CN118562953A - 检测opn1lw与opn1mw基因单倍体型的试剂在近视诊断试剂盒中的应用及产品 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及检测OPN1LW与OPN1MW基因单倍体型的试剂在近视诊断试剂盒中的应用及产品。本发明的检测方法包括两轮扩增，第一轮扩增的引物为SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.2，用于扩增OPN1LW和/或OPN1MW基因簇的第一个基因；第二轮扩增轮引物为SEQ ID NO.3‑SEQ ID NO.6，扩增的底物为第一轮扩增的产物，通过两轮的扩增可以判定基因单倍体型及单倍体型来源。本发明的方法具有较高的灵敏度和准确度，并且方法简单，可有效用于指导配镜。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及检测OPN1LW与OPN1MW基因单倍体型的试剂在近视诊断试剂盒中的应用及产品。
背景技术
近视是屈光不正的一种，表现为当眼在调节放松状态下，平行光线进入眼内，其聚焦在视网膜之前，导致视网膜上不能形成清晰像。近视的原因包括遗传因素、环境因素和不良用眼习惯等。准确配镜对近视患者至关重要，因为不合适的眼镜可能加重近视症状，甚至导致其它眼健康问题。准确配镜不仅可以改善视力，还可以预防视力进一步下降。而对近视状况及原因的分析，对有效配镜有着举足轻重的作用。
有研究确定近视基因之一MYP1突变的患儿，其视网膜对比度信号异常增高，进一步的研究发现，位于该基因片段内的OPN1LW(长波长视锥蛋白基因)/OPN1MW(中波长视锥蛋白基因)突变与人群近视易感性相关。OPN1LW和OPN1MW的突变(特定一些SNP突变组合简称为单倍体型)导致其前信使RNA剪接过程中出现严重的3号外显子跳跃或错误剪接，表达这些单倍体型的锥形光感受器几乎不含光色素。8种OPN1LW和OPN1MW基因常见单体型(LIAVA、LIVVA、LVAVA、LIAVS、MIAVA、MVVVA、MVAVA和LIAIA)与色觉缺陷、高度近视等多种视力障碍相关，其中LVAVA、LIVVA、LIAVA三种单倍体型是与中国人群高度近视相关的主要类型。这些单倍体型为第3号外显子SNP的组合，分别位于p.153、p.171、p.174、p.178和p.180，以对应的氨基酸缩写进行编码。这些与近视和高度近视相关的单倍体型可导致不同程度的3号外显子跳跃，从而影响视蛋白的正常表达。相反，同一视网膜中表达非跳跃单倍型的视锥细胞相对充满光色素。由光色素含量不同的相邻视锥细胞产生的异常对比信号会刺激轴向伸长，从而导致远视力模糊。
此外，研究也发现，部分具有近视控制效果的镜片，如DOT(Diffusion OpticsTechnology，点扩散近视控制技术)镜片，通过在相邻锥体之间创造较低的信号差异来降低视网膜对比度，在减缓儿童近视进展方面是有效且安全，这也进一步证实了OPN1LW和OPN1MW单倍体型与导致高度近视的视锥感光细胞缺陷直接相关。因此，对于近视和高度近视患者，尤其是早发性高度近视人群，有必要通过基因检测明确OPN1LW和OPN1MW基因单倍体型信息，及早进行配镜干预，控制眼轴增长，从而降低继发于高度近视的危及视力的眼部疾病风险。
OPN1LW和OPN1MW基因的遗传分析复杂，这些基因串联排列在X染色体上，其拷贝数高度变异，但只有排在前两个的基因表达。大多数男性有三个视蛋白基因，大多数女性有六个视蛋白基因。此外，OPN1LW和OPN1MW基因同源性非常高(核苷酸序列同源性～98％)，常规的高通量测序技术无法将其准确比对到参考基因组上，因此不能准确判读前两个基因的序列，进而无法判读其单倍体型，同时也无法了解基因的表达情况。因此，亟需开发一种准确检测OPN1LW和OPN1MW表达基因单倍体型的方法，用于指导配镜。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种基于巢氏PCR和Sanger测序对OPN1LW和OPN1MW表达基因单倍体型进行检测，第一轮特异性扩增OPN1基因簇的第一个基因(OPN1LW或OPN1MW基因)，第二轮进一步确定基因单倍体型及单倍体型来源。灵敏度、准确度高，操作简便，可一次性检测各种OPN1基因单倍体型，并确定单倍体型的基因来源。
一方面，本发明提供了一种检测OPN1LW和/或OPN1MW基因单倍体型的试剂，所述的试剂包括第一轮扩增引物和第二轮扩增轮引物；所述的第一轮扩增引物的序列如SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.2所示，扩增OPN1LW和/或OPN1MW基因簇的第一个基因；所述的第二轮扩增轮引物如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.6所示，扩增的底物为第一轮扩增的产物。
具体地，所述的试剂还包括扩增预混液；
具体地，所述的第一轮扩增引物的扩增体系为：
进一步具体地，所述的扩增预混液1包括但不限于：扩增缓冲液、Mg2+或热启动酶中的一种或多种。
所述的第一轮扩增引物的扩增程序为：
具体地，所述的第二轮扩增引物的扩增体系为：
进一步具体地，所述的扩增预混液2包括但不限于：扩增缓冲液、Mg2+或热启动酶中的一种或多种。
所述的第二轮扩增引物的扩增程序为：
又一方面，本发明提供了一种检测OPN1LW和/或OPN1MW基因单倍体型的方法，所述的包括以下步骤：
S1、提取样本中的DNA；
S2、利用权利要求1中所述的第一轮扩增引物以步骤S1的DNA为模板进行第一轮扩增，获得第一轮扩增产物；第一轮扩增OPN1LW和/或OPN1MW基因簇的第一个基因。
S3、回收步骤S2的第一轮扩增产物；
S4、利用权利要求1中所述的第二轮扩增引物以步骤S3回收的第一轮扩增产物为模板进行第二轮扩增，获得第二轮扩增产物；
S5、对步骤S3的第二轮扩增产物进行Sanger测序；
S6、判定OPN1LW和/或OPN1MW基因单倍体型(p.153/p.171/p.174/p.178/p.180位置的氨基酸类别缩写)及其基因来源。
所述的OPN1LW基因mRNA参考序列为NM_020061.6，所述OPN1MW基因mRNA参考序列为NM_000513.2。
具体地，所述的步骤S1的样本可以是口腔拭子、新鲜组织、血斑或外周静脉血。
优选地，所述的步骤S1的样本可以是外周静脉血。
具体地，所述的步骤S2的第一轮扩增的体系可以是：
| 试剂名称 | 浓度 | 体积/μL |
| 扩增预混液1 | 2× | 25 |
| F-SEQ ID NO.1 | 5-10μM | 1 |
| R-SEQ ID NO.2 | 5-10μM | 1 |
| 模板DNA | 1-20ng/μL | 5 |
| 无核酶水 | / | 补至50μL |
；
所述的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2只扩增OPN1LW和/或OPN1MW基因簇的第一个基因，因此检测的单倍体型来源于OPN1LW和/或OPN1MW基因簇的第一个基因。
所述的扩增预混液1为扩增缓冲液、Mg2+或热启动酶中的一种或多种。
优选地，所述的步骤S2的第一轮扩增的体系为：
| 试剂名称 | 浓度 | 体积/μL |
| 扩增预混液1 | 2× | 25 |
| F-SEQ ID NO.1 | 8-10μM | 1 |
| R-SEQ ID NO.2 | 8-10μM | 1 |
| 模板DNA | 5-10ng/μL | 5 |
| 无核酶水 | / | 补至50μL |
。
具体地，所述的步骤S2的第一轮扩增的程序可以是：
优选地，所述的步骤S2的第一轮扩增的程序可以是：
具体地，所述的步骤S4的第二轮扩增的体系可以是：
所述SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6均既可以扩增OPN1LW基因，也可以扩增OPN1MW基因。
所述的扩增预混液2为扩增缓冲液、Mg2+或热启动酶中的一种或多种。
优选地，所述的步骤S4的第二轮扩增的体系可以是：
具体地，所述的步骤S4的第二轮扩增的程序可以是：
优选地，所述的步骤S4的第二轮扩增的程序可以是：
又一方面本发明提供了前述的试剂在制备OPN1LW和/或OPN1MW基因单倍体型检测试剂盒中的应用。
又一方面本发明提供了一种试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包前述的试剂。
具体地，所述的试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。
本发明所取得的技术效果：
(1)检测的准确度高；
(2)检测的精密度高；
(3)检测的灵敏度高；
(4)本发明的检测方法可有效用于指导配镜。
附图说明
图1为实施例1第一轮长片段扩增产物的琼脂糖凝胶图。
图2为5ng/μL、1ng/μL和0.2ng/μL的人基因组DNA第一轮扩增产物胶图，其中，泳道1为阴性对照，泳道2为Hind IIIλDNA，泳道3-5分别为0.2ng/μL、1ng/μL和5ng/μL的人基因组DNA第一轮长片段扩增的产物，右侧为Hind IIIλDNA各条带大小。
图3为0.2ng/μL的人基因组DNA第二轮扩增产物胶图，其中，泳道1为3号外显子阴性对照，泳道2-4分别为0.2ng/μL、1ng/μL和5ng/μL的人基因组DNA第一轮产物的3号外显子扩增产物，泳道5为100bp DNA ladder，泳道6-8分别为50.2ng/μL、1ng/μL和5ng/μL的人基因组第一轮产物的5号外显子扩增产物，泳道9为5号外显子阴性对照，右侧为100bp DNAladder各条带大小。
图4为3号外显子测序峰图(参考序列为OPN1LW)，从上到下分别为0.2ng/μL、1ng/μL和5ng/μL的人基因组DNA对应的测序峰图。
图5为5号外显子测序峰图(参考序列为OPN1LW)，从上到下分别为0.2ng/μL、1ng/μL和5ng/μL的人基因组DNA对应的测序峰图。
图6为本发明扩增预混液和对比扩增预混液第一轮长片段扩增产物对比胶图，其中，泳道1为Hind IIIλDNA，泳道2-4为本发明扩增预混液第一轮长片段扩增产物，从左到右分别为样本1、样本2和样本3，泳道5-7为对比扩增预混液第一轮长片段扩增产物，从左到右分别为样本1、样本2和样本3，右侧为Hind IIIλDNA各条带大小。
图7为本发明引物和对比引物第一轮长片段扩增产物对比胶图，其中，泳道1为Hind IIIλDNA，泳道2-4为对比例2-4的引物第一轮长片段扩增产物，泳道5为本发明实施例1引物第一轮长片段扩增产物，右侧为Hind IIIλDNA各条带大小。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本实施例中的OPN1基因是指OPN1LW和/或OPN1MW基因。
实施例1
一种检测OPN1LW和OPN1MW基因单倍体型的方法，具体流程如下：
(1)DNA提取
本发明的DNA样本可以来源于口腔拭子、新鲜组织、血斑和外周静脉血，本实施例的DNA样本来自外周静脉血。
DNA提取按照常规的DNA提取流程，使用广州美基生物科技有限公司的DNA提取试剂盒(货号IVD3102)。
(2)第一轮长片段扩增：以步骤(1)基因组DNA为模板，按照表1体系配制长片段扩增体系，进行PCR扩增。第一轮扩增OPN1基因簇的第一个基因，扩增程序为：94℃2min；(98℃10s，68℃8min)40个循环。每次扩增带上阴性和阳性质控品，所述的阴性质控品为无核酶水，所述阳性质控品为含OPN1LW和OPN1MW基因且OPN1LW排在第一位的人基因组DNA。
表1
| 试剂名称 | 体积(μL) |
| 扩增预混液1(KOD One PCR Master Mix) | 25 |
| 引物OPN1-F(10μM) | 1 |
| 引物OPN1-R(10μM) | 1 |
| 模板DNA(2～20ng/μL) | 5 |
| 无核酶水 | 补至50μL |
所述扩增预混液1来源于东洋纺生物科技有限公司，货号KMM-101。所述引物OPN1-F、引物OPN1-R分别为扩增OPN1LW或OPN1MW基因15kb目的片段的正向引物和反向引物，序列见表2。
表2
| 引物名称 | 序列(5’-3’) | 序列编号 |
| 引物OPN1-F | GAAGGGAACAGAGAACACATAAACA | SEQ ID NO.1 |
| 引物OPN1-R | TTCACGCCATCGGTAGACA | SEQ ID NO.2 |
(3)长片段回收：将50μL第一轮长片段扩增产物跑0.8～1％的琼脂糖凝胶，带上15K ladder或Hind IIIλDNA。设置电压为40V，电流为60mA，电泳1.5h后拍照如下图，将目的条带切胶回收(图1中的箭头)。胶回收使用常规的琼脂糖胶回收试剂盒，操作流程按照说明书进行。
(4)第二轮Exon3和Exon5扩增：以回收的长片段为模板按照表3配制体系，进行第二轮3号外显子和5号外显子扩增。扩增程序为：98℃2min；(98℃10s，60℃10s，72℃30s)35个循环。3号外显子扩增确定OPN1LW或OPN1MW基因的单倍体型，5号外显子扩增确定单倍体型来源于OPN1LW或OPN1MW基因。每次扩增带上阴性质控品和阳性质控品的长片段回收产物。
表3
所述PrimeSTAR Max Premix(2X)来源于TAKARA公司，货号R045A。
所述的引物序列见表4。
表4
| 引物名称 | 序列(5’-3’) | 序列编号 |
| 3号外显子-F | TGTCGTTTTTTCCACCTCAGTCC | SEQ ID NO.3 |
| 3号外显子-R | CAGAGTCTGACCCTGCCCACT | SEQ ID NO.4 |
| 5号外显子-F | TCCAACCCCCGACTCACTATCC | SEQ ID NO.5 |
| 5号外显子-R | ACGGTATTTTGAGTGGGATCTGCT | SEQ ID NO.6 |
(5)Sanger测序：将第二轮扩增产物进行Sanger测序。
(6)单倍体型判读：根据3号外显子的测序结果确定单倍体型，单倍体型为第3号外显子SNP的组合，分别位于p.153、p.171、p.174、p.178和p.180，以对应的氨基酸缩写进行编码。表5-1和表5-2汇总了与近视和高度近视相关性大的8种单倍体型cDNA核苷酸序列、氨基酸序列和对应单倍体型发生3号外显子正确剪切的概率。以单倍体型1为例：所检测的OPN1LW或OPN1MW基因的c.453、c.457、c.465、c.511、c.513、c.521、c.532和c.538的核苷酸分别为G、C、G/C、A、T、C、G和G；p.153、p.171、p.174、p.178和p.180分别为L(亮氨酸)、I(异亮氨酸)、A(丙氨酸)、V(缬氨酸)和A(丙氨酸)；这种单倍体型对应的3号外显子发生正确剪切的比例是0％。根据5号外显子的测序结果确定单倍体型来源，若p.309为Y，则检测的单倍体型来源于OPN1LW基因，若p.309为F，则检测的单倍体型来源于OPN1MW基因。
表5-1
表5-2
实验例
1、准确度
选取50例只含有OPN1LW基因(≥1拷贝)的外周静脉血、50例只含有OPN1MW基因(≥1拷贝)的外周静脉血和100例含有1拷贝OPN1LW和1拷贝OPN1MW基因(其中50例OPN1LW基因在前，OPN1MW基因在后；50例OPN1MW基因在前，OPN1LW基因在后)的外周静脉血，按照实施例1进行单倍体型检测，受检者均为男性。OPN1LW和OPN1MW基因的拷贝数由MLPA确定，同时含有1拷贝OPN1LW和1拷贝OPN1MW基因的样本两个基因的排列顺序用长程PCR(LR-PCR)确定。结果显示：50例只含有OPN1LW基因(≥1拷贝)的样本只有2例检出与近视和高度近视相关性大的单倍体型，分别为LIAIA和MVAVA，检出单倍体型均来源于OPN1LW基因；50例只含有OPN1MW基因(≥1拷贝)的样本只有1例检出与近视和高度近视相关性大的单倍体型，为LIAVS，检出单倍体型均来源于OPN1MW基因；50例OPN1LW基因在前，OPN1MW基因在后的样本有4例检出与近视和高度近视相关性大的单倍体型，分别为LVAVA、MIAVA、LIAIA和MVVVA，检出单倍体型均来源于OPN1LW基因；50例OPN1MW基因在前，OPN1LW基因在后的样本有3例检出与近视和高度近视相关性大的单倍体型，分别为LIVVA、LIAVS和MVAVA，检出单倍体型均来源于OPN1MW基因。检测出与近视和高度近视相关性大的单倍体型的10例样本OPN1基因拷贝数及其排列顺序和单倍体型结果汇总如表6所示。
表6
检出的单倍体型均来源于OPN1基因簇的第一个基因，与理论完全相符，表明搭建的OPN1LW和OPN1MW基因单倍体型的检测流程可以准确检测OPN1基因单倍体型并确定单倍体型的基因来源。
2、精密度
选取1例只含OPN1LW基因(1拷贝)、1例只含有OPN1MW基因(2拷贝)和1例含有1拷贝OPN1LW基因和1拷贝OPN1MW基因基因(OPN1LW在前，OPN1MW在后)的样本，每例样本按照实施例1重复检测10次，每例样本10次检测结果均保持一致，见表7。
表7
3、灵敏度
利用本发明实施例1的检测方法检测5ng/μL、1ng/μL和0.2ng/μL的人基因组DNA的OPN1基因单倍体型，3个浓度梯度检出的单倍体型及其基因来源均一致。表明本发明实施例1的检测方法可以检测低至0.2ng/μL的人基因组DNA的OPN1基因单倍体型。第一轮扩增产物胶图见图2，第二轮产物的胶图见图3，3号外显子测序峰图见图4，5号外显子测序峰图见图5。
应用例
利用本发明实施例1检测出LIAVA、LIVVA和LVAVA三种单倍体型的76例近视患者(测试组)和检出其它(LIAVA、LIVVA和LVAVA除外)单倍体型的88例近视患者(对照组)分别进行DOT配镜治疗。经过1年的随访，与基线相比，测试组眼轴(axial length，AL)增长了0.16mm(±0.025mm)，对照组眼轴增长了0.28mm(±0.031mm)，测试组眼轴增长的速度显著低于对照组(p＜0.001)；与基线相比，测试组SE(spherical equivalent，等效球镜度)下降了0.17D(±0.067D)，对照组SE下降了0.50D(±0.072D)，测试组近视度数的控制效果显著优于对照组(p＜0.001)。以上结果表明OPN1基因单倍体型检测可以有效指导近视配镜治疗。
对比例1
参照实施例1的方法设置对比例，对比例与实施例1的区别在于第一轮PCR扩增使用的扩增预混液不同，对比例使用的扩增预混液来源于TAKARA公司的TaKaRa LA(货号RR02MQ)。同时用本发明实施例1的扩增预混液和对比1的扩增预混液对3例口腔拭子样本进行第一轮PCR扩增，结果显示：本发明实施例1的扩增预混液对应的3例样本(样本1、样本2和样本3)在15kb位置均有目的条带，而对比例1的3例样本均无目的条带(图6)。
对比例2-4
参照实施例1的方法设置对比例，对比例与实施例1的区别在于第一轮PCR使用的引物序列不同，对比例2-4的引物序列见表8。同时用本发明实施例1的引物和对比例2-4的引物对1例外周静脉血样本进行第一轮PCR。
表8
结果显示：本发明实施例1的引物在15kb位置有目的条带，而对比例均无目的条带(图7)。
Claims (10)
1.一种检测OPN1LW和/或OPN1MW基因单倍体型的试剂，其特征在于，所述的试剂包括第一轮扩增引物和第二轮扩增轮引物；所述的第一轮扩增引物的序列如SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.2所示，扩增OPN1LW和/或OPN1MW基因簇的第一个基因；所述的第二轮扩增轮引物如SEQID NO.3-SEQ ID NO.6所示，扩增的底物为第一轮扩增的产物。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述的试剂还包括扩增缓冲液、Mg2+或热启动酶中的一种或多种。
3.一种检测OPN1LW和/或OPN1MW基因单倍体型的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
S1、提取样本中的DNA；
S2、利用权利要求1中所述的第一轮扩增引物以步骤S1的DNA为模板进行第一轮扩增，获得第一轮扩增产物；
S3、回收步骤S2的第一轮扩增产物；
S4、利用权利要求1中所述的第二轮扩增引物以步骤S3回收的第一轮扩增产物为模板进行第二轮扩增，获得第二轮扩增产物；
S5、对步骤S4的第二轮扩增产物进行Sanger测序；
S6、判定OPN1LW和/或OPN1MW基因单倍体型及其基因来源。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的步骤S1的样本为口腔拭子、新鲜组织、血斑或外周静脉血。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的步骤S2的第一轮扩增的体系为：
；
所述的扩增预混液1为扩增缓冲液、Mg2+或热启动酶中的一种或多种。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的步骤S2的第一轮扩增的程序为：
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的步骤S4的第二轮扩增的体系为：
所述的扩增预混液2为扩增缓冲液、Mg2+或热启动酶中的一种或多种。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的步骤S4的第二轮扩增的程序为：
9.权利要求1-2任一项所述的试剂在制备OPN1LW和/或OPN1MW基因单倍体型检测试剂盒中的应用。
10.一种试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包括权利要求1-2任一项所述的试剂。
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