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CN118531166A - 一种基于高通量测序技术的外源性病毒污染检测方法及其应用 - Google Patents

一种基于高通量测序技术的外源性病毒污染检测方法及其应用 Download PDF

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CN118531166A
CN118531166A CN202411009913.XA CN202411009913A CN118531166A CN 118531166 A CN118531166 A CN 118531166A CN 202411009913 A CN202411009913 A CN 202411009913A CN 118531166 A CN118531166 A CN 118531166A
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cells
culture
virus
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sequencing technology
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CN202411009913.XA
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龚圆昊
秦冲
韩婷
沈施佳
董元舒
童涌
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Suzhou Pharmacopoeia Testing And Inspection Co ltd
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Suzhou Pharmacopoeia Testing And Inspection Co ltd
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Abstract

本发明公开了一种基于高通量测序技术的外源性病毒污染检测方法及其应用。所述检测方法包括：取待检测细胞，进行第一培养，取第一培养过程中细胞进行裂解，剩余细胞继续培养，收集裂解细胞上清并接种于贴壁指示细胞进行第二培养，取第一培养和第二培养后细胞进行总RNA核酸抽提；对总RNA进行建库并测序，对测序结果进行生物信息学分析，鉴定病毒序列，判断病毒污染。本发明首次开发了使用高通量测序检测具备感染能力的外源性病毒的方法，可实现准确地检测，灵敏度和体外培养法相近，此外，检测时间更短，检测的病毒范围更广，可用于替代体外培养法。

Description

一种基于高通量测序技术的外源性病毒污染检测方法及其 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种基于高通量测序技术的外源性病毒污染检测方法及其应用。
背景技术
随着生物技术的持续不断发展，治疗用生物制品已逐渐成熟，形成完整的产业链。与传统化学制药相比，生物制品利用生物技术从生物体，生物组织，细胞，体液中分离出有效成分后制备出预防，治疗和诊断的制品。在这些生物体、生物组织、细胞和体液中，往往存在内源性和外源性病毒污染的风险。生物制品的病毒安全性是生物制药行业产品体系的焦点之一。
其中，中国仓鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary, CHO）和人肾胚293细胞（Human Embryonic Kidney，HEK293）在蛋白，疫苗类产品生产中被大量使用，其质量直接影响生物制品的质量安全，特别是病毒类生物活性物质污染会严重影响制品的质量安全。同时，CHO和HEK293作为人源，灵长类病毒感染指示细胞之一，在细胞系病毒感染筛查实验中大量使用。目前很多病毒疫苗类生物制品以HEK293作为表达宿主。因此，需要开发一种方便、快捷、灵敏、特异性强的检测病毒的方法。
对生产生物制品的细胞，可参照ICH Q5A指导原则进行病毒安全性评价，最新版本ICH Q5A(R2)于2023年开始使用，其中规定：对于生物制品的工程细胞系，需要针对其主细胞库(MCB)，工作细胞库(WCB)以及生产终末细胞库(EOPC)进行细胞库外源性病毒检测。目前细胞库检测外源性病毒主要使用体外培养法，将细胞库细胞裂解后，接种至指示细胞，并通过传代培养至28天后，进行终点检测来确定细胞库是否存在具备感染能力的外源性病毒。此方法测试周期长，需要操作人员每3-4天进行细胞换液，每7或14天进行细胞传代，每次操作后隔天需要观察细胞病变（cytopathic effect，CPE），费时费力，对检测人员造成极大的工作量。而每一次的操作，又增加了操作人员污染样品，造成假阳性的可能。此外，体外培养法虽然名为广谱筛选法，可检测的病毒取决于该病毒是否为指示细胞的易感和宽容病毒（susceptible and permissive）。大多数病毒不易感，或不宽容，则该方法检测失效。另外，细胞培养期间，需要观察病毒对指示细胞造成细胞病变CPE。如果病毒本身不会造成细胞CPE，则此方法检测失效。最后，终点检测为血凝反应测试，血吸附测试，及免疫荧光抗体测试。可检测病毒表面必须含有可以于红细胞表面受体相结合的蛋白血凝素（hemagglutinin，HA）。也就是说，如果病毒表面不具备HA，则即使细胞被病毒感染，也无法通过体外培养法检测检出。最终造成假阴性结果。因此，急需一种比传统细胞培养法更灵敏，更广谱的病毒筛查方案。
高通量测序法属于核酸扩增技术（NAT）的一种，如下一代测序技术（NGS），其原理为将细胞库样本中的核酸片段化，再进行扩增，最后通过生物信息学分析将扩增的核酸片段与参照病毒库进行比对，找出细胞库中的潜在病毒核酸片段，该方法具有较好的广谱筛查性，具备可以替代目前业内公认的药典法--体外培养法的潜力。然而，由于核酸扩增技术的局限性，高通量测序法只评估样本中是否存在病毒核酸，并不能确定筛查出的病毒核酸是否具有感染性，为了避免高通量测序法检出的病毒为假阳性，在使用高通量测序法检出病毒核酸后，需要进一步进行培养法或其他方法确认病毒的感染性，从而增加检测成本及时间成本。高通量测序的另一个难点在于高宿主核酸背景对微量病毒核酸的干扰，导致假阴性的发生。外源性污染的病毒，包括一些潜伏期相对较长的病毒(latent infection)和易感但不宽容病毒(susceptible but nonpermissive)，可长期潜伏于细胞库中不进行扩增。这些病毒在大量宿主核酸的“保护下”，有漏检的可能性。
综上所述，开发高效、准确、低成本的检测生物制品中的病毒的方法，对于生物制品领域具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种基于高通量测序技术的外源性病毒污染检测方法及其应用，以期开发能够替代体外培养法的外源性病毒污染检测方法，同时实现快速、准确地检测，拓展检测谱。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种基于高通量测序技术的外源性病毒污染检测方法，所述检测方法包括：
取待检测细胞，进行第一培养，取第一培养过程中细胞进行裂解，剩余细胞继续培养，收集裂解细胞上清并接种于贴壁指示细胞进行第二培养，取第一培养和第二培养后细胞进行总RNA核酸抽提；对总RNA进行建库并测序，对测序结果进行生物信息学分析，鉴定病毒序列，判断病毒污染。
本发明中，设计了基于高通量测序法检测细胞库外源性病毒的方法，首先进行细胞培养，再结合高通量测序，确保检出病毒具有感染性，从而减少假阳性结果的概率。还可让微量的病毒进行扩增，从而可以更好地进行微量病毒的检测，提高检测限，可检测病毒最低至10感染单位，可替代现有体外培养法。此外，相对于传统的体外培养法，可有效加速检测周期，可从28天左右缩短至8天左右，显著简化操作难度，简化流程，大幅减少人员污染样品的风险，减少检测人员操作的时间，并且可以检测已知和未知的病毒，拓展检测谱。
本发明是一种比体外培养法检测范围更广，检测时间更短；且与传统的高通量测序相比，可以检测活病毒的病毒检测法。
可以理解，所述待检测细胞为任何用于生产生物制品的细胞库，如常见的CHO、Vero或HEK293等。
优选地，所述第一培养的时间为4~6天。
优选地，取第一培养2~4天细胞进行裂解。
优选地，所述第二培养的时间为1~3天。
优选地，所述贴壁指示细胞包括MRC-5、Vero、BHK21、CHO或HEK293中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述第一培养和第二培养的温度各自独立地为35~38℃，如36℃或37℃等。
优选地，所述生物信息学分析包括以下步骤：
a. 质量控制；
b. 去除宿主序列；
c. 与病毒数据库比对；
d. 筛选出所有比对上病毒数据库中参考序列的reads；
e. 将筛选出的reads分别比对到筛选出的每一个病毒基因组上；
f. 计算覆盖碱基数；
g. 输出同种病毒覆盖碱基数最高的结果。
本发明选取bwa-mem，进行宿主比对，在运行分类软件前，将宿主reads过滤，可减少整个流程的操作时间，节省运算能力。Kraken2软件对所有已知病毒（NCBI库及RVDB库）进行订制建库，作为对比参照病毒库，所有已知的病毒均被包含在库中，并且可以随时更新扩增新发现的病毒，Kraken2在进行reads分类过程中，使用k-mer法进行精确映射（exactmapping），因此可以尽可能地减少假阳性病毒的检出。通过改善的生物分析流程，最大化去除宿主背景信息，在不浪费大量运行资源的同时，可识别极低量的病毒。
优选地，所述宿主序列包括家牛（bos taurus）、家鼠（mus musculus）、仓鼠（golden hamster）、恒河猴（rhesus monkey）、绿猴（chlorocebus sabaeus）、犬（canislupus）、猪（sus scrofa）和人类（homo sapiens）的基因序列。
优选地，步骤b还包括去除生物制品生产中的载体序列、细菌序列或内源性病毒序列的步骤（过滤器数据vecter_bacteria）。
优选地，所述病毒数据库包括NCBI数据库与RVDB数据库共同收录的全部病毒已知完整序列。
优选地，步骤c所述与病毒数据库比对的筛选标准为reads长度≥75bp且比对率≥95%。
优选地，判断病毒检出阳性的标准为所述病毒的覆盖碱基数≥200bp。
作为优选的技术方案，所述基于高通量测序技术的外源性病毒污染检测方法包括以下步骤：
（1）取待检测细胞，进行第一培养4~6天，取第一培养过程中2~4天细胞进行裂解，收集裂解细胞上清并接种于贴壁指示细胞进行第二培养1~3天，取第一培养和第二培养后细胞进行总RNA核酸抽提；
（2）对总RNA进行建库并测序，对测序结果进行生物信息学分析：
a. 质量控制；
b. 去除宿主序列；
c. 与病毒数据库比对；
d. 筛选出所有比对上病毒数据库中参考序列的reads；
e. 将筛选出的reads分别比对到筛选出的每一个病毒基因组上；
f. 计算覆盖碱基数；
g. 输出同种病毒覆盖碱基数最高的结果，覆盖碱基数≥200bp，则判定该种病毒检出阳性。
第二方面，本发明提供第一方面所述的基于高通量测序技术的外源性病毒污染检测方法在生物制品制备中的应用。
所述应用包括利用第一方面所述的基于高通量测序技术的外源性病毒污染检测方法检测生物制品制备过程中产品的病毒污染情况。
本发明的检测方法检测时间短、准确性高且能广谱筛查，可有效应用于生物制品制备过程中，替代药典法，进行细胞库（cell bank），未加工收获液（UPB）等生物制品的安全检测。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明针对传统的体外培养法检测周期长、操作复杂、检测谱窄等问题，现有高通量测序法较难确认病毒是否具有真正的感染性、灵敏度低等问题，设计全新的基于高通量测序法检测细胞库外源性病毒的方法，首先进行细胞培养再结合高通量测序，检测时间更短，广谱筛查性更广，检测灵敏度，准确率更高，可有效替代体外培养法，应用于细胞库（cell bank）、未加工收获液（UPB）等生物制品的安全检测。
附图说明
图1为本发明基于高通量测序技术的外源性病毒污染检测方法流程示意图。
图2为体外培养法检测流程示意图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买获得的常规产品。
本发明设计一种基于高通量测序技术的高灵敏度病毒污染检测方法，在高通量测序法之前，增加了细胞库培养步骤，确保检出病毒具有感染性，从而减少假阳性结果的概率，可让微量的病毒进行扩增，从而可以更好地进行微量病毒的检测，提高高通量测序法的检测限，此外，检测周期更短，检测普更广，检测流程示意图如图1所示。
实施例1
本实施例使用高通量测序法检测CHO细胞库外源性病毒污染。
1、待检测样品为细胞库CHO细胞，将细胞稀释至1e7 cells/mL。储存在-80℃冰箱直至检测开始。指示细胞选择MRC-5，Vero和BHK21细胞，用于扩增不适于在CHO细胞扩增的病毒。模型病毒选择CHO易感病毒VSV和MVM。CHO非易感病毒使用HSV-1，PI-3和Reo-3。这些模型病毒包括了双链和单链，DNA和RNA，包膜和非包膜，病毒基因组大小从5.1 kb到152kb。可代表绝大部分常见的病毒种类。
2、按照下表1将不同感染单位（PFU）的模型病毒掺入到1e7 cells/mL的CHO细胞中，此为模拟感染微量病毒的细胞库待检样品。未参入任何病毒的细胞为阴性对照样品。
表1
3、感染天数5天的为该细胞易感病毒。将冻存在-80℃的细胞在37℃复苏后，1000rpm 短暂离心2 min。掺入对应感染单位的病毒，先在37℃培养箱内，小体积（1.5 mL）接种孵育2 h。孵育结束后，将细胞加入至预热30 mL培养基的摇瓶中。在37℃培养箱悬浮培养5天后收获并进行总RNA核酸抽提。
4、感染天数2天的为该细胞非易感病毒。首先按照第3步，将病毒掺入至CHO细胞后，悬浮培养。在第三天，将部分细胞取出，剩余细胞继续培养2天；将取出的细胞短暂离心后重复冻融2次，裂解细胞，取细胞裂解液上清接种至贴壁培养的指示细胞，在37℃接种2h，最后将贴壁指示细胞在37℃培养箱继续培养2天后收获，将两批合并进行总RNA核算抽提。
5、总RNA抽提使用RNeasy mini kit (Qiagen#74104)。对于悬浮培养的细胞，短暂离心细胞悬液，并将上清液转移至50 mL试管中。用3 mL PBS清洗细胞团块，同时将其收集至50 mL试管中。用收集的上清液将细胞重悬至1e7个细胞/mL。短暂离心后，用0.6 mL RLT+与β-巯基乙醇预混合的缓冲液裂解细胞团块。对于贴壁细胞培养物（指示细胞），将细胞培养基转移至15 mL离心管中。用2 mL PBS清洗细胞一次，同时将其收集至相应的15 mL离心管中。试管在1000 rpm、25℃离心10 min。弃去上清液，加入0.6 mL β-巯基乙醇预先混合的RLT裂解液消化细胞。提取后，将RNA保存在 <-60℃下直至文库制备。
6、文库构建使用试剂盒 (Illumina#20040525)，使用 10 ng 细胞库细胞 RNA 和10 ng 指示细胞RNA（不同细胞的等量组合）生成文库。在此基础上，使用试剂盒（IlluminaRibo-Zero Plus rRNA Depletion Kit）去除样本中的核糖体RNA，然后按照生产商的逆转录步骤，生成cDNA文库。文库制备结束后，通过2100生物分析仪 (Agilent) 确认 DNA 片段大小和完整性，作为质量控制/检查步骤。
7、通过初始质量控制/检查步骤后，使用2×300 循环 NextSeq 500/550 v2.5试剂盒，使用NextSeq Illumina 平台对得到的文库进行测序。通过不同的独特双重指数（unique duel index）区分不同的样本。每个文库通过 NextSeq 550 进行分析，生成至少10个 G 序列数据。
8、测序结束后，得到150bp的双端测序结果。使用bcl2fastq程序按照样品对应的index拆分数据，并开始生物信息学分析流程。
(1)数据首先经过fastp处理，以去除测序分数过低的reads(高通量测序平台产生的小片段的序列数据)并移除接头序列。
(2)使用BWA-MEM程序将fastp处理后的reads与宿主基因库比对，参数为K-mer=31，移除所有比对上宿主基因库的reads。
(3)使用Kraken2程序将非宿主reads与包含NCBI数据库与RVDB数据库中共同收录的完整病毒已知完整序列的数据库进行比对，以reads长度≥75bp，同时比对率≥90%作为标准筛选出全部符合的reads和这些reads能比对上的病毒基因组。
(4)使用BWA-MEM程序将上一步筛选出的reads分别比对到上一步筛选出的每一个病毒基因组上，以reads长度≥75bp，同时比对率≥90%作为标准用Samtools计算比对上的覆盖碱基数，并输出同种病毒覆盖碱基数最高的结果供阳性判断。如果该覆盖碱基数≥200bp，则认为该种病毒检出阳性，并输出病毒种名，生成测序报告。
结果如表2所示。
表2
从表2可以看出，在阴性未检出任何病毒的条件下，所有掺入的待测病毒都被检出阳性，证明本发明方法可以检出待测CHO细胞库中感染滴度最少为10PFU的病毒。
实验例2
本实施例使用高通量测序法检测HEK细胞库外源性病毒污染。
1、待检测样品为细胞库HEK细胞。将细胞稀释至1e7 cells/ml。储存在-80℃冰箱直至检测开始。指示细胞选择MRC-5，Vero和BHK21细胞，用于扩增不适于在HEK293细胞扩增的病毒。模型病毒选择HEK293易感病毒Ad5，HCMV和HEV。HEK293非易感病毒选择HSV-1，PI-3，Reo-3和Sindbus病毒。这些模型病毒包括了双链和单链，DNA和RNA，包膜和非包膜，病毒基因组大小从5.1 kb到152 kb。具备代表绝大部分常见的病毒种类。
2、按照表3将不同感染滴度的模型病毒掺入到1e7的HEK293细胞中。此为模拟感染微量病毒的细胞库待检样品。未参入任何病毒的细胞为阴性对照样品。
表3
3、按照实例1所示检测方案对HEK293进行外源性病毒检测。
结果如表4所示。
表4
有表3可知，在阴性未检出任何病毒的条件下，所有掺入的待测病毒都被检出阳性，证明本方法可以检出待测HEK细胞库中感染滴度最少为10 PFU的病毒。
对比例1
本发明目的为设计一种可以替代体外培养法的检测细胞库外源性病毒的方法。因此，使用体外培养法检测外源性病毒作为对比。
为了对比体外培养法和本发明高通量测序法检测外源性病毒的检测限（LOD）。选取HSV-1，PI-3，VSV和MVM病毒，分别接种在指示细胞MRC-5，Vero和CHO贴壁细胞，并进行了为期28天的体外培养。病毒接种浓度为0.1 PFU，1 PFU和10 PFU。每种接种浓度进行三个重复孔，只需要一个孔出现CPE，则可判定为阳性。具体体外培养法流程示意图如图2所示，具体包括：将1e7 CHO细胞进行2次冻融，充分裂解后，以2000 rpm 在4℃离心10 min。离心后，取上清并分别掺入0.1，1和10 PFU HSV-1, PI-3和VSV病毒。在T25培养瓶中培养指示细胞，MRC-5，Vero和CHO贴壁细胞。每种PFU分别准备5个重复培养瓶。在接种当天（Day 0），指示细胞的密度保持低于50%。将掺入病毒后的细胞裂解液接种至指示细胞，并在37℃孵育90-120min。孵育结束后，将细胞裂解液移除，并加入指示细胞用培养基。细胞在37℃孵育培养28天。每3-5天，细胞进行换液。在第7和第14天进行细胞传代。传代方式为，将细胞消化收集，进行2次冻融，充分裂解后，以2000 rpm在4℃离心10 min。离心后，取上清并传代至下一批次的指示细胞T25培养瓶中。在第28天，收集细胞并进行终点试验，血凝集和血吸附试验。在培养期间，定期观察细胞呈现感染病毒后的细胞病变（CPE）。如果细胞提前出现病变，并出现大量死亡，则提前收集细胞并将收获液在-80℃保存，直到第28天进行终点试验。
血凝集试验（Hemagglutination Assay）。将细胞培养收集的上清液以1000 rpm离心5 min。在圆底96孔板中，每孔加入0.1 mL PBS/BSA。在96孔圆底板第一行孔加入0.1 mL离心后的上清液，阴性对照使用0.1 mL细胞培养基。在96孔板中进行2倍梯度稀释，从第一行的混合液中转移0.1 mL至下一行，以此类推直至最后一行。梯度稀释以后，在每个孔中加入0.07 mL 0.5% 鸡，豚鼠，人和豚鼠加鸡红细胞。并在2-8℃和37℃孵育1-2 h。当红细胞出现明显的纽扣状凝集，记录为阴性，呈弥散状记录为阳性。
3个不同接种浓度分别进行三次重复实验。只有3个重复实验全部为阳性时，此病毒接种浓度被视为该病毒的检测限。
结果如表5所示，当接种0.1 PFU HSV-1至MRC-5细胞时，3个重复实验均未发现CPE。当接种1 PFU HSV-1接种至MRC-5时候，1次实验出现CPE。只有当10 PFU HSV-1接种至MRC-5时，3次重复实验均出现明显CPE。说明，当10 PFU病毒接种至MRC-5时，才可稳定检测出病毒。因此，可得出，使用体外培养发检测HSV-1病毒的检测限为10 PFU。
表5
如表6所示，当接种0.1 PFU PI-3病毒至Vero时，3个重复实验同样未出现CPE。接种1 PFU PI-3至Vero细胞时，2次实验出现CPE。只有当Vero接种10 PFU PI-3病毒时，才能3次重复实验都稳定检出CPE。说明检测PI-3检测限为10 PFU。
表6
如表7所示，当接种0.1 PFU VSV病毒至CHO细胞时，1个实验出现CPE。接种1 PFU和10 PFU 时，可稳定检测出CPE。因此，检测VSV的检测限为10 PFU。
表7
当接种0.1，1，10 PFU MVM病毒至CHO细胞时，所有重复实验都未出现CPE，表8。说明使用体外培养法，CHO细胞无法检测MVM病毒。
表8
由表5-表8可知，使用体外培养法，可以稳定检测10 PFU HSV-1，PI-3和1 PFUVSV，使用本发明方法检测10 PFU，表明本发明在高通量测序法之前，增加细胞库培养步骤，进行检测，可以使病毒检测限接近至现有体外培养法，表明本发明检测方法可以用于替代体外培养法。
但是，通过体外检测法检测MVM，无法得出样品是否含有具有感染性的病毒的结论。相反，从表2得知，使用本发明方法检测，可以证明MVM的确可以感染CHO细胞，无需通过细胞病变作为感染依据。其原因为，MVM可以在CHO上感染，但是不表现出CPE，因此仅通过体外培养检测来判断样品是否含有MVM病毒，有可能会造成MVM的漏检。同理，除了MVM以外，还有很多病毒并不会造成CPE。例如HEV无法在Vero和HEK293细胞产生CPE。而使用本发明方法，可以证明HEV可以感染HEK293细胞，无需观察细胞病变。
综上所述，本发明首次开发了使用高通量测序检测具备感染能力的外源性病毒的方法，可实现准确地检测，灵敏度和体外培养法相近，此外，检测时间更短，检测的病毒范围更广，可用于替代体外培养法。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种基于高通量测序技术的外源性病毒污染检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：
取待检测细胞，进行第一培养，取第一培养过程中细胞进行裂解，剩余细胞继续培养，收集裂解细胞上清并接种于贴壁指示细胞进行第二培养，取第一培养和第二培养后细胞进行总RNA核酸抽提；
对总RNA进行建库并测序，对测序结果进行生物信息学分析，鉴定病毒序列，判断病毒污染。
2.根据权利要求1所述的基于高通量测序技术的外源性病毒污染检测方法，其特征在于，所述待检测细胞为任何用于生产生物制品的细胞库；
所述待检测细胞包括CHO、Vero或HEK293中任意一种或至少两种组合。
3.根据权利要求1所述的基于高通量测序技术的外源性病毒污染检测方法，其特征在于，所述第一培养的时间为4~6天；
取第一培养2~4天细胞进行裂解。
4.根据权利要求1所述的基于高通量测序技术的外源性病毒污染检测方法，其特征在于，所述第二培养的时间为1~3天。
5.根据权利要求1所述的基于高通量测序技术的外源性病毒污染检测方法，其特征在于，所述贴壁指示细胞包括MRC-5、Vero、BHK21、CHO或HEK293中任意一种或至少两种的组合。
6.根据权利要求1所述的基于高通量测序技术的外源性病毒污染检测方法，其特征在于，所述第一培养和第二培养的温度各自独立地为35~38℃。
7.根据权利要求1所述的基于高通量测序技术的外源性病毒污染检测方法，其特征在于，所述生物信息学分析包括以下步骤：
a. 质量控制；
b. 去除宿主序列；
c. 与病毒数据库比对；
d. 筛选出所有比对上病毒数据库中参考序列的reads；
e. 将筛选出的reads分别比对到筛选出的每一个病毒基因组上；
f. 计算覆盖碱基数；
g. 输出同种病毒覆盖碱基数最高的结果。
8.根据权利要求7所述的基于高通量测序技术的外源性病毒污染检测方法，其特征在于，所述宿主序列包括家牛、家鼠、仓鼠、恒河猴、绿猴、犬、猪和人类的基因序列；
步骤b还包括去除生物制品生产中的载体序列、细菌序列或内源性病毒序列的步骤；
所述病毒数据库包括NCBI数据库与RVDB数据库共同收录的全部病毒已知完整序列；
步骤c所述与病毒数据库比对的筛选标准为reads长度≥75 bp且比对率≥95%；
判断病毒检出阳性的标准为所述病毒的覆盖碱基数≥200 bp。
9.根据权利要求1所述的基于高通量测序技术的外源性病毒污染检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
（1）取待检测细胞，进行第一培养4~6天，取第一培养过程中2~4天细胞进行裂解，收集裂解细胞上清并接种于贴壁指示细胞进行第二培养1~3天，取第一培养和第二培养后细胞进行总RNA核酸抽提；
（2）对总RNA进行建库并测序，对测序结果进行生物信息学分析：
a. 质量控制；
b. 去除宿主序列；
c. 与病毒数据库比对；
d. 筛选出所有比对上病毒数据库中参考序列的reads；
e. 将筛选出的reads分别比对到筛选出的每一个病毒基因组上；
f. 计算覆盖碱基数；
g. 输出同种病毒覆盖碱基数最高的结果，覆盖碱基数≥200 bp，则判定该种病毒检出阳性。
10.权利要求1-9任一项所述的基于高通量测序技术的外源性病毒污染检测方法在生物制品制备中的应用；
所述应用包括利用权利要求1-9任一项所述的基于高通量测序技术的外源性病毒污染检测方法检测生物制品制备过程中产品的病毒污染情况。
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