CN118530944A - 一种诱导干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞和/或多巴胺神经元的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，公开了一种诱导干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞和/或多巴胺神经元的试剂盒及其应用。试剂盒中采用化学成分明确的培养基、化学小分子和细胞因子，不涉及动物源性成分等容易带来批次差异等不稳定因素的物质，并且，价格上相对于已知的商业化的分化培养基便宜，同时，分化周期减少，可以用于临床，弥补了现有分化方法所采用的试剂的不足。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种诱导干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞和/或多巴胺神经元的试剂盒及其应用。
背景技术
帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种是中老年人群常见的神经退行性疾病，临床上的主要表现为静止性震颤、肌强直、运动迟缓及姿势障碍等典型症状，除此之外还表现为一系列其他非运动症状，如语言功能障碍，抑郁等精神疾病。PD的具体病因及发病机制十分复杂，主要病理特征是中脑黑质致密部多巴胺能神经元死亡缺失，纹状体多巴胺分泌不足。目前临床上的主要治疗策略是传统药物治疗，但是药物治疗效果非常有限，只能部分改善患者的运动症状，而不能从根本上达到治疗目的。并且，随着时间的推移，药物的效果会逐渐变差，还经常伴随着非自主运动等严重副作用。而随着干细胞技术的发展和大量干细胞临床实验的开展，细胞疗法在治疗PD等神经退行性疾病中显示出了积极的疗效，有可能成为PD最有效的治疗方式。
多能干细胞(Pluripotent stem cell，PSC)是一类具有无限增殖能力和多种分化潜能的干细胞，可以在体外诱导分化为多巴胺能神经前体细胞，作为一种理想的细胞来源用于PD治疗。目前现有的分化方法很多，但是，均存在一定的局限性如分化效率低，分化时间长，不能得到成熟的功能性神经元。另外，一些分化方法常用Matrigel作为基质胶，或者小鼠成纤维细胞作为滋养层进行神经分化，这些方法引入了动物源性成分，不能用于临床治疗。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种诱导干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞或多巴胺神经元的试剂盒。
本发明第二方面的目的，在于提供第一方面的试剂盒的应用。
本发明第三方面的目的，在于提供一种诱导干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞或多巴胺神经元的方法。
本发明第四方面的目的，在于提供一种多巴胺能神经前体细胞。
本发明第五方面的目的，在于提供一种多巴胺神经元。
本发明第六方面的目的，在于提供一种药物组合物。
本发明第七方面的目的，在于提供本发明第四方面的多巴胺能神经前体细胞、本发明第五方面的多巴胺神经元和/或第六方面的药物组合物的应用。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种诱导干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的试剂盒，包含：第一培养基、第二培养基、第三培养基、第四培养基和第五培养基；
所述第一培养基为含有GSK3β抑制剂、SHH激动剂和以下中的至少一种或至少两种的基础培养基：TGFβ/ALK抑制剂、BMP4抑制剂；
所述第二培养基为含有GSK3β抑制剂、SHH激动剂和以下中的至少一种、至少两种或至少三种的基础培养基：ROCK抑制剂、TGFβ/ALK抑制剂、BMP4抑制剂；
所述第三培养基为含有以下中的至少一种、至少两种或至少三种的基础培养基：BMP4抑制剂、SHH激动剂、生长因子；
所述第四培养基为含有以下中的至少一种或至少两种的基础培养基：SHH激动剂、生长因子；
所述第五培养基为含有以下中的至少一种、至少两种或至少三种的基础培养基：ROCK抑制剂、SHH激动剂、生长因子。
优选地，所述第一培养基为包含TGFβ/ALK抑制剂、BMP4抑制剂、GSK3β抑制剂和SHH激动剂的基础培养基。
优选地，所述第二培养基为包含ROCK抑制剂、TGFβ/ALK抑制剂、BMP4抑制剂、GSK3β抑制剂和SHH激动剂的基础培养基。
优选地，所述第三培养基为包含BMP4抑制剂、SHH激动剂和生长因子的基础培养基。
优选地，所述第四培养基为包含SHH激动剂和生长因子的基础培养基。
优选地，所述第五培养基为包含ROCK抑制剂、SHH激动剂和生长因子的基础培养基。
优选地，所述第一培养基和第二培养基的TGFβ/ALK抑制剂独立选自：SB431542、SB-505、A-83-01、GW6604、IN-1130、Ki26894、LY2157299、LY364947(HTS-466284)、LY550410、LY573636、LY580276、NPC-30345、SB-505124、SD-093、Sm16、SM305、SX-007、Antp-Sm2A、LY2109761中的至少一种。
优选地，所述第一培养基的TGFβ/ALK抑制剂包含SB431542。
优选地，所述TGFβ/ALK抑制剂在所述第一培养基中的浓度为0.2μM～100μM；进一步为1～20μM；更进一步为10μM。
优选地，所述第二培养基中的TGFβ/ALK抑制剂包含SB431542。
优选地，所述TGFβ/ALK抑制剂在所述第二培养基中的浓度为0.2μM～100μM；进一步为1～20μM；更进一步为10μM。
优选地，所述第一培养基、第二培养基和第三培养基的BMP4抑制剂独立选自：dorsomorphin、noggin、LDN-193189、follistatin、chordin、gremlin、DMH1中的至少一种。
优选地，所述第一培养基的BMP4抑制剂包含DMH1。
优选地，所述BMP4抑制剂在所述第一培养基中的浓度为0.2μM～10μM；进一步为1～3μM；更进一步为2μM。
优选地，所述第二培养基的BMP4抑制剂包含DMH1。
优选地，所述BMP4抑制剂在所述第二培养基中的浓度为0.2μM～10μM；进一步为1～3μM；更进一步为2μM。
优选地，所述第三培养基的BMP4抑制剂包含DMH1。
优选地，所述BMP4抑制剂在所述第三培养基中的浓度为0.2μM～10μM；进一步为0.8～1.2μM；更进一步为1μM。
优选地，所述第一培养基和第二培养基的GSK3β抑制剂独立选自：GSK3β抑制剂IX(6-溴靛玉红3’-肟)、SB216763、GSK3β抑制剂VII(4-二溴苯乙酮)、L803-mts、6-bromo-indirubin-3’-oxime(BIO)、TWS119、AZD2858、AR-A014418、TDZD-8、LY2090314、2-D08、IM-12、1-Azakenpaullone、Indirubin、CHIR99021中的至少一种。
优选地，所述第一培养基的GSK3β抑制剂包含CHIR99021。
优选地，所述GSK3β抑制剂在所述第一培养基中的浓度为0.2μM～3μM；进一步为0.2～1μM；更进一步为0.6μM。
进一步优选地，所述第二培养基的GSK3β抑制剂包含CHIR99021。
优选地，所述GSK3β抑制剂在所述第二培养基中的浓度为0.2μM～3μM；进一步为0.2～1μM；更进一步为0.6μM。
优选地，所述第一培养基、第二培养基、第三培养基、第四培养基和第五培养基中的SHH激动剂独立选自：SHH、SHH C25II、SAG，SAG 21K、Hh-Ag1.5、20a-羟基胆固醇、嘌吗啡胺中的至少一种。
优选地，所述第一培养基的SHH激动剂包含SAG。
优选地，所述SHH激动剂在所述第一培养基中的浓度为0.5μM～2.5μM；进一步为1μM～1.75μM；更进一步为1μM。
优选地，所述第二培养基的SHH激动剂包含SAG。
优选地，所述SHH激动剂在所述第二培养基中的浓度为0.5μM～2.5μM；进一步为1μM～1.75μM；更进一步为1μM。
优选地，所述第三培养基的SHH激动剂包含SAG。
优选地，所述SHH激动剂在所述第三培养基中的浓度为0.1μM～1μM；进一步为0.1～0.5μM；更进一步为0.2μM。
优选地，所述第四培养基的SHH激动剂包含SAG。
优选地，所述SHH激动剂在所述第四培养基中的浓度为0.1μM～1μM；进一步为0.1～0.5μM；更进一步为0.2μM。
优选地，所述第五培养基的SHH激动剂包含SAG。
优选地，所述SHH激动剂在所述第五培养基中的浓度为0.1μM～1μM；进一步为0.1～0.5μM；更进一步为0.2μM。
优选地，所述第二培养基和第五培养基的ROCK抑制剂独立选自：Y-27632、HA100、HA1152、Blebbistatin、HA-1077、KD-025、Y-33075、Narciclasine中的至少一种。
进一步优选地，所述第二培养基的ROCK抑制剂包含Y-27632。
优选地，所述ROCK抑制剂在所述第二培养基中的浓度为5～15μM；进一步为10μM。
进一步优选地，所述第五培养基的ROCK抑制剂包含Y-27632。
优选地，所述ROCK抑制剂在所述第五培养基中的浓度为5～15μM；进一步为10μM。
优选地，所述第三培养基、第四培养基和第五培养基的生长因子独立选自：表皮生长因子(EGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子-I(IGF-1)、IGF-Ⅱ、白血病抑制因子(LIF)、神经生长因子(NGF)、抑瘤素M(OSM)、血小板衍生的内皮细胞生长因子(PDECGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)中的至少一种。
进一步优选地，所述第三培养基的生长因子包含成纤维细胞生长因子。
优选地，所述生长因子在所述第三培养基中的浓度为10ng/mL～1mg/mL；进一步为80～120ng/mL；更进一步为100ng/mL。
进一步优选地，所述第四培养基的生长因子包含成纤维细胞生长因子。
优选地，所述生长因子在所述第四培养基中的浓度为10ng/mL～1mg/mL；进一步为80～120ng/mL；更进一步为100ng/mL。
进一步优选地，所述第五培养基的生长因子包含成纤维细胞生长因子。
优选地，所述生长因子在所述第五培养基中的浓度为10ng/mL～1mg/mL；进一步为80～120ng/mL；更进一步为100ng/mL。
更进一步优选地，所述成纤维细胞生长因子包含FGF8b。
优选地，所述第一培养基、第二培养基、第三培养基、第四培养基和第五培养基的基础培养基独立选自IMDM(Iscoves Modified Dulbeccos Medium)培养基、Eagle s BasalMedium(BME)培养基、GMEM培养基、MEM培养基、DMEM培养基，Hams F-12培养基、RPMI1640培养基、Neurobasal培养基中的至少一种。
优选地，所述第一培养基、第二培养基、第三培养基、第四培养基和第五培养基的基础培养基为含有非必须氨基酸和N2添加剂的基础培养基。
优选地，所述非必须氨基酸在所述基础培养基中的浓度为0.2～5％(v/v)；进一步为0.5～2％(v/v)，更进一步为1％(v/v)。
优选地，所述N2添加剂在所述基础培养基中的浓度为0.2～5％(v/v)；进一步为0.5～2％(v/v)，更进一步为1％(v/v)。
优选地，所述第一培养基的基础培养基包含DMEM/F12。
优选地，所述第二培养基的基础培养基包含DMEM/F12。
优选地，所述第三培养基的基础培养基包含DMEM/F12。
优选地，所述第四培养基的基础培养基包含DMEM/F12。
优选地，所述第五培养基的基础培养基包含DMEM/F12。
在本发明中，所述第一培养基和第二培养基用于诱导干细胞分为中脑底板细胞。
在本发明中，所述第三培养基用于诱导中脑底板细胞分化为多巴胺能神经祖细胞。
在本发明中，所述第四培养基和第五培养基用于诱导多巴胺能神经祖细胞分化为多巴胺能神经前体细胞。
优选地，所述干细胞为具有多向分化潜能的干细胞。
优选地，所述具有多向分化潜能的干细胞包含胚胎干细胞、孤雌生殖干细胞、诱导多能干细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞、脐血干细胞中的至少一种；进一步优选地，所述具有多向分化潜能的干细胞包含诱导多能干细胞。
优选地，所述干细胞来源于哺乳动物；进一步来源于灵长类，更进一步来源于人。
优选地，所述干细胞为人胚胎干细胞(hESCs)(例如H1、H9)和/或人诱导多能干细胞(hiPSCs)(例如WC50、IMR90)。
优选地，所述人胚胎干细胞为商业化人胚胎干细胞系。
优选地，所述人胚胎干细胞为未经过体内发育的受精14天以内的人类胚胎分离或者获取的干细胞。
一种诱导干细胞分化为多巴胺神经元的试剂盒，包含：上述诱导干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的试剂盒和第六培养基；所述第六培养基为含有脑源性生长因子(BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、抗坏血酸(AA)、环磷酸腺苷(cAMP)和化合物E(Compound E)的基础培养基。
优选地，所述脑源性生长因子(BDNF)在所述第六培养基中的浓度为1ng/mL～100ng/mL；进一步为15～25ng/mL；更进一步为20ng/mL。
优选地，所述胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)在所述第六培养基中的浓度为1ng/mL～100ng/mL；进一步为15～25ng/mL；更进一步为20ng/mL。
优选地，所述抗坏血酸(AA)在所述第六培养基中的浓度为10μM～1mM；进一步为150～250μM；更进一步为200μM。
优选地，所述环磷酸腺苷(cAMP)在所述第六培养基中的浓度为0.1μM～10μM；进一步为0.5～1.5μM；更进一步为1μM。
优选地，所述化合物E(Compound E)在所述第六培养基中的浓度为0.05μM～1μM；进一步为0.05～0.15μM；更进一步为0.1μM。
优选地，所述第六培养基的基础培养基包含IMDM(Iscoves Modified DulbeccosMedium)培养基、Eagle s Basal Medium(BME)GMEM培养基、MEM培养基、DMEM培养基，HamsF-12培养基、RPMI1640培养基、Neurobasal培养基中的至少一种；进一步优选地，所述第六培养基的基础培养基包含Neurobasal培养基。
优选地，所述第六培养基的基础培养基为含有N2添加剂、非必须氨基酸和B27添加剂的基础培养基。
优选地，所述B27添加剂在所述基础培养基中的浓度为0.2～5％(v/v)；进一步为0.5～2％(v/v)，更进一步为1％(v/v)。
优选地，所述非必须氨基酸在所述基础培养基中的浓度为0.2～5％(v/v)；进一步为0.5～2％(v/v)，更进一步为1％(v/v)。
优选地，所述N2添加剂在所述基础培养基中的浓度为0.2～5％(v/v)；进一步为0.5～2％(v/v)，更进一步为0.5％(v/v)。
在本发明中，第六培养基用于诱导多巴胺能神经前体细胞分化为多巴胺神经元。
优选地，所述诱导干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的试剂盒中还包含第七培养基，所述第七培养基为含有ROCK抑制剂的基础培养基。
优选地，所述ROCK抑制剂在所述第七培养基中的浓度为5～15μM；进一步为10μM。
优选地，所述第七培养基的基础培养基包含IMDM(Iscoves Modified DulbeccosMedium)培养基、Eagle s Basal Medium(BME)培养基、MEM培养基、DMEM培养基，Hams F-12培养基、RPMI1640培养基、Fischers培养基、E8培养基、mTESR培养基、StemFit Basic 03、StemFit Basic 04、NutriStem hPSC XF培养基、StemMACS iPS Brew培养基、Stem-PartnerACF培养基、TeSR-AOF培养基、TeSR2培养基、StemFit完全培养基中的至少一种；进一步包含StemFit完全培养基。
在本发明中，所述第七培养基用于促进干细胞存活。
本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面的试剂盒在(1)～(4)中任一项中的应用；
(1)制备多巴胺能神经前体细胞；(2)制备多巴胺神经元；(3)制备诱导干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的产品；(4)制备诱导干细胞分化为多巴胺神经元的产品。
优选地，所述干细胞为具有多向分化潜能的干细胞。
优选地，所述具有多向分化潜能的干细胞包含胚胎干细胞、孤雌生殖干细胞、诱导多能干细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞、脐血干细胞中的至少一种；进一步优选地，所述具有多向分化潜能的干细胞包含诱导多能干细胞。
优选地，所述干细胞来源于哺乳动物；进一步来源于灵长类，更进一步来源于人。
优选地，所述干细胞为人胚胎干细胞(hESCs)(例如H1、H9)和/或人诱导多能干细胞(hiPSCs)(例如WC50、IMR90)。
优选地，所述人胚胎干细胞为商业化人胚胎干细胞系。
优选地，所述人胚胎干细胞为未经过体内发育的受精14天以内的人类胚胎分离或者获取的干细胞。
本发明的第三个方面，提供一种诱导干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的方法，包含采用本发明第一个方面的诱导干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的试剂盒和/或诱导干细胞分化为多巴胺神经元的试剂盒的步骤。
优选地，所述方法包含如下步骤：
(1)将干细胞用本发明第一个方面的试剂盒中的第一培养基进行第一次培养，然后用本发明第一个方面的试剂盒中的第二培养基重悬，进行第二次培养，得到中脑底板细胞；
(2)将中脑底板细胞用本发明第一个方面的试剂盒中的第三培养基进行第三次培养，得到多巴胺能神经祖细胞；
(3)将多巴胺能神经祖细胞用本发明第一个方面的试剂盒中的第四培养基进行第四次培养，然后用本发明第一个方面的试剂盒中的第五培养基进行第五次培养，得到多巴胺能神经前体细胞。
优选地，步骤(1)中所述第一次培养的时间为6～10天；进一步为7～9天；更进一步为8天。
优选地，步骤(1)中所述第一次培养为贴壁培养；进一步为在包被Vitronectin的培养装置上贴壁培养。
优选地，步骤(1)中所述第二次培养的时间为1～3天；进一步为1.5～2.5天；更进一步为2天。
优选地，步骤(1)中所述第二次培养前还包括消化步骤。
优选地，步骤(1)中所述第二次培养为悬浮培养。
优选地，步骤(2)中所述第三次培养的时间为3～7天；进一步为4～6天；更进一步为5天。
优选地，步骤(2)中所述第三次培养为悬浮培养。
优选地，步骤(3)中所述第四次培养的时间为5～9天；进一步为6～8天；更进一步为7天。
优选地，步骤(3)中所述第四次培养为贴壁培养；进一步为在包被Vitronectin的培养装置上贴壁培养。
优选地，步骤(3)中所述第五次培养的时间为0.5～1.5天；进一步为1天。
优选地，步骤(3)中所述第五次培养前还包括消化步骤。
优选地，步骤(3)中所述第五次培养为悬浮培养。
优选地，步骤(1)中所述干细胞进行第一次培养前还包括如下步骤：用本发明第一个方面的试剂盒中的第七培养基进行第N次培养。
优选地，所述第N次培养的时间为0.5～1.5天；进一步为1天。
优选地，上述培养的条件为32～38℃、4～6％CO2。
一种诱导干细胞分化为多巴胺神经元的方法，包含采用本发明第一个方面的诱导干细胞分化为多巴胺神经元的试剂盒的步骤。
优选地，所述方法包含如下步骤：
(1)将干细胞用本发明第一个方面的试剂盒中的第一培养基进行第一次培养，然后用本发明第一个方面的试剂盒中的第二培养基重悬，进行第二次培养，得到中脑底板细胞；
(2)将中脑底板细胞用本发明第一个方面的试剂盒中的第三培养基进行第三次培养，得到多巴胺能神经祖细胞；
(3)将多巴胺能神经祖细胞用本发明第一个方面的试剂盒中的第四培养基进行第四次培养，然后用本发明第一个方面的试剂盒中的第五培养基进行第五次培养，得到多巴胺能神经前体细胞；
(4)将多巴胺能神经前体细胞用本发明第一个方面的试剂盒中的第六培养基进行第六次培养，得到多巴胺神经元。
优选地，步骤(1)中所述第一次培养的时间为6～10天；进一步为7～9天；更进一步为8天。
优选地，步骤(1)中所述第一次培养为贴壁培养；进一步为在包被Vitronectin的培养装置上贴壁培养。
优选地，步骤(1)中所述第二次培养的时间为1～3天；进一步为1.5～2.5天；更进一步为2天。
优选地，步骤(1)中所述第二次培养前还包括消化步骤。
优选地，步骤(1)中所述第二次培养为悬浮培养。
优选地，步骤(2)中所述第三次培养的时间为3～7天；进一步为4～6天；更进一步为5天。
优选地，步骤(2)中所述第三次培养为悬浮培养。
优选地，步骤(3)中所述第四次培养的时间为5～9天；进一步为6～8天；更进一步为7天。
优选地，步骤(3)中所述第四次培养为贴壁培养；进一步为在包被Vitrovectin的培养装置上贴壁培养。
优选地，步骤(3)中所述第五次培养的时间为0.5～1.5天；进一步为1天。
优选地，步骤(3)中所述第五次培养前还包括消化步骤。
优选地，步骤(3)中所述第五次培养为悬浮培养。
优选地，步骤(4)中所述第六次培养的时间为18～24天；进一步为20～22天；更进一步为21天。
优选地，步骤(4)中所述第六次培养前还包括消化步骤。
优选地，步骤(4)中所述第六次培养为贴壁培养；进一步为在包被Matrigel的培养装置上贴壁培养。
优选地，步骤(1)中所述干细胞进行第一次培养前还包括如下步骤：用本发明第一个方面的试剂盒中的第七培养基进行第N次培养。
优选地，所述第N次培养的时间为0.5～1.5天；进一步为1天。
优选地，上述培养的条件为32～38℃、4～6％CO2。
优选地，所述干细胞为具有多向分化潜能的干细胞。
优选地，所述具有多向分化潜能的干细胞包含胚胎干细胞、孤雌生殖干细胞、诱导多能干细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞、脐血干细胞中的至少一种；进一步优选地，所述具有多向分化潜能的干细胞包含诱导多能干细胞。
优选地，所述干细胞来源于哺乳动物；进一步来源于灵长类，更进一步来源于人。
优选地，所述干细胞为人胚胎干细胞(hESCs)(例如H1、H9)和/或人诱导多能干细胞(hiPSCs)(例如WC50、IMR90)。
优选地，所述人胚胎干细胞为商业化人胚胎干细胞系。
优选地，所述人胚胎干细胞为未经过体内发育的受精14天以内的人类胚胎分离或者获取的干细胞。
本发明的第四个方面，提供一种多巴胺能神经前体细胞，通过本发明第一个方面的诱导干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的试剂盒和/或诱导干细胞分化为多巴胺神经元的试剂盒和/或本发明第三个方面的诱导干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的方法制备得到。
优选地，所述多巴胺能神经前体细胞中OTX2+EN1+细胞的含量为80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上或96％以上；进一步为90.1％。
优选地，所述多巴胺能神经前体细胞中FOXA2+LMX1A+细胞的含量为80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上或96％以上；进一步为87.5％。
优选地，所述多巴胺能神经前体细胞中CD166+细胞的含量为80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上或96％以上；进一步为97.07％。
优选地，所述多巴胺能神经前体细胞中Corin+细胞的含量为80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上或96％以上；进一步为87.74％。
优选地，所述多巴胺能神经前体细胞中CD166+Corin+细胞的含量为80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上或96％以上，进一步为82.42％。
优选地，所述多巴胺能神经前体细胞包含多巴胺能神经前体细胞群。
本发明的第五个方面，提供一种多巴胺神经元，通过本发明第一个方面的诱导干细胞分化为多巴胺神经元的试剂盒和/或本发明第三个方面的诱导干细胞分化为多巴胺神经元的方法制备得到。
优选地，所述多巴胺神经元包含多巴胺神经元群。
本发明的第六个方面，提供一种药物组合物，包含：本发明第四个方面的多巴胺能神经前体细胞和/或本发明第五个方面的多巴胺神经元。
优选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体或辅料。
优选地，所述的药物组合物为液体制剂。
优选地，所述药学上可接受的载体或辅料包括但并不限于：生理盐水、水、细胞缓冲液、脑脊液、复方电解质注射液、林格氏溶液和海藻糖溶液中的至少一种。
优选地，所述水为ddH2O。
优选地，所述细胞缓冲液包含：PBS、HBSS、EBSS、HEPES等常用细胞缓冲液；进一步优选地，所述细胞缓冲液包含：PBS、HBSS中的至少一种。
优选地，所述脑脊液为人工脑脊液。
优选地，所述药物组合物还包含说明书。
优选地，所述说明书记载了所述多巴胺能神经前体细胞和/或所述多巴胺神经元的给药剂量和/或给药次数。
优选地，所述多巴胺能神经前体细胞和/或所述多巴胺神经元的给药剂量为1*105～4*108个/次；进一步为2*105～2*108个/次。
优选地，所述多巴胺能神经前体细胞和/或所述多巴胺神经元的给药次数为1～3次。
优选地，所述药物组合物还包含其他预防和/或治疗神经系统疾病的药物。
优选地，所述神经系统疾病包括神经退行性疾病、神经损伤性疾病中的至少一种；进一步优选地，所述神经系统疾病包括帕金森病、肌萎缩侧索硬化症、阿尔兹海默病、亨廷頓舞蹈病、脊髓损伤、脑卒中、颅内肿瘤、癫痫、颅脑外伤、遗传性神经系统疾病、脑血管病、瘫痪、重症肌无力、多发性硬化、周围神经系统病、神经炎病、脑瘫、抑郁症中的至少一种；更进一步优选地，所述神经系统疾病包括帕金森病、肌萎缩侧索硬化症、脑卒中、颅脑外伤、阿尔兹海默病、脊髓损伤中的至少一种；再进一步优选地，所述神经系统疾病包括帕金森病、肌萎缩侧索硬化症、脑卒中、颅脑外伤中的至少一种。
本发明的第七个方面，提供本发明第四个方面的多巴胺能神经前体细胞、本发明第五个方面的多巴胺神经元、本发明第六个方面的药物组合物的应用。
本发明第四个方面的多巴胺能神经前体细胞和/或本发明第五个方面的多巴胺神经元在构建细胞库中的应用。
本发明第四个方面的多巴胺能神经前体细胞、本发明第五个方面的多巴胺神经元、和/或本发明第六个方面的药物组合物在制备预防和/或治疗神经系统疾病的药物中的应用。
优选地，所述药物还包含说明书。
优选地，所述说明书记载了所述多巴胺能神经前体细胞、所述多巴胺神经元、和/或所述药物组合物的给药剂量和/或给药次数。
优选地，所述多巴胺能神经前体细胞、所述多巴胺神经元、和/或所述药物组合物的给药剂量按多巴胺能神经前体细胞和/或多巴胺神经元计为1*105～4*108个/次；进一步为2*105～2*108个/次。
优选地，所述多巴胺能神经前体细胞、所述多巴胺神经元、和/或所述药物组合物的给药次数为1～3次。
优选地，一种治疗神经系统疾病的方法，包括如下步骤：向受试对象施用本发明第四个方面的多巴胺能神经前体细胞、本发明第五个方面的多巴胺神经元、和/或本发明第六个方面的药物组合物。
优选地，所述多巴胺能神经前体细胞、所述多巴胺神经元、和/或所述药物组合物的给药剂量按多巴胺能神经前体细胞和/或多巴胺神经元计为1*105～4*108个/次；进一步为2*105～2*108个/次。
优选地，所述多巴胺能神经前体细胞、所述多巴胺神经元、和/或所述药物组合物的给药次数为1～3次。
优选的，所述的对象为哺乳动物，更优选为灵长类，更进一步优先为人。
优选地，所述神经系统疾病包括神经退行性疾病、神经损伤性疾病中的至少一种；进一步优选地，所述神经系统疾病包括帕金森病、肌萎缩侧索硬化症、阿尔兹海默病、亨廷頓舞蹈病、脊髓损伤、脑卒中、颅内肿瘤、癫痫、颅脑外伤、遗传性神经系统疾病、脑血管病、瘫痪、重症肌无力、多发性硬化、周围神经系统病、神经炎病、脑瘫、抑郁症中的至少一种；更进一步优选地，所述神经系统疾病包括帕金森病、肌萎缩侧索硬化症、脑卒中、颅脑外伤、阿尔兹海默病、脊髓损伤中的至少一种；再进一步优选地，所述神经系统疾病包括帕金森病、肌萎缩侧索硬化症、脑卒中、颅脑外伤中的至少一种。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒中采用化学成分明确的培养基、化学小分子和细胞因子，不涉及动物源性成分等容易带来批次差异等不稳定因素的物质，并且，价格上相对于已知的商业化的分化培养基便宜，同时，分化周期减少，可以用于临床，弥补了现有分化方法所采用的试剂的不足，所制备得到的多巴胺能神经前体细胞、多巴胺神经元纯度高，适用于细胞移植和相关疾病治疗。
附图说明
图1是人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞以及多巴胺神经元的示意图。
图2是实施例7方法中不同阶段的细胞的形态图：其中，A为D0天(分化的第0天)的细胞形态图；B为D7天的细胞形态图；C为D15天的细胞形态图；D为D20天的细胞形态图；E为D24天的细胞形态图；F为D26天的细胞形态图；G为D40天的细胞形态图；比例尺为200μm。
图3是实施例7中诱导后获得的多巴胺能神经前体细胞免疫荧光染色图：其中，A为DAPI免疫荧光染色图；B为OTX2免疫荧光染色图；C为EN1免疫荧光染色图；D为A、B、C同一视野下免疫荧光染色混合图；E为DAPI免疫荧光染色图；F为FOXA2免疫荧光染色图；G为LMX1A免疫荧光染色图；H为E、F、G同一视野下免疫荧光染色混合图；比例尺为100μm。
图4是实施例7中诱导后获得的多巴胺能神经前体细胞的流式细胞分析图：其中，A是OTX2+细胞的流式结果图；B是FOXA2+细胞的流式结果图；C是LMX1A+细胞的流式结果图；D是CD166+细胞的流式结果图；E是Corin+细胞的流式结果图；F是CD166+Corin+细胞的流式结果图。
图5是不同CHIR99021浓度(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μM，分别对应对比例5、实施例8-1、8-2、7、8-3、8-4)诱导下的分化得到的中脑底板细胞的前中后脑神经标志物(OTX2、En1、HOXA2)荧光定量PCR的相对表达量图。
图6是不同SAG浓度(0、0.5、1、1.25、1.5、1.75μM，分别对应对比例6、实施例9-1、7、9-2、9-3、9-4)诱导下的分化得到的中脑底板细胞的免疫荧光染色图：其中，A为0μM SAG诱导下的分化得到的中脑底板细胞的免疫荧光染色图；B为0.5μM SAG诱导下的分化得到的中脑底板细胞的免疫荧光染色图；C为1μM SAG诱导下的分化得到的mDAP细胞的免疫荧光染色图；D为1.25μM SAG诱导下的分化得到的中脑底板细胞的免疫荧光染色图；E为1.5μM SAG诱导下的分化得到的中脑底板细胞的免疫荧光染色图；F为1.75μM SAG诱导下的分化得到的中脑底板细胞的免疫荧光染色图；红色荧光表示mDAP细胞标志物FOXA2，蓝色荧光表示DAPI，绿色荧光表示PAX6；比例尺为100μm。
图7是不同SAG浓度(0、0.5、1、1.25、1.5、1.75μM，分别对应对比例6、实施例9-1、7、9-2、9-3、9-4)诱导下的分化得到的中脑底板细胞的标志物(FOXA2、PAX6)荧光定量PCR的相对表达量图。
图8是6-OHDA(模型组)与溶媒组(vehicle(1％VC))(对照组)小鼠术后第4周(术后1m)APO旋转结果图：***、***表示p＜0.001(6-OHDA(模型组)在0m、6-OHDA术后2W之间的差异；6-OHDA(模型组)在0m、6-OHDA术后1m之间的差异)；##表示p＜0.01。
图9是6-OHDA(模型组)与溶媒组(vehicle(1％VC))(对照组)小鼠术后第4周(术后1m)转棒实验结果图：***(6-OHDA(模型组)在0m、6-OHDA术后1m之间的差异)、###表示p＜0.001。
图10是细胞移植前(造模后1m)、细胞移植后1m、2m、3m、4m、6m的APO旋转结果的折线图：***(6-OHDA+mDAP在0m、4m之间的差异；6-OHDA+mDAP在0m、6m之间的差异)表示p＜0.001，#(6m时在6-OHDA+mDAP、6-OHDA+溶媒之间的差异)表示p＜0.05。
图11是细胞移植前(造模后1m)、细胞移植后1m、2m、3m、4m、6m的APO旋转结果的柱形图：***(4m时在6-OHDA+mDAP、6-OHDA+溶媒之间的差异，6m时在6-OHDA+mDAP、6-OHDA+溶媒之间的差异)，###表示p＜0.001，$表示p＜0.05。
图12A是造模前0m、细胞移植前(造模后1m)、细胞移植后1m、2m、3m、4m的转棒实验结果图：***(6-OHDA+mDAP在细胞移植前(造模后1m)、细胞移植后4m之间的差异)、###(6-OHDA+mDAP在细胞移植前(造模后1m)、造模前0m之间的差异)表示p＜0.001，*(6-OHDA+mDAP在细胞移植前(造模后1m)、细胞移植后1m之间的差异)表示p＜0.05，$表示p＜0.05。
图12B是造模前0m、细胞移植前(造模后1m)、细胞移植后2m、3m、4m、5m、6m(分别对应图12B中的-1m、0m、2m、3m、4m、5m、6m)：***表示p＜0.001(6-OHDA+mDAP在0m、4m之间的差异；6-OHDA+mDAP在0m、5m之间的差异；6-OHDA+mDAP在0m、6m之间的差异)，##(6m时在6-OHDA+mDAP、6-OHDA+溶媒之间的差异)表示p＜0.01。
图13是细胞移植4个月小鼠脑片免疫荧光染色结果图：其中，A是细胞移植4个月后的脑片连续切片后的免疫荧光染色图；B是细胞移植4个月后的脑片进行stem101&TH&DAPI共染后的原图；C是细胞移植4个月后的脑片进行stem101&TH&DAPI共染后的20×物镜、10×目镜局部放大图(1)；D是细胞移植4个月后的脑片进行stem101&TH&DAPI共染后的60×物镜、10×目镜局部放大图；E是细胞移植4个月后的脑片进行stem101&TH&DAPI共染后的20×物镜、10×目镜局部放大图(2)；F是细胞移植4个月后的脑片进行stem101&TH&DAPI共染后的20×物镜、10×目镜局部放大图中的DAPI染色部分图；G是细胞移植4个月后的脑片进行stem101&TH&DAPI共染后的20×物镜、10×目镜局部放大图中的TH染色部分图；H是细胞移植4个月后的脑片进行stem101&TH&DAPI共染后的20×物镜、10×目镜局部放大图中的stem101染色部分图。
图14是细胞移植6个月后小鼠脑片进行hNCAM和TH的IHC染色的结果图：其中，A是细胞移植6个月后小鼠脑片进行hNCAM的IHC染色图；B是细胞移植6个月后小鼠脑片进行TH的IHC染色图；C是细胞移植6个月后小鼠脑片进行TH的IHC染色图的10×和20×局部放大图。
图15是细胞移植6个月后小鼠脑片进行stem101&TH&DAPI共染后的免疫荧光图：其中，A是细胞移植6个月后小鼠脑片连续切片后的免疫荧光染色图；B是细胞移植6个月后小鼠脑片进行stem101&TH&DAPI共染后的20×局部放大图；C是细胞移植6个月后小鼠脑片进行stem101&TH&DAPI共染后的60×局部放大图；D是细胞移植6个月后小鼠脑片进行stem101&TH&DAPI共染后的20×局部放大图中的DAPI染色部分图；E是细胞移植6个月后小鼠脑片进行stem101&TH&DAPI共染后的20×局部放大图中的TH染色部分图；F是细胞移植6个月后小鼠脑片进行stem101&TH&DAPI共染后的20×局部放大图中的stem101染色部分图；G是细胞移植6个月后小鼠脑片进行stem101&TH&DAPI共染后的60×局部放大图中的DAPI染色部分图；H是细胞移植6个月后小鼠脑片进行stem101&TH&DAPI共染后的60×局部放大图中的TH染色部分图；I是细胞移植6个月后小鼠脑片进行stem101&TH&DAPI共染后的60×局部放大图中的stem101染色部分图，其中局部放大图所指倍数是物镜倍数，目镜倍数都是10×。
图16是细胞移植6个月后小鼠脑片进行PSD95&TH&DAPI共染后的免疫荧光图(60×，所指倍数是物镜倍数，目镜倍数是10×，其中蓝色部分为DAPI染色部分，黄色部分为PSD95染色部分，绿色部分为TH染色部分)。
图17是细胞移植6个月后小鼠脑片进行FOXA2&TH&stem101&DAPI共染后的免疫荧光图：其中，A是细胞移植6个月后小鼠脑片进行FOXA2&TH&stem101&DAPI共染后的免疫荧光原图(4×)；B是细胞移植6个月后小鼠脑片进行FOXA2&TH&stem101&DAPI共染后的20×局部放大图；C是细胞移植6个月后小鼠脑片进行FOXA2&TH&stem101&DAPI共染后的60×局部放大图；D是细胞移植6个月后小鼠脑片进行FOXA2&TH&stem101&DAPI共染后的20×局部放大图中的DAPI染色部分图；E是细胞移植6个月后小鼠脑片进行FOXA2&TH&stem101&DAPI共染后的20×局部放大图中的TH染色部分图；F是细胞移植6个月后小鼠脑片进行FOXA2&TH&stem101&DAPI共染后的20×局部放大图中的FOXA2染色部分图；G是细胞移植6个月后小鼠脑片进行FOXA2&TH&stem101&DAPI共染后的20×局部放大图中的stem101染色部分图；H是细胞移植6个月后小鼠脑片进行FOXA2&TH&stem101&DAPI共染后的60×局部放大图中的DAPI染色部分图；I是细胞移植6个月后小鼠脑片进行FOXA2&TH&stem101&DAPI共染后的60×局部放大图中的TH染色部分图；J是细胞移植6个月后小鼠脑片进行FOXA2&TH&stem101&DAPI共染后的60×局部放大图中的FOXA2染色部分图；K是细胞移植6个月后小鼠脑片进行FOXA2&TH&stem101&DAPI共染后的60×局部放大图中的stem101染色部分图，其中局部放大图所指倍数是物镜倍数，目镜倍数都是10×。
图18是细胞移植6个月后小鼠脑片进行DAPI&stem101&5-HT共染后的免疫荧光图：其中，A是细胞移植6个月后小鼠脑片进行DAPI&stem101&5-HT共染后的免疫荧光原图(4×)；B是细胞移植6个月后小鼠脑片进行DAPI&stem101&5-HT共染后的20×局部放大图；C是细胞移植6个月后小鼠脑片进行DAPI&stem101&5-HT共染后的60×局部放大图；D是细胞移植6个月后小鼠脑片进行DAPI&stem101&5-HT共染后的20×局部放大图的5-HT染色部分图；E是细胞移植6个月后小鼠脑片进行DAPI&stem101&5-HT共染后的20×局部放大图的stem101染色部分图；F是细胞移植6个月后小鼠脑片进行DAPI&stem101&5-HT共染后的20×局部放大图的DAPI染色部分图；G是细胞移植6个月后小鼠脑片进行DAPI&stem101&5-HT共染后的60×局部放大图的5-HT染色部分图；H是细胞移植6个月后小鼠脑片进行DAPI&stem101&5-HT共染后的60×局部放大图的stem101染色部分图；I是细胞移植6个月后小鼠脑片进行DAPI&stem101&5-HT共染后的60×局部放大图的DAPI染色部分图，其中局部放大图所指倍数是物镜倍数，目镜倍数都是10×。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
定义
术语“干细胞”是指能够自我复制并且具有多能性或多潜能性的细胞。通常来说，干细胞可以使受伤组织再生。本文中的干细胞可以是但不限于胚胎干(ES)细胞、诱导多能干细胞或组织干细胞(也称为组织特异性干细胞或体干细胞)。
“胚胎干(ES)细胞”是来源于早期胚胎的多能干细胞。ES细胞最初于1981年建立，其自1989年以来也应用于敲除小鼠的产生。在1998年，建立了人ES细胞，其目前正变得可用于再生医学。
与ES细胞不同，组织干细胞具有有限的分化潜能。组织干细胞存在于组织中的特定位置并且具有未分化的细胞内结构。因此，组织干细胞的多能性通常较低。组织干细胞具有较高的核/质比并具有较少的细胞内细胞器。大多数组织干细胞具有低多能性、长细胞周期和超过个体寿命的增殖能力。基于细胞来源于的部位例如皮肤系统、消化系统、骨髓系统、神经系统等，将组织干细胞分成几类。皮肤系统中的组织干细胞包括表皮干细胞、毛囊干细胞等。消化系统中的组织干细胞包括胰腺(常见)干细胞、肝干细胞等。骨髓系统中的组织干细胞包括造血干细胞、间充质干细胞等。神经系统中的组织干细胞包括神经干细胞、视网膜干细胞等。
“诱导多能干细胞”(通常缩写为iPS细胞或iPSC)是指通过引入某些称为重编程因子的因子由非多能细胞(通常体细胞)或终末分化细胞(例如成纤维细胞、造血细胞、肌细胞、神经元、表皮细胞等)人工制备的多能干细胞类型。
术语“分化”是一种过程，通过该过程，较不特化的细胞形成至少一种更特化的新细胞类型的后代。
术语“基础培养基”属于化学成分确定的培养基，包括但不限于如IMDM(Iscove'sModified Dulbecco'sMedium)培养基、Eagle's Basal Medium(BME)培养基、MEM培养基、DMEM培养基，Ham's F-12培养基、RPMI1640培养基、Fischer's培养基、E8培养基、mTESR培养基、StemFit Basic 03、StemFit Basic 04、NutriStem hPSC XF培养基、StemMACS iPSBrew培养基、Stem-Partner ACF培养基、TeSR-AOF培养基、TeSR2培养基等基础细胞培养基。
术语“SB431542”还包括SB431542及其盐，尤其是药学上可接受的盐。
术语“CHIR99021”包括CHIR99021及其盐，尤其是药学上可接受的盐。
术语“Y-27632”还包括Y-27632及其盐，尤其是药学上可接受的盐。优选的药学上可接受的盐是Y-27632 2HCL。
术语“多巴胺能神经祖细胞”，即“dopaminergic progenitor cell”，神经祖细胞是指具有有限的自我更新能力，能分化成至少两个不同的细胞系的多能干细胞，多巴胺能神经祖细胞是指可以产多巴胺的神经祖细胞。
术语“多巴胺能神经前体细胞”，即“dopaminergic neural precursor cell”，通常是指能够在体外或体内增殖和/或分化为多巴胺能神经元的细胞。多巴胺能神经前体细胞可以来自中脑腹侧神经细胞，可以由多能干细胞分化而来。多巴胺能神经前体细胞也可以从其他细胞类型分化或重编程。本发明中的多巴胺能神经前体细胞可有多巴胺能神经祖细胞经过简单培养后得到，二者在转换前后的标志物表达纯度上区别不大。
术语“中脑底板细胞”，中脑底板细胞是一个神经发育生物学在神经管结构的概念，指神经管中脑段最腹侧的结构，多巴胺神经元发育自中脑底板。对应于神经分化，中脑底板细胞等于多巴胺神经神经祖细胞。
术语“FOXA2”参与胚胎发育、组织特异性基因表达的建立和分化组织中基因表达调控的转录因子。在胚胎发育中是脊索形成所必需的。如本文所用，“Foxa2”是指Uniprot编号：Q9Y261。
术语“PAX6”在眼睛、鼻子、中枢神经系统和胰腺的发育中具有重要功能的转录因子。胰岛α细胞分化所必需。与PAX4竞争结合胰高血糖素、胰岛素和生长抑素启动子中的共同元素。通过建立正确的祖细胞结构域来调节腹侧神经元亚型的规范。如本文所用，“PAX6”是指Uniprot编号：P26367。
术语“OTX2”可能与大脑和感觉器官的发育有关的转录因子。如本文所用，“OTX2”是指Uniprot编号：P32243。
术语：“En1”需要正确形成顶端外胚层脊和正确的肢体背腹模式。如本文所用，“En1”是指Uniprot编号：Q05925。
术语“HOXA2”，在脊椎动物中，编码称为同源盒基因的转录因子类的基因位于四个独立染色体上名为A、B、C和D的簇中。这些蛋白质的表达在胚胎发育过程中受到时空调控。该基因是7号染色体A簇的一部分，编码DNA结合转录因子，可调节基因表达、形态发生和分化。编码的蛋白质可能参与后脑阶段在发育过程中沿前后轴放置在适当位置的过程。如本文所用，“HOXA2”是指Uniprot编号：O43364。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
本实施例中采用的人多能干细胞为人诱导多能干细胞(iPSC)，通过CTSTMCytoTuneTM-iPS2.1仙台病毒重编程试剂盒(货号:A34546)制备得到(具体方法参见说明书)，初始细胞为人成纤维细胞。
实施例1一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的试剂盒
一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的试剂盒，包含：第一培养基、第二培养基、第三培养基、第四培养基和第五培养基；
其中，第一培养基为含有10μM SB431542、2μM DMH1、0.6μM CHIR99021和1μM SAG的神经基础培养基；
第二培养基为含有10μM Y27632、10μM SB431542、2μM DMH1、0.6μM CHIR99021和1μM SAG的神经基础培养基；
第三培养基为含有1μM DMH1、0.2μM SAG和100ng/mL成纤维细胞生长因子8b(FGF8b)的神经基础培养基；
第四培养基为含有0.2μM SAG和100ng/mL FGF8b的神经基础培养基；
第五培养基为含有10μM Y27632、0.2μM SAG和100ng/mL FGF8b的神经基础培养基；
其中，神经基础培养基由以下组分组成：98％(v/v)DMEM/F12(Gibco)、1％(v/v)非必须氨基酸(Non-essential amino acid，Gibco)和1％(v/v)N2添加剂(N2 supplement，Gibco)。
实施例2-1一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的试剂盒
一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的试剂盒，与实施例1中的试剂盒相同，区别仅在于：第一培养基和第二培养基中的CHIR99021的浓度为0.2μM。
实施例2-2一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的试剂盒
一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的试剂盒，与实施例1中的试剂盒相同，区别仅在于：第一培养基和第二培养基中的CHIR99021的浓度为0.4μM。
实施例2-3一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的试剂盒
一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的试剂盒，与实施例1中的试剂盒相同，区别仅在于：第一培养基和第二培养基中的CHIR99021的浓度为0.8μM。
实施例2-4一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的试剂盒
一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的试剂盒，与实施例1中的试剂盒相同，区别仅在于：第一培养基和第二培养基中的CHIR99021的浓度为1.0μM。
实施例3-1一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的试剂盒
一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的试剂盒，与实施例1中的试剂盒相同，区别仅在于：第一培养基和第二培养基中的SAG的浓度为0.5μM。
实施例3-2一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的试剂盒
一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的试剂盒，与实施例1中的试剂盒相同，区别仅在于：第一培养基和第二培养基中的SAG的浓度为1.25μM。
实施例3-3一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的试剂盒
一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的试剂盒，与实施例1中的试剂盒相同，区别仅在于：第一培养基和第二培养基中的SAG的浓度为1.5μM。
实施例3-4一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的试剂盒
一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的试剂盒，与实施例1中的试剂盒相同，区别仅在于：第一培养基和第二培养基中的SAG的浓度为1.75μM。
实施例4一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺神经元的试剂盒
一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺神经元的试剂盒，包含：实施例1的诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的试剂盒和第六培养基；
其中，第六培养基为含有20ng/mL脑源性生长因子(BDNF)、20ng/mL胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、200μM抗坏血酸(AA)、1μM环磷酸腺苷(cAMP)和0.1μM化合物E(CompoundE)的神经分化培养基；
其中，神经分化培养基由以下组分组成：97.5％(v/v)Neurobasal(Gibco)、0.5％(v/v)N2添加剂(N2supplement，Gibco)、1％(v/v)B27添加剂(B27 supplement，Gibco)和1％(v/v)非必须氨基酸(Non-essential amino acid，Gibco)。
实施例5-1一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺神经元的试剂盒
一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺神经元的试剂盒，与实施例4的试剂盒相同，区别仅在于：诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的试剂盒为实施例2-1中的试剂盒。
实施例5-2一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺神经元的试剂盒
一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺神经元的试剂盒，与实施例4的试剂盒相同，区别仅在于：诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的试剂盒为实施例2-2中的试剂盒。
实施例5-3一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺神经元的试剂盒
一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺神经元的试剂盒，与实施例4的试剂盒相同，区别仅在于：诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的试剂盒为实施例2-3中的试剂盒。
实施例5-4一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺神经元的试剂盒
一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺神经元的试剂盒，与实施例4的试剂盒相同，区别仅在于：诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的试剂盒为实施例2-4中的试剂盒。
实施例6-1一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺神经元的试剂盒
一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺神经元的试剂盒，与实施例4的试剂盒相同，区别仅在于：诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的试剂盒为实施例3-1中的试剂盒。
实施例6-2一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺神经元的试剂盒
一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺神经元的试剂盒，与实施例4的试剂盒相同，区别仅在于：诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的试剂盒为实施例3-2中的试剂盒。
实施例6-3一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺神经元的试剂盒
一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺神经元的试剂盒，与实施例4的试剂盒相同，区别仅在于：诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的试剂盒为实施例3-3中的试剂盒。
实施例6-4一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺神经元的试剂盒
一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺神经元的试剂盒，与实施例4的试剂盒相同，区别仅在于：诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的试剂盒为实施例3-4中的试剂盒。
实施例7一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞和多巴胺神经元的方法
一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞以及多巴胺神经元的方法，包含采用实施例4的试剂盒的步骤，具体如下(分化示意图如图1所示)：
(1)诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞：
1)人多能干细胞的培养：
按照约10万每孔的数量将人诱导多能干细胞以团块的形式在预先包被过Laminin的基质上进行铺板，并使用E8完全培养基进行细胞培养，培养过程中每隔4～5天消化传代；
2)多巴胺能神经前体细胞的分化：
S1：分化前一天，将汇合度约为70％～80％的人多能干细胞用TrypLE酶消化成单细胞，将细胞以8000/cm2的密度接种到预先包被过Vitronectin(Gibco)的6孔板中，接种培养基为StemFit完全培养基，并添加10μM Y27632组分以促进干细胞存活；
S2：细胞贴壁生长24h后，将培养基更换为实施例1的试剂盒中的第一培养基(作为分化的第0天，D0)，于37℃、5％CO2的二氧化碳细胞培养箱中培养8天(每两天换液一次)；
S3：在分化的第9天，用Accutase(Innovative)消化细胞，然后用实施例1的试剂盒中的第二培养基重悬细胞，再将1500万细胞接种至T75悬浮培养瓶中，摇晃均匀后，于37℃、5％CO2的二氧化碳细胞培养箱中培养2天，使细胞在悬浮状态中自发形成神经球，得到中脑底板细胞；
S4：在分化的第11天，将培养基更换为实施例1中的试剂盒中的第三培养基，于37℃、5％CO2的二氧化碳细胞培养箱中培养5天(每2.5天换液一次)，得到多巴胺能神经祖细胞；
S5：在分化的第16天，将培养基更换为实施例1中的试剂盒中的第四培养基，并将500万神经球细胞做贴壁处理(贴于Vitrovectin(Gibco)预先包被的T75培养瓶中继续培养)，于37℃、5％CO2的二氧化碳细胞培养箱中培养7天(每2.5天换液一次)；
S6：在分化的第23天，用Accutase(Innovative)消化细胞，然后用实施例1的试剂盒中的第五培养基重悬细胞，再将1500万细胞接种至T75悬浮培养瓶中，摇晃均匀后，于37℃、5％CO2的二氧化碳细胞培养箱中培养一天，使细胞在悬浮状态中自发形成神经球，得到多巴胺能神经前体细胞(mDAP细胞)；
(2)诱导多巴胺能神经前体细胞分化为多巴胺神经元：
在分化的第24天，将步骤(1)得到的多巴胺能神经前体细胞用Accutase消化成单细胞，接种到Matrigel包被过的细胞玻璃爬片上，接种密度为2×105个/cm2，同时将培养基更换为实施例4的试剂盒中的第六培养基，于37℃、5％CO2的二氧化碳细胞培养箱中培养3周(每3.5天换液一次)，得到多巴胺神经元。
实施例8-1一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞和多巴胺神经元的方法
一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺神经元前体细胞以及多巴胺神经元的方法，与实施例7相同，区别仅在于采用实施例5-1的试剂盒。
实施例8-2一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞和多巴胺神经元的方法
一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺神经元前体细胞以及多巴胺神经元的方法，与实施例7相同，区别仅在于采用实施例5-2的试剂盒。
实施例8-3一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞和多巴胺神经元的方法
一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺神经元前体细胞以及多巴胺神经元的方法，与实施例7相同，区别仅在于采用实施例5-3的试剂盒。
实施例8-4一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞和多巴胺神经元的方法
一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺神经元前体细胞以及多巴胺神经元的方法，与实施例7相同，区别仅在于采用实施例5-4的试剂盒。
实施例9-1一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞和多巴胺神经元的方法
一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺神经元前体细胞以及多巴胺神经元的方法，与实施例7相同，区别仅在于采用实施例6-1的试剂盒。
实施例9-2一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞和多巴胺神经元的方法
一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺神经元前体细胞以及多巴胺神经元的方法，与实施例7相同，区别仅在于采用实施例6-2的试剂盒。
实施例9-3一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞和多巴胺神经元的方法
一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺神经元前体细胞以及多巴胺神经元的方法，与实施例7相同，区别仅在于采用实施例6-3的试剂盒。
实施例9-4一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞和多巴胺神经元的方法
一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺神经元前体细胞以及多巴胺神经元的方法，与实施例7相同，区别仅在于采用实施例6-4的试剂盒。
对比例1一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的试剂盒
一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的试剂盒，与实施例1中的试剂盒相同，区别仅在于：第一培养基和第二培养基中的CHIR99021的浓度为0μM。
对比例2一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的试剂盒
一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的试剂盒，与实施例1中的试剂盒相同，区别仅在于：第一培养基和第二培养基中的SAG的浓度为0μM。
对比例3一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺神经元的试剂盒
一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺神经元的试剂盒，与实施例4的试剂盒相同，区别仅在于：诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的试剂盒为对比例1中的试剂盒。
对比例4一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺神经元的试剂盒
一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺神经元的试剂盒，与实施例4的试剂盒相同，区别仅在于：诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的试剂盒为对比例2中的试剂盒。
对比例5一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞和多巴胺神经元的方法
一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺神经元前体细胞以及多巴胺神经元的方法，与实施例7相同，区别仅在于采用对比例3的试剂盒。
对比例6一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞和多巴胺神经元的方法
一种诱导人多能干细胞分化为多巴胺神经元前体细胞以及多巴胺神经元的方法，与实施例7相同，区别仅在于采用对比例4的试剂盒。
效果实施例1使用实施例7方法制备的mDAP细胞检测
1.细胞形态
将实施例7中分化到不同阶段的细胞从培养箱中拿出，显微镜下观察细胞并拍照记录。
D0天的诱导后细胞形态，D7天的诱导后细胞形态，D15天的诱导后细胞形态，D20天的诱导后细胞形态，D24天的诱导后细胞形态，D26天的诱导后细胞形态，D40天的诱导后细胞形态如图2中A～G所示不同诱导天数的细胞形态符合预期的中脑底板细胞阶段、多巴胺能神经祖细胞阶段、多巴胺能神经前体细胞阶段以及多巴胺神经元阶段的形态特征。实施例8-1～实施例9-4中分化到不同阶段的细胞具有类似的形态特征。
2.免疫荧光染色
实施例7中诱导后获得的多巴胺能神经前体细胞，弃上清，PBS洗两遍，加入多聚甲醛室温固定15分钟，PBS清洗三次后，用PBST进行透化(0.2％Triton+PBS)10分钟，PBS清洗一次后加入封闭液(PBST+3％驴血清)室温30分钟后加入OTX2一抗(1:500；R&D)，FOXA2一抗(1:500,R&DAF2400)，EN1一抗(赛默飞，PA5-14149)，LMX1A一抗(Millipore，AB10533)4℃过夜后，PBS清洗3次，加入二抗(1:500；Jackson Lab)，37℃避光孵育1小时，PBS清洗3次后，加入DAPI染核5分钟，PBS清洗三次后进行荧光显微镜观察和避光拍照。
DAPI，OTX2，EN1以及以上3种合并免疫荧光染色情况、DAPI，FOXA2，LMX1A以及以上3种合并免疫荧光染色情况如图3所示：可见OTX2，EN1，FOXA2，LMX1A等细胞干性指标在制备的mDAP细胞表面均有较高表达量，并且其中约90.1％的细胞共表达OTX2和EN1，约87.5％的细胞共表达FOXA2和LMX1A。实施例8-1～实施例9-4中获得的多巴胺能神经前体细胞具有类似的效果。
3.FACS检测
将实施例7诱导得到的mDAP细胞至1.5mL离心管，离心弃去上清液。染色液(含0.5％BSA的PBS缓冲液)重悬后平均分装至7个新的离心管中，每管加入Isotype、OTX2、FOXA2、LMX1A，CD166(CD166抗体，Miltenyi biotech，货号：130-115-547)、Corin抗体以及CD166和Corin混合抗体后混匀后孵育20～30min。加入染色液洗涤一次，离心后弃去上清，用流式细胞仪检测。
实施例7得到的多巴胺能神经前体细胞中OTX2、FOXA2、LMX1A、CD166和/或Corin等细胞干性指标代表的细胞群在总的细胞群中的表达比例的结果如图4所示：特异性表达OTX2标志物的细胞群在总的细胞群中表达比例为97.47％，特异性表达FOXA2标志物的细胞群在总的细胞群中表达比例为86.96％，特异性表达LMX1A标志物的细胞群在总的细胞群中表达比例为99.66％，特异性表达CD166标志物的细胞群在总的细胞群中表达比例为97.07％，特异性表达Corin标志物的细胞群在总的细胞群中表达比例为87.74％，特异性共同表达CD166和Corin标志物的细胞群在总的细胞群中表达比例为82.42％，从实验数据上看：可见，实施例7所述方法制备的mDAP细胞表面为CD166阳性的细胞比例明显高于专利申请US20220333071A1中所制备的中脑多巴胺能神经祖细胞中CD166阳性细胞的比例39.12％，该专利申请中的所定义的多巴胺能神经祖细胞相当于本发明中的多巴胺能神经前体细胞，细胞纯度更高，杂质细胞比例更少，更有利于细胞的移植和相关疾病的治疗；类似地，实施例7所述方法制备的mDAP细胞中特异性共同表达CD166和Corin标志物的细胞群在总的细胞群中比例高于专利申请
US20220333071A1中所制备的中脑多巴胺能神经祖细胞纯度更高，更适合做神经前体细胞的细胞移植和相关疾病治疗。实施例8-1～实施例9-4中获得的多巴胺能神经前体细胞具有类似的效果。
效果实施例2使用实施例7、实施例8-1～8-4、对比例5方法制备的中脑底板细胞检测
1.荧光定量PCR
分别取实施例7、实施例8-1～实施例8-4、对比例5的中脑底板细胞并在D11使用RT-QPCR测定各脑区特异性指标，结果如图5所示。图5中，纵坐标为各组目的基因相对于内参基因GAPDH的表达量的相对值(内参基因GAPDH的基因表达量的值为“1”)，横坐标为不同的CHIR99021使用剂量(分别对应对比例5、实施例8-1～实施例8-2、实施例7、实施例8-3～实施例8-4)。
具体操作方法为：分别取未经诱导iPSC细胞及诱导得到的中脑底板细胞5×105，按照
Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2试剂盒操作说明书进行RNA的提取。提取的RNA经浓度测定后用于下游实验。取RNA 1μg使用HiScriptⅢRT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)反转录试剂盒进行反转录操作。反转录结束后向20μL体系cDNA中加入180μLDNase/RNase Free超纯水作为qPCR模板。取荧光定量96孔板，按荧光定量PCR反应体系成分加入反应体系，96孔板反应体系加入完毕后，使用封口膜封号，于2000rpm离心2min。打开qPCR仪，设置参数：Pre-incubation(预变性),95℃30s。Amplification(扩增).95℃10s,60℃30s，40个循环。参数设置完成后开始qPCR反应。结束后读取数据，根据读取结果使用2-△△CT进行基因相对表达水平计算。以GAPDH为内参基因对比中脑底板细胞中OTX2、En1、HOXA2因子的表达(OTX2为前/中脑标志物(表达量高时，说明细胞属于前脑阶段；表达量下降，表明细胞在发育过程中逐渐从前脑向中脑分化)，EN1为中脑标志物，HOXA2为后脑标志物)。各因子的引物序列如表1所示。
表1各因子PCR引物序列
| Primer(引物) | 序列 |
| OTX2-F1 | AGA GGA GGT GGC ACT GAA AA(SEQ ID NO:1) |
| OTX2-R1 | GCT GTT GTT GCT GTT GTT GG(SEQ ID NO:2) |
| GAPDH-F2 | ATGTTCGTCATGGGTGTGAA(SEQ ID NO:3) |
| GAPDH-R2 | AGGGGTGCTAAGCAGTTGGT(SEQ ID NO:4) |
| FOXA2-F | CCGTTCTCCATCAACAACCT(SEQ ID NO:5) |
| FOXA2-R | GGGGTAGTGCATCACCTGTT(SEQ ID NO:6) |
| HOXA2-F | CGTCGCTCGCTGAGTGCCTG(SEQ ID NO:7) |
| HOXA2-R | TGTCGAGTGTGAAAGCGTCGAGG(SEQ ID NO:8) |
| EN1-F1 | CGTGGCTTACTCCCCATTTA(SEQ ID NO:9) |
| EN1-R1 | TCTCGCTGTCTCTCCCTCTC(SEQ ID NO:10) |
| PAX6-F1 | TGGTATTCTCTCCCCCTCCT(SEQ ID NO:11) |
| PAX6-R1 | TAAGGATGTTGAACGGGCAG(SEQ ID NO:12) |
图5显示3次独立重复试验单批次的前中后脑标志物的RNA相对表达水平，三次重复实验结果表明，当CHIR添加浓度为0μM时，OTX2表达量最高，添加量为1μM时，HOXA2相对表达量最高。随着CHIR99021的浓度的增加(0～1μM)，OTX2表达呈下降趋势，HOXA2的表达呈上升趋势，EN1的表达先上升后下降，意味着随着CHIR99021的添加，细胞命运逐渐后端化，当CHIR99021添加浓度为0.6μM时，EN1相对表达量达到峰值。结果显示当CHIR99021添加浓度为0.6μM时，中脑标志物EN1的相对表达量最高，而前脑标志物OTX2和后脑标志物HOXA2都处于较低水平的表达。因此最优添加浓度为0.6μM。
效果实施例3使用实施例7、实施例9-1～9-4、对比例6方法制备的中脑底板细胞检测
1.免疫荧光染色
方法同效果实施例1
结果和分析：图6显示为不同SAG浓度诱导下的分化得到的中脑底板细胞的免疫荧光染色结果：在没有SAG诱导的情况下，PAX6标志物表达量很高，而在经过SAG诱导以后，PAX6的表达量迅速下降；同时FOXA2的表达量随着SAG使用浓度的增加也逐步增加，直到SAG诱导使用浓度为1μM时，FOXA2的表达量达到最大(其中红色荧光为分化得到的中脑底板细胞标志物FOXA2的免疫荧光染色结果，蓝色荧光为DAPI免疫荧光染色结果，绿色荧光为细胞标志物PAX6的免疫荧光染色结果)；当SAG添加浓度为1μM～1.75μM时，FOXA2阳性细胞的比例可以达到83％以上，SAG诱导使用浓度在1μM～1.75μM均可以实现诱导效果，其最优值为1μM(FOXA2阳性细胞的比例约为85％)。
2.荧光定量PCR
方法同效果实施例2
结果和分析：
不同SAG浓度诱导下，分化得到的中脑底板细胞标志物FOXA2的相对表达量如图7所示：SAG诱导使用浓度最优值为1μM(基于成本和效果考虑)，但是在1μM～1.75μM范围内也可以起到很好的诱导作用，分化得到的细胞高表达FOXA2同时低表达PAX6。
效果实施例4使用实施例7制备得到的多巴胺能神经前体细胞(mDAP细胞)在治疗帕金森病中的应用
1.实验内容
1.1基本信息
样品名称：实施例7制备得到的多巴胺能神经前体细胞(mDAP细胞)；
给药方式：培养在人工脑脊液(ACSF,懋康生物，MX0951)，进行脑立体定位注射；
给药量：1×10^5细胞/μL，注射2μL。
给药持续时间：一次性给药。
1.2实验动物
实验动物情况如表2所示。
表2实验动物
1.3造模信息
小鼠造模信息如表3所示。
表3小鼠造模信息
注：1.♂:指雄性小鼠，♀:指雌性小鼠；2.6-OHDA：6-羟基多巴胺；3.vehicle(1％VC)：溶媒组(1％抗坏血酸)。
1.4细胞移植分组信息
细胞移植分组信息如表4所示。
表4细胞移植分组信息
注：1.♂:指雄性小鼠，♀:指雌性小鼠；2.6-OHDA：6-羟基多巴胺；3.mDAP：多巴胺能神经前体细胞。
1.5结果评估
采用行为学检测方法评估实验结果。
1.6实验步骤
1.6.1小鼠造模及筛选
1)用异氟烷气麻机麻醉小鼠；
2)将麻醉好的小鼠固定在小鼠脑立体定位仪上，使其颅骨面保持水平；头顶部去毛，用碘伏对皮肤进行消毒，在头顶部正中切口，钝性分开头皮及筋膜，暴露骨膜；
3)分别立体定位缓慢注射1uL 6-OHDA(模型组，3mg/mL，溶剂为1％VC)和1uL 1％VC(对照组)进小鼠左脑黑质中；
4)注射后清理创口，确认无出血缝合皮肤，恢复后对小鼠进行常规饲养；
5)术后第4周进行行为学检测，筛选符合标准的成模小鼠；
其中，行为学检测包括APO旋转、转棒实验，具体方法如下：
APO诱导的旋转：小鼠腹腔注射阿扑吗啡(APO)0.5mg/kg，5min后，将小鼠放入20cm直径的圆筒内，视频记录小鼠30min内的运动轨迹，记录30min转圈数；
转棒实验：将小鼠放置于转棒仪上，第一天训练：10s，转速由1rpm升高到10rpm，300s，重复3次；第二天训练：15s，转速由1rpm升高到15rpm，300s，重复3次；第三天正式实验：15s，转速由1rpm升高到15rpm，记录小鼠的掉落时间。
1.6.2细胞移植
1)按表4对成模小鼠进行分组注射，注射位置为脑部的左纹状体；术后(细胞移植后)每月进行一次行为学检测(方法同1.6.1)，持续6个月；
2)在移植细胞4个月、6个月后对小鼠进行取材(主要是血液及脑组织)，对脑组织进行免疫荧光：①将灌注PFA取脑得到的脑组织浸入20％蔗糖至组织沉底(2-3天)。②将脑组织浸入30％蔗糖至组织沉底(2-3天)。③取出已脱水好的脑组织，用OCT胶固定于样品托上，快速冻于-80℃低温保存。④切取所需部位，厚度：40μm。⑤在装有1×PBS缓冲液的6孔板中漂洗后，放置于含有150μL冻存液(1L冻存液：300g蔗糖+400mL 1×PBS缓冲液，然后用乙二醇定容到1L)的96孔板中，-20℃保存。从-20℃冰箱取出脑片，1×PBS缓冲液漂洗3次，5min/次；加入5％驴抗血清(货号SL050，厂家索莱宝)室温封闭1h；加入一抗(鼠抗Stem101一抗，货号Y40400，厂家Takara；兔抗TH一抗，货号AB152，厂家Millipore；山羊抗PSD95一抗，货号ab12093，厂家Abcam；兔抗血清素一抗，厂家Sigma，货号s5545-100μl；山羊抗FOXA2一抗，货号AF2400，厂家R&D)，放入96孔板里，4℃孵育过夜。取出4℃孵育过夜的脑片，回收一抗(4℃保存)，1×PBS缓冲液漂洗3次，5min/次；加入二抗(R(488)驴抗兔二抗，货号A-21206，厂家Invitrogen，对应；G(546)驴抗山羊二抗，货号A-11056，厂家Invitrogen；M(647)驴抗鼠二抗，货号A-31571，厂家Invitrogen)，室温孵育2h；1×PBS缓冲液漂洗3次，5min/次；滴加DAPI(DAPI，货号F6057，厂家Sigma)封片、拍照。
2.实验结果
2.1造模后4周行为学检测结果
2.1.1雌雄SCID beige小鼠阿扑吗啡(APO)诱导的旋转实验结果
术后第4周(术后1m)APO旋转结果如图8所示：模型组(6-OHDA)小鼠旋转次数显著大于对照组(vehicle(1％VC)，溶媒)，表明造模成功。
2.1.2雌雄SCID beige小鼠转棒实验结果
术后第4周(术后1m)转棒实验结果如图9所示：模型组(6-OHDA)小鼠在转棒上停留的时间显著小于对照组(vehicle(1％VC)，溶媒)，表明造模成功。
两种行为学实验后筛选出40只成模小鼠其中随机挑选16只进行下一步分组细胞移植。
2.2细胞移植后6个月行为学检测结果
2.2.1雌雄SCID beige小鼠阿扑吗啡(APO)诱导的旋转实验结果
细胞移植前(造模后1m；对应图10、11中的0m)、细胞移植后1m、2m、3m、4m、6m(对应图10、11中的1m、2m、3m、4m、6m)的APO旋转结果如图10、11所示：在细胞移植6个月后，6-OHDA+mDAP(样品组)小鼠的旋转次数显著低于6-OHDA+ACSF(溶媒)(对照组)；同时，相较于细胞移植前，细胞移植6个月后，6-OHDA+mDAP(样品组)小鼠的旋转次数显著降低，表明移植实施例7制备得到的多巴胺能神经前体细胞后显著(具有统计学显著性差异，p<0.001)改善了模型小鼠的偏瘫性旋转行为。
2.2.2雌雄SCID beige小鼠转棒实验结果
造模前0m、细胞移植前(造模后1m)、细胞移植后1m、2m、3m、4m的转棒实验结果如图12A所示：在细胞移植4个月后，6-OHDA+mDAP(样品组)小鼠在转棒上停留的时间显著高于6-OHDA+ACSF(对照组)；同时，相较于细胞移植前，细胞移植4个月后，6-OHDA+mDAP(样品组)小鼠在转棒上停留的时间显著提高，造模前0m、细胞移植前(造模后1m)、细胞移植后2m、3m、4m、5m、6m(分别对应图12B中的-1m、0m、2m、3m、4m、5m、6m)的转棒实验结果如图12B所示,表明移植实施例7制备得到的多巴胺能神经前体细胞后显著改善了模型小鼠的姿势步态障碍行为。
3.2.3细胞移植4个月小鼠脑切片免疫荧光染色结果
对细胞移植4个月后小鼠的脑组织冠状冰冻切片进行stem101(红，图13中H)&TH(绿，图13中G)&DAPI(蓝，图13中F)的共染(图13中B为脑片原图，图13中C和图13中E为图13中B的20×物镜、10×目镜局部放大图，图13中D为图13中B的60×物镜、10×目镜局部放大图)。确认细胞移植后4个月，移植细胞的存活及定向分化情况。可看到移植细胞有较多存活且部分定向分化成了多巴胺能神经元。(图13中A从左往右分别是移植细胞后的脑片连续切片后的免疫荧光染色图)。
3.2.4细胞移植6个月小鼠脑切片免疫荧光染色和免疫组化结果
对细胞移植6个月后小鼠的脑组织冠状冰冻切片进行hNCAM的免疫组化(IHC)染色(一抗孵育：从-20℃冰箱取出脑片，以免疫组化笔圈出组织，加入3％H2O2避光反应15min；1×PBS缓冲液漂洗3次，5min/次；加入5％驴抗血清室温封闭1h；加入hNCAM一抗(Sc-106，Abcam)或TH一抗(millipore，AB152)，放入湿盒中，4℃孵育过夜。取出4℃孵育过夜的脑片，回收一抗(4℃保存)，1×PBS缓冲液漂洗3次，5min/次；加入二抗5％驴抗鼠血清室温孵育1h；1×PBS缓冲液漂洗3次，5min/次；加入DAB显色液显色，能看到明显的显色反应时，1×PBS缓冲液漂洗3次，5min/次，以终止反应；室温下晾干脑片，过夜，完全晾干的脑片呈白色。)，确定mDAP细胞注射后6个月存留的移植人源细胞数量，结果如图14所示：可看到移植细胞在红框位置有较多存活，并大量分化为了多巴胺能神经元；对细胞移植6个月后小鼠的脑组织冠状冰冻切片进行stem101(红)&TH(绿)&DAPI(蓝)的免疫荧光共染确认细胞移植后6个月残留的移植细胞量及分化的多巴胺能神经元的数量水平，结果如图15所示：可看到移植细胞有较多存活且部分定向分化成了多巴胺能神经元；对细胞移植6个月后小鼠的脑组织冠状冰冻切片进行PSD95(黄)&TH(绿)&DAPI(蓝)的共染，结果如图16所示：可以看出分化的多巴胺能神经元之间产生突触连结；对细胞移植6个月后小鼠的脑组织冠状冰冻切片进行FOXA2(黄)&TH(绿)&stem101(红)&DAPI(蓝)的共染，结果如图17所示：可以看出注射入脑内的mDAP细胞大部分都能与FOXA2共标，有分化为多巴胺能神经元的潜力；对细胞移植6个月后小鼠的脑组织冠状冰冻切片进行DAPI(蓝)&stem101(红)&5-HT(绿)的共染，确定DAP细胞分化成非分化特异性的5-HT神经元的含量，结果如图18所示：可以看出非分化特异性的5-HT神经元没有跟移植的mDAP共染到，说明mDAP纯度非常高，分化特异性非常强，没有分化成非预期分化的5-HT神经元。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种试剂盒，包含：第一培养基、第二培养基、第三培养基、第四培养基和第五培养基；所述第一培养基为含有GSK3β抑制剂、SHH激动剂和以下中的至少一种或至少两种的基础培养基：TGFβ/ALK抑制剂、BMP4抑制剂；
所述第二培养基为含有GSK3β抑制剂、SHH激动剂和以下中的至少一种、至少两种或至少三种的基础培养基：ROCK抑制剂、TGFβ/ALK抑制剂、BMP4抑制剂；
所述第三培养基为含有以下中的至少一种、至少两种或至少三种的基础培养基：BMP4抑制剂、SHH激动剂、生长因子；
所述第四培养基为含有以下中的至少一种或至少两种的基础培养基：SHH激动剂、生长因子；
所述第五培养基为含有以下中的至少一种、至少两种或至少三种的基础培养基：ROCK抑制剂、SHH激动剂、生长因子。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：
所述第一培养基和第二培养基的TGFβ/ALK抑制剂独立选自：SB431542、SB-505、A-83-01、GW6604、IN-1130、Ki26894、LY2157299、LY364947、LY550410、LY573636、LY580276、NPC-30345、SB-505124、SD-093、Sm16、SM305、SX-007、Antp-Sm2A、LY2109761中的至少一种；
优选地，所述第一培养基、第二培养基和第三培养基的BMP4抑制剂独立选自：dorsomorphin、noggin、LDN-193189、follistatin、chordin、gremlin、DMH1中的至少一种；优选地，所述第一培养基和第二培养基的GSK3β抑制剂独立选自：GSK3β抑制剂IX、SB216763、GSK3β抑制剂VII、L803-mts、6-bromo-indirubin-3’-oxime、TWS119、AZD2858、AR-A014418、TDZD-8、LY2090314、2-D08、IM-12、1-Azakenpaullone、Indirubin、CHIR99021中的至少一种；
优选地，所述第一培养基、第二培养基、第三培养基、第四培养基和第五培养基中的SHH激动剂独立选自：SHH、SHH C25II、SAG，SAG 21K、Hh-Ag1.5、20a-羟基胆固醇、嘌吗啡胺中的至少一种；
优选地，所述第二培养基和第五培养基的ROCK抑制剂独立选自：Y-27632、HA100、HA1152、Blebbistatin、HA-1077、KD-025、Y-33075、Narciclasine中的至少一种；
优选地，所述第三培养基、第四培养基和第五培养基的生长因子独立选自：表皮生长因子、血小板衍生的生长因子、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子-I、IGF-Ⅱ、白血病抑制因子、神经生长因子、抑瘤素M、血小板衍生的内皮细胞生长因子、转化生长因子-α、血管内皮细胞生长因子中的至少一种；
优选地，所述第一培养基、第二培养基、第三培养基、第四培养基和第五培养基的基础培养基独立选自IMDM培养基、Eagle s BasalMedium培养基、GMEM培养基、MEM培养基、DMEM培养基，Hams F-12培养基、RPMI1640培养基、Neurobasal培养基中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：
所述试剂盒还包含：第六培养基，所述第六培养基为含有脑源性生长因子、胶质细胞源性神经营养因子、抗坏血酸、环磷酸腺苷和化合物E的基础培养基；
优选地，所述第六培养基的基础培养基包含IMDM培养基、BME培养基，GMEM培养基、MEM培养基、DMEM培养基，Hams F-12培养基、RPMI1640培养基、Neurobasal培养基的至少一种。
4.权利要求1～3所述的试剂盒在(1)～(4)中任一项中的应用；
(1)制备多巴胺能神经前体细胞；(2)制备多巴胺神经元；(3)制备诱导干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的产品；(4)制备诱导干细胞分化为多巴胺神经元的产品。
5.如下a1)～a2)中任一种方法：
a1)一种诱导干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的方法，包含采用权利要求1～3任一项所述的试剂盒的步骤；
a2)一种诱导干细胞分化为多巴胺神经元的方法，包含采用权利要求1～3任一项所述的试剂盒的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
a1)中所述诱导干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的方法包含如下步骤：
(1)将干细胞用权利要求1～3任一项所述的试剂盒中的第一培养基进行第一次培养，然后用权利要求1～3任一项所述的试剂盒中的第二培养基重悬，进行第二次培养，得到中脑底板细胞；
(2)将中脑底板细胞用权利要求1～3任一项所述的试剂盒中的第三培养基进行第三次培养，得到多巴胺能神经祖细胞；
(3)将多巴胺能神经祖细胞用权利要求1～3任一项所述的试剂盒中的第四培养基进行第四次培养，然后用权利要求1～3任一项所述的试剂盒中的第五培养基进行第五次培养，
得到多巴胺能神经前体细胞；
或a2)中所述诱导干细胞分化为多巴胺神经元的方法包含如下步骤：
(1)将干细胞用权利要求1～3任一项所述的试剂盒中的第一培养基进行第一次培养，然后用权利要求1～3任一项所述的试剂盒中的第二培养基重悬，进行第二次培养，得到中脑底板细胞；
(2)将中脑底板细胞用权利要求1～3任一项所述的试剂盒中的第三培养基进行第三次培养，得到多巴胺能神经祖细胞；
(3)将多巴胺能神经祖细胞用权利要求1～3任一项所述的试剂盒中的第四培养基进行第四次培养，然后用权利要求1～3任一项所述的试剂盒中的第五培养基进行第五次培养，得到多巴胺能神经前体细胞；
(4)将多巴胺能神经前体细胞用权利要求3所述的试剂盒中的第六培养基进行第六次培养，得到多巴胺神经元；
优选地，a1)或a2)的步骤(1)中所述第一次培养的时间为6～10天；
优选地，a1)或a2)的步骤(1)中所述第二次培养的时间为1～3天；
优选地，a1)或a2)的步骤(2)中所述第三次培养的时间为3～7天；
优选地，a1)或a2)的步骤(3)中所述第四次培养的时间为5～9天；
优选地，a1)或a2)的步骤(3)中所述第五次培养的时间为0.5～1.5天；
优选地，a2)的步骤(4)中所述第六次培养的时间为18～24天。
7.一种多巴胺能神经前体细胞，通过权利要求1～3中任一项所述的试剂盒和/或权利要求5～6中任一项所述诱导干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞的方法制备得到；
优选地，所述多巴胺能神经前体细胞中OTX2+EN1+细胞的含量大于80％；
优选地，所述多巴胺能神经前体细胞中FOXA2+LMX1A+细胞的含量大于80％；
优选地，所述多巴胺能神经前体细胞中CD166+细胞的含量大于80％；
优选地，所述多巴胺能神经前体细胞中Corin+细胞的含量大于80％。
8.一种多巴胺神经元，通过权利要求1～3中任一项所述的试剂盒和/或权利要求5～6中任一项所述诱导干细胞分化为多巴胺神经元的方法制备得到。
9.一种药物组合物，包含：权利要求7所述的多巴胺能神经前体细胞和/或权利要求8所述的多巴胺神经元；
优选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体或辅料；
优选地，所述药物组合物还包含其他预防和/或治疗神经系统疾病的药物。
10.如下b1)～b2)中任一种应用：
b1)权利要求7所述的多巴胺能神经前体细胞和/或权利要求8所述的多巴胺神经元在构建细胞库中的应用；
b2)权利要求7所述的多巴胺能神经前体细胞、权利要求8所述的多巴胺神经元和/或权利要求9所述的药物组合物在制备防治神经系统疾病的药物中的应用。
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