~7。

优选地，所述碱液为KOH溶液，调节pH为8.5~11。

优选地，所述氧化反应的反应时间为1~15天。

优选地，所述透析所用的透析袋的截留分子量为7000~14000 Da。

优选地，所述透析处理时，还包括多次换水直至电导率小于1μS/cm。

优选地，所述过滤所用的滤布为200~800目。

本发明方法以高碘酸为反应试剂，通过调节生物基原料和高碘酸的添加比例以及反应液浓度，用适宜的碱液调节反应液pH，并控制反应时间，分离得到蛋白质多级结构产物。采用本发明方法提取角蛋白多级结构，将沉淀物P1多次水洗并离心，底部沉淀为干净的皮质细胞；将上部混浊液P2在10000 rpm的速度下离心，沉淀为丝状物，上清为角蛋白纳米颗粒；将丝状物沉淀多次在10000 rpm的速度下水洗离心，得到较纯净的丝状物。将皮质细胞、丝状物和角蛋白纳米颗粒在低温冷冻24小时，然后在真空冷冻干燥24-48小时，最终得到干燥的角蛋白多级结构。氧化反应阶段中，以LiOH调节pH为pH 6.5~7的反应体系效果最佳，反应1~3天得到的皮质细胞产物最多，最高产率可达20%；3~6天内得到丝状物最佳，最高产率可达16%；6~10天内产物以角蛋白纳米颗粒为主，最高可达76%。分离得到的皮质细胞的形态呈现的是梭状，长度为150~200微米，直径为5~10微米；分离得到的丝状物是皮质细胞被剥离的产物，形貌为丝状，直径为0.1~0.4微米，长度为2~10微米；分离得到的蛋白纳米颗粒为具有壳核结构的球形，直径为50~200 nm。

与现有技术相比，本发明的有益之处在于：

（1）本发明提供的通过高碘酸盐氧化提取蛋白质多级结构的方法，避免了传统方法对角蛋白结构的剧烈破坏，极大地保留了蛋白质天然的微纳米结构，这为制备高性能蛋白质基先进功能材料提供了理想的原料。

（2）本发明提供的方法不需要对生物原料进行复杂的前处理，也不需要对生物材料进行脱脂处理，本方法操作简单，仅通过简单的反应条件调控得到不同层次的蛋白质生物结构，具有高效性、可控性和环境友好性，更利于产业化发展。

（3）采用本发明方法还适用于多种动植物蛋白的分离提取，如胶原蛋白、溶菌酶、大豆分离蛋白、血清蛋白等的，具有广泛的适用性。

附图说明

图1所示为根据本发明分离头发皮质细胞、丝状物和角蛋白纳米颗粒方法的流程图；

图2所示为头发结构示意图；

图3所示为头发纤维的SEM图；

图4所示为经过高碘酸盐氧化头发反应后得到的样品形貌，其中(a)为皮质细胞光学显微镜下的形貌；(b)为丝状物光学显微镜下的形貌；(c)为蛋白纳米颗粒透射电镜图；

图5所示为经过高碘酸盐氧化溶菌酶反应后得到的样品形貌，其中(a)为溶菌酶未经氧化的原始样品透射电镜观察形貌，(b)为氧化反应后得到的溶菌酶蛋白纳米颗粒透射电镜图。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供通过高碘酸盐氧化提取蛋白质多级结构的方法，包括以下步骤：

步骤一、高碘酸盐的氧化反应

（2）在1000 rpm转速下，室温下避光搅拌进行氧化反应。

步骤二、蛋白质多级结构的纯化与分离

（4）将沉淀物P1多次水洗并离心、将上部混浊液P2进行离心水洗，干燥后得到蛋白质的多级结构。分离流程如图1所示。

在一些示例中，所述破碎的生物基原料长度＜1cm。

在一些示例中，所述生物基原料、纯水、高碘酸的比例为1∶（20~100）：（1~7）。

在一些示例中，所述碱液为LiOH溶液或氨水，调节pH为6.5~7。

在一些示例中，所述碱液为KOH溶液，调节pH为8.5~11。

在一些示例中，所述透析所用的透析袋的截留分子量为7000~14000 Da。

在一些示例中，所述透析处理时，还包括多次换水直至电导率小于1μS/cm。

在一些示例中，所述过滤所用的滤布为200~800目。

在下述实施中，所用的高碘酸、氢氧化钾、氢氧化锂和氨水均购自麦克林试剂公司；所用的生物基原料：头发来自理发店，平均直径为100 μm；羽毛来自屠宰场；胶原蛋白、溶菌酶均采购自麦克林试剂公司。

实施例1

本实施例通过高碘酸盐氧化提取蛋白质多级结构的方法，包括以下步骤：

步骤一、高碘酸盐氧化反应

（1）取10个反应瓶，将头发、羽毛剪裁成小于一厘米的小段，将头发和羽毛分别称取0.5 g于5个反应瓶中，于每个反应瓶中加入常温的纯水50 mL和高碘酸2.0 g，在搅拌器上搅拌使高碘酸溶解并保持搅拌状态，加入LiOH，调节pH=7。

（2）在室温下1000 rpm转速避光分别搅拌1天、3天、6天、10天、15天。

步骤二、蛋白质多级结构的纯化与分离

（1）当反应结束后，于反应瓶中加入适量乙二醇淬灭未反应完的高碘酸。然后将反应液转入7000~14000 Da的透析袋中进行透析，多次换水直至电导率小于1μS/cm。

（2）将透析后的样品进行过滤，使用200~800目的滤布进行过滤，去除未彻底反应的发丝或羽毛（收集，烘干称重计算未反应完全物重），收集滤液。

（3）将滤液静置沉降24小时，缓慢地将静置后的样品转出，分别收集沉淀P1和上部混浊液P2。

（4）将沉淀物P1多次1000 rpm水洗离心，底部沉淀为干净的皮质细胞；将上部混浊液P2在10000 rpm下离心，沉淀为丝状物，上清为角蛋白纳米颗粒；将丝状物沉淀多次10000rpm水洗离心，得到较纯净的丝状物。将皮质细胞、丝状物和角蛋白纳米颗粒干燥，并计算产率，分离结果见表1。

表1：实施例1的分离提取结果

实施例2

本实施例通过高碘酸盐氧化提取蛋白质多级结构的方法，与实施例1基本相同，不同之处在于，本实施例加的碱液为氨水，调节pH=7，分离结果见表2。

表2：实施例2的分离提取结果

实施例3

本实施例通过高碘酸盐氧化提取蛋白质多级结构的方法，与实施例1基本相同，不同之处在于，本实施例加的碱液为KOH溶液，调节pH=10，分离结果见表3。

表3：实施例3的分离提取结果

实施例4

步骤一、高碘酸盐氧化反应

（1）分别称取0.5 g溶菌酶于5个反应瓶中，于每个反应瓶中加入常温的纯水50 mL和高碘酸2.0 g，在搅拌器上搅拌使高碘酸溶解并保持搅拌状态，加入LiOH，调节pH=7。

（2）在室温下1000 rpm转速避光分别搅拌1天、2天、3天、5天、7天。

步骤二、蛋白质多级结构的纯化与分离

（2）将透析后的样品于10000 rpm离心10 min去除大颗粒杂质，得到的澄清的上清液为较纯净的蛋白质纳米颗粒，干燥并计算产率，分离结果见表4。

实施例5

本实施例通过高碘酸盐氧化提取蛋白质多级结构的方法，与实施例4基本相同，不同之处在于，本实施例加的碱液为KOH溶液，调节pH=10，分离结果见表4。

表4：实施例4和5的分离提取结果

对比例1

本对比例提取蛋白质多级结构的方法，步骤与实施例1基本相同，不同之处在于，步骤一：将头发、羽毛剪裁成小于一厘米的小段，称取0.5 g于反应瓶中，加入常温的0.2mol/L Na₂HPO₄·NaH₂PO₄（pH=7）缓冲液、0.2 mol/L Na₂CO₃·NaHCO₃（pH=10）缓冲液，在室温下1000 rpm转速搅拌15天，详情和分离结果见表5。

对比例2

本对比例提取蛋白质多级结构的方法，步骤与实施例1基本相同，不同之处在于，本对比例不使用任何碱液调节pH值，分离结果见表5。

表5：对比例1-2的分离提取结果

本发明通过高碘酸盐氧化提取头发中的角蛋白多级结构(图2为头发结构示意图、图3为头发纤维的SEM图)，获得的皮质细胞和丝状物，在光学显微镜观察下的形貌分别如图4（a）与（b）所示。皮质细胞在显微镜下的形貌为梭状，长度为150~200微米，直径为5~10微米；丝状物是皮质细胞被剥离之后得到的产物，在显微镜下形貌为丝状，直径为0.1~0.4微米，长度为2~10微米。获得的角蛋白纳米颗粒经透射电镜(TEM)观察，其形貌如图4（c），从图中可以看出，角蛋白纳米颗粒具有壳核结构的球形形貌，直径为50~200 nm。

由对比例1-2与实施例1-5相比可知，仅在碱液条件下或者仅在高碘酸的条件下，蛋白质的剥离效果很差；高碘酸只有在适宜的碱液条件下，才能发挥效果。从实施例1-5可知，高碘酸在不同的碱液条件下，其反应效率也不同，可以通过调节碱液和pH以及反应时间来对反应的程度进行控制。使用高碘酸盐剥离提取蛋白质的多层结构是具有优势的，一是可以通过控制反应时间来控制剥离程度，在实施例1-3中，在反应1-3天内得到的皮质细胞产物最多，最高产率达20%左右；3-6天内得到丝状物最佳，最高产率可达16%左右；6-10天内为蛋白质纳米颗粒为主，最高可达76%；此外，高碘酸在不同的条件下氧化性强度不同，实施例1-3对比可知，高碘酸在LiOH和氨水中，反应液初始pH=7时，氧化性强度较强；高碘酸在KOH中，反应液pH=10时，氧化性强度较弱；因此，还可以通过加入不同的碱液，将pH调节至不同的值，来调控高碘酸盐氧化剥离的程度；二是作操作简便，不需要经过复杂的的预处理，不会引入其他化学试剂，对人体和环境的危害都很小，氧化反应结束后，只需对未反应完全的高碘酸进行灭活处理即可保证安全。

从实施例4-5和图5可以看出，使用高碘酸盐氧化提取溶菌酶的蛋白质纳米颗粒同样适用。图5为透射电镜下，经过高碘酸盐氧化溶菌酶反应前后样品的形貌，其中，(a) 为溶菌酶未经氧化的原始样品形貌，(b)为高碘酸盐氧化反应后得到的溶菌酶蛋白纳米颗粒形貌；从图中可以看出，未经反应的样品为无序状态，经高碘酸盐氧化后转变为较为均匀的直径为10~50纳米的球形颗粒。与胶原蛋白规律一致，样品原本为无序状态，经氧化后转变较为均匀的直径10~30纳米的球形颗粒。从表4可以看出，通过高碘酸盐氧化提取溶菌酶中的蛋白质多级结构时，以LiOH溶液作为调节pH的碱时，溶菌酶在反应5天时产率最高，可达85%左右；以KOH溶液作为调节pH的碱时，反应速率相对较慢，这与实施例1和实施例3中提取角蛋白的规律一致。

在上述实施例中，延长反应时间至15-30天，仍可分离提取得到蛋白质纳米颗粒，说明本发明提供的通过高碘酸盐氧化提取蛋白质多级结构的方法比较温和。发明人还针对碱液LiOH、KOH将反应液调节至其他pH值（如LiOH溶液调节pH=10；KOH溶液调节pH=7等），或者用缓冲液Na₂HPO₄·NaH₂PO₄将反应液调节pH=7等做了相关实验，在调节pH的过程中，出现了少量固体析出现象，导致最终的分离提取结果较实施例1-4稍差。

表6为本发明提供的方法与其他研究方法的对比区别，从表中可以看出，本发明提供的方法可以从富含蛋白质的生物基原料中提取得到不同微纳米尺寸的蛋白结构。而采用表中的其他方法提取得到的蛋白质产物单一，多为小分子蛋白质。

综上所述，本发明方法以高碘酸为反应试剂，通过调节生物基原料和高碘酸的添加比例以及反应液浓度，用适宜的碱液调节反应液pH，并控制反应时间，分离得到蛋白质多级结构产物。本发明提供的方法反应条件温和，可以避免蛋白质多级结构被破坏，极大地保留了蛋白质天然的微纳米结构，这为制备高性能角蛋白先进功能材料提供了理想的原料；此外，本发明提供的方法操作简单，通过对氧化反应时间进行调控，就可以得到不同层次的蛋白质生物结构，具有高效性、可控性和环境友好性，更有利于产业化发展。

表6：本发明与以往研究的其他方法对比

以上具体实施方式详细描述了本发明的实施，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节。在本发明的权利要求书和技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单改型和改变，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

Claims

1.通过高碘酸盐氧化提取蛋白质多级结构的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将生物基原料、纯水和高碘酸混合，搅拌将高碘酸溶解，加碱液调节反应液pH；所述生物基原料包括毛发、羽毛、指甲、犄角、蹄中的一种；所述碱液为LiOH溶液、氨水或KOH溶液，当所述碱液为LiOH溶液或氨水时，调节pH为6.5~7；当所述碱液为KOH溶液时，调节pH为8.5~11；

（2）室温下避光搅拌进行氧化反应；

（3）将反应液进行透析、过滤后收集滤液；

（4）将滤液静置沉降，收集沉淀物P1和上部混浊液P2；

（5）将沉淀物P1多次水洗并离心处理、将上部混浊液P2离心水洗，干燥后得到蛋白质多级结构的生物材料。

2.根据权利要求1所述的通过高碘酸盐氧化提取蛋白质多级结构的方法，其特征在于，所述蛋白质包括角蛋白。

3.根据权利要求1所述的通过高碘酸盐氧化提取蛋白质多级结构的方法，其特征在于，所述生物基原料、纯水、高碘酸的比例为1：（20~100）：（1~7）。

4.根据权利要求1所述的通过高碘酸盐氧化提取蛋白质多级结构的方法，其特征在于，所述生物基原料、纯水、高碘酸的比例为1：（20~100）：4。

5.根据权利要求1所述的通过高碘酸盐氧化提取蛋白质多级结构的方法，其特征在于，所述氧化反应的反应时间为1~15天。

6.根据权利要求1所述的通过高碘酸盐氧化提取蛋白质多级结构的方法，其特征在于，所述透析所用的透析袋的截留分子量为7000~14000 Da。

7.根据权利要求1所述的通过高碘酸盐氧化提取蛋白质多级结构的方法，其特征在于，所述过滤所用的滤布为200~800目。