CN118530980B - 极低副反应产物淀粉一步法生产塔格糖的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于塔格糖生产领域，提供了极低副反应产物淀粉一步法生产塔格糖的生产方法。本发明从高温热泉宏基因组中的葡萄糖六磷酸异构酶、塔格糖六磷酸异构酶中筛选出来了两个酶，即：葡萄糖六磷酸异构酶(Pgi‑R)和塔格糖六磷酸异构酶的(T6PE‑P)，这两个酶在一步法催化淀粉形成塔格糖过程中，对于合成山梨糖的副反应催化能力极低。
Description
技术领域
本发明属于塔格糖生产领域，特别涉及极低副反应产物淀粉一步法生产塔格糖。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
淀粉一步法催化生产塔格糖的过程中，随着塔格糖在溶液体系中的逐渐积累，葡萄糖六磷酸异构酶、塔格糖六磷酸异构酶的副反应逐渐表现出来。葡萄糖六磷酸异构酶原本用于催化葡萄糖六磷酸形成果糖六磷酸；塔格糖六磷酸异构酶原本用于催化果糖六磷酸异构形成塔格糖六磷酸；然而在体系中塔格糖含量较高时这两个酶产生的副反应可以将塔格糖催化形成塔格糖(色谱图的10号峰)与山梨糖(色谱图的7号峰)，如图1所示。然而，山梨糖过高会极大影响塔格糖的分离结晶成本。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种极低副反应产物淀粉一步法生产塔格糖的生产方法。本发明从高温热泉宏基因组中的葡萄糖六磷酸异构酶、塔格糖六磷酸异构酶中筛选出来了两个酶，即：葡萄糖六磷酸异构酶(Pgi-R)和塔格糖六磷酸异构酶的(T6PE-P)，这两个酶在一步法催化淀粉形成塔格糖过程中，对于合成山梨糖的副反应催化能力极低。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个方面，提供了一种用于极低副反应产物淀粉一步法生产塔格糖的葡萄糖六磷酸异构酶(Pgi-R)，所述葡萄糖六磷酸异构酶为具有
SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白。
SEQ ID NO:1如下：
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在一些实施方式中，所述塔格糖的葡萄糖六磷酸异构酶(Pgi-R)来源于菌Ruminiclostridium cellobioparum。
本发明的第二个方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸为编码如
SEQ ID NO:1所示蛋白的核苷酸序列。
本发明的第三个方面，提供了上述的葡萄糖六磷酸异构酶(Pgi-R)在减少淀粉一步法生产塔格糖的副反应中的应用。
在一些实施方式中，所述副反应包括：将淀粉催化形成山梨糖。
本发明的第四个方面，提供了一种用于淀粉一步法生产塔格糖的塔格糖六磷酸异构酶的(T6PE-P)，所述塔格糖六磷酸异构酶为具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白。
在一些实施方式中，塔格糖六磷酸异构酶的(T6PE-P)来源于菌Paraburkholderiaphenoliruptrix。
本发明的第五个方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸为编码如
SEQ ID NO:2所示蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:2如下：
Mtnvvsrlsggegtakklkgiysicsahpwvlgaamkqaldddtplliestsnqvdqfggytgmkpadfvrfvhlia
drtglprtrlilggdhlgpnawrslpaeeamqraealidayvsagftkihldtsmscagdparlsddvvaerasrlcaiae
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lrevvervmlakpgnwekyyhgddrekrllrtysysdrvryywadpeidaaanklisnladidisenvlsrylpeqywqfrrglidatpmsliqskvrevigvyaaacka。
本发明的第六个方面，提供了上述的塔格糖六磷酸异构酶的(T6PE-P)在减少淀粉一步法生产塔格糖的副反应中的应用。
在一些实施方式中，所述副反应包括：将淀粉催化形成山梨糖。
本发明的第七个方面，提供了一种极低副反应产物淀粉一步法生产塔格糖的生产方法，包括：
在淀粉的反应液中分别加入α葡聚糖磷酸化酶、磷酸葡萄糖变位酶、上述Pgi-R粗酶液、上述T6PE-P粗酶液、6磷酸塔格糖磷酸酶(T6PP)，在一定温度下进行催化反应，即得。
在一些实施方式中，所述淀粉的反应液包括：磷酸氢二钾、硫酸镁、淀粉液化液。
本发明的有益效果
(1)本发明从高温热泉的宏基因组中筛选并克隆出了一个来源于Ruminiclostridium cellobioparum的葡萄糖六磷酸异构酶，命名为Pgi-R。该酶与其它来源的葡萄糖六磷酸异构酶相比，该酶催化合成副反应的能力降低了70％。
(2)本发明从高温热泉的宏基因组中筛选并克隆出了一个来源于Paraburkholderia phenoliruptrix的塔格糖六磷酸异构酶的，命名为T6PE-P。该酶与其它来源的塔格糖六磷酸合成酶相比，该酶催化合成副反应的能力降低了85％。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示例性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1是实施例2中采用传统方法一步法催化淀粉形成的混合糖溶液色谱图，塔格糖(色谱图的10号峰)与山梨糖(色谱图的7号峰)。
图2是实施例2中采用本发明的Pgi-R、T6PE-P一步法催化淀粉形成的混合糖溶液色谱图，塔格糖(色谱图的10号峰)与山梨糖(色谱图的7号峰)。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
以下实施例中，实验材料如下：
麦芽糊精，ALDRICH公司产品，产品编号419672；
pET41b载体，Novagen，Madison，WI；
大肠杆菌表达菌BL21(DE3)，Invitrogen，Carlsbad，CA。
其他原料皆为市售产品。
实施例1Pgi-R与T6PE-P基因的克隆
本发明从高温热泉底泥宏基因组测下获得的序列中上获得了该可能得葡萄糖六磷酸异构酶与塔格糖六磷酸合成酶的氨基酸序列。本发明随后委托金斯瑞有限公司根据该氨基酸序列设计编码该多肽的多核苷酸(DNA)序列，并对大肠杆菌表达系统进行密码子优化，优化后的多核苷酸序列如SEQ.NO.3与SEQ.NO.4所示。
SEQ.NO.3：
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SEQ.NO.4：
ATGACCAACGTGGTGAGTCGCCTGAGTGGCGGCGAAGGTACCGCAAAAAAGCTGAAAGGCATCTATAGCATCTGCAGTGCCCATCCGTGGGTTCTGGGTGCAGCCATGAAACAGGCCCTGGATGATGATACCCCGCTGCTGATTGAAAGCACCAGTAATCAGGTGGATCAGTTTGGCGGCTATACCGGTATGAAACCGGCCGATTTTGTGCGTTTTGTTCATCTGATCGCCGATCGTACCGGTCTGCCGCGTACCCGCCTGATTCTGGGTGGCGATCATCTGGGCCCGAATGCATGGCGCAGCCTGCCGGCAGAAGAAGCAATGCAGCGCGCAGAAGCCCTGATTGATGCATACGTTAGTGCCGGTTTTACCAAAATCCACCTGGATACCAGTATGAGTTGCGCAGGTGACCCGGCACGCCTGAGCGATGATGTTGTGGCAGAACGCGCAAGCCGCCTGTGCGCAATTGCAGAAGCCGCAGCCGAACGTAAAGGCAATCGTGAAAAACCGGTTTACATCATCGGCACCGAAGTGCCGGTGCCGGGTGGCGCAGCTGAAGAACTGGAAACCGTGGAAATTACCAGTCCGGATGCCGCCCTGGATACCGTGGCCGTTCATCGTAATGCCTGGCGCGATCGTGGTCTGGATGATGCATGGCAGCGCGTTATTGCACTGGTTGTTCAGCCGGGCGTTGAATTTGATCATACCAAAGTGGTGGACTACAAGCCGGAACTGGCAACCAAACTGAGCGCAATTCTGAAAGAACTGCCGGGTATGGTTTTCGAAGCCCATAGTACCGATTACCAGACCCCGGAAGCACTGGCCGCCCTGGTTCAGGATGGTTTTGCCATTCTGAAAGTGGGTCCGGGTGTTACCTTTGCCCTGCGCGAAGCACTGTATGCCCTGGCCGAAATTGAAAATGAACTGGTGGTGCCGGAAGCCCGTAGCAATCTGCGCGAAGTTGTGGAACGCGTGATGCTGGCCAAACCGGGTAATTGGGAAAAATATTACCACGGCGACGACCGCGAAAAACGCCTGCTGCGTACCTATAGCTATAGTGATCGTGTTCGCTACTACTGGGCCGATCCGGAAATTGATGCAGCCGCCAATAAGCTGATTAGCAATCTGGCAGATATCGACATCAGCGAAAACGTGCTGAGTCGTTATCTGCCGGAACAGTATTGGCAGTTTCGTCGTGGCCTGATTGATGCCACCCCGATGAGTCTGATTCAGAGCAAAGTGCGTGAAGTGATTGGCGTTTATGCCGCCGCATGCAAAGCA
金斯瑞有限公司将该密码子优化好的序列克隆pET41b载体连接后，获得pET41b-Pgi-R以及pET41b-T6PE-P表达载体。在该表达载体中，由T7启动子(T7promotor)和T7终止子(T7terminator)等元件负责基因的表达。
实施例2蛋白的表达和活性测定
(1)蛋白表达
将pET41b-Pgi-R以及pET41b-T6PE-P转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取单克隆至3ml含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基，37℃，220rpm培养过夜。取1ml过夜菌至200ml含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃，220rpm至OD600值达到0.8左右，加入终浓度为100μM的Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)，分别在37℃和18℃诱导蛋白质表达。37℃诱导4小时，18℃诱导20小时。诱导结束后，离心收集菌体，用30mM磷酸缓冲液(pH 7.0)重悬菌体，超声破壁，得到细胞破碎液，用SDS-PAGE检测酶的表达量，对细胞破碎液进行高速离心(12000rpm，10min)，制备出粗酶液(粗酶液按照百分比比例直接可以添加入催化反应液中)。
(2)传统方法催化淀粉一步法生产塔格糖
在1L反应液(50mM磷酸氢二钾、5mM硫酸镁、300g/l的淀粉液化液，pH7.0)中分别加入50Uα葡聚糖磷酸化酶(αGP)、50U磷酸葡萄糖变位酶(PGM)、50U葡萄糖磷酸异构酶(PGI)、50U塔格糖六磷酸合成酶(T6PE)、50U 6磷酸塔格糖磷酸酶(T6PP)在60℃催化反应72h后取样通过高效液相色谱法对反应液中塔格糖以及山梨糖进行检测(图1)。
(3)采用葡萄糖六磷酸异构酶(Pgi-R)、塔格糖六磷酸异构酶的(T6PE-P)催化淀粉一步法生产塔格糖
在1L反应液(50mM磷酸氢二钾、5mM硫酸镁、300g/l的淀粉液化液，pH7.0)中分别加入10Uα葡聚糖磷酸化酶(αGP)、10U磷酸葡萄糖变位酶(PGM)、10ml Pgi-R粗酶液、30mlT6PE-P粗酶液、50U 6磷酸塔格糖磷酸酶(T6PP)在60℃催化反应72h后取样通过高效液相色谱法对反应液中塔格糖以及山梨糖进行检测(图2)。
与图1相比，图2中的山梨糖的含量降低了约85％。由此可知，本发明的葡萄糖六磷酸异构酶(Pgi-R)和塔格糖六磷酸异构酶的(T6PE-P)可以有效地降低催化淀粉一步法生产塔格糖过程中副反应的发生。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种淀粉一步法生产塔格糖的生产方法，其特征在于，包括：
在淀粉的反应液中分别加入α葡聚糖磷酸化酶、磷酸葡萄糖变位酶、葡萄糖六磷酸异构酶Pgi-R的粗酶液、塔格糖六磷酸异构酶T6PE-P的粗酶液和6磷酸塔格糖磷酸酶，进行催化反应，即得；
所述葡萄糖六磷酸异构酶Pgi-R的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述塔格糖六磷酸异构酶T6PE-P的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述淀粉的反应液包括：磷酸氢二钾、硫酸镁和淀粉液化液。
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