CN118541384A

CN118541384A - 新型重组胶原多肽和分子

Info

Publication number: CN118541384A
Application number: CN202380017132.2A
Authority: CN
Inventors: 塔玛拉·吉尔伯特; 查尔斯·戈登; 皮埃尔·萨尔维; 露西尔·波恩尼
Original assignee: Kaibulim Co ltd
Current assignee: Kaibulim Co ltd
Priority date: 2022-01-14
Filing date: 2023-01-16
Publication date: 2024-08-23
Also published as: US20250074969A1; AU2023207816A1; JP2025502343A; KR20240133713A; WO2023135300A1; EP4453026A1

Abstract

本发明涉及新型重组胶原多肽和胶原分子、编码该胶原多肽和胶原分子的多核苷酸、制备该胶原多肽和胶原分子的方法及其组合物和用途。新型重组胶原多肽或胶原分子因为对皮肤有多种益处，包括预防性抗衰老、治疗性抗衰老、抗氧化、抗色素沉着、保湿、抗皱和促进弹性的活性，所以可用于化妆品、个人护理、营养保健品和生物医学应用。

Description

新型重组胶原多肽和分子

技术领域

本发明涉及新型重组胶原多肽和胶原分子、编码该胶原多肽和胶原分子的多核苷酸(polynucleotides)、制备该胶原多肽和胶原分子的方法及其组合物和用途。新型重组胶原多肽或胶原分子因为对皮肤有多种益处，包括预防性抗衰老、治疗性抗衰老、抗氧化、抗色素沉着、保湿、抗皱和促进弹性的活性，所以可用于化妆品、个人护理、营养保健品和生物医学应用。

背景技术

多年来，化妆品行业一直致力于通过不同的化学和机器治疗来预防皮肤衰老和皮肤损伤。内在皮肤衰老是导致皮肤变薄、干燥和出现皱纹的必然过程。另一方面，皮肤的外在损伤是由空气污染或日晒等环境侵害导致。这也导致了皱纹的出现、丧失弹性和皮肤结构的退化。

胶原是人体皮肤的主要结构蛋白。人体皮肤分为上层(表皮)和下层(真皮)。胶原专门存在于细胞外基质(ECM)中，负责为表皮和真皮中的周围细胞提供结构和支撑。众所周知，随着时间的推移，人体ECM的结构变化会导致皮肤衰老。导致这些变化的机制包括影响皮肤主要成分的分子和机械完整性的内在和外在因素。

因此，管理皮肤衰老的策略是：(1)通过适当地皮肤滋养和补水来减缓内在衰老过程；(2)通过保护皮肤来抵御紫外线照射和皮肤氧化等外在因素；以及(3)弥补随着年龄的增长而不足的内在稳定胶原。

旨在采用上述策略的护肤品通常含有胶原。胶原和明胶(明胶是变性和部分降解的胶原)是从动物组织中分离出来的。化妆品市场上的典型胶原产品可分为全长胶原产品和水解胶原产品。使用经萃取的全长胶原的胶原产品倾向于具有保湿效果，但一般体积过大，无法渗透皮肤屏障。全长胶原倾向于作为位于皮肤之上的表层。水解胶原(即全长蛋白质降解成较小的片段(<1000Da))被认为具有抗菌特性和与较长的胶原多肽相比，更高的生物利用率，并且可通过酶消化或在酸或碱中反应生成。在这种方法中，会产生许多从全长动物胶原中衍生的肽，即异质混合物。其中一些肽的长度足够短从而可以比全长胶原更有效地渗透皮肤，但其活性浓度必然较低。

然而，由于对动物来源的胶原的跨物种生物相容性和免疫原性、动物来源污染病原体的风险以及难以重复分离具有同一化学成分的胶原制剂等问题的担忧，护肤品的胶原替代来源的需求增加。事实上，明胶制剂使用中的一个重要问题是其变异性。此外，许多消费者倾向于非动物(即纯素(vegan))来源的胶原制剂。

使用替代来源的胶原(如细菌胶原)的化妆品可能会使用与人类蛋白质结构相似的蛋白质，但通常不会复制人类蛋白质的实际氨基酸组成，并因此效果不如人类胶原。

因此，需要替代来源的胶原，该胶原不仅在结构上与人类蛋白质相同或相似，而且与现有技术的胶原分子相比，给化妆品、个人护理、营养保健品和生物医学用途提供更好的抗衰老和皮肤愈合性能。本发明的新型胶原多肽和胶原分子可以满足这些需求。

发明内容

本发明提供了包含来源于人类I型α1(A1)胶原序列的胶原多肽，并且该胶原多肽能够从培养的酵母细胞中分泌。这些胶原多肽还可以形成高阶结构，特别是同源三聚体(homotrimeric)胶原分子。值得注意的是，本文所述的胶原多肽和胶原分子具有多种对皮肤有益的作用，包括预防性抗衰老、治疗性抗衰老、抗氧化、抗色素沉着、保湿、抗皱和促进弹性等活性。因此，本文所述的胶原多肽和分子具有显著的抗衰老作用。

因此，本发明的一个方面提供了一种包含与SEQ ID NO：2有至少85％同一性的氨基酸序列的胶原多肽，其中胶原多肽的分子量为1至80kDa。

本发明的另一个方面提供了三个包括本文所述的胶原多肽的同源三聚体胶原分子。

本发明的另一方面提供了一种编码本文所述胶原多肽或与本文所述胶原多肽有至少85％同一性的多肽的核酸，以及包含以上核酸的表达载体。

本发明的另一方面提供了包含本文所述的表达载体或核酸的宿主细胞。

本发明的另一方面提供了包含本文所述的胶原多肽或胶原分子和一种或多种赋形剂的组合物，以及所述组合物的用途。

本发明的另一方面提供了一种制备重组胶原多肽或胶原分子的方法，包括以下步骤：

(a)提供编码包含与SEQ ID NO：2有至少85％同一性的氨基酸序列的胶原多肽的核苷酸序列，其中编码的胶原多肽分子量为1-80kDa；

(b)可选地，提供编码人脯氨酰-4-羟化酶的核苷酸序列，

(c)将(a)和可选的(b)的核苷酸序列插入至少一个载体中，以及

(d)在培养的酵母细胞中表达(c)的载体，优选毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞，并且

(e)从培养的酵母细胞中分离重组胶原多肽或胶原分子。

本发明的另一个方面提供了通过本文所述的方法制备的重组胶原多肽或胶原分子。

附图说明

图1：SDS-PAGE凝胶显示由毕赤酵母表达和分泌的不同的胶原多肽(用构建体#2(SEQ ID NO：8)、#4(SEQ ID NO：10)、#6(SEQ ID NO：12)和#8(SEQ ID NO：14)生产－见表2)。箭头指向相关化合物。星号表示P4H亚基。

图2：通过4-16％的SDS-PAGE分析比较胃蛋白酶消化和未消化的蛋白质悬浮液(全长构建体#5(SEQ ID NO：11)和#6(SEQ ID NO：12))，显示毕赤酵母产生并分泌的同源三聚体胶原分子(如箭头所示的条带)对胃蛋白酶的消化耐受。凝胶上显示为较低重量条带的裂解产物(SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22)似乎也是如此。

图3：显示测试胶原多肽和缓冲溶液对正常人真皮角质细胞(normal humandermal keratinocyte)的细胞毒性活性(图A-G分别显示样品1-7的结果)。

图4：显示样品2、4、5和7对NHEK细胞中不同基因表达的生物活性。纵轴表示与使用空白制剂(缓冲溶液，见样品1、3和6)处理的细胞相比，基因表达过高或过低(over-orunder-expression)的百分比。样品2、4、5和7分别与样品1、3、3和6进行比较。MMP1：基质金属肽酶1；SIRT2/SIRT6：沉默信息调节因子(Sirtuin)2和6；SOD2：线粒体超氧化物歧化酶2；GLRX：谷氧还蛋白；HMOX1：血红素氧合酶1；AZGP1：α2-糖蛋白1，锌接合；(-)表示该基因表达下调可能对皮肤有益。(+)表示该基因表达上调可能对皮肤有益。

具体实施方式

定义

为了使本发明易于理解，下文列出了本发明过程中使用的几个术语的定义。

如本文所用，缩写″kDa″代表千道尔顿。

如本文所用，术语″氨基酸″指20种天然氨基酸之一或任何非天然类似物。优选地，术语″氨基酸″指20种天然氨基酸之一。

本文所用术语″多肽″或″蛋白质″是指由氨基酸序列组成的大分子。蛋白质可以是天然蛋白质，即由天然存在的非重组细胞产生的蛋白质；也可以是由基因编辑或重组细胞产生的蛋白质，包括具有天然蛋白质氨基酸序列的分子，或天然序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或替代的分子。

术语″序列同一性″表示对两个序列之间同源性程度的定量测量，这两个序列可以是核苷酸(也称核酸)序列或氨基酸序列。如果要比较的两个序列的长度不相等，则必须对它们进行对齐，以尽可能达到最佳匹配，允许在核酸序列或氨基酸序列的末端插入间隙或截断。技术人员会发现，有多种比较序列同一性的方法(见下文)。

本文所用的″保守氨基酸取代″是指该氨基酸可被其相应组中的另一种氨基酸取代，具体分为以下六组：[1]丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；[2]天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；[3]天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；[4]精氨酸(R)、赖氨酸(K)；[5]异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；以及[6]苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。

本文所用术语″同源三聚体″是指由三个相同类型的胶原多肽组成的复合物，即三个人I型A1胶原多肽。

本文所用″重组″是指使用重组技术制造的多肽或蛋白质分子，即不是天然存在的。生产重组核酸和多肽的方法和技术在本领域是众所周知的。

本文所用的″分离″是指从细胞培养基中和从细胞培养基组分中分离出来的蛋白质，例如，可以是至少从90％细胞培养基组分中分离出来。

如本文所用，″抗氧化剂″分子具有抗氧化活性，即能够刺激例如皮肤细胞中的天然抗氧化途径。

如本文所用，″抗衰老活性″分子能够通过对参与衰老过程的基因进行不同的转录调控(与基线表达水平相比)，减缓皮肤细胞(例如正常人真皮角质细胞)中的内在衰老过程，例如包括参与预防和治疗性抗衰老、抗氧化和抗色素沉着(例如通过mRNA测序确定)的基因。

“载体”是一种核酸，可用来将与之相连的另一种核酸(或″构建体″)导入细胞，例如通过电穿孔。其中一种载体是″质粒″，它是指可与另外核酸片段连接的线性或环状双链DNA分子。另一种载体是病毒载体(如有复制缺陷的逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，可将另外的DNA片段引入病毒基因组。某些载体能够在被导入的宿主细胞中自主复制(如包含细菌复制起点的细菌载体和附着体(episomal)哺乳动物载体)。其他载体(如非附着体哺乳动物载体)在导入宿主细胞后并在选择压力下培养后，会整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。载体可用于在细胞中引导选定核酸的表达。

宿主细胞″是指可用于表达核酸(例如本发明公开的核酸)的细胞。

根据本发明，宿主细胞是酵母细胞，优选是毕赤酵母。

如本文所用，″受试者″包括所有哺乳动物，优选是人类。

如本文所用，″患者″是指要治疗的受试者。

如本文所用，″治疗″是减少疾病或病症的症状、抑制疾病或病症的发展、使疾病或病症消退和/或治愈疾病或病症的同义词。本发明中的术语″治疗″是指包括对疾病或病症的治疗性治疗以及预防性或抑制性措施。

本文所用术语″本发明的″或″根据本发明″是指本文所公开和/或要求的本发明的所有方面和实施方案。本文中被称为″本文公开″或″本文描述″的任何方面、项目或实施方案均应理解为″本发明″或″根据本发明″的方面、项目或实施方案。

如本文所用，术语″包括”应理解为既包括″具有″也包括″由......组成″，这两种含义都是本发明的具体意图，因此也是根据本发明单独公开的实施方案。

如本文所用，元素或元件前的冠词″一″和″一个″意在对元素或元件的实例(即发生)数量不作限制。

因此，″一″或″一个″应理解为包括一个或至少一个，元素或成分的单数词形式也包括复数，除非数字明显是单数。

胶原多肽

在一个方面，本发明提供了一种胶原多肽，其氨基酸序列与SEQ ID NO：2有至少85％同一性，其中胶原多肽的分子量为1至80kDa。人I型A1胶原的氨基酸序列见SEQ ID NO：20。

在某些实施方案中，胶原多肽的分子量为2至45kDa。在某些实施方案中，胶原多肽的分子量为5至20kDa。据信，本发明胶原多肽的大小使其与全长胶原相比能够更有效地渗透皮肤。

在某些实施方案中，胶原多肽是人I型A1胶原的片段。

在某些实施方案中，胶原多肽可包含至少两个PGP氨基酸序列。

在某些实施方案中，胶原多肽的氨基酸序列包含至少10％的脯氨酸。优选地，胶原多肽的氨基酸序列包含至少15％的脯氨酸。更优选地，胶原多肽的氨基酸序列包含至少20％的脯氨酸。

在某些实施方案中，胶原多肽的氨基酸序列包含至少1.5％、至少2.5％、至少5％或至少7.5％的羟脯氨酸。胶原中的羟脯氨酸比率越高，保湿和抗衰老活性就越高。较高的羟脯氨酸比率预期还改善营养保健品的性能，因为一种潜在的作用机理是使含羟脯氨酸的二肽和三肽进入血液。

在某些实施方案中，胶原多肽的氨基酸序列至少包括15％的甘氨酸。优选地，胶原多肽的氨基酸序列包含至少20％的甘氨酸。更优选地，胶原多肽的氨基酸序列包含至少25％的甘氨酸。

在一些实施方案中，胶原多肽的氨基酸序列包括羟基化赖氨酸。

据信，本文所述胶原多肽的富含脯氨酸/羟脯氨酸、甘氨酸和/或羟基化赖氨酸的氨基酸序列促进其对人体皮肤的优秀的保湿和抗衰老效果。

在一些实施方案中，胶原多肽的等电点大于7，优选大于8。

在某些实施方案中，胶原多肽是一种抗氧化剂。

例如，胶原多肽可优选包含GFSGLDGAKGD(SEQ ID NO：6)或与GFSGLDGAKGD(SEQ IDNO：6)有最多三个保守氨基酸取代差异的氨基酸序列。

在一些实施方案中，胶原多肽具有抗衰老活性。因此，在某些实施方案中，含有本发明胶原多肽的产品将通过对参与衰老过程的基因进行不同的转录调控来减缓皮肤细胞的内在衰老过程。

因此，在某些实施方案中，胶原多肽可将皮肤细胞中MMP1的表达下调(downregulate)至少20％，优选至少40％，更优选至少60％(与基线表达水平相比)。在其他实施方案中，胶原多肽上调(upregulate)皮肤细胞中SIRT2/SIRT6的表达至少10％，优选至少30％，更优选至少50％(与基线表达水平相比)。在其他实施方案中，胶原多肽可将皮肤细胞中SOD2的表达上调至少30％，优选至少60％，更优选至少90％(与基线表达水平相比)。在一些实施方案中，胶原多肽可使皮肤细胞中GLRX的表达上调至少20％，优选至少40％，更优选至少60％(与基线表达水平相比)。在其他实施方案中，胶原多肽能使皮肤细胞中HMOX1的表达上调至少40％，优选至少上调80％，更优选至少上调120％，最优选至少上调150％(与基线表达水平相比)。在其他实施方案中，胶原多肽上调皮肤细胞中AZGP1的表达至少30％，优选至少60％，更优选至少90％(与基线表达水平相比)。

在优选实施方案中，胶原多肽上调皮肤细胞中SIRT2/SIRT6、SOD2、GLRX、HMOX1和AZGP1中一种或多种的表达(与基线表达水平相比)。在一些特别优选的实施方案中，胶原多肽上调皮肤细胞中SIRT2/SIRT6、SOD2、GLRX、HMOX1和AZGP1的表达(与基线表达水平相比)。在其中一些实施方案中，胶原多肽可下调皮肤细胞中MMP1的表达(与基线表达水平相比)。

在一些优选的实施方案中，胶原多肽上调皮肤细胞中SIRT2/SIRT6、SOD2、GLRX、HMOX1和AZGP1中的一种或多种的表达至少50％(与基线表达水平相比)，并下调皮肤细胞中MMP1的表达至少50％(与基线表达水平相比)。

在一些实施方案中，胶原多肽是低敏的。因此，在某些实施方案中，含有本发明胶原多肽的产品应用于受试者时不会引起过敏反应。

在某些实施方案中，胶原多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：1至4或7至17中的任意一个有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性或至少98％同一性。优选地，胶原多肽包括选自SEQ ID NO：1至4和7至17的氨基酸序列。

在优选的实施方案中，胶原多肽包括与SEQ ID NO：2有至少90％同一性、至少95％同一性或至少98％同一性的氨基酸序列。在特别优选的实施方案中，胶原多肽包含的氨基酸序列SEQ ID NO：2。

在其他优选的实施方案中，胶原多肽包含与SEQ ID NO：3、21和22中的任意一个有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性或至少98％同一性的氨基酸序列。在其中一些实施方案中，胶原多肽包括SEQ ID NO：3、21和22中任意一个氨基酸序列。

在特别的实施方案中，胶原多肽包括与SEQ ID NO：8有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性或至少98％同一性的氨基酸序列。在特别优选的实施方案中，胶原多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO：8。

在一些特别优选的实施方案中，胶原多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO：2，并且分子量为5至20kDa。在其中一些实施方案中，胶原多肽的等电点>8。在其中一些实施方案中，胶原多肽包含至少2.5％的羟脯氨酸。

蛋白质和/或核酸序列同一性(同源性)可使用本领域已知的各种序列比对算法和程序进行评估。在序列比对中，通常将一个序列作为参考序列(如本文中公开的序列)，与测试序列比对。然后，序列比对算法根据程序参数计算出测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。

例如，两个氨基酸或两个核酸序列的同一性百分比可通过BLAST算法确定，该算法描述于：Altschul et al.，1990，J.Mol.Biol.215：403-410、Altschul et al.，1997，Nucleic Acids Res.25：3389-3402、以及Karin et al.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：5873-5787。另外，两个氨基酸或两个核酸序列的同一性百分比可通过例如DIAMOND算法确定，该算法描述于Benjamin Buchfink，Chao Xie&DanielH.Huson，Fast and Sensitive Protein Alignment using DIAMOND，Nature Methods，12，59-60(2015)。

在某些实施方案中，胶原多肽是重组胶原多肽。

在某些实施方案中，胶原多肽是分离胶原多肽。

核酸、载体和宿主细胞

在另一方面，本发明提供了编码本文及其所有实施方案所述胶原多肽的核酸。

因此，本发明的核酸编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽，或与其有至少85％有同一性的多肽，其中胶原多肽的分子量为1至80kDa。在某些实施方案中，编码的胶原多肽分子量为2至45kDa。在一些优选的实施方案中，编码的胶原多肽分子量为5至20kDa。

在一些实施方案中，核酸编码的多肽包含SEQ ID NO：3、21和22中任意一个的氨基酸序列，或与其有至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的多肽。优选地，核酸编码包含SEQ ID NO：3、21和22中任意一个的氨基酸序列的多肽。

在其它实施方案中，核酸编码包含SEQ ID NO：8、10、11、12、15和16中任意一个的氨基酸序列的多肽，或与其有至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的多肽。优选地，核酸编码包含SEQ ID NO：8、10、11、12、15和16中任意一个的氨基酸序列的多肽。

在优选的实施方案中，核酸编码包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的多肽，或与其有至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的多肽。优选地，核酸编码包含SEQ IDNO：8氨基酸序列的多肽。

在另一个方面，本发明提供了包含本文及其所有实施方案所述核酸表达载体。

在另一个方面，本发明提供了包含本文及其所有实施方案所述表达载体或核酸的宿主细胞。

胶原分子

在另一个方面，本发明提供了包含本文及其所有实施方案所述三个胶原多肽的同源三聚体的胶原分子。

因此，作为同源三聚体，本发明的胶原分子不同于天然的人I型胶原，后者是由两个α1多肽和一个α2多肽组成的异源三聚体。

在某些实施方案中，胶原多肽或胶原分子是糖基化的。

优选地，胶原多肽或胶原分子是从培养的酵母细胞(如毕赤酵母)中分泌出来的。在某些实施方案中，培养的酵母细胞是野生型菌株。或者，培养的酵母细胞基因组中的甲醇氧化酶被敲除，从而导致它们在甲醇中的生长速度较慢。在优选的实施方案中，培养的酵母细胞缺失AOX1基因。在某些实施方案中，培养的酵母细胞稳定表达脯氨酰-4-羟化酶。

本领域技术人员可以理解，通过重组技术在酵母细胞中生产的胶原多肽或胶原分子可以归类为纯素，即它们不是来自动物或动物产品。因此，在某些实施方案中，本文所述的胶原多肽和胶原分子是纯素的。

组合物及其用途

在另一方面，本发明提供了一种组合物，该组合物包含本文所述及其所有实施方案的胶原多肽或本文及其所有实施方案所述的胶原分子，以及一种或多种赋形剂。

赋形剂可以是技术人员已知的任何赋形剂，例如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、硅胶、硬脂酸钠、甘油、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、丙二醇、乙二醇和乙醇；以及它们的组合。

本文所述的组合物可以包括包含水性载体和增稠剂的连续水相(continuousaqueous phase)。水相可进一步包含在油相中溶解度有限的其他亲水性物质，包括但不限于水溶性成分、水溶性防晒剂和其他水溶性护肤活性成分。本文所述的组合物包含约60％至约98％的水相，最好是约65％至约97％的水相。

本文所述的组合物可进一步包含载液(carrier)、稳定剂、防腐剂、增稠剂、乳化剂、湿润剂、润肤剂和/或其他成分。

载液可以是技术人员已知的任何载液，例如水液、葡萄糖溶液、甘油溶液、微乳剂、纳米颗粒、脂质体悬浮剂、油(包括植物油或合成油，如花生油、大豆油、矿物油和芝麻油；异丙醇、气态碳氟化合物、乙醇、聚乙烯吡咯烷酮、丙二醇、凝胶制造材料、硬脂醇、硬脂酸、山梨糖醇单油酸酯和甲基纤维素)；以及它们的组合。

本发明中特别有用的载液包括水和低级烷基醇的水溶液。此处有用的低级烷基醇是具有1至6个碳原子的一元醇，更优选乙醇和甘油。水性载液优选基本上是水。最好使用去离子水。也可根据产品所需的特性，使用包括矿物阳离子在内的天然来源的水。

本文所述组合物的pH值最好在3到8左右。pH值可调节到能使胶原发挥最佳功效的水平。为达到理想的pH值，可加入缓冲剂和其他pH调节剂。合适的pH调节剂包括醋酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、氢氧化钠、三乙醇胺、氨甲基丙醇和碳酸盐。

稳定剂可以是技术人员已知的任何稳定剂，例如氨基酸、抗坏血酸、表面活性剂(如泊洛沙姆(poloxamer))、多元糖醇(如甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露糖醇)以及它们的组合。

本文所述组合物的水相包含约0.1％至约2％，最好是约0.2％至约1.5％的增稠剂，包括稠化剂、胶凝剂和结构剂。增稠剂的含量和种类可根据与其他成分的相容性以及产品的其他所需特性来选择。增稠剂包括交联聚丙烯酸酯聚合物和共聚物、疏水改性聚丙烯酸酯聚合物和共聚物、聚丙烯酰胺聚合物和共聚物、聚丙烯酰二甲基脲酸酯、氨甲基丙醇(AMP)基聚合物和共聚物、多糖和树胶。羧酸/羧酸盐共聚物这里也可以。此处有用的羧酸/羧酸盐共聚物的非限制性实例包括CTFA名称为丙烯酸酯/C10-30烷基丙烯酸酯交联聚合物，商品名为PemulenTR-1、PemulenTR-2、Carbopol Ultrez 10、Carbopol Ultrez 20、Carbopol Ultrez 21、Carbopol 1342、Carbopol 1382和Carbopol ETD 2020(均来自Noveon)、黄原胶。在此非常有用的其他市售水溶性聚合物包括黄原胶(商品名为KELTROL系列，可从Kelco购买)；商品名为Carbopol 934、Carbopol 940、Carbopol 950、Carbopol 980和Carbopol 981(均来自Noveon)的Carbomer；商品名为ACRYSOL 22(来自Rohm和Hass)的丙烯酸酯/硬脂醇聚醚-20甲基丙烯酸酯共聚物；商品名为SEPIGEL 305(来自Seppic)的聚丙烯酰胺；商品名为LUBRAGEL NP的甘油聚甲基丙烯酸酯，以及商品名为LUBRAGEL OIL(均来自ISP公司)的甘油聚甲基丙烯酸酯、丙二醇和PVM/MA共聚物的混合物；商品名为ClearogelSC11(来自Michel Mercier Products Inc)的硬葡聚糖；，商品名为CARBOWAXPEGs、POLYOXWASRs和UCON FLUIDS(均来自Amerchol)的环氧乙烷和/或环氧丙烷聚合物。另一类增稠剂包括结构剂，如硬脂醇、鲸蜡醇和山嵛醇。

本文所述的组合物可含有乳化剂，用于分散和悬浮水相中的油相。当本文所述的组合物含有乳化剂时，乳化剂的含量不超过1％，最好不超过0.5％，更优选不超过0.2％。乳化剂的例子包括聚乙二醇20山梨醇酐单月桂酸酯(聚山梨醇酯20)、硬脂醇聚醚-20、鲸蜡硬脂醇聚醚-20、PPG-2甲基葡萄糖醚二硬脂酸酯、鲸蜡醇聚醚-10、聚山梨醇酯80、十六烷基磷酸酯、鲸蜡醇磷酸酯钾、二乙醇胺十六烷基磷酸酯、聚山梨醇酯60、甘油硬脂酸酯、PEG-100硬脂酸酯、聚氧乙烯20山梨醇酐油酸酯(聚山梨醇酯85)、山梨糖醇酐单月桂酸酯、聚氧乙烯4月桂醇醚硬脂酸钠、聚甘油-4异硬脂酸酯、月桂酸己酯、PPG-2甲基葡萄糖醚二硬脂酸酯、鲸蜡醇聚醚-10、二乙醇胺十六烷基磷酸酯、甘油硬脂酸酯、PEG 40氢化蓖麻油、PEG-60氢化蓖麻油、甘油-25PCA异硬脂酸酯及其混合物。

防腐剂可以是本领域技术人员已知的任何防腐剂，例如十八烷基二甲基苄基氯化铵、六甲基氯化铵、苯扎氯铵、苯甲氯铵、苯酚、丁醇或苄醇、对羟基苯甲酸烷基酯(如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯)、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚、二元醇(如丙二醇)、丁二醇和丙二醇。乳化剂的例子包括醋酸三乙酯、辛酸甘油酯、苯甲酸、辛酸山梨糖醇酯、甘油、乙酰丙酸钠、茴香酸钠、倍半二醇、苯丙醇、葡萄糖酸内酯、乳酸杆菌发酵液、乳酸杆菌、丙二醇、丁二醇和倍半二醇、乳酸杆菌、椰子树(椰子)果提取物、水果提取物、白色念珠菌/萝卜根发酵滤液、苄醇、脱氢乙酸、山梨酸钾、山梨酸及其混合物。

本文所述的组合物可能含有一种或多种额外的化妆品活性成分，用于提高最终化妆品的功效。当本文所述组合物含有额外的活性成分时，它们所含的额外活性成分不超过20％，最好不超过10％，最好不超过1％，最好不超过0.1％。活性成分的例子包括但不限于：透明质酸、水解胶原、动物来源胶原、海洋胶原、铜肽、肽及其衍生物、维甲酸及其衍生物、烟酰胺、维生素C、维生素E、维生素K、α-羟基酸(AHA)、β-羟基酸(BHA)、阿魏酸、神经酰胺及其混合物。

本文所述的组合物还可进一步包含湿润剂、润肤剂、去角质剂、非维生素抗氧化剂和自由基清除剂、毛发生长调节剂、矿物质、防腐剂、植物甾醇和/或植物激素、蛋白酶抑制剂、酪氨酸酶抑制剂、消炎剂和N-酰基氨基酸化合物。合适的湿润剂包括但不限于聚亚烷基二醇等多元醇及其衍生物。示例有丙二醇、二丙二醇、聚丙二醇、聚乙二醇、山梨醇、羟丙基山梨醇、己二醇、1，3-丁二醇、1，2，6-己三醇、乙氧基化甘油、丙氧基化甘油及其混合物。合适的润肤剂包括但不限于碳氢化合物、脂肪酸、脂肪醇和酯类。

然而，本文所述组合物中的其他成分可以是亲水性聚合物，如聚乙二醇(PEG)；单糖；二糖；包括甘露糖和三卤糖；寡聚糖、多糖和其他碳水化合物，包括糊精或糊精反糖；螯合剂，如EDTA；成盐反离子，如钠；金属络合物(如锌-蛋白质络合物)；以及脂肪酸酯、脂肪酸醚或糖酯。

本文所述组合物可根据预期用途配制成各种不同的剂型，如液体、半固体或固体剂型。在一个实施方案中，本文所述组合物配制成膏霜、乳液、精华液、水溶液、软膏、糊剂、化妆水(lotion)、悬浮液、凝胶、面膜、皮肤清洁剂，如肥皂、卸妆膏、卸妆液、卸妆乳、卸妆片、洗面奶、洗发水、护发素或沐浴露。组合物最好包含在膏霜中。在另一个实施方案中，本文所述的组合物配制成固体剂型，如片剂、胶囊、颗粒或粉末。

本文所述的组合物用于受试者外用(即作为化妆品或个人护理产品)。本文所述组合物也可内用(internally)(即作为营养保健品或生物医药产品)。因此，在某些实施方案中，本文所述组合物可局部施用，如表层施用(如通过微针)或深层注射。在其他实施方案中，本文所述组合物内用。

本文所述组合物可补偿与衰老和皮肤损伤相关的胶原损失。

因此，本文所述组合物及其所有实施方案可用于修复受损皮肤，或保护皮肤免受氧化损伤、色素沉着或衰老。

同样，本文提供了一种修复受损皮肤或保护皮肤免受氧化损伤、色素沉着或衰老的方法，包括向受试者的皮肤或皮肤细胞施用本文及其所有实施方案所述的组合物。另外，组合物也可以内部施用。

本文还提供了本文所述组合物及其所有实施方案作为皮肤保湿剂的用途。

本文所述组合物能滋养皮肤，并有望改善肤质、平衡皮肤、使皮肤丰满、光滑并减少皱纹。

在某些实施方案中，本文所述组合物用于治疗皮肤疾病。皮肤疾病的示例包括痤疮、玫瑰痤疮、牛皮癣、特应性皮炎(湿疹)、接触性皮炎和白癜风。

制备重组胶原多肽或胶原分子的方法

在另一方面，本发明提供了一种制备重组胶原多肽或胶原分子的方法，包括以下步骤：

(a)提供编码胶原多肽的核苷酸序列，该序列包含与SEQ ID NO：2有至少85％同一性的氨基酸序列，其中编码的胶原多肽分子量为1-80kDa；

(b)可选地提供编码人脯氨酰-4-羟化酶的核苷酸序列，

(c)将(a)和可选地(b)的核苷酸序列插入至少一个载体中，并且

(d)在培养的酵母细胞中表达(c)的载体，优选毕赤酵母，以及

(e)从培养的酵母细胞中分离重组胶原多肽或胶原分子。

在某些实施方案中，编码的胶原多肽分子量为2至45kDa。在一些实施方案中，编码的胶原多肽的分子量为5至20kDa。

在一些实施方案中，编码的胶原多肽可包含至少两个PGP氨基酸序列。

在一些实施方案中，编码的胶原多肽的氨基酸序列包含至少10％的脯氨酸。优选地，编码的胶原多肽的氨基酸序列包含至少15％的脯氨酸。更优选地，编码的胶原多肽的氨基酸序列包含至少20％的脯氨酸。

在某些实施方案中，胶原多肽的氨基酸序列包含至少1.5％、至少2.5％、至少5％或至少7.5％的羟脯氨酸。

在某些实施方案中，编码的胶原多肽的氨基酸序列包含至少15％的甘氨酸。更优选地，编码的胶原多肽的氨基酸序列包含至少20％的甘氨酸。更优选地，编码的胶原多肽的氨基酸序列包含至少25％的甘氨酸。

在某些实施方案中，编码的胶原多肽的氨基酸序列包含羟化赖氨酸。

在某些实施方案中，编码的胶原多肽的氨基酸序列的等电点>7，优选>8。

在某些实施方案中，编码的胶原多肽是一种抗氧化剂。

例如，编码的胶原多肽可包含GFSGLDGAKGD(SEQ ID NO：6)或与GFSGLDGAKGD(SEQID NO：6)最多有三个保守氨基酸取代差异的氨基酸序列。

在一些实施方案中，编码的胶原多肽具有抗衰老活性。

在某些实施方案中，编码的胶原多肽是低敏的。

在某些实施方案中，编码的胶原多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：1至4或7至17中的任意一个有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性或至少98％同一性。优选地，编码的胶原多肽包括选自SEQ ID NO：1至4和7至17的氨基酸序列。

在优选的实施方案中，编码的胶原多肽包括与SEQ ID NO：2有至少90％同一性、至少95％同一性或至少98％同一性的氨基酸序列。在特别优选的实施方案中，编码的胶原多肽包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

在其他优选的实施方案中，编码的胶原多肽包括与SEQ ID NO：3、21和22中任何一个有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性或至少98％同一性的氨基酸序列。在其中一些实施方案中，编码的胶原多肽包括SEQ ID NO：3、21和22中任一个的氨基酸序列。

在一些实施方案中，编码的胶原多肽包含与SEQ ID NO：8、10、11、12、15和16中任意一个有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性或至少98％同一性的氨基酸序列。优选地，编码的胶原多肽包含选自SEQ ID NO：8、10、11、12、15和16中任一个的氨基酸序列。

在优选的实施方案中，编码的胶原多肽包含与SEQ ID NO：8有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性或至少98％同一性的氨基酸序列。在其中一些实施方案中，编码的胶原多肽包括SEQ ID NO：8的氨基酸序列。

上文披露了各种比较序列同一性的方法。

在某些实施方案中，由该方法产生的重组胶原分子，包括如本文及其所有实施方案所述的三个胶原多肽的同源三聚体。

在某些实施方案中，由该方法产生的重组胶原多肽或胶原分子是糖基化的。

在某些实施方案中，编码人I型A1胶原片段的胶原多肽的核苷酸序列前面是编码分泌信号序列的核苷酸序列。例如，编码分泌信号序列的核苷酸序列可编码MatαD分泌信号序列(SEQ ID NO：5的氨基酸序列)。也可使用其它分泌信号序列，如OST1、MatAlphaF、Invertase和来自人的天然分泌信号。

在一些实施方案中，人脯氨酰-4-羟化酶由SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19的氨基酸序列编码。

在某些实施方案中，(a)和/或(b)的核苷酸序列被插入到使用双向启动子的载体中。

在某些实施方案中，(a)和/或(b)的核苷酸序列被插入到使用可诱导和去抑制启动子的载体中。例如，启动子可以是甲醇诱导型启动子。

在某些实施方案中，(a)和/或(b)的核苷酸序列被插入到允许翻译后转运至内质网的载体。

可以通过常规方法，如转染、转导或电穿孔，将载体导入酵母细胞。最好是通过线性化载体的电穿孔将载体导入酵母细胞。

酵母细胞可在约17至约23℃(如约20℃)的温度下培养，并提供充足的养分，如碳源(如葡萄糖)、氮源(如NH4+)、盐类(如Na+、K+、Mg2+、Ca2+等)、微量元素、蛋白胨(一种由蛋白质部分水解形成的多肽和氨基酸的水溶性混合物)，以及在合适的pH值(如酸性pH值)下培养。本领域已知的酵母生长培养基(如酵母和霉菌″YM″培养基或酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖(YPD)培养基)可提供足够的营养物质。通常，酵母生长培养基是一种阻止细菌和其他不耐酸生物的生长的同时，允许酵母生长的酸性pH值的选择性生长培养基。

在某些实施方案中，方法中使用的酵母细胞是野生型菌株。或者，该方法中使用的酵母细胞基因组中的甲醇氧化酶被敲除，导致它们在甲醇中的生长速度更慢。在优选的实施方案中，该方法中使用的酵母菌株具有AOX1基因缺失。这种酵母的一个例子是MutS菌株，可从Invitrogen公司(KM71 H)、格拉茨技术大学(CBS7435MutS)或Biogrammatics公司(BG11)购买。MutS菌株仍表达Aox2，但当甲醇作为唯一碳源时，其生长速度比野生型菌株慢。

在某些实施方案中，重组胶原多肽或胶原分子从培养酵母细胞的培养上清液中分离出来。例如，可采用离心、沉淀或过滤等方法。

在某些实施方案中，重组胶原分子是一种抗氧化剂。

在某些实施方案中，通过本文所述方法制备的重组胶原多肽或胶原分子是纯素的，即该方法不使用动物产品。

本文还提供了一种通过本文所述方法及其所有实施方案制备的重组胶原多肽或胶原分子。所述胶原分子包括三个胶原多肽的同源三聚体。

在某些实施方案中，通过本文所述方法制备的重组胶原多肽包括至少1.5％、至少2.5％、至少5％或至少7.5％的羟脯氨酸。

本文所述词语或图元素的定义不仅包括字面上列出的元素组合，还包括以基本相同的方式执行基本相同的功能以获得基本相同的结果的所有等效结构、材料或行为。因此，从这个意义上讲，可以用两个或两个以上要素的等效替代来代替所述要素中的任何一个要素及其各种实施方案，也可以用一个要素来代替权利要求中的两个或两个以上要素。

在本领域普通技术人员看来，现在已知的或后来设计的与所要求的主题的变化，都被明确地视为在预期范围及其各种实施方案内的等同物。因此，本领域普通技术人员现在或以后已知的显而易见的替代品被定义为在所定义的要素范围内。因此，本公开内容应理解为包括此处具体说明和描述的内容、概念上等同的内容、可明显替代的内容以及包含关键想法的内容。

项目

1.一种胶原多肽，包含与SEQ ID NO：2有至少85％同一性的氨基酸序列，其中胶原多肽的分子量为1至80kDa。

2.根据第1项所述的胶原多肽，其中所述胶原多肽的分子量为2至45kDa。

3.根据第1项所述的胶原多肽，其中所述胶原多肽的分子量为5至20kDa。

4.根据第1-3项中任一项所述的胶原多肽，其中所述胶原多肽是人I型A1胶原的片段。

5.根据第1-4项中任一项所述的胶原多肽，其中所述胶原多肽包含至少两个PGP氨基酸序列。

6.根据第1-5项中任一项所述的胶原多肽，其中所述胶原多肽的氨基酸序列包含至少2.5％的羟脯氨酸。

7.根据第1-6项中任一项所述的胶原多肽，其中所述胶原多肽的氨基酸序列包含至少15％的甘氨酸。

8.根据第1-7项中任一项所述的胶原多肽，其中胶原多肽包括羟化赖氨酸。

9.根据第1-8项中任一项所述的胶原多肽，其中所述胶原多肽的等电点>7，优选>8。

10.根据第1-9项中任一项所述的胶原多肽，其中所述胶原多肽是一种抗氧化剂。

11.根据第1-10项中任一项所述的胶原多肽，其中所述胶原多肽具有抗衰老活性。

12.根据第1-11项中任一项所述的胶原多肽，其中与基线表达水平相比，所述胶原多肽上调皮肤细胞中SIRT2/SIRT6、SOD2、GLRX、HMOX1和AZGP1中的一种或多种的表达至少50％。

13.根据第1-12项中任一项所述的胶原多肽，其中与基线表达水平相比，所述胶原多肽下调皮肤细胞中MMP1的表达至少50％。

14.根据第1-13项中任一项所述的胶原多肽，其中所述胶原多肽包含GFSGLDGAKGD(SEQ ID NO：6)的氨基酸序列或与GFSGLDGAKGD(SEQ ID NO：6)最多三个保守氨基酸取代差异的氨基酸序列。

15.根据第1-14项中任一项所述的胶原多肽，其中所述胶原多肽是低敏的。

16.根据第1-15项中任一项所述的胶原多肽，其中所述胶原多肽包含与SEQ IDNO：1至4或7至17中任一个有至少85％同一性的氨基酸序列。

17.根据第1-16项中任一项所述的胶原多肽，其中所述胶原多肽包含选自SEQ IDNO：1至4和7至17中任一个的氨基酸序列。

18.根据第1-17项中任一项所述的胶原多肽，其中所述胶原多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

19.根据第1-18项中任一项所述的胶原多肽，其中所述胶原多肽包含与SEQ IDNO：3、21和22中任一个有至少85％同一性的氨基酸序列。

20.根据第1-19项中任一项所述的胶原多肽，其中所述胶原多肽包含选自SEQ IDNO：3、21和22的氨基酸序列。

21.根据第1-20项中任一项所述的胶原多肽，其中所述胶原多肽是重组胶原多肽。

22.根据第1-21项中任一项所述的胶原多肽，其中所述胶原多肽是分离的胶原多肽。

23.根据包含如第1-22项中任一项所定义的三个胶原多肽的同源三聚体的胶原分子。

24.根据第1-22项中任一项所述的胶原多肽或第23项的胶原分子，其中胶原多肽或胶原分子是糖基化的。

25.根据前述任一项所述的胶原多肽或胶原分子，其中所述胶原多肽或胶原分子已从培养的酵母细胞中分泌，优选毕赤酵母。

26.编码第1-22或24-25项中任一项所定义的胶原多肽的核酸。

25.一种编码包含SEQ ID NO：8、10、11、12、15和16中任一项的氨基酸序列的胶原多肽或与其有至少85％同一性的多肽的核酸。

28.根据第27项所述的核酸，其中编码的胶原多肽包括SEQ ID NO：8、10、11、12、15和16中任一项的氨基酸序列。

29.包含第26-28项中任一项所述的核酸的表达载体。

30.包含第29项所述的表达载体或第26-28项中任一项的核酸的宿主细胞。

31.包含第1-22项或第24-25项中任一项所述的胶原多肽或第23-25项中任一项所述的胶原分子和一种或多种赋形剂的组合物。

32.根据第31项所述的组合物，其中所述组合物包含在膏霜、乳液、精华液、水溶液、软膏、糊剂、化妆水、悬浮液、凝胶、面膜、皮肤清洁剂、卸妆膏、卸妆液、卸妆乳、卸妆片、洗面奶、洗发水、护发素或沐浴露中。

33.根据第31项所述的组合物，其中该组合物包含在片剂、胶囊、颗粒或粉末中。

34.根据第31-33项中任一项所述的组合物，其中该组合物包含一种或多种额外的活性成分。

35.根据第31-34项中任一项所述的组合物，其中所述组合物用于受试者的局部使用。

36.根据第31-35项中任一项所述的组合物用于治疗皮肤疾病。

37.根据第31-36项中任一项所述的组合物在修复受损皮肤，或保护皮肤免受氧化损伤、色素沉着或衰老中的用途。

38.一种修复受损皮肤、或保护皮肤免受氧化损伤、色素沉着或衰老的方法，包括向受试者施用第31-36项中任一项所述的组合物。

39.根据第38项所述的方法，其中将组合物施用至受试者的皮肤或皮肤细胞。

40.根据第31-36项中任一项所述的组合物作为皮肤保湿剂的用途。

41.一种制备重组胶原多肽或胶原分子的方法，包括以下步骤：

(a)提供编码包含与SEQ ID NO：2有至少85％同一性的氨基酸序列的胶

原多肽的核苷酸序列，其中编码的胶原多肽分子量为1-80kDa；

(b)可选地，提供编码人脯氨酰-4-羟化酶的核苷酸序列，

(c)将(a)和可选的(b)的核苷酸序列插入至少一个载体中，以及

(d)在培养的酵母细胞中表达(c)的载体，优选毕赤酵母细胞，并且

(e)从培养的酵母细胞中分离重组胶原多肽或胶原分子。

42.根据第41项所述的方法，其中编码的胶原多肽包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

43.根据第41项或第42项所述的方法，其中编码的胶原多肽的分子量为2至45kDa。

44.根据第41项或第42项所述的方法，其中编码的胶原多肽的分子量为5至20kDa。

45.根据第41-44项中任一项所述的方法，其中编码的胶原多肽包括至少两个PGP氨基酸序列。

46.根据第41-45项中任一项所述的方法，其中编码的胶原多肽的氨基酸序列包括至少2.5％的羟脯氨酸。

47.根据第41-46项中任一项所述的方法，其中编码的胶原多肽的氨基酸序列包括至少15％的甘氨酸。

48.根据第41-47项中任一项所述的方法，其中编码的胶原多肽包括羟基化赖氨酸。

49.根据第41-48项中任一项所述的方法，其中编码的胶原多肽的等电点>7，优选>8。

50.根据第41-49项中任一项所述的方法，其中编码的胶原多肽是一种抗氧化剂。

51.根据第41-50项中任一项所述的方法，其中编码的胶原多肽具有抗衰老活性。

52.根据第41-51项中任一项所述的方法，其中编码的胶原多肽包含GFSGLDGAKGD(SEQ ID NO：6)的氨基酸序列或与GFSGLDGAKGD(SEQ ID NO：6)有最多三个保守氨基酸取代差异的氨基酸序列。

53.根据第41-52项中任一项所述的方法，其中编码的胶原多肽是低敏的。

54.根据第41-53项中任一项所述的方法，其中编码的胶原多肽包含与SEQ ID NO：1至4或7至17中任一项有至少85％同一性的氨基酸序列。

55.根据第41-53项中任一项所述的方法，其中编码的胶原多肽包括选自SEQ IDNO：1至4和7至17的氨基酸序列。

56.根据第41-53项中任一项所述的方法，其中编码的胶原多肽包括与SEQ ID NO：3、21和22中任一个有至少85％同一性的氨基酸序列。

57.根据第41-53项中任一项所述的方法，其中编码的胶原多肽包括选自SEQ IDNO：3、21和22中任一个的氨基酸序列。

58.根据第41-57项中任一项所述的方法，其中所述重组胶原分子包括三个第1-22和24-28项中任一项所定义的胶原多肽的同源三聚体。

59.根据第41-58项中任一项所述的方法，其中重组胶原多肽或胶原分子是糖基化的。

60.根据第41-59项中任一项所述的方法，其中编码包含与SEQ ID NO：2有至少85％同一性的氨基酸序列的胶原多肽的核苷酸序列前面是编码分泌信号序列的核苷酸序列。

61.根据第60项所述的方法，其中编码分泌信号序列的核苷酸序列编码SEQ IDNO：5的氨基酸序列。

62.根据第41-61项中任一项所述的方法，其中所述人脯氨酰-4-羟化酶由SEQ IDNO：18和SEQ ID NO：19的氨基酸序列编码。

63.根据第41-62项中任一项所述的方法，其中(a)和/或(b)的核苷酸序列被插入到使用双向启动子的载体中。

64.根据第41-63项中任一项所述的方法，其中将(a)和/或(b)的核苷酸序列插入到使用可诱导和去抑制启动子的载体中。

65.根据第64项所述的方法，其中启动子是甲醇诱导的。

66.根据第41-65项中任一项所述的方法，其中将(a)和/或(b)的核苷酸序列插入到允许翻译后转运至内质网的载体。

67.根据第41-66项中任一项所述的方法，其中重组胶原多肽或胶原分子从培养的酵母细胞的培养上清液中分离。

68.通过第41-68项中任一项所述的方法制备的重组胶原多肽或胶原分子。

69.根据第68项所述的重组胶原分子，其中重组胶原分子包括三个胶原多肽的同源三聚体。

实施例

实施例1：胶原多肽和胶原分子的开发

此实施例中使用了与人I型A1胶原片段(SEQ ID NO：22)相对应的胶原氨基酸序列(例如，见SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)。

为了平衡水溶性和皮肤渗透性，选择了分子量在1至80kDa，优选2至45kDa之间的人I型A1胶原氨基酸序列。

大多数蛋白质在pH范围为5.5至8时达到净电荷状态。这是蛋白质的最低溶解度状态，称为等电点。为便于制备护肤品(通常pH值为5.5)或个人护理制剂，在pH值为5.5时，蛋白质应处于可溶状态，即表面带电。

选择含有脯氨酸的人I型A1胶原的氨基酸序列，优选富含脯氨酸。胶原氨基酸序列中的脯氨酸在胶原合成过程中会在内质网中羟化。胶原中的羟脯氨酸比率越高，其保湿和抗衰老活性就越高。较高的羟脯氨酸比率也有望改善作为营养保健品的性能，因为与潜在的作用机制之一是使含羟脯氨酸的二肽和三肽进入血液。

本发明的胶原多肽基于人I型A1胶原的片段，人I型A1胶原的片段包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列(见下表)。

一些用于表达胶原多肽的构建体在N端(SEQ ID NO：3)和/或C端(SEQ ID NO：4)制备有编码人I型A1胶原多肽区的序列，以进一步促进胶原多肽形成高阶结构。对于这些构建体，在胶原序列与C端和N端前肽区域之间设计了KEX2裂解位点(cleavage site)(″EKR″)，以便裂解C端和/或N端前肽。KEX2是一种原产于毕赤酵母的蛋白酶。

一些构建体含有编码酵母MatαD分泌信号序列(SEQ ID NO：5)的核苷酸序列，以促进编码的胶原多肽从毕赤酵母细胞中分泌。MatαD指的是交配因子α1前肽的缺失变体，与全长信号序列相比，该变体可导致某些分泌蛋白水平的增加(G.P.Lin-Cereghino et al.，Gene，2013，519，311-317)。MatαD被认为有助于翻译后转运至内质网(ER)。在不拘泥于理论的前提下，可以认为，分泌信号序列若能增加在ER中的停留时间，就会增加ER中共同表达的脯氨酰-4羟化酶对胶原多肽的羟化作用。以这种方式控制在ER中停留的时间有助于胶原羟化和胶原多肽分泌之间的平衡。

上述氨基酸序列如表1所示。

表1：用于在酵母中表达和分泌的人胶原I型A1多肽的氨基酸序列

从上文可以看出，SEQ ID NO：1至4含有PGP基序。

采用了表1中的序列组合，设计并制备了用于表达胶原多肽的构建体，。有些构建体被制备用于在酵母(如毕赤酵母)中表达。

表2提供了这些构建体的实例及其编码的氨基酸序列。SEQ ID NO：7-17分别对应于构建体#1-11。

用构建体#1-11生成的胶原多肽的氨基酸序列在表2中用粗体和斜体表示。

表2：构建体及其氨基酸序列

在上表中：下划线序列＝MatαD分泌信号(SEQ ID NO：5)；粗体和斜体序列：用相应构建体生产的胶原多肽序列。

构建体中使用的启动子是甲醇诱导型启动子，它也是一种去抑制型启动子，这意味着它的活性在低浓度碳源(如葡萄糖)时就已经开始，然后可以通过添加甲醇进一步扩大。因此，如果需要，该启动子可以在无甲醇条件下生产重组蛋白。由于在甲醇诱导之前已经存在一些转录活性，因此细胞在扩大表达之前已经可以适应这种条件。

从上表2可以看出，用构建体#2、#4、#5、#6、#9和#10(分别对应于SEQ ID NO：8、10、11、12、15和16)生产的胶原多肽包括人I型A1胶原的″80 AA″片段(SEQ ID NO：2)。

用构建体#2、#4、#5、#6、#9和#10制得的胶原多肽的序列如下表3所示。

用构建体#2、#4和#9制得的胶原多肽与SEQ ID NO：2的氨基酸序列对应。用构建体#5、#6和#10获得的胶原多肽分别对应于包括SEQ ID NO：2的SEQ ID NO：21、22和3的氨基酸序列。

表3：胶原多肽的氨基酸序列

下表4列出了人脯氨酰-4-羟化酶(P4HA和P4HB)和人胶原I型A1的氨基酸序列。

表4：人脯氨酰-4-羟化酶(P4HA和P4HB)和人胶原I型A1的氨基酸序列

实施例2：来自毕赤酵母的Col1a1胶原片段的蛋白质分泌筛选和表征

发明人根据实施例1中定义的构建体过度表达了编码人I型A1胶原多肽的构建体。

发明人通过在基因组中随机整合构建体，在双向启动子下共同过度表达了毕赤酵母系统中脯氨酸羟基化的机制(脯氨酰-4-羟化酶(P4HA和B异四聚体A2B2，来自人类))。

材料和方法：

毕赤酵母转化

毕赤酵母P4H平台菌株通过电穿孔用1pg Smil线性化表达构建物转化。在1mLYPD/山梨醇(1：1)中于30℃、550rpm下再生3小时后，将细胞接种在含100mg/L博莱霉素(Zeocin)的YPD琼脂平板上。

毕赤酵母的培养和诱-导表达

深孔板培养方案

依赖甲醇的深孔板培养方案(筛选和复筛)：

-在无菌条件下，在96孔深孔板中制备培养基。用无菌牙签将目标毕赤酵母菌株的新鲜单菌落接种到250pL BMG1中。

-在28℃、320rpm、80％湿度条件下培养60小时。

-生长60小时后，将克隆压印到YPD琼脂方孔板上保存，并加入250pLBMM2诱导培养。

-接种后68、84和92小时后，加入50pL BMM10进一步诱导，总共108小时(＝诱导48小时)后停止培养。

-4000rpm、4℃下离心细胞10分钟，收获上清液，进行活性测定或进行SDS-PAGE分析以检测目标蛋白质。

去抑制(无甲醇)深孔板培养方案(筛选)：

-在无菌条件下，在96孔深孔板中制备培养基。

-用无菌牙签将目标毕赤酵母菌株的新鲜单菌落接种到250L BMG1中。

-在28℃、320rpm、湿度80％的条件下培养60小时。

-生长60小时后，将克隆压印到YPD琼脂方形平板上保存，并加入250pL BMG0.5诱导培养。

-接种后68、84和92小时后，加入50P1 BMG2，5进一步诱导，总共108小时(＝诱导48小时)后停止培养。

-将细胞在4000rpm、4℃下离心10分钟，收获上清液并进行活性检测或进行SDS-PAGE或原生凝胶分析以检测目标蛋白质。

试剂、化学品和材料组成

-无菌250mL至2.5L挡板摇瓶。

-YPD(1％w/V酵母提取物、2％w/V蛋白胨、2％w/V葡萄糖)。

-BMM10(含5％甲醇的最小甲醇缓冲液：1.34％酵母氮基(不含氨基酸)、4x10-5％生物素、200mM磷酸钾缓冲液、pH 6.0和5％甲醇)。

-BMM2(含5％甲醇的最小甲醇缓冲液：1.34％酵母氮基(不含氨基酸)、4x10-5％生物素、200mM磷酸盐钾缓冲液、pH 6.0和1％甲醇)。

-BMG1(含5％甲醇的最小甲醇缓冲液：1.34％酵母氮基(不含氨基酸)、4x10-5％生物素、200mM磷酸盐钾缓冲液、pH 6.0和1％甘油)。

-BMG0.5(含5％甲醇的最小甲醇缓冲液：1.34％酵母氮基(不含氨基酸)、4x10-5％生物素、200mM磷酸钾缓冲液、pH 6.0和0.5％甘油)。

-BMG2.5(含5％甲醇的最小甲醇缓冲液：1.34％酵母氮基(不含氨基酸)、4x10-5％生物素、200mM磷酸钾缓冲液、pH 6.0和2.5％甘油)。

-纯甲醇。

SDSPAGE方案

-通过变性凝胶电泳(SDS-PAGE)分析蛋白质：根据分子量分离蛋白质，评估蛋白质的生产概况。运行Bolt Bis-Tris Plus Mini凝胶的标准方案：

-离心培养基(4000转，10分钟)。从细胞中分离上清液。

-测量每个样品中的蛋白质浓度。将待分析样本中的蛋白质浓度归一化。

-将样品与含有LDS的4X Loading缓冲液和含有DTT的10X还原剂混合。加入蒸馏水至30升。

-在Bis Tris 4-16％凝胶中上样15-20L/孔的样品。

-在MES running缓冲液中运行(200V，25分钟)

-在BlueSafe蛋白染色剂中孵育45分钟，然后用蒸馏水洗涤过夜，使凝胶溶解。

用胃蛋白酶消化的蛋白悬浮液进行SOSPAGE：

-冻干后的蛋白溶液在50mM磷酸二氢钾缓冲液(pH2.2)中稀释，并在22℃和20小时时用0.05mg/mL胃蛋白酶处理。

图1中的SDS-PAGE凝胶显示了毕赤酵母中过表达胶原的片段。这些SDS PAGE凝胶显示了构建体#2、4、6和8(构建体#2(SEQ ID NO：8)、4(SEQ ID NO：10)、6(SEQ ID NO：12)和8(SEQ ID NO：14)--见表2)的胶原多肽表达。星号显示的是P4H机制的两个亚基。

毕赤酵母中人胶原COL1A1片段同源三聚体形成的特征

根据Vuorela等人的文章(EMBO Journal 1997，第16卷第22期)，P4H机制的过量表达与胶原片段的组装之间存在复杂的调节关系。P4HA亚基以前被描述为保留在ER中。在发明人的实验中，它偶尔会分泌到上清液中--见图1，该图显示了与构建体#2(SEQ ID NO：8)共同表达时，P4H亚基分泌到上清液中的情况。

图2中的进一步SDS-PAGE分析显示了毕赤酵母产生和分泌的同源三聚体胶原片段，因为全长构建质粒的迁移率约为～25kDa(对于构建质粒#5和6(分别为SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12，用红色箭头表示))，以及任何裂解产物(如SEQ ID NO：21和22)都抵抗胃蛋白酶消化，这是显示同源三聚体结构的标准方法。

实施例3：氨基酸序列

方法

-通过NanoHPLC-MS/MS分析产生的肽。

-鉴定选定菌株分泌组中发现的蛋白质。

-分析作为翻译后修饰(PTM)的脯氨酸羟化。

-预计覆盖率至少为50％。

-蛋白质分解酶：建议以胰蛋白酶为标准。

结果

-从SDS凝胶中分离出的两个条带的肽分析结果如下：

胶原多肽1(SEQ ID NO：2)：7.3kDa，由构建体#2生成(见图2)

胶原多肽2(SEQ ID NO：22)：11.2kDa，由构建体#6生成(见图2)

-凝胶内蛋白酶解(胰蛋白酶)和在串联质谱仪上分析所产生的肽显示，所有选定的蛋白质条带似乎都是胶原。

-在分析的样品中，属于所述胶原的肽属于10种最丰富的肽。

-对于所有分析的构建体来说，分泌肽的处理都被认为是完全的，因为没有一个样本显示出与分泌信号MatαD相对应的肽段。

以下结果是对上述肽段的深入分析：

胶原多肽1(SEQ ID NO：2)

-胶原的序列覆盖率为55％

-分析发现该肽至少有28％的脯氨酸羟基化原生位点被羟基化，相当于2.5％的羟脯氨酸。

胶原多肽2(SEQ ID NO：22)

-胶原的序列覆盖率为43％。

-发现了胶原片段以及N端和C端片段。

-分析发现肽中至少有15％的脯氨酸羟基化原生位点被羟基化，相当于1.6％的羟脯氨酸。

实施例4：细胞毒性试验和基因表达分析

用不同的胶原处理正常人真皮角质细胞(NHEKs)后，通过mRNA测序测定与皮肤衰老有关的不同基因的表达变化。

方法

1.细胞毒性试验

试验模型：

首先，测定不同浓度的不同产品(样品1-7，如下)对正常人真皮角质细胞(NHEKs)的细胞毒性。

样品：

测试产品的标记如下：

-样品1-缓冲溶液(PBS)，用于重新悬浮目标蛋白

-样品2-目标蛋白(SEQ ID NO：2)以2.25w％在缓冲溶液中(见样品1)-Cambrium纯素人胶原

-样品3-缓冲溶液(20mM乙酸)用于重新悬浮牛胶原和水解胶原

-样品4-2.25w％的牛胶原的缓冲溶液(见样品3)-Gibco^TM Collagen I，bovine(可从ThermoFisher购买；产品编号A1064401；2018年11月23日)

-样品5-2.25w％的水解胶原蛋白的缓冲溶液(见样品3)-iCONFIT hydrolysedcollagen(可从iCONFIT European Foods OU，Tallinn购买)

-样品6-用于重新悬浮合成胶原蛋白的缓冲溶液(由水、5w/v％的己二醇和5w/v％的丁二醇组成)

-样品7-缓冲溶液的合成胶原蛋白溶液(见样品6)-INCI：sh-多肽-121

操作步骤：

将所有样品以4种不同浓度直接稀释于适当的培养基中：2.5％、1％、0.5％和0.1％(稀释倍数分别为40、100、200和1000)。实验以三次重复(n＝3)的方式进行。

产品与NHEK在37℃下培养24小时。在24小时培养期的最后3小时，将细胞增殖试剂WST1(Roche)加入培养基中。WST1含有四氮唑盐，代谢活跃的细胞会将其裂解成甲酰肼染料(黄色指示剂)。黄色染色的程度(通过450nm处的吸光度检测)与活细胞的数量成正比，数值介于未处理对照的80％至120％之间，表明该产品没有细胞毒性。

2.基因表达分析

试验模型：

用mRNA测序法测定正常人真皮角质细胞(NHEK)经样品1-7处理后的基因表达变化。

样品：

试验以三次重复(n＝3)的方式进行，组合如下：

-NHEK未经处理(NT)

-NHEK+样品1，浓度为2.5％

-NHEK+样品2，浓度为2.5％

-NHEK+样品3，浓度为2.5％

-NHEK+样品4，浓度为2.5％

-NHEK+样品5，浓度为2.5％

-NHEK+样品6，浓度为2.5％

-NHEK+样品7，浓度为2.5％

具体而言，在合适的培养基(Promocell)下，NHEK以每孔10，000个细胞的浓度在96孔板中培养。在贴壁后，将2.5％(见上文)的样品1-7添加到NHEK中并培养24小时。

然后，从NHEK中提取mRNA，进行反转录，并按照用于实时PCR的Fluidigm说明书(96个基因)制备DNA进行测序。

对已知参与与常见化妆品需求相关的皮肤细胞通路的基因列表进行了测试。

结果

1.细胞毒性检测

2.5％或更低浓度的样品1-7中未检测到对NHEK的细胞毒性活性(活细胞百分比为未处理对照细胞的80-120％；见图4)。

2.基因表达分析

表5和图5显示了经样品2、4、5和7处理后，NHEK中与治疗性和预防性抗衰老及其他有益皮肤作用相关的特定基因的表达变化(表示与NHEK的基础水平相比上调/下调的百分比)。

仅显示了大于50％诱导和小于50％抑制的变化。

表5：样品2、4、5和7对NHEK中不同基因表达的生物活性

在上表中MMP1：基质金属肽酶1；SIRT2/SIRT6：Sirtuin 2和6；SOD2：线粒体超氧化物歧化酶2；GLRX：谷氧还蛋白；HMOX1：血红素氧合酶1；AZGP1：α2-糖蛋白1，锌接合；(-)表示该基因表达下调可能对皮肤有益。(+)表示该基因的表达上调可能与对皮肤的有益作用有关。

讨论

值得注意的是，与使用其他胶原处理相比，样品2显著影响了NHEK细胞中参与预防和治疗性抗衰老、抗氧化和抗色素沉着的各种不同基因的表达(上调和下调)(见表5：抑制MMP1的表达；激活SIRT2/SIRT6、SOD2、GLRX、HMOX1和AZGP1的表达)。

如下表6所示，样品2处理NHEK后，这些基因表达的上调和下调表明对皮肤有益。

表6：使用样品2处理NHEK后，NHEK中不同表达基因的概述

因此，生成的数据表明，使用样品2通过激活皮肤的抗氧化防御，有效预防衰老；还可以抑制胶原的分解，促进细胞增殖和寿命的调控，有效调节衰老引起的多种影响，从而有预防和治疗衰老的有益的皮肤活性。

结论

这些数据表明，本发明的胶原多肽通过影响与皮肤衰老有关的各种不同基因的转录调控来减缓皮肤细胞内在衰老过程，从而具有很强的抗衰老活性。

Claims

1.一种胶原多肽，其包括与SEQ ID NO：2有至少85％同一性的氨基酸序列，其中所述胶原多肽的分子量为1至80kDa。

2.根据权利要求1所述的胶原多肽，其中所述胶原多肽包含所述SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的胶原多肽，其中所述胶原多肽的所述氨基酸序列包含至少2.5％的羟脯氨酸。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的胶原多肽，其中所述胶原多肽的等电点>7，优选地>8。

5.根据权利要求1_4中任一项所述的胶原多肽，其中所述胶原多肽的分子量为2至45kDa。

6.根据权利要求5所述的胶原多肽，其中所述胶原多肽的分子量为5至20kDa。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的胶原多肽，其中所述胶原多肽具有抗衰老活性。

8.一种胶原分子，其包括三个根据权利要求1-7中任一项所定义的胶原多肽的同源三聚体。

9.一种编码根据权利要求1-7中任一项所定义的胶原多肽的核酸。

10.一种包含权利要求9所述的核酸的表达载体。

11.一种包含权利要求10所述的表达载体或权利要求9所述的核酸的宿主细胞。

12.一种包含权利要求1-7中任一项所述的胶原多肽或权利要求8所述的胶原分子，和一种或多种赋形剂的组合物。

13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述组合物被包含在膏霜、乳液、精华液、水溶液、软膏、糊剂、化妆水、悬浮液、凝胶、面膜、皮肤清洁剂、卸妆膏、卸妆液、卸妆乳、卸妆片、洗面奶、洗发水、护发素或沐浴露中。

14.根据权利要求12所述的组合物，其中所述组合物被包含在片剂、胶囊、颗粒或粉末中。

15.根据权利要求12-14中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含一种或多种附加活性成分。

16.一种权利要求12-15中任一项所述的组合物在修复受损皮肤、或保护皮肤免受氧化损伤、色素沉着或衰老中的用途。

17.一种权利要求12-15中任一项所述的组合物作为皮肤保湿剂的用途。

18.一种制备重组胶原多肽或胶原分子的方法，其包括以下步骤：

(a)提供编码胶原多肽的核苷酸序列，所述序列包含与SEQ ID NO：2有至少85％同一性的氨基酸序列，其中所述编码胶原多肽的分子量为1-80kDa；

(b)可选地，提供编码人脯氨酰-4-羟化酶的核苷酸序列，

(c)将(a)和可选地(b)的所述核苷酸序列插入至少一个载体，并且

(d)在培养的酵母细胞中表达(c)所述的载体，以及

(e)从所述培养的酵母细胞中分离重组胶原多肽或胶原分子。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述酵母细胞是毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞。

20.根据权利要求18或19所述的方法，其中所述(a)和/或(b)的所述核苷酸序列被插入到允许翻译后转运至内质网的载体中。

21.根据权利要求18-20中任一项所述的方法，其中从所述培养的酵母细胞的培养基上清液中分离所述重组胶原多肽或胶原分子。

22.一种由权利要求18-21中任一项所述的方法制备的重组胶原多肽或胶原分子。