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CN118562750B - 黄嘌呤氧化酶 - Google Patents

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CN118562750B
CN118562750B CN202410628835.5A CN202410628835A CN118562750B CN 118562750 B CN118562750 B CN 118562750B CN 202410628835 A CN202410628835 A CN 202410628835A CN 118562750 B CN118562750 B CN 118562750B
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xanthine oxidase
xod
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amino acid
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刘鹏飞
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Beijing Dacheng Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明公开了一种黄嘌呤氧化酶。本发明还公开了一种突变的黄嘌呤氧化酶，热稳定性好且活性高。本发明还公开了编码黄嘌呤氧化酶的DNA序列、含有DNA序列的表达载体、重组菌株、黄嘌呤氧化酶的制备方法。本发明还公开了黄嘌呤氧化酶在制备临床检测5’‑核苷酸酶、腺苷脱氨酶试剂盒中的应用，重复性好，精密度高。

Description

黄嘌呤氧化酶
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域。更具体地说，本发明涉及一种黄嘌呤氧化酶、突变的黄嘌呤氧化酶、编码黄嘌呤氧化酶的DNA序列、含有DNA序列的表达载体、重组菌株、黄嘌呤氧化酶的制备方法以及黄嘌呤氧化酶在制备临床检测5’-核苷酸酶、腺苷脱氨酶试剂盒中的应用。
背景技术
黄嘌呤氧化酶(XOD，EC 1.17.3.2)是一种多功能的钼黄素蛋白，是黄嘌呤氧化还原酶(XOR)的形式之一。XOD的特征是每个酶单元结合两个黄素分子(FAD)，两个钼原子和八个铁原子。XOD广泛分布于各种真核生物和原核生物的组织和细胞中。真核生物XODs是分子量为300KDa的同源二聚体。大多数原核生物可以与嘌呤作为氮、碳或能源一起生长。原核来源不同亚基(Mw)揭示了几种不同的四级结构，如(αβγ)2包膜红杆菌，α3恶臭假单胞菌(PpXOD)，(αβ)2荚膜红杆菌(RcXOD)和节杆菌属，αβγ来自大肠杆菌(EcXOD)，和来自节肢杆菌S-2的αβ。其分子量和亚基组成的差异反映了原核XOD酶与真核XOD酶相比的多样性和进化过程。原核XOD家族的多样性可能揭示了这些酶的不同特性和特定功能。然而，对原核生物XOD的研究较少。
XOD属于金属黄素蛋白复合物类。通过氧化巯基残基或黄嘌呤脱氢酶(XDH)蛋白酶解生产。尿酸盐形成的最后两个步骤中，XOD和XDH起着至关重要的作用。在慢性肝病患者的血清中，可观察到XOD水平升高。因此，XOD可用作检测肝病的生物标志物。黄黄嘌呤氧化酶是嘌呤代谢途径中的关键酶，催化次黄嘌呤羟基化为黄嘌呤，并进一步将黄嘌呤羟基化为尿酸，同时降低NAD或分子氧。这种酶也与咖啡因代谢有关。XOD在异生素的分解代谢中也起着至关重要的作用，包括各种药物，如硫嘌呤药物，含有6-巯基嘌呤，别嘌呤醇和尿酸。过量的XOD活性会导致高尿酸血症(血液中尿酸水平较高)，这进一步导致痛风。
目前国内外所使用的黄嘌呤氧化酶，主要是从牛奶中获取，活性约1U/mg。由于其来源较为单一，生产成本较高，而且黄嘌呤氧化酶的含量和质量受批次影响，在应用上对其限制很大。国内外公司的相应产品的热稳定性不好，不能满足试剂运输中产生的高温问题。因此，需要一种新的黄嘌呤氧化酶基因和假单胞菌表达系统。
发明内容
本发明的目的是提供一种黄嘌呤氧化酶，其B亚基氨基酸序列为SEQ ID NO:1，A亚基氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
本发明的另一目的是提供一种突变的黄嘌呤氧化酶，其B亚基氨基酸序列为SEQID NO:3；其A亚基氨基酸序列为SEQ ID NO:4。
本发明的另一目的是提供编码黄嘌呤氧化酶的DNA序列。
本发明的另一目的是提供含有DNA序列的表达载体。
本发明的另一目的是提供含有DNA序列的重组菌株。
本发明的另一目的是提供黄嘌呤氧化酶的制备方法。
本发明的另一目的是提供黄嘌呤氧化酶在制备临床检测5’-核苷酸酶、腺苷脱氨酶试剂盒中的应用。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种黄嘌呤氧化酶，其B亚基氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，A亚基氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
突变的黄嘌呤氧化酶，其B亚基氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，其A亚基氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
编码所述的黄嘌呤氧化酶的DNA序列，如SEQ ID NO:5所示。
编码所述的黄嘌呤氧化酶的DNA序列，如SEQ ID NO:6所示。
包含所述的DNA序列的表达载体，所述载体是原核表达载体、昆虫细胞表达载体、酵母或真菌表达载体。
包含所述的DNA序列的重组菌株，通过将包含黄嘌呤氧化酶表达框的表达载体转化至表达宿主中得到，所述黄嘌呤氧化酶表达框由启动子和连接于所述启动子下游的黄嘌呤氧化酶基因组成，所述表达宿主为门多萨假单胞菌、门多萨假单胞菌、铜绿假单胞杆菌、恶臭假单胞杆菌、荧光假单胞杆菌。
黄嘌呤氧化酶的制备方法，包括构建所述的黄嘌呤氧化酶的表达载体，转化表达宿主得到重组菌株，诱导黄嘌呤氧化酶的表达，分离纯化黄嘌呤氧化酶。
所述的黄嘌呤氧化酶在制备临床检测5’-核苷酸酶、腺苷脱氨酶试剂盒中的应用。
本发明至少包括以下有益效果：
第一、本发明将黄嘌呤氧化酶基因用易错PCR进行随机突变，并通过表达载体在门多萨假单胞菌NK-01中进行预表达与筛选，得到一株热稳定性好且活性高的黄嘌呤氧化酶突变体，该黄嘌呤氧化酶突变体的酶学性质与野生型黄嘌呤氧化酶相同，且其热稳定性显著高于野生型黄嘌呤氧化酶，活性是牛奶来源的91.1倍，适合黄嘌呤氧化酶大规模工业化生产。
第二、本发明通过重组菌株发酵，可获得大量黄嘌呤氧化酶突变体，为临床诊断试剂的开发提供大量原料，降低生产成本。本发明制备的试剂盒用于检测5’-核苷酸酶、腺苷脱氨酶，重复性好，精密度高。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明的pBBR1MCS-5_XOD图谱和pBBR1MCS-5_XOD-mut图谱；
图2为本发明的XOD的PCR鉴定结果；
图3为本发明的XOD与XOD-mut在不同pH下的活力曲线；
图4为本发明的XOD与XOD-mut在不同pH保持15h后的活力曲线；
图5为本发明的XOD与XOD-mut在不同温度下的活力曲线；
图6为本发明的XOD、XOD-mut与牛奶来源cXOD在不同温度下保持30min后的活力曲线。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明保护的黄嘌呤氧化酶，其B亚基氨基酸序列为SEQ ID NO:1，A亚基氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
SEQ ID NO:1氨基酸序列具体如下：
MAININGAPAEATPRPGGQCLRTFLREQGNLGVRKGCDGGDCGACTVHVDGTDGVPVCIYPAVRAEV
TTIETTIEGLAEASGLHPGLHPVQQCGFCTRQGFQCGFCTAATFSDMTAATFDDEQGNLCLPRNLKGSI
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QLLHLKLHLKVLRSPHAHARVVSIDSDALKIPRIPGVVAVSPTQLFSAPEQLFSTAQHELFTDDNVVRFI
GQLDDVVRFIGQRVAAVGTRAVAAAEAGVRALAAEYEELPAVFTPGDKDSRPGAPLVHGGPANNVAA
ARISRPDRNVVAGFRAGSVADGFSAADFIHEALETHSQRVQHVALETHAAISQVPFLVKEGRLQVRTSS
QVPDRVRVTLCRVFGLEEDRVQEVLVAGRVGGGFGGKQEVQVEVALAALKLKRPVQLHPFTIQFTAT
TTRHPFTIRLKAGASDTGAHLTALELDVLGVMFHYGNHGPGVMFHGVMFHAVYKCDNKKVDAHA
MYTNTVPSGIDERGYGLSQMIFAVLNMMDELAAGIGMDPYPEPEEDVMVREGDHMLSTHPEPEEDR
GRGSYGLDQCLDLVRPEWVTGRERYRAAGLDQLGPRGHYGAALSMIDTVPPRGHFAHSRIAEFGGT
YQADVGTAEFGNGTTALGTSAQLAATALSTEAAHDTGAQSDTDLVEHDTGAFGSAEELSTGKATLAA
AEELAVRIDCHLNAGIRQTQASACVLAELYVVVDRTPVALSELAQAALYEEALAAEGRWGGTNTGTG
FNVHGFRVAVNRVNPRQRILQSVQAADAGVVVNPRQCRGQIEGGIAQAIGAALTDILRVDSTGKVTTD
IDVPRSETFADVPRSAKFADTNDKLGPPALANMSESPFNPVIRFSAIRNATGVRFASLLALRDRIYLGAS
AMVPVGEGVTR
SEQ ID NO:2氨基酸序列具体如下：
MDMNTIEAVRPTADPAQWRDGDAWLAGETVLFSYGSYAFGPRQVAGWEPGAGGETPVTVTDDGICT
VCRTCTIAELPGGAGVPDAAGLSWVYRPCLVRPCCDSFVAWNLSTNMVTVGGNLCTSSLCADISLCA
GLDGVATHGARGLTSRSVPTGDGTGDAKECRSIRLPLLRSVHLPASALSISLSNLRRLSLSNLGRSGVLI
GRRGFTALVLTVSTKRPVRQLRFDSLPDAVLAHSLDDAIPDGLYHDDHGLPAWRNDRRDMLAEEIRA
LCADPTGTGAPGPVSGPKHRSAPASGSTALPKGA
本发明保护的突变的黄嘌呤氧化酶，其B亚基氨基酸序列为SEQ ID NO:3；其A亚基氨基酸序列为SEQ ID NO:4。
SEQ ID NO:3氨基酸序列具体如下：
MAININGAPAEATPRPGGQCLRTFLREQGNLGVRKGCDGGDCGACTVHVDGTDGVPVCIYPAVRAEV
TTIETTIEGLAEASGLHPGLHPVQQCGFCTRQGFQCGFCTAATFSDMTAATFDDEQGNLCLPRNLKGSI
ADSCTGYRAIADAVADSAGHPAPQGQGARPDSGSQPDPEPGQLGDDVPAPASGAARYTLARYTLDIK
QLLHLKLHLKVLRSPHAHARVVSIDSDALKIPRIPGVVAVSPTQLFSAPEQLFSTAQHELFTDDNVVRFI
GQLDDVVRFIGQRVAAVGTRAVAAAEAGVRALAAEYEELPAVFTPGDKDSRPGAPLVHGGPANNVAA
ARISRPDRNVVAGFRAGSVADGFSAADFIHEALETHSQRVQHVALETHAAISQVPFLVKEGRLQVRTSS
QVPDRVRVTLCRVFGLEEDRVQEVLVAGRVGGGFGGKQEVQVEVALAALKLKRPVQLHPFTIQFTAT
TTRHPFTIRLKAGASDTGAHLTALELDVLGVMFHYGNHGPGVMFHGVMFHAVYKCDNKKVDAHA
MYTNTVPSGIDERGYGLSQMIFAVLNMEDELAAGIGMDPYPEPEEDVMVREGDHMLSTHPEPEEDR
GRGSYGLDQCLDLVRPEWVTGRERYRAAGLDQLGPRGHYGAALSMIDTVPPRGHFAHSRIAEFGGT
YQADVGTAEFGNGTTALGTSAQLAATALSTEAAHDTGAQSDTDLVEHDTGAFGSAEELSTGKATLAA
AEELAVRIDCHLNAGIRQTQASACVLAELYVVVDRTPVALSELAQAALYEEALAAEGRWGGTNTGTG
FNVHGFRVAVNRTNPRQRILQSVQAADAGVVVNPRQCRGQIEGGIAQAIGAALTDILRVDSTGKVTTD
IDVPRSETFADVPRSAKFADTNDKLGPPALANMSESPFNPVIRFSAIRNATGVRFASLLALRDRIYLGAS
AMVPVGEGVTR
SEQ ID NO:4氨基酸序列具体如下：
MDMNTIEAVRPTADPAQWRDGDAWLAGETVLFSYGSYAFGPRQVAGWEPGAGGETPVTVTDDGICT
VCRTCTIAELPGGARVPDAAGLSWVYRPCLVRPCCDSFVAWNLSTNMVTVGGNLCTSSLCADISLCA
GLDGVATHGARGLTSRSVPTGDGTGDAKECRSIRLPLLRSVHLPASALSISLSNLRRLSLSNLGRSGVLI
GRRGFTALVLTVSTKRPVRQLRFDSLPDAVLAHSLDDAIPDGLYHDDHGLPAWRNDRRDMLAEEIRA
LCADPTGTGAPGPVSGPKHRSAPASGSTALPKGA
具体地，对黄嘌呤氧化酶核酸序列进行易错PCR随机突变，黄嘌呤氧化酶B亚基，第203位氨基酸由P突变K，第568位氨基酸由M突变E，第819位氨基酸由V突变T；黄嘌呤氧化酶A亚基，第81位氨基酸由G突变R，得到热稳定性好且活性高的黄嘌呤氧化酶。
对所述的氨基酸序列SEQ ID NO:1-4进行一个或多个氨基酸的替换、缺失或增加，但其黄嘌呤氧化酶功能不变的氨基酸序列也属于本申请的保护范围。
氨基酸序列中如果发生同一个组别的氨基酸残基取代，例如由K取代R或由L取代I，所述残基在蛋白质结构域中所起的作用没有改变，因此对蛋白质的立体结构并不会产生影响，因此仍然可以实现蛋白的功能。例如，D和E、S和T、A和G、Q和N、P和G、F和W、A和V、C和M等，两两之间相互替换，不会影响蛋白的立体结构和功能活性。所述同属一个类别的氨基酸残基取代可以发生在黄嘌呤氧化酶上的任意一个氨基酸残基位置上。相反，不同类别的氮基酸残基发生取代，或者氨基酸的取代不符合上述列举的取代规律，很可能会使蛋白的结构发生变化，功能出现差异。
本发明提供的黄嘌呤氧化酶还可以进行修饰或突变，得到衍生的蛋白质。本发明所述“衍生的蛋白质”指与具有上述氨基酸序列的黄嘌呤氧化酶存在氨基酸基酸序列上的差异，或者有不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。所述诱导变异体可以通过各种技术得到，如辐射或诱变剂中产生的随机突变，也可以通过如定点突变法或其他己知分子生物学的技术获得。
修饰形式包括：体内或体外的蛋白的化学衍生形式，如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酸或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。
在更进一步优选的实施方式中，所述黄嘌呤氧化酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少90％的一致性，优选具有至少95％的一致性，更优选具有至少99％的一致性。
编码黄嘌呤氧化酶XOD的DNA序列，如SEQ ID NO:5所示。
SEQ ID NO:5核苷酸序列具体如下：
ATGGACATGAACACCATCGAGGCCGTGCGTCCGACCGCCGATCCAGCGCAATGGCGTGACGGT
GATGCCTGGCTGGCCGGTGAAACCGTGCTGTTCAGCTACGGCAGCTACGCCTTCGGTCCGCGT
CAGGTGGCCGGTTGGGAACCAGGTGCCGGTGGCGAAACCCCAGTGACCGTGACCGACGACGG
CATCTGCACCGTGTGCCGTACCTGCACCATCGCCGAGCTGCCAGGTGGTGCGGGTGTGCCGGA
TGCCGCCGGTCTGAGCTGGGTGTATCGTCCGTGCCTGGTGCGTCCGTGCTGCGACAGCTTCGTG
GCCTGGAACCTGAGCACCAACATGGTGACCGTCGGTGGCAACCTGTGCACCAGCAGCCTGTGC
GCCGACATCTCGCTGTGCGCCGGTCTGGATGGCGTGGCGACCCATGGTGCCCGTGGTCTGACC
AGCCGTTCGGTGCCAACCGGTGACGGCACCGGTGATGCGAAAGAGTGCCGCAGCATCCGCCT
GCCGCTGCTGCGTAGCGTGCATCTGCCAGCGAGCGCCCTGAGCATCAGCCTGAGCAACCTGCG
TCGCCTGAGCCTGTCGAACCTGGGTCGCAGCGGTGTGCTGATCGGTCGCCGTGGCTTCACCGC
GCTGGTGCTGACCGTGTCGACCAAGCGTCCGGTGCGCCAGCTGCGCTTCGACAGCCTGCCGGA
CGCCGTGCTGGCCCATAGCCTGGATGACGCGATCCCGGACGGCCTGTACCACGACGACCATGG
CCTGCCAGCCTGGCGCAACGACCGTCGCGATATGCTGGCCGAAGAGATCCGTGCGCTGTGCGC
GGATCCAACCGGCACCGGTGCGCCAGGTCCGGTGAGCGGTCCGAAACATCGTAGCGCCCCAG
CCAGCGGTTCGACCGCGCTGCCAAAGGGTGCCTGAGCATGGCCATCAACATCAACGGTGCCCC
AGCCGAGGCGACCCCACGTCCAGGCGGTCAGTGCCTGCGTACCTTCCTGCGCGAGCAGGGCA
ACCTGGGCGTGCGCAAAGGTTGCGACGGTGGCGATTGCGGTGCCTGCACCGTCCATGTGGATG
GCACCGATGGCGTGCCGGTCTGCATCTACCCAGCCGTGCGTGCGGAGGTGACCACCATCGAAA
CCACCATCGAGGGCCTGGCCGAGGCCAGCGGTCTGCACCCAGGCCTGCATCCGGTGCAGCAGT
GCGGCTTCTGCACCCGTCAGGGCTTCCAATGCGGTTTCTGCACCGCCGCCACCTTCAGCGACAT
GACCGCGGCGACCTTCGACGACGAACAGGGTAACCTGTGCCTGCCACGCAACCTGAAGGGCT
CGATCGCCGACTCGTGCACCGGCTACCGTGCGATCGCGGATGCCGTGGCCGATAGCGCCGGTCA
TCCAGCGCCACAAGGTCAGGGTGCCCGTCCGGATAGCGGCAGCCAGCCGGATCCAGAACCGG
GTCAGCTGGGCGACGATGTGCCAGCGCCAGCCTCGGGTGCCGCGCGTTATACCCTGGCGCGTT
ACACCCTGGACATCCCACAGCTGCTGCATCTGAAGCTGCACCTGAAGGTCCTGCGCAGCCCAC
ACGCGCATGCCCGTGTCGTGAGCATCGACTCGGACGCCCTGAAGATCCCACGCATCCCAGGCG
TGGTGGCCGTGTCGCCGACCCAACTGTTCTCGGCCCCAGAGCAGCTGTTCTCCACCGCGCAGC
ACGAGCTGTTCACCGACGACAACGTGGTGCGCTTCATCGGCCAGCTGGACGACGTGGTCCGTT
TCATCGGTCAACGCGTGGCCGCCGTGGGCACCCGTGCCGTCGCCGCCGCCGAAGCCGGTGTGC
GTGCCCTGGCCGCCGAGTACGAAGAACTGCCAGCCGTGTTCACCCCAGGCGACAAGGACAGC
CGTCCAGGTGCGCCACTGGTGCATGGCGGTCCAGCCAACAACGTGGCCGCGGCGCGTATCTCG
CGTCCGGACCGCAACGTGGTCGCCGGTTTCCGTGCCGGTTCGGTGGCCGATGGTTTCAGCGCC
GCCGACTTCATCCACGAGGCCCTGGAAACCCACTCGCAGCGCGTGCAGCACGTCGCGCTGGA
AACCCATGCCGCGATCAGCCAGGTGCCATTCCTGGTGAAAGAGGGTCGCCTGCAGGTCCGCAC
CAGCTCGCAAGTGCCGGATCGCGTGCGTGTGACCCTGTGCCGTGTGTTCGGCCTGGAAGAGGA
CCGCGTGCAAGAGGTGCTGGTCGCGGGTCGTGTCGGTGGCGGTTTCGGTGGTAAGCAAGAGG
TCCAGGTGGAAGTGGCCCTGGCGGCCCTGAAGCTGAAGCGTCCAGTGCAACTGCATCCGTTCA
CCATCCAGTTCACCGCCACCACCACCCGTCATCCATTCACCATCCGCCTGAAAGCCGGTGCCAG
CGATACCGGTGCGCATCTGACCGCGCTGGAACTGGACGTGCTGGGCGTGATGTTCCACTACGG
CAACCACGGTCCGGGTGTCATGTTCCACGGCGTCATGTTCCATGCCGTGTACAAGTGCGACAA
CAAGAAGGTGGACGCCCACGCCATGTACACCAACACCGTGCCGAGCGGCATCGACGAGCGTG
GCTATGGCCTGAGCCAGATGATCTTCGCCGTCCTGAACATGATGGACGAGCTGGCGGCCGGTAT
CGGCATGGACCCGTATCCGGAACCGGAAGAGGATGTGATGGTGCGCGAGGGCGACCACATGCT
GAGCACCCATCCAGAGCCGGAAGAGGACCGTGGCCGTGGCAGCTACGGCCTGGACCAGTGCC
TGGACCTGGTCCGTCCGGAATGGGTGACCGGTCGCGAGCGTTATCGTGCGGCCGGTCTGGACC
AACTGGGTCCGCGTGGCCATTACGGTGCGGCCCTGTCCATGATCGATACCGTGCCACCGCGTGG
TCACTTCGCCCACAGCCGTATCGCGGAATTCGGTGGCACCTACCAGGCCGATGTGGGCACCGC
CGAGTTCGGCAACGGCACCACCGCGCTGGGCACCTCGGCGCAACTGGCCGCCACCGCGCTGT
CGACCGAAGCCGCGCATGACACCGGTGCGCAGAGCGACACCGACCTGGTCGAGCATGATACC
GGTGCCTTCGGCAGCGCCGAGGAACTGTCCACCGGCAAAGCGACCCTGGCGGCGGCCGAAGA
ACTGGCCGTGCGCATCGACTGCCACCTGAACGCCGGTATCCGTCAGACCCAGGCCAGCGCCTG
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CCGGCTTCAACGTGCACGGCTTCCGCGTCGCCGTGAACCGCGTGAACCCACGCCAGCGTATCC
TGCAGAGCGTGCAAGCGGCCGATGCGGGTGTCGTGGTCAACCCACGTCAGTGCCGTGGTCAGA
TCGAAGGCGGTATCGCCCAGGCGATCGGTGCCGCGCTGACCGATATCCTGCGCGTGGACAGCA
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CGGCCAAGTTCGCGGACACCAACGACAAGCTGGGTCCGCCAGCGCTGGCCAACATGAGCGAG
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CGCTGCTGGCCCTGCGCGACCGCATCTACCTGGGTGCGAGCGCCATGGTGCCGGTCGGTGAAG
GCGTGACCCGCTGA
编码突变的黄嘌呤氧化酶XOD-mut的DNA序列，如SEQ ID NO:6所示。
SEQ ID NO:6核苷酸序列具体如下：
ATGGACATGAACACCATCGAGGCCGTGCGTCCGACCGCCGATCCAGCGCAATGGCGTGACGGTGA
TGCCTGGCTGGCCGGTGAAACCGTGCTGTTCAGCTACGGCAGCTACGCCTTCGGTCCGCGTCAGG
TGGCCGGTTGGGAACCAGGTGCCGGTGGCGAAACCCCAGTGACCGTGACCGACGACGGCATCTG
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GGTCCAGGTGGAAGTGGCCCTGGCGGCCCTGAAGCTGAAGCGTCCAGTGCAACTGCATCCGTTC
ACCATCCAGTTCACCGCCACCACCACCCGTCATCCATTCACCATCCGCCTGAAAGCCGGTGCCAG
CGATACCGGTGCGCATCTGACCGCGCTGGAACTGGACGTGCTGGGCGTGATGTTCCACTACGGCA
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AAGGTGGACGCCCACGCCATGTACACCAACACCGTGCCGAGCGGCATCGACGAGCGTGGCTATG
GCCTGAGCCAGATGATCTTCGCCGTCCTGAACATGGAGGACGAGCTGGCGGCCGGTATCGGCATG
GACCCGTATCCGGAACCGGAAGAGGATGTGATGGTGCGCGAGGGCGACCACATGCTGAGCACCC
ATCCAGAGCCGGAAGAGGACCGTGGCCGTGGCAGCTACGGCCTGGACCAGTGCCTGGACCTGGT
CCGTCCGGAATGGGTGACCGGTCGCGAGCGTTATCGTGCGGCCGGTCTGGACCAACTGGGTCCGC
GTGGCCATTACGGTGCGGCCCTGTCCATGATCGATACCGTGCCACCGCGTGGTCACTTCGCCCACA
GCCGTATCGCGGAATTCGGTGGCACCTACCAGGCCGATGTGGGCACCGCCGAGTTCGGCAACGGC
ACCACCGCGCTGGGCACCTCGGCGCAACTGGCCGCCACCGCGCTGTCGACCGAAGCCGCGCATG
ACACCGGTGCGCAGAGCGACACCGACCTGGTCGAGCATGATACCGGTGCCTTCGGCAGCGCCGA
GGAACTGTCCACCGGCAAAGCGACCCTGGCGGCGGCCGAAGAACTGGCCGTGCGCATCGACTGC
CACCTGAACGCCGGTATCCGTCAGACCCAGGCCAGCGCCTGCGTCCTGGCCGAACTGTACGTGGT
GGTCGATCGCACCCCAGTCGCGCTGAGCGAACTGGCCCAAGCGGCGCTGTACGAGGAAGCGCTG
GCCGCGGAAGGCCGTTGGGGTGGCACCAACACCGGCACCGGCTTCAACGTGCACGGCTTCCGCG
TCGCCGTGAACCGCACGAACCCACGCCAGCGTATCCTGCAGAGCGTGCAAGCGGCCGATGCGGG
TGTCGTGGTCAACCCACGTCAGTGCCGTGGTCAGATCGAAGGCGGTATCGCCCAGGCGATCGGTG
CCGCGCTGACCGATATCCTGCGCGTGGACAGCACCGGCAAGGTCACCACCGATATCGACGTGCCA
CGCAGCGAAACCTTCGCGGACGTCCCACGCTCGGCCAAGTTCGCGGACACCAACGACAAGCTGG
GTCCGCCAGCGCTGGCCAACATGAGCGAGAGCCCGTTCAACCCGGTGATCCGCTTCAGCGCCATC
CGTAACGCCACCGGTGTGCGCTTCGCCTCGCTGCTGGCCCTGCGCGACCGCATCTACCTGGGTGC
GAGCGCCATGGTGCCGGTCGGTGAAGGCGTGACCCGCTGA
以黄嘌呤氧化酶的基因为模板，将此基因用易错PCR进行随机突变，并通过构建的表达载体在门多萨假单胞菌NK-01中进行预表达与筛选，得到的突变基因工程菌，表达的黄嘌呤氧化酶热稳定好，能耐70℃高温。经检测，酶学性质为：B亚基分子量约101KDa，A亚基分子量约24.4KDa；热稳定性：70℃，30min。在37℃，pH 7.5条件下XOD的Km值为2.5×10-5M(黄嘌呤为底物)，3.6×10-5M(次黄嘌呤为底物)；XOD-mut的Km值为1.8×10-5M(黄嘌呤为底物)，3.2×10-5M(次黄嘌呤为底物)。而且，在发酵生产黄嘌呤氧化酶的应用中，能够在不改变原有的生产过程，工艺步骤的情况下，使微生物发酵法生产黄嘌呤氧化酶的生产能力提高，适合黄嘌呤氧化酶大规模工业化生产，具有很高的应用价值和工业实用性。
<XOD的载体构建和摇瓶发酵>
1.实验材料
pBBR1MCS-5载体质粒、门多萨假单胞菌NK-01菌种本公司保存；DNA marker15000购自北京天根生物科技有限公司；蛋白胨和酵母粉购自OXOID；Ni柱和SP柱购自GE公司；EcoR I和Sal I酶购自NEB(北京)有限公司。
2.黄嘌呤氧化酶蛋白的表达的构建
由生工生物合成XOD基因片段，与pBBR1MCS-5载体经EcoR I和Sal I双酶切后用同源重组酶进行连接，PCR鉴定结果如图2所示，M：marker，黄嘌呤氧化酶DNA序列C端包含8×His标签，然后转化DH5α感受态，涂LB固体平板(庆大霉素10μg/mL)，每条基因做菌落PCR筛选转化子24个，并用双酶切鉴定重组子，送测序公司基因测序，构建成功载体命名为pBBR1MCS-5-XOD，图谱如图1A所示。
3.黄嘌呤氧化酶表达质粒小提
黄嘌呤氧化酶阳性克隆DH5α菌株，接种到10mL的LB培养基中，含10μg/mL的gentamycin，培养至对数生长中期(OD600＝0.5-0.8)时取出1mL菌液加入无菌甘油-80℃保存菌种，剩余细菌继续于37℃过夜培养。用质粒小提试剂盒提质粒，分装保存。
LB培养基：Trypton l％，Yeast Extract 0.5％，NaCl 1％，pH 7.5。制作平板时加入2％琼脂粉。121℃高压灭菌20min。可于室温保存数月。用于培养pBBR1MCS-5转化宿主菌DH5α时，让培养基冷却至至少50℃，然后将gentamycin加入到10μg/mL终浓度，可以4℃条件下保存1-2周。
4.门多萨假单胞菌电击感受态制备
(1)-80℃保存的门多萨假单胞菌在固体LB平板上划线；
(2)从新鲜培养的平板上接种一单菌落至5-10mL LB液体培养基中，200rpm，37℃培养过夜(16h)；
(3)接种1.5mL过夜培养的菌液至150mL(装于500mL的三角瓶中)新鲜的LB培养基中，200rpm，37℃培养3-4h，至细菌达到对数生长期，菌数达到约1×108cells/mL；
(4)将菌液转移至无菌50mL离心管中，冰浴15min，然后4℃，4500rpm，5min，离心收集菌体；
(5)弃上清，用30mL冰冷的10％甘油重悬菌体，冰浴5min，然后4℃，4500rpm，5min，离心收集菌体；
(6)弃上清，用15mL冰冷的10％甘油重悬菌体，冰浴5min，然后4℃，4500rpm，5min，离心收集菌体；
(7)用2mL预冷的10％甘油重悬菌体，细胞浓度约1×1010cells/mL；
(8)将感受态细胞分装于1.5mL的离心管中，每份50μL，超低温(液氮)速冻之后，于-80℃保藏。
5.电转门多萨假单胞菌
取5μL质粒电转化NK-01电击感受态细胞250μL，混匀后加入预冷的0.2cm(electrode gap)电击转化杯(cuvette)中，具体参数为高压脉冲2.5kV/cm，电容25μF，电阻200Ω，电击5ms；电击完毕取出杯子并立即加入800μl LB培养基并转移到原离心管中，37℃，200rpm，复苏1h，取500μL菌液涂布至含有30μg/mL的gentamycin的LB板上，于37℃过夜倒置培养24-36h。
6.pBBR1MCS-5-XOD菌种的摇瓶发酵
挑取单克隆菌落3株，29-30℃，150rpm培养4h，取菌加入甘油于-80℃保存菌种。同时1:1000接入TB培养基(不含乳糖)中，29-30℃，150rpm培养8h后，加入钼酸铵终浓度为1mM，继续培养20h后取2mL菌液12000rpm离心弃上清，向沉淀加入2mL Tris-HCl缓冲液，pH7.5，超声1-2min后12000rpm离心得上清，即得细胞粗酶液。
7.纯化
通过镍柱亲和层析将黄嘌呤氧化酶提纯。
平衡缓冲液：pH 7.5的50mM Tris缓冲液含0.15M NaCl，含20mM咪唑。
洗脱缓冲液：①pH 7.5的50mM Tris缓冲液含0.15M NaCl，含50mM咪唑。
②pH 7.5的50mM Tris缓冲液含0.15M NaCl，含100mM咪唑。
③pH 7.5的50mM Tris缓冲液含0.15M NaCl，含300mM咪唑。
(1)取纯化Ni柱，清洗干净柱子，加入3-4mL镍琼脂糖凝胶，用洗瓶清洗柱子5次，再用平衡液平衡柱子2次；
(2)过柱，流出FT，取样FT；
(3)用20倍柱体积平衡缓冲液洗去未吸附的杂蛋白，流速1-2mL/min，直到流出液经紫外分光检测仪测光吸收稳定时开始洗脱柱子上吸附的XOD；
(4)用50mM，100mM，300mM咪唑浓度分阶段洗脱柱子，洗脱5-10个柱体积左右，流速1-2mL/min，4mL/管收集；(收集蛋白起点的确定：紫外分光光度的示数上升较快；收集蛋白终点的确定：紫外分光光度示数下降平稳)
(5)将收集的各浓度梯度洗脱下来的XOD蛋白，取样测活，跑SDS-page电泳；
(6)根据活性结果和SDS-page电泳图，对有活性的XOD蛋白洗脱组分进行透析换液。
<XOD酶活性的测定>
XOD酶活性一个单位定义为在37℃，pH 7.5条件下催化每分钟形成一微摩尔尿酸的酶量。
反应公式：
尿酸在293nm处有光吸收。
试剂配置如表1所示。
表1
酶活力检测步骤：
1、反应管(比色杯)中准备表2的反应混合液，37℃平衡5min。
表2
2、加0.1mL待测酶溶液(预先用预冷的E酶稀释液把酶溶液稀释到0.1-0.2U/mL)，颠倒混匀。
3、分光光度计预热37℃，用蒸馏水调零，于293nm处检测3-4min后OD值的增长，计算每分钟的ΔOD test(从线性曲线的起点开始计算)。
同时用E酶稀释液代替酶溶液，用同样的方法测定ΔOD blank。
<XOD酶活力计算>
酶活单位计算方法：
体积XOD酶活力
重量XOD酶活力(U/mg)＝(U/mL)×1/C
其中，各符号或数字的含义如下：Vt，总体积(2.5mL)；Vs，样本体积(0.1mL)；12.5，pH 7.5测定条件下尿酸的毫摩尔消光系数cm2/mM)；1.0，光穿过路径(cm)；df，稀释倍数；C，酶浓度(c mg/mL)。
取细胞粗酶液测定酶活性，筛选高产的转化子，发酵后纯化XOD并冻干，再测定活性，突变株XOD-mut比XOD活性提高126％，如表3所示。对照组cXOD购买自Sigma公司，货号10110434001。
表3
名称 活性(U/mg-solid)
cXOD 1
XOD 40.2
XOD-mut 91.1
<XOD基因的热稳定性随机突变>
将黄嘌呤氧化酶序列表达载体pBBR1MCS-5-XOD用易错PCR进行随机突变，切胶回收得到突变的DNA片段，将该突变的DNA片段与pBBR1MCS-5质粒连接，构建重组载体pBBR1MCS-5-XOD-mut，如图1B所示。质粒小提，然后通过电转的方式转入门多萨假单胞菌NK-01电击感受态中，涂板子挑克隆，并将其进行扩大培养得转化产物培养液。
所述易错PCR方法进行随机突变的条件如下：
25μL 2×易错PCR缓冲液(100mM KCl，15mM MgCl2，50mM Tris-HCl pH8.2，0.02％明胶；5μM dATP，5μM dGTP，5μM dTTP和5μM dCTP；0.1mM MnCl2，0.5U Taq DNA聚合酶)，500nM引物XOD-For、500nM引物XOD-Rev、25ng质粒DNA，无菌水调至反应体积至50μL；
扩增程序为：将上述反应体系95℃8min；31个循环的“95℃30s，56℃30s，72℃4min”；72℃10min；将得到的PCR扩增基因产物用1％琼脂糖凝胶电泳分离，并回收DNA片段。
进一步地，pBBR1MCS-5-XOD的PCR扩增反应中，采用如下引物对：
XOD-For：5’-ATTTCACACAGGAAACAGCTATGGACATGAACACCATCG-3’；
XOD-Rev：5’-TAACAAAATATTAACGCTCAGCGGGTCACGCCTTCACCG-3’；
<突变株筛选>
将随机突变后的克隆，培养菌液，再扩大培养并诱导后，进行超声破胞，然后在多个不同的递增的温度下，水浴加热，对不同温度加热后的破胞液进行测活。
在对pBBR1MCS-5-XOD的随机突变实验中，得到在70℃加热下黄嘌呤氧化酶活性不丢失的克隆，并且该突变使酶的活性增加126％，该克隆即为突变的热稳定性好且活性高的黄嘌呤氧化酶基因工程菌株，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，其载体为pBBR1MCS-5-XOD-mut。
<pH对XOD与XOD-mut酶活力和稳定性的影响>
用不同pH(6-9)的缓冲液配制酶检测液(磷酸盐缓冲液)，按上述方法测定酶活力，确定XOD最适反应pH值。37℃下，分别在pH 6-9的缓冲液中测定XOD与XOD-mut的活力，结果如图3所示，pH 6.0时XOD与XOD-mut活性为40％，随着pH的增加，XOD与XOD-mut活性逐渐增加，在pH 8时达到最大值。随后开始降低。因此，XOD与XOD-mut在pH 7-9之间具有活力，并且XOD与XOD-mut的最适反应pH值为8.0。
将酶液用不同pH(4-10)的Britton-Robinson缓冲液稀释，25℃保温15h后，测定残余酶活力。以在最适pH下XOD与XOD-mut的酶活性，制作pH与酶活力的曲线，考察XOD与XOD-mut的pH稳定性。结果如图4所示，在pH 4-6处理时XOD与XOD-mut活性逐渐增高，在pH 6-9处理时对XOD与XOD-mut活性没有影响，随后随着pH的上升酶活力降低。
<温度对XOD与XOD-mut酶活力和稳定性的影响>
在pH 7.5的50mM磷酸盐缓冲液中，按照上述方法测定不同温度下酶活力，确定XOD最适反应温度。在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、和80℃下得到XOD与XOD-mut的活性数据，最高活力温度为65℃，制作活性曲线，结果如图5所示，25-65℃XOD与XOD-mut活力增加，65-80℃XOD与XOD-mut活力逐渐缓慢降低。
研究cXOD、XOD与XOD-mut的热稳定性，在pH 7.5的50mM磷酸盐缓冲液中，cXOD、XOD与XOD-mut酶活为15U/mL的酶液在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、和80℃下各保温30min，迅速冷却至室温，测定残余酶活力，制作在不同温度下保持30min后的cXOD、XOD与XOD-mut的酶活曲线，结果如图6所示，cXOD在30-50℃下处理30min，酶活性少量丢失，60℃处理30min后cXOD活力剩余45％，70℃处理30min后cXOD活力剩余16％，在80℃处理条件下全部丧失；XOD在30-60℃下处理30min，酶活性少量丢失，70℃处理30min后XOD活力剩余50％，在80℃处理条件下基本丧失；XOD-mut在30-70℃下处理30min，酶活性基本没有丧失，80℃处理30min后XOD-mut活力剩余40％。图中30℃、40℃数据重合导致视图重叠。
<XOD的发酵罐工艺>
XOD发酵种子液的摇瓶培养：
重组菌株培养物在125mL折流摇瓶中培养25mL，摇瓶中包含约为初始发酵液体积5-10％的从LB平板上的一个菌落或者冷冻甘油储藏液中接种的种子，摇瓶至于30℃，180rpm振荡培养。如有必要，用庆大霉素(30mg/L)作为培养基中维持质粒。种子培养基由5g/L葡萄糖、3g/L K2HPO4、2g/L(NH4)2Cl、5g/L酵母提取物、6g/L Na2HPO4、pH 7.0组成。培养物的生长之后，使用贝克曼DU 640分光光度计(贝克曼库尔特，Brea CA)在600nm(OD600)的光密度。
XOD补料批式发酵：
1、将发酵罐和补料分批培养基灭菌。补料分批发酵在10L发酵罐和5L发酵培养基中进行。补料分批培养基由40g/L葡萄糖、10g/L(NH4)2SO4、25g/L酵母提取物、25g/L肽酯、10g/LMgSO4·7H2O、6g/L磷酸氢二钠、3g/L磷酸氢二钾、1g/L L-天冬氨酸、40μg/mL L-苯丙氨酸、40μg/mL L-酪氨酸、40μg/mL L-色氨酸、10μg/mL 4-羟基苯甲酸和1mL/L微量元素溶液组成。
2、在灭菌和冷却后，待温度降至30℃时，开启搅拌和通气并用氨水(10％，v/v)将培养基的pH调整到7.0。
3、从种子液摇瓶中接种初试发酵体积5-10％的种子液到发酵罐内。搅拌速度(200rpm-700rpm)由溶解氧(DO)反馈控制，以保持氧水平在30％左右。发酵温度设置为30℃，无菌空气保持在流速为1vvm。喂养介质含：500g/L葡萄糖、2mL/L微量元素溶液。
4、每个发酵阶段的完成都需要进行取样，并且每天至少两次。每个时间点取10mL样品，并从10mL中另取出1mL样品。样品用于分析细胞的生长(OD600和细胞湿重)，pH，显微观察，蛋白质的液度或活性。将菌体和上清(离心后)在-80℃下保藏，用于后面的分析。
<XOD在5’-核苷酸酶检测试剂盒中的应用>
5’-核苷酸酶检测试剂盒包括试剂R1和试剂R2，试剂R1所含组分及浓度为：150mMTris缓冲液，0.15M谷氨酸，0.5KU/L嘌呤核苷酸磷酸化酶，1.2KU/L黄嘌呤氧化酶，3KU/L过氧化物酶，0.03wt％PC300，1.2KU/L抗坏血酸氧化酶，5μM亚铁氰化钾，0.5wt％Triton X-100，1wt％Tween20，100mM氯化镁，所述试剂R1的pH为7.2；试剂R2所含组分及浓度为：130mM磷酸盐缓冲液，80mM肌苷酸二钠，2mM 4-AAP，0.03wt％PC300，200mM磷酸氢二钠，所述试剂R2的pH为7.2。
试剂盒其他成分固定，只改变黄嘌呤氧化酶的来源，黄嘌呤氧化酶分别用牛奶来源的(简称cXOD，购买自Sigma公司，货号10110434001，活性1U/mg)，本发明的XOD和突变株XOD-mut作对比实验。制得的测定5’-核苷酸酶的试剂盒对两个不同浓度待测样本进行的多次反复测定，对所得的结果进行精密度SD(标准差)和CV(变异系数)计算，结果如表4所示。
表4
精密度1 cXOD XOD XOD-mut 精密度2 cXOD XOD XOD-mut
1 29.6 28.7 29.4 1 10.9 10.7 10.5
2 28.4 29.1 28.3 2 10.6 10.8 10.2
3 30.2 28.5 28.6 3 10.5 10.4 10.7
4 27.9 28.5 28.1 4 10.6 10.2 10.6
5 28.6 28.0 28.5 5 10.2 10.6 10.4
6 26.5 29.3 28.8 6 10.7 10.4 10.8
7 28.4 28.4 28.9 7 9.5 10.6 10.5
8 27.6 28.0 28.2 8 10.1 10.2 10.9
9 27.1 29.1 28.8 9 10.9 10.6 10.4
10 29.9 28.4 29.0 10 9.4 10.2 10.4
AVE 28.42 28.60 28.66 AVE 10.34 10.47 10.54
SD 1.21 0.45 0.40 SD 0.54 0.22 0.21
CV 4.25％ 1.57％ 1.40％ CV 5.18％ 2.11％ 2.01％
可以看出本发明XOD和XOD-mut制备的试剂盒的精密度较好，而对比例中cXOD对检测结果的精密度具有一定程度的影响，CV值明显偏大，使精密度降低。与包含牛奶来源的cXOD的试剂配方相比，本发明具有如下有益效果：重复性好，精密度高。
这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，在不实质性影响黄嘌呤氧化酶活性前提下，对本发明的序列替换、添加和/或缺失一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸，以获得所述黄嘌呤氧化酶氨基酸序列的变体，它们都被视为包括在本发明保护的范围内。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (10)

1.黄嘌呤氧化酶，其特征在于，其B亚基氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，A亚基氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2. 突变的黄嘌呤氧化酶，其特征在于，其B亚基氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，其A亚基氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
3. 编码权利要求1所述的黄嘌呤氧化酶的DNA序列，其特征在于，如SEQ ID NO:5所示。
4. 编码权利要求2所述的突变的黄嘌呤氧化酶的DNA序列，其特征在于，如SEQ ID NO:6所示。
5.包含权利要求3或4所述的DNA序列的表达载体，其特征在于，所述表达载体是原核表达载体、昆虫细胞表达载体或真菌表达载体。
6.包含权利要求3或4所述的DNA序列的重组菌株，其特征在于，通过将包含黄嘌呤氧化酶表达框的表达载体转化至表达宿主中得到，所述黄嘌呤氧化酶表达框由启动子和连接于所述启动子下游的黄嘌呤氧化酶基因组成，所述表达宿主为门多萨假单胞菌。
7.黄嘌呤氧化酶的制备方法，其特征在于，包括构建权利要求1所述的黄嘌呤氧化酶的表达载体，转化表达宿主得到重组菌株，诱导黄嘌呤氧化酶的表达，分离纯化黄嘌呤氧化酶。
8.黄嘌呤氧化酶的制备方法，其特征在于，包括构建权利要求2所述的突变的黄嘌呤氧化酶的表达载体，转化表达宿主得到重组菌株，诱导黄嘌呤氧化酶的表达，分离纯化黄嘌呤氧化酶。
9.权利要求1所述的黄嘌呤氧化酶在制备临床检测5’-核苷酸酶、腺苷脱氨酶试剂盒中的应用。
10.权利要求2所述的突变的黄嘌呤氧化酶在制备临床检测5’-核苷酸酶、腺苷脱氨酶试剂盒中的应用。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101402922A (zh) * 2008-11-10 2009-04-08 集美大学 一种节杆菌及其产生黄嘌呤氧化酶的应用和制备方法
CN107119059A (zh) * 2017-04-20 2017-09-01 武汉轻工大学 可用于临床检测的黄嘌呤氧化酶、其编码基因及其应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2917400B2 (ja) * 1990-04-18 1999-07-12 東洋紡績株式会社 耐熱性キサンチンオキシダーゼおよびその製造法
WO2015008637A1 (ja) * 2013-07-16 2015-01-22 東洋紡株式会社 キサンチンオキシダーゼ遺伝子とそれをコードするアミノ酸配列

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101402922A (zh) * 2008-11-10 2009-04-08 集美大学 一种节杆菌及其产生黄嘌呤氧化酶的应用和制备方法
CN107119059A (zh) * 2017-04-20 2017-09-01 武汉轻工大学 可用于临床检测的黄嘌呤氧化酶、其编码基因及其应用

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