CN118530376B - 一种具有修复抗皱活性的弹性蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种具有修复抗皱活性的弹性蛋白及其制备方法与应用，涉及重组蛋白技术领域，旨在解决现有人造类弹性蛋白的修复及抗皱效果不佳的技术问题。所述兼具修复和抗皱活性的类弹性蛋白，所述兼具修复和抗皱活性的类弹性蛋白是将层粘连蛋白通过柔性linker连接在初始类弹性蛋白的N端或C端所获得的；所述层粘连蛋白的蛋白序列如SEQ ID No.9所示。
Description
技术领域
本申请涉及重组蛋白技术领域，尤其涉及一种具有修复抗皱活性的弹性蛋白及其制备方法与应用。
背景技术
弹性蛋白在医学、美容、化妆品和保健品等领域有广泛的应用前景，但是天然提取的弹性蛋白难点在于蛋白纯度低，分子量大，且不均一，难以形成规模化生产。经动物提取的产品则有产品纯度低、具有携带病毒的风险、免疫原性的风险、成本高等局限性。
人造类弹性蛋白与天然弹性蛋白相似，具有良好的细胞相容性，在体内可降解为天然氨基酸，免疫排斥反应低，近几年，人造类弹性蛋白已成为生物医学材料领域的一大亮点。随着ELP广泛的使用价值的日益显现，人造类弹性蛋白在异源体内的高通量表达成为应用的瓶颈问题之一。
发明内容
本申请提供了一种具有修复抗皱活性的弹性蛋白及其制备方法与应用，至少解决了现有人造类弹性蛋白的修复及抗皱效果不佳的技术问题。
为解决上述技术问题，本申请实施例提供了：一种兼具修复和抗皱活性的类弹性蛋白，所述兼具修复和抗皱活性的类弹性蛋白是将层粘连蛋白通过柔性linker连接在初始类弹性蛋白的N端或C端所获得的；所述层粘连蛋白的蛋白序列如SEQ ID No.9所示。
作为本申请一些可选实施方式，当所述初始类弹性蛋白的核苷酸序列表达如SEQID No.6所示时，所述兼具修复和抗皱活性的类弹性蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示；
当所述初始类弹性蛋白的核苷酸序列表达如SEQ ID No.4所示时，所述兼具修复和抗皱活性的类弹性蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示；
当所述初始类弹性蛋白的核苷酸序列表达如SEQ ID No.5所示时，所述兼具修复和抗皱活性的类弹性蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.14所示。
作为本申请一些可选实施方式，所述SEQ ID No.10所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列表达如SEQ ID No.11所示；
所述SEQ ID No.12所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列表达如SEQ ID No.13所示；
所述SEQ ID No.14所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列表达如SEQ ID No.15所示。
再一方面，本申请实施例提供了一种具有抗皱活性的类弹性蛋白，所述初始类弹性蛋白的蛋白序列为［VPGKG（VPGVG）8VPGFG］n，n数目为≥1；所述初始类弹性蛋白的核苷酸序列表达如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6任一项所示。
作为本申请一些可选实施方式，所述n数目为2、4和8；
当n数目为2时，所述人造类弹性蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；
当n数目为4时，所述人造类弹性蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；
当n数目为8时，所述人造类弹性蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
作为本申请一些可选实施方式，所述SEQ ID No.1所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列表达如SEQ ID No.4所示；
所述SEQ ID No.2所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列表达如SEQ ID No.5所示；
所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列表达如SEQ ID No.6所示。
再一方面，本申请实施例提供了一种如上所述兼具修复和抗皱活性的类弹性蛋白的制备方法，包括以下步骤：
选择LN-5目标基因序列，并将所述LN-5目标基因序列通过柔性linker（GGGGS）3连接至重组弹性蛋白的N端，其中，所述重组弹性蛋白包括重组弹性蛋白ELP2、重组弹性蛋白ELP4或重组弹性蛋白ELP8；获得如SEQ ID No.10、SEQ ID No.12或SEQ ID No.14所示的修复性重组弹性蛋白序列；基于所述修复性重组弹性蛋白序列进行优化设计，获得如SEQ IDNo.11、SEQ ID No.13或SEQ ID No.15所示的核苷酸序列；
再基于如SEQ ID No.11、SEQ ID No.13或SEQ ID No.15所示的核苷酸序列，获得修复性重组人弹性蛋白重组质粒，将所述修复性重组人弹性蛋白重组质粒进行毕赤酵母电转化处理，并培养至出现单菌落，筛选获得高拷贝重组酵母工程菌株；将高拷贝重组酵母工程菌株进行诱导表达，获得表达目的蛋白；将所述表达目的蛋白进行纯化处理，获得兼具修复和抗皱活性的类弹性蛋白。
再一方面，本申请实施例提供了一种如上所述具有抗皱活性的类弹性蛋白的制备方法，包括以下步骤：
基于如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示类弹性蛋白的蛋白序列进行优化设计，分别获得如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；再基于如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的重组类弹性蛋白基因序列，获得重组类弹性蛋白质粒，即pPIC9K-ELP2、pPIC9K-ELP4和pPIC9K-ELP8；
将pPIC9K-ELP2、pPIC9K-ELP4和pPIC9K-ELP8进行毕赤酵母电转化处理，并培养至出现单菌落，筛选获得高拷贝重组酵母工程菌株；将高拷贝重组酵母工程菌株进行诱导表达，分别获得表达目的蛋白ELP2、表达目的蛋白ELP4和表达目的蛋白ELP8；
将表达目的蛋白ELP2、表达目的蛋白ELP4和表达目的蛋白ELP8进行纯化处理，获得重组弹性蛋白ELP2、重组弹性蛋白ELP4和重组弹性蛋白ELP8。
再一方面，本申请实施例提供了一种如上所述兼具修复和抗皱活性的类弹性蛋白的应用，将所述兼具修复和抗皱活性的类弹性蛋白应用于制备护肤品；
由所述兼具修复和抗皱活性的类弹性蛋白制备的护肤品促Hacat细胞贴壁比活性为28500U/mg；
由所述兼具修复和抗皱活性的类弹性蛋白制备的护肤品促细胞增殖比活性为59500U/mg；
由所述兼具修复和抗皱活性的类弹性蛋白制备的护肤品促Hacat细胞迁移活性为46.40%。
再一方面，本申请实施例提供了一种如上所述具有抗皱活性的类弹性蛋白的应用，将所述初始类弹性蛋白应用于制备护肤品；
由所述初始类弹性蛋白制备的护肤品促Hacat细胞贴壁比活性为3000U/mg~6400U/mg；
由所述初始类弹性蛋白制备的护肤品促细胞增殖比活性为2460U/mg~9600U/mg；
由所述初始类弹性蛋白制备的护肤品促Hacat细胞迁移活性为26.57%。
市场上已有天然提取的弹性蛋白销售，是从水鲣鱼中提取，天然提取的弹性蛋白，分子量大，且不均一，但也具有一定的功效。天然提取的难点在于蛋白纯品含量有限，且难以形成规模化生产。经动物提取的产品则有产品纯度低、具有携带病毒的风险、免疫原性的风险、成本高等局限性。因此，通过基因工程技术在原核微生物或真核微生物中表达、制备高纯度的人源化弹性蛋白则是必要的。本申请利用基因工程技术重组表达层粘连蛋白功能片段和弹性蛋白结构域片段，获得了一种可修复性弹性蛋白。经过体外细胞验证和人体功效验证，可修复性弹性蛋白同时具有的层粘连蛋白和弹性蛋白的功效，有明显提高细胞增殖、促细胞粘附和促细胞迁移活性。可以应用于生物护肤领域，有明显的抗皱修复功效。即本申请提供一种毕赤酵母表达的人弹性蛋白与层粘连蛋白的融合蛋白，并利用连接短肽linker（GGGGS）串联表达弹性蛋白五肽重复片段序列和层粘连蛋白结构域功能区片段序列。利用毕赤酵母表达无内毒素、产率高、培养基简单、表达蛋白稳定且可分泌至胞外易于纯化，同时具有将异源蛋白进行正确加工、修饰、合理的空间折叠等功能。所以使用酵母表达异源蛋白具有较大优势。本申请的融合蛋白肽同时具有弹性蛋白和层粘连蛋白功效，有明显促细胞增殖、促细胞粘附和促细胞迁移活性。
附图说明
为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
图1为ELP2高拷贝菌株表达量鉴定结果图；
图2为ELP4和ELP8高拷贝菌株表达量鉴定结果图；
图3为重组弹性蛋白ELP2、ELP4和ELP8纯化结果图；
图4为修复性ELP8-LN-5高拷贝菌株表达量鉴定结果图；
图5为修复性ELP8-LN-5纯化结果图；
图6为重组弹性蛋白促Hacat细胞贴壁活性结果图；
图7为重组弹性蛋白促细胞增殖活性结果图；
图8为修复性ELP8-LN-5促Hacat细胞贴壁和NIH 3T3细胞增殖活性结果图；
图9为修复性ELP8-LN-5促Hacat细胞迁移活性结果图；
图10为受试者使用样品后眼部鱼尾纹部位皱纹变化结果图；
图11为受试者使用样品后皮肤皱纹面积结果图；
图12为受试者使用样品后皮肤弹性R2值结果图；
图13为受试者使用样品后皮肤角质层含水量结果图；
图14为受试者使用样品后皮肤经表皮水分流失TWEL值结果图。
本申请目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
弹性蛋白（elastin）属于细胞外基质蛋白(extracellular matrix，ECM)，主要分布于血管、皮肤、韧带和肺等组织器官。弹性蛋白能够提供足够的弹性和恢复力，为组织提供拉伸和恢复其原始形状的 能力。弹性蛋白是一种巨大、复杂的、疏水性的蛋白，弹性蛋白不易被普通的蛋白酶降解，但能够被其它特殊的蛋白酶降解，如基质金属蛋白酶、组织蛋白酶等。弹性蛋白原通过化学方式降解，变成弹性蛋白多肽。弹性蛋白的可溶性前体称为原弹性蛋白（tropoelastin），原弹性蛋白经过自凝聚，交联成不可溶的渔网状结构，称为弹性蛋白。这使得从动物组织中提取弹性蛋白非常困难，这需要分解弹性蛋白分子进行释放，每个原弹性蛋白分子具有36个随机排列的结构域，具有交替的疏水性和亲水性结构域，且异源提取的天然弹性蛋白对人体有一定的排斥反应，同时具有潜在的携带病原体危害人体的风险。
重组弹性蛋白是原弹性蛋白的疏水结构域衍生来的循环重复氨基酸序列，是一种经过人工改造的、具有弹性且随温度变化会发生相变的基因工程多肽，在结构上主要由VPGⅩG五肽段单元串联重复组成，Xaa客座子是除脯氨酸外的任何氨基酸。现有的研究已经表明此多肽序列像原弹性蛋白一样具有生物学活性，即促进细胞粘附特性和细胞增殖能力，有希望成为新型的生物医学材料和生物护肤类原材料。
层粘连蛋白（laminin，LN）是由α、β、γ3条链通过二硫键结合而形成的大分子粘附糖蛋白家族中的成员，为基底膜结构的成分之一。LN至今为止已经知道有15个异三聚体，其中曾被命名为kalinin、epiligrin、nicein的层粘连蛋白-5（LN-5），作为上皮基底膜的主要组成蛋白，对上皮细胞与基底膜之间的稳定结合起着重要作用，与其他已知的ECM相比，LN-5具有更强的促进细胞粘附、迁移以及扩散的能力。据目前所知由于皮肤真皮层的细胞外基质变形导致皮肤皱纹增加和弹性减少，并且影响表皮与真皮之间的基底膜的结构及功能变化或皮肤老化。在基底膜结构成分中的层粘连蛋332（5）起到通过坚固地固定表皮和真皮来向表皮与真皮之间赋予安全性的必要作用。
因此，本申请通过将弹性蛋白与层粘连蛋白融合表达获得一种可修复性弹性蛋白，促进其促细胞增殖、促细胞粘附活性和促迁移活性，使其达到除皱和修复效果。
本申请提供一种毕赤酵母表达的人弹性蛋白与层粘连蛋白的融合蛋白，并利用连接短肽linker（GGGGS）串联表达弹性蛋白五肽重复片段序列和层粘连蛋白结构域功能区片段序列。利用毕赤酵母表达无内毒素、产率高、培养基简单、表达蛋白稳定且可分泌至胞外易于纯化，同时具有将异源蛋白进行正确加工、修饰、合理的空间折叠等功能。所以使用酵母表达异源蛋白具有较大优势。本申请的融合蛋白肽同时具有弹性蛋白和层粘连蛋白功效，有明显促细胞增殖、促细胞粘附和促细胞迁移活性。
为便于本领域技术人员理解，下面对本申请所述技术方案中所涉及的序列进行罗列：
SEQ ID No.1：
VPGKGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGFGVPGKGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGFG-
SEQ ID No.2：
VPGKGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGFGVPGKGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGFGVPGKGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGFGVPGKGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGFG-
SEQ ID No.3：
VPGKGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGFGVPGKGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGFGVPGKGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGFGVPGKGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGFGVPGKGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGFGVPGKGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGFGVPGKGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGFGVPGKGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGFG-
SEQ ID No.4：
GTTCCAGGCAAAGGCGTCCCCGGCGTGGGGGTACCTGGTGTCGGTGTACCCGGTGTCGGTGTCCCTGGCGTCGGTGTTCCGGGTGTTGGCGTACCAGGTGTGGGAGTCCCAGGAGTAGGCGTGCCTGGGGTTGGAGTGCCCGGATTTGGAGTGCCGGGGAAGGGAGTCCCGGGGGTTGGGGTTCCCGGGGTTGGGGTACCCGGAGTAGGCGTACCTGGCGTAGGTGTGCCGGGGGTTGGAGTTCCAGGAGTGGGAGTACCTGGGGTGGGCGTCCCAGGTGTGGGGGTCCCGGGCTTCGGTTAA
SEQ ID No.5：
GTGCCCGGAAAAGGGGTCCCAGGCGTAGGAGTGCCTGGCGTGGGGGTTCCTGGAGTAGGTGTACCAGGAGTCGGAGTCCCAGGCGTTGGGGTCCCGGGGGTTGGTGTGCCTGGCGTCGGAGTCCCCGGTGTGGGGGTTCCGGGATTTGGTGTGCCCGGCAAGGGAGTCCCGGGTGTTGGTGTCCCAGGAGTCGGAGTACCTGGAGTTGGTGTTCCAGGGGTAGGGGTTCCGGGCGTGGGAGTCCCAGGGGTAGGTGTTCCAGGTGTAGGTGTGCCTGGGGTTGGCGTTCCCGGATTCGGTGTGCCCGGTAAAGGTGTCCCGGGCGTGGGGGTTCCGGGAGTGGGAGTCCCTGGCGTGGGAGTGCCTGGCGTAGGCGTGCCGGGTGTAGGGGTACCAGGGGTAGGAGTCCCTGGCGTTGGCGTTCCGGGTGTAGGTGTGCCCGGGTTCGGCGTCCCCGGTAAGGGGGTTCCTGGCGTTGGTGTCCCAGGGGTCGGGGTCCCCGGAGTAGGCGTACCCGGGGTAGGAGTGCCAGGGGTAGGCGTGCCGGGGGTAGGTGTTCCTGGCGTTGGAGTCCCGGGCGTAGGGGTGCCCGGTTTTGGCTAA
SEQ ID No.6：
GTACCTGGAAAGGGCGTACCCGGGGTAGGTGTTCCCGGCGTCGGGGTGCCAGGCGTCGGCGTCCCAGGTGTGGGTGTCCCAGGTGTTGGTGTTCCTGGTGTTGGAGTTCCCGGTGTGGGCGTCCCAGGCGTCGGTGTCCCAGGCTTCGGGGTCCCTGGAAAAGGAGTTCCAGGAGTCGGCGTTCCGGGGGTTGGTGTCCCTGGCGTTGGCGTGCCAGGCGTCGGGGTCCCTGGAGTGGGTGTACCCGGAGTCGGTGTTCCAGGCGTCGGCGTCCCAGGGGTCGGAGTCCCGGGTTTTGGAGTTCCTGGTAAGGGGGTCCCGGGGGTGGGAGTGCCTGGAGTAGGAGTGCCAGGCGTTGGGGTTCCCGGTGTCGGAGTACCGGGTGTGGGCGTACCTGGTGTAGGTGTCCCCGGAGTAGGCGTCCCTGGAGTGGGCGTGCCCGGCTTTGGGGTGCCGGGTAAAGGCGTACCAGGAGTAGGTGTACCTGGAGTTGGTGTCCCAGGCGTTGGTGTCCCCGGCGTAGGAGTACCCGGAGTGGGAGTGCCCGGAGTCGGCGTACCCGGAGTTGGTGTGCCTGGGGTTGGCGTGCCGGGGTTTGGTGTACCTGGTAAGGGAGTTCCGGGTGTAGGCGTGCCTGGCGTAGGTGTCCCCGGGGTCGGGGTGCCGGGGGTCGGTGTGCCGGGAGTGGGAGTCCCAGGTGTGGGTGTCCCAGGGGTCGGAGTTCCGGGGGTTGGAGTGCCAGGATTTGGAGTTCCTGGGAAAGGAGTACCCGGCGTTGGGGTTCCAGGGGTGGGCGTGCCAGGGGTAGGCGTCCCTGGGGTTGGCGTTCCGGGGGTCGGCGTCCCGGGTGTTGGCGTTCCAGGCGTAGGAGTTCCCGGCGTGGGGGTGCCCGGGTTCGGGGTCCCTGGGAAAGGGGTACCCGGGGTGGGTGTACCCGGGGTTGGCGTACCAGGAGTAGGTGTGCCTGGGGTGGGTGTACCGGGAGTGGGCGTACCTGGGGTGGGTGTTCCGGGGGTAGGAGTACCCGGAGTTGGAGTCCCGGGGTTCGGGGTACCGGGTAAGGGAGTACCGGGAGTGGGGGTTCCGGGAGTAGGTGTTCCTGGGGTAGGCGTACCGGGGGTTGGCGTCCCCGGTGTTGGGGTGCCTGGTGTGGGCGTACCAGGGGTTGGAGTGCCGGGTGTGGGCGTACCCGGTTTCGGCTAA
SEQ ID No.7：
CPCPHNSFGMCCVVNGGDVRCSCKAGYGQCERCAPGYFGN PQKFGGSC
SEQ ID No.8：
LQGLSASAGLLEQMRHMEQAKDLRNQLLNYRSAISNHGSKIEGLERELDLNQEFELQEKAQVNSRKAQLNNNVNRAQSAKELDVKIKNVIRNVHILLKQISGDGEGNNVPSGDFSREAEAQRMMRELRNRNFGKHLREAEADKRESQLLLNRIRQKHQGENNGLANSIRDSLNEYEAKLSDLRARLQEAAAQAKQANGLNQENERALGAIQRQVKEINSLQSDFKYLADSSLLQNIALQLKEKS
SEQ ID No.9：
CPCPHNSFGMCCVVNGGDVRCSCKAGYGQCERCAPGYFGN PQKFGGSCLQGLSASAGLLEQMRHMEQAKDLRNQLLNYRSAISNHGSKIEGLERELDLNQEFELQEKAQVNSRKAQLNNNVNRAQSAKELDVKIKNVIRNVHILLKQISGDGEGNNVPSGDFSREAEAQRMMRELRNRNFGKHLREAEADKRESQLLLNRIRQKHQGENNGLANSIRDSLNEYEAKLSDLRARLQEAAAQAKQANGLNQENERALGAIQRQVKEINSLQSDFKYLADSSLLQNIALQLKEKS-
SEQ ID No.10：
VPGKGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGFGVPGKGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGFGVPGKGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGFGVPGKGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGFGVPGKGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGFGVPGKGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGFGVPGKGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGFGVPGKGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGFGGGGGSGGGGSGGGGSCPCPHNSFGMCCVVNGGDVRCSCKAGYGQCERCAPGYFGNPQKFGGSCLQGLSASAGLLEQMRHMEQAKDLRNQLLNYRSAISNHGSKIEGLERELDLNQEFELQEKAQVNSRKAQLNNNVNRAQSAKELDVKIKNVIRNVHILLKQISGDGEGNNVPSGDFSREAEAQRMMRELRNRNFGKHLREAEADKRESQLLLNRIRQKHQGENNGLANSIRDSLNEYEAKLSDLRARLQEAAAQAKQANGLNQENERALGAIQRQVKEINSLQSDFKYLADSSLLQNIALQLKEKS-
SEQ ID No.11：
GTTCCCGGCAAAGGGGTTCCTGGAGTTGGCGTCCCTGGCGTAGGTGTACCAGGCGTAGGAGTGCCTGGAGTGGGCGTGCCCGGAGTGGGGGTGCCCGGCGTTGGTGTACCAGGGGTTGGTGTGCCGGGCGTCGGAGTCCCTGGGTTCGGGGTACCCGGCAAGGGGGTCCCTGGCGTGGGCGTTCCGGGGGTCGGGGTTCCGGGTGTCGGCGTGCCCGGTGTCGGAGTTCCTGGAGTTGGAGTACCTGGTGTTGGGGTTCCAGGAGTCGGCGTACCCGGTGTGGGAGTCCCCGGATTCGGGGTTCCGGGCAAGGGAGTCCCGGGGGTCGGGGTGCCGGGGGTAGGTGTCCCTGGAGTAGGGGTTCCGGGTGTAGGGGTGCCTGGTGTCGGCGTCCCGGGAGTAGGAGTTCCGGGAGTTGGGGTGCCAGGCGTGGGAGTCCCTGGCTTTGGTGTACCAGGCAAAGGCGTCCCTGGCGTAGGAGTCCCAGGGGTTGGGGTACCTGGAGTAGGAGTTCCGGGTGTAGGAGTTCCCGGGGTAGGGGTGCCAGGTGTTGGCGTCCCCGGTGTTGGTGTACCGGGGGTAGGAGTGCCTGGCTTTGGAGTCCCAGGCAAGGGGGTGCCGGGTGTGGGAGTACCGGGAGTAGGTGTACCAGGTGTAGGCGTGCCTGGCGTCGGCGTGCCCGGAGTCGGCGTCCCGGGTGTTGGAGTACCGGGGGTTGGAGTCCCCGGGGTTGGGGTGCCGGGCTTTGGGGTGCCAGGCAAAGGGGTACCAGGCGTGGGTGTTCCAGGCGTAGGTGTTCCAGGGGTCGGAGTACCTGGTGTAGGAGTTCCGGGTGTCGGTGTGCCCGGAGTAGGCGTCCCTGGCGTTGGGGTCCCCGGTGTAGGAGTGCCCGGATTCGGTGTGCCTGGTAAGGGTGTGCCGGGGGTGGGTGTGCCTGGTGTGGGAGTACCAGGCGTTGGGGTTCCCGGCGTTGGAGTCCCTGGTGTCGGAGTGCCCGGGGTTGGTGTGCCTGGTGTGGGTGTGCCCGGTGTGGGCGTTCCAGGGTTTGGAGTACCGGGCAAAGGGGTGCCAGGGGTTGGTGTACCTGGCGTAGGCGTTCCAGGCGTAGGGGTGCCAGGAGTTGGCGTCCCCGGTGTCGGCGTCCCCGGGGTCGGTGTTCCGGGTGTCGGTGTACCAGGGGTGGGCGTTCCAGGTTTCGGTGGTGGAGGAGGCAGCGGAGGAGGCGGGTCCGGGGGAGGGGGTTCATGCCCGTGCCCTCACAATTCTTTTGGCATGTGTTGTGTTGTAAACGGAGGGGATGTCAGGTGCAGTTGTAAAGCAGGCTACGGGCAGTGCGAGAGATGCGCTCCAGGTTATTTTGGTAACCCCCAAAAGTTCGGGGGAAGCTGTCTGCAGGGACTCTCGGCGTCGGCTGGGCTATTGGAGCAAATGCGACATATGGAACAGGCAAAGGATTTACGTAACCAGTTGCTGAATTATAGATCCGCGATCTCCAATCACGGCAGTAAAATCGAGGGCCTAGAGCGCGAACTCGATTTAAACCAGGAGTTTGAATTACAAGAAAAAGCCCAAGTCAATTCACGTAAAGCGCAGCTAAATAACAACGTAAATAGAGCGCAAAGCGCCAAGGAATTAGACGTTAAGATTAAGAACGTCATACGCAATGTTCACATACTTCTCAAACAAATTAGTGGGGACGGGGAAGGTAATAACGTCCCCTCAGGGGACTTCTCTCGCGAGGCTGAAGCACAACGGATGATGCGGGAACTTAGAAACAGGAACTTCGGCAAGCATCTGCGAGAGGCGGAGGCGGACAAACGTGAAAGCCAGCTTCTGCTTAATAGGATCCGCCAGAAACATCAAGGTGAGAACAACGGACTCGCAAATTCAATACGGGACTCCCTTAATGAGTACGAGGCCAAACTGTCTGATTTGCGGGCTCGACTACAAGAAGCAGCAGCACAGGCTAAGCAAGCTAACGGGCTCAATCAAGAGAATGAAAGGGCTTTAGGGGCCATTCAGAGACAAGTGAAAGAAATAAACTCGTTGCAGAGTGATTTTAAGTACTTGGCCGATAGCTCTCTATTACAGAACATCGCCTTGCAGCTTAAGGAAAAAAGTTGA
SEQ ID No.12：
VPGKGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGFGVPGKGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGVGVPGFGGGGGSGGGGSGGGGSCPCPHNSFGMCCVVNGGDVRCSCKAGYGQCERCAPGYFGNPQKFGGSCLQGLSASAGLLEQMRHMEQAKDLRNQLLNYRSAISNHGSKIEGLERELDLNQEFELQEKAQVNSRKAQLNNNVNRAQSAKELDVKIKNVIRNVHILLKQISGDGEGNNVPSGDFSREAEAQRMMRELRNRNFGKHLREAEADKRESQLLLNRIRQKHQGENNGLANSIRDSLNEYEAKLSDLRARLQEAAAQAKQANGLNQENERALGAIQRQVKEINSLQSDFKYLADSSLLQNIALQLKEKS-
SEQ ID No.13：
GTTCCAGGCAAAGGCGTCCCCGGCGTGGGGGTACCTGGTGTCGGTGTACCCGGTGTCGGTGTCCCTGGCGTCGGTGTTCCGGGTGTTGGCGTACCAGGTGTGGGAGTCCCAGGAGTAGGCGTGCCTGGGGTTGGAGTGCCCGGATTTGGAGTGCCGGGGAAGGGAGTCCCGGGGGTTGGGGTTCCCGGGGTTGGGGTACCCGGAGTAGGCGTACCTGGCGTAGGTGTGCCGGGGGTTGGAGTTCCAGGAGTGGGAGTACCTGGGGTGGGCGTCCCAGGTGTGGGGGTCCCGGGCTTCGGTGGTGGAGGAGGCAGCGGAGGAGGCGGGTCCGGGGGAGGGGGTTCATGCCCGTGCCCTCACAATTCTTTTGGCATGTGTTGTGTTGTAAACGGAGGGGATGTCAGGTGCAGTTGTAAAGCAGGCTACGGGCAGTGCGAGAGATGCGCTCCAGGTTATTTTGGTAACCCCCAAAAGTTCGGGGGAAGCTGTCTGCAGGGACTCTCGGCGTCGGCTGGGCTATTGGAGCAAATGCGACATATGGAACAGGCAAAGGATTTACGTAACCAGTTGCTGAATTATAGATCCGCGATCTCCAATCACGGCAGTAAAATCGAGGGCCTAGAGCGCGAACTCGATTTAAACCAGGAGTTTGAATTACAAGAAAAAGCCCAAGTCAATTCACGTAAAGCGCAGCTAAATAACAACGTAAATAGAGCGCAAAGCGCCAAGGAATTAGACGTTAAGATTAAGAACGTCATACGCAATGTTCACATACTTCTCAAACAAATTAGTGGGGACGGGGAAGGTAATAACGTCCCCTCAGGGGACTTCTCTCGCGAGGCTGAAGCACAACGGATGATGCGGGAACTTAGAAACAGGAACTTCGGCAAGCATCTGCGAGAGGCGGAGGCGGACAAACGTGAAAGCCAGCTTCTGCTTAATAGGATCCGCCAGAAACATCAAGGTGAGAACAACGGACTCGCAAATTCAATACGGGACTCCCTTAATGAGTACGAGGCCAAACTGTCTGATTTGCGGGCTCGACTACAAGAAGCAGCAGCACAGGCTAAGCAAGCTAACGGGCTCAATCAAGAGAATGAAAGGGCTTTAGGGGCCATTCAGAGACAAGTGAAAGAAATAAACTCGTTGCAGAGTGATTTTAAGTACTTGGCCGATAGCTCTCTATTACAGAACATCGCCTTGCAGCTTAAGGAAAAAAGTTGA
SEQ ID No.14：
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
SEQ ID No.15：
GTGCCCGGAAAAGGGGTCCCAGGCGTAGGAGTGCCTGGCGTGGGGGTTCCTGGAGTAGGTGTACCAGGAGTCGGAGTCCCAGGCGTTGGGGTCCCGGGGGTTGGTGTGCCTGGCGTCGGAGTCCCCGGTGTGGGGGTTCCGGGATTTGGTGTGCCCGGCAAGGGAGTCCCGGGTGTTGGTGTCCCAGGAGTCGGAGTACCTGGAGTTGGTGTTCCAGGGGTAGGGGTTCCGGGCGTGGGAGTCCCAGGGGTAGGTGTTCCAGGTGTAGGTGTGCCTGGGGTTGGCGTTCCCGGATTCGGTGTGCCCGGTAAAGGTGTCCCGGGCGTGGGGGTTCCGGGAGTGGGAGTCCCTGGCGTGGGAGTGCCTGGCGTAGGCGTGCCGGGTGTAGGGGTACCAGGGGTAGGAGTCCCTGGCGTTGGCGTTCCGGGTGTAGGTGTGCCCGGGTTCGGCGTCCCCGGTAAGGGGGTTCCTGGCGTTGGTGTCCCAGGGGTCGGGGTCCCCGGAGTAGGCGTACCCGGGGTAGGAGTGCCAGGGGTAGGCGTGCCGGGGGTAGGTGTTCCTGGCGTTGGAGTCCCGGGCGTAGGGGTGCCCGGTTTTGGCGGTGGAGGAGGCAGCGGAGGAGGCGGGTCCGGGGGAGGGGGTTCATGCCCGTGCCCTCACAATTCTTTTGGCATGTGTTGTGTTGTAAACGGAGGGGATGTCAGGTGCAGTTGTAAAGCAGGCTACGGGCAGTGCGAGAGATGCGCTCCAGGTTATTTTGGTAACCCCCAAAAGTTCGGGGGAAGCTGTCTGCAGGGACTCTCGGCGTCGGCTGGGCTATTGGAGCAAATGCGACATATGGAACAGGCAAAGGATTTACGTAACCAGTTGCTGAATTATAGATCCGCGATCTCCAATCACGGCAGTAAAATCGAGGGCCTAGAGCGCGAACTCGATTTAAACCAGGAGTTTGAATTACAAGAAAAAGCCCAAGTCAATTCACGTAAAGCGCAGCTAAATAACAACGTAAATAGAGCGCAAAGCGCCAAGGAATTAGACGTTAAGATTAAGAACGTCATACGCAATGTTCACATACTTCTCAAACAAATTAGTGGGGACGGGGAAGGTAATAACGTCCCCTCAGGGGACTTCTCTCGCGAGGCTGAAGCACAACGGATGATGCGGGAACTTAGAAACAGGAACTTCGGCAAGCATCTGCGAGAGGCGGAGGCGGACAAACGTGAAAGCCAGCTTCTGCTTAATAGGATCCGCCAGAAACATCAAGGTGAGAACAACGGACTCGCAAATTCAATACGGGACTCCCTTAATGAGTACGAGGCCAAACTGTCTGATTTGCGGGCTCGACTACAAGAAGCAGCAGCACAGGCTAAGCAAGCTAACGGGCTCAATCAAGAGAATGAAAGGGCTTTAGGGGCCATTCAGAGACAAGTGAAAGAAATAAACTCGTTGCAGAGTGATTTTAAGTACTTGGCCGATAGCTCTCTATTACAGAACATCGCCTTGCAGCTTAAGGAAAAAAGTTGA
实施例1构建及制备不同重复数目重组弹性蛋白菌株
1）基因序列选择
类弹性蛋白多肽是原弹性蛋白的疏水结构域衍生来的循环重复氨基酸序列，是一种经过人工改造的、具有弹性且随温度变化会发生相变的基因工程多肽，在结构上主要由VPGXG五肽段单元串连重复组成，Xaa可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸。
本申请选择的弹性蛋白序列为［VPGKG（VPGVG）8VPGFG］n，n数目为≥1；其中，n优选为2、4和8。
步骤1）：当n数为2的氨基酸序列为SEQ ID No.1，有100aa；在C端添加终止子，针对不同宿主中基因的转录、翻译过程存在差异，对编码重组弹性蛋白的DNA序列进行优化设计，其对应的核苷酸序列为SEQ ID No.4，以使重组弹性蛋白更容易在毕赤酵母中表达。将优化后的重组类弹性蛋白基因序列（SEQ ID No.4），委托金斯瑞生物科技股份有限公司进行基因片段合成。将合成的基因片段通过EcoR Ⅰ和NotⅠ的酶切位点插入pPIC9K质粒，获得重组人弹性蛋白重组质粒，分别命名为pPIC9K-ELP2。
当n数为4的氨基酸序列为SEQ ID No.2，有200aa；在C端添加终止子，针对不同宿主中基因的转录、翻译过程存在差异，对编码重组弹性蛋白的DNA序列进行优化设计，其对应的核苷酸序列为SEQ ID No.5，以使重组弹性蛋白更容易在毕赤酵母中表达。将优化后的重组类弹性蛋白基因序列（SEQ ID No.5），委托金斯瑞生物科技股份有限公司进行基因片段合成。将合成的基因片段通过EcoR Ⅰ和NotⅠ的酶切位点插入pPIC9K质粒，获得重组人弹性蛋白重组质粒，分别命名为pPIC9K-ELP4。
当n数为8的氨基酸序列为SEQ ID No.3，有400aa；在C端添加终止子，针对不同宿主中基因的转录、翻译过程存在差异，对编码重组弹性蛋白的DNA序列进行优化设计，其对应的核苷酸序列为SEQ ID No.6，以使重组弹性蛋白更容易在毕赤酵母中表达。将优化后的重组类弹性蛋白基因序列（SEQ ID No.6），委托金斯瑞生物科技股份有限公司进行基因片段合成。将合成的基因片段通过EcoR Ⅰ和NotⅠ的酶切位点插入pPIC9K质粒，获得重组人弹性蛋白重组质粒，分别命名为pPIC9K-ELP8。
步骤2）：将步骤1）获得的重组质粒pPIC9K-ELP2、pPIC9K-ELP4和pPIC9K-ELP8各取10μg，分别经过限制性内切酶SacⅠ线性化处理，并采用无水乙醇回收获得线性化重组质粒。
取100 μL GS115毕赤酵母感受态细胞与所述线性化重组质粒混合后，移入预冷的电转化杯中，立即冰浴5 min。选择电转仪的酵母模式，进行电击。然后立即向电转杯中加入1 mL预冷的1 M的山梨醇，混合均匀后将混合物转移到无菌EP管中，30 °C培养箱静置孵育1h~2 h，获得菌液。取100 μL ~ 200 μL菌液涂布于MD固体平板，室温静置10min，30℃培养箱倒置培养约2d~5 d，直至出现单菌落。
步骤3）：将步骤2）所述MD平板上的单菌落用无菌白色枪头对应接种到G418浓度分别为0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL和4mg/mL的YPD固体平板上。转化子若能同时在含0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL和4mg/mL 的G418的YPD固体平板上生长，说明该转化子含有多拷贝的目的基因。经过这一步筛选可得到可高效表达的高拷贝重组酵母工程菌株。实验证明，GS115/pPIC9K-ELP2 、GS115/pPIC9K-ELP4和GS115/pPIC9K-ELP8均可以在4mg/mL高浓度G418的平板上生长，即均为高拷贝重组菌株。
步骤4）：将高拷贝重组菌株GS115/pPIC9K-ELP2、GS115/pPIC9K-ELP4和GS115/pPIC9K-ELP8，分别挑取四个单菌落接种于BMGY培养基，30 ºC，220 rpm培养24 h至OD值为2~6。根据实测OD值调整BMGY培养菌液体积，3000 rpm，10 min收集菌体，用与BMGY等体积的BMMY培养基重悬菌体，使起始OD值为2.0。30 ºC，220 rpm继续培养，每24 h向培养基添加0.5%甲醇，经甲醇诱导后96h，分别取菌液样品，离心收集表达上清液。经SDS-PAGE电泳分析重组菌株表达情况，表达的目的蛋白分别命名为ELP2（分子量为8.36kD）、ELP4（分子量为16.70kD）和ELP8（分子量为33.30kD）。表达量鉴定结果见图1和图2。
步骤5）：使用阳离子交换介质（层析填料为厦门三冀产SP Sanarose 6 HP，装载于GE Akta层析系统），以柠檬酸盐缓冲液（20Mm，pH 5.0）平衡层析柱至电导率值及A280吸光值不变，设置样品上样流速5 mL/min，检测紫外A280吸光值，当其上升时，开始接样。待上样结束后，再以柠檬酸盐缓冲液平衡阳离子层析介质，直至紫外和电导降至最低且不再变化，平衡结束。再以含NaCl（500mM）的柠檬酸盐缓冲液洗脱并收集对应的蛋白，即获得重组弹性蛋白ELP2、ELP4和ELP8（如图3）。
实验例1
分别测试实施例1所述重组弹性蛋白ELP2、ELP4和ELP8促Hacat细胞贴壁活性：
用20mM pH 7.4 的PBS溶液稀释至0.5μg/mL，在96孔板中进行2倍梯度稀释，共做10个稀释度，每孔50μL不同稀释度，每个样品平行测试三次，同时用20mM PBS作为阴性对照，设置商品化弹性蛋白（购自索莱宝，P06063）作为阳性对照，4℃孵育过夜。孵育完成后弃去板中液体，每孔加入100μL 30g/L BSA封闭，置于37℃温箱孵育1h；取出弃去板中液体，加入对数生长期的人皮肤永生化角质细胞Hacat，每孔为1.0×105/mL，每孔100μL，37℃温箱孵育5h。将孵育完成的细胞板用20mM PBS洗涤3次，镜下观察细胞贴壁情况，选取200倍镜下除边缘处五个点计贴壁细胞数，根据计数结果四参数拟合曲线得出效价。
结果如表1和图6所示，可以看出，本申请实施例1所制备的重组弹性蛋白促Hacat细胞贴壁效果显著高于商品化弹性蛋白，并且随着n循环数增加促细胞贴壁活性越高，其中n为8活性最高。
表1重组弹性蛋白促Hacat细胞贴壁活性
实验例2
分别测试实施例1所述重组弹性蛋白ELP2、ELP4和ELP8促NIH 3T3细胞增殖活性：
参考《中国药典》2020版（三部）附录“3528”。本法系依据重组弹性蛋白对小鼠胚胎成纤维细胞（BALB/c 3T3 细胞）的生长具有刺激作用，NIH 3T3细胞的生长状况因不同的重组弹性蛋白生物学活性的差异，以此检测体外促细胞增殖的生物学活性。
1.1试验材料：
完全细胞培养液：加入10%胎牛血清的1640培养液（含青链霉素），4℃保存；无血清培养基：1640培养液（含青链霉素），4℃保存；消化液：0.25%胰蛋白酶；噻唑蓝（MTT）溶液：称取MTT粉末0 .10g，加PBS 20mL使溶解，经0 .22μm滤膜过滤除菌，4℃避光保存；NIH 3T3细胞（购自武汉普诺赛）；
样本：实施例1的重组弹性蛋白、商品化弹性蛋白（购自索莱宝，P06063）。
1.2具体实施方法：
将NIH 3T3细胞株用完全细胞培养液于37℃、5%二氧化碳的条件下培养，控制细胞浓度为5.0×105/mL，传代后24h-36h用于生物学活性测定；弃去培养瓶中的培养液，消化和收集细胞，用完全细胞培养液配成5.0×105/mL的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL，于37℃、5%二氧化碳的条件下培养；24h后换成20mM PBS缓冲液，于37C、5%二氧化碳条件下培养24h；制备的细胞培养板弃去PBS缓冲液，加入供试品溶液，每孔100μL，于37℃、5%二氧化碳条件下培养64h-72h；每孔加入MTT溶液20μL，于37℃、5%二氧化碳条件下培养5h。弃去培养板中的液体后，向每孔中加入DMSO 100μL，混匀后在酶标仪上，以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。
1.3数据处理：
试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。测定结果如下表2和图7所示，可以看出，本申请实施例1所制备的重组弹性蛋白促NIH 3T3细胞增殖效果显著高于商品化弹性蛋白，并且随着n循环数增加促细胞增殖活性越高，其中n为8活性最高。
表2 重组弹性蛋白促细胞增殖活性
实施例3
基于上述实验例1和实验例2的实验结果数据，可以看出，重组弹性蛋白ELP8的促Hacat细胞贴壁活性和促NIH 3T3细胞增殖活性最高，即抗皱效果最为明显，因此，将层粘连蛋白（LN）通过一段柔性linker（GGGGS）3~5，优先选择linker（GGGGS）3，连接在重组弹性蛋白ELP8的N端或C端，优先选择在C端。
1）LN-5基因序列的选择
LN- 5与其他已知的ECM相比，具有更强的促进细胞粘附、迁移以及扩散的能力。查找NCBI数据库，LN- 5的α3链的基因登录号为（CAA59428.1），选择基因序列114~164区域，即为EGF_Lam，SEQ ID No.7，选择基因序列227~484区域，即为Laminin_I，SEQ ID No.8，通过串联获得层粘连蛋白序列，SEQ ID No.9。
通过一段柔性linker（GGGGS）3将层粘连蛋白序列SEQ ID No.9连接至重组弹性蛋白ELP8的N端，即为修复性重组弹性蛋白序列，SEQ ID No.10。
在C端添加终止子，针对不同宿主中基因的转录、翻译过程存在差异，对编码修复性重组弹性蛋白的DNA序列进行优化设计，其核苷酸序列为SEQ ID No.11，使修复性重组弹性蛋白更容易在毕赤酵母中表达。
将优化后的修复性重组类弹性蛋白基因序列SEQ ID No.11，委托金斯瑞生物科技股份有限公司进行基因片段合成。将合成的基因片段通过EcoR Ⅰ和NotⅠ的酶切位点插入pPIC9K质粒，获得修复性重组人弹性蛋白重组质粒，命名为pPIC9K-ELP8-FN-5（分子量为62.0kD）。
按照实施例1的方法构建表达修复性重组人弹性蛋白重组菌株、高拷贝菌株筛选和可修复性重组弹性蛋白制备，并将最终产物命名为ELP8-LN-5融合蛋白。图4为修复性重组弹性蛋白ELP8-LN-5高拷贝菌株表达量鉴定结果。图5为ELP8-LN-5融合蛋白纯化结果。
实验例3修复性重组蛋白促细胞贴壁活性和增殖活性
按照实验例1和实验例2的测试方法，测试实施例2制备的ELP8-LN-5融合蛋白，同时以实施例1制备的重组弹性蛋白ELP8作为对照，阴性对照为PBS组，比较ELP8-LN-5融合蛋白与重组弹性蛋白ELP8的活性，检测结果如表3。
表3 修复性ELP8-LN-5促Hacat细胞贴壁和NIH 3T3细胞增殖活性
从表3和图8所示，本申请实施例2所制备的ELP8-LN-5融合蛋白促Hacat细胞贴壁活性和促NIH 3T3细胞增殖效果显著高于实施例1制备的重组弹性蛋白ELP8，这说明弹性蛋白融合层粘连蛋白可明显提高其促细胞贴壁活性和促增殖活性。
实验例4ELP8-LN-5融合蛋白促Hacat细胞迁移活性
具体方法如下：
1）用黑色记号笔在6孔细胞培养板背后，用直尺对齐，均匀划横线，大约每隔0.5cm~1cm一道横线，横穿过孔；
2）收集对数生长期Hacat细胞，调整细胞密度为5×105/mL，2mL/孔，加入到上述6孔细胞板中，放置37℃ 5%二氧化碳培养箱培养24h，细胞长满单层，用枪头比着直尺，垂直于背后的横线划痕，每孔内划2道横线，用PBS洗细胞3次，洗掉划下的悬浮细胞，然后向孔内加入1.8mL无血清DMEM培养基。
3）向孔内添加ELP8-LN-5融合蛋白和重组弹性蛋白ELP8，并且用商品化ELP（同上）作阳性对照组，以上蛋白浓度均为50μg/mL，PBS作为空白对照组。
4）将已加入待检样品的6孔细胞板放入37℃ 5%二氧化碳培养箱培养24h。培养第0h拍照，记录每孔内拍照位置。培养第24h，对固定位置进行观察、拍照。使用Image J软件对细胞迁移的图片进行处理，获得初始划痕面积和无细胞空白区域面积数据，计算迁移率。其中，迁移率=无细胞空白区域面积/初始划痕面积×100％。
细胞对照孔与各个样品孔0h与18h观察结果图9所示。并且计算各个处理组对HaCaT角质化细胞促迁移效果。
本专利发明的重组弹性蛋白ELP8和商品化ELP比较，促HaCat细胞迁移效果相近，与阴性对照比较差异显著；ELP8-LN-5融合蛋白活性最高，说明ELP8融合层粘连蛋白可提高弹性蛋白的促迁移活性达到74%。
实验例5ELP8-LN-5融合蛋白进行人体皮肤功效评价。
1） ELP8-LN-5融合蛋白在人体皮肤上抗皱效果测试
将实施例2制备的ELP8-LN-5融合蛋白制备成ELP8-LN-5融合蛋白精华液样品，通过30名亚洲成年女性受试者在正常情况下连续使用该ELP8-LN-5融合蛋白精华液样品28天，眼部鱼尾纹部位皮肤皱纹面积、皮肤弹性R2值，以及皮肤科医生对受试者进行功效性临床评估和安全性临床评估，评估该测试样品在抗皱的功效及安全性。
1.1具体实施方法：
使用样品前：测试开始前两天，受试者停用化妆品或外用药品，测试前一天晚上，受试者洗脸后脸上不再涂抹任何护肤品；测试当天早上，清水洗脸后脸上不涂抹任何护肤品；受试者在温度21±1℃，相对湿度50±10%RH的环境中休息30分钟；皮肤科医生进行临床评估；技术员使用皮肤快速光学成像系统PRIMOS对受试者进行图像采集；技术员使用皮肤弹性测试仪Cutometer检测皮肤弹性R2值和眼部鱼尾纹部位皮肤皱纹面积；受试者在技术员指导下使用测试样品；发放测试样品和使用说明。
分别使用样品14天和28天后：受试者在实验室用洁面产品清洁面部；受试者在温度21±1℃，相对湿度50±10%RH的环境中休息30分钟；技术员使用皮肤快速光学成像系统PRIMOS对受试者进行图像采集；技术员使用皮肤弹性测试仪 Cutometer检测皮肤弹性R2值和眼部鱼尾纹部位皮肤皱纹面积。
1.2评判依据：
皮肤弹性：Courage+ Khazaka皮肤弹性测试仪，检测皮肤弹性R2值，测量值升高，说明皮肤弹性提升。
皮肤皱纹面积（鱼尾纹）：Courage皮肤快速光学成像系统PRIMOS用于检测皮肤皱纹面积，数值越小，说明皱纹体积越小。
1.3数据处理
经过统计学软件分析，比较在使用修复性重组弹性蛋白精华液第14d和28d与使用前的差异性。结果如图11和图12所示。“*”表示皮肤弹性R2值、皮肤皱纹面积与使用前比较差异性显著，P<0.05。
由图10所示，受试者在使用ELP8-LN-5融合蛋白精华液使用第14天后，眼部皮肤皱纹面积和数量减少，皱纹深度变浅，特别是第28天抗皱效果尤为明显，经过数据统计，见图11所示，使用第14d和28d时，鱼尾纹的皮肤皱纹面积与使用前比较明显降低，差异显著。如图12所示，使用第14d时皮肤弹性R2值与使用前有一定程度提高，但差异不显著，而使用第28d时皮肤弹性R2值显著提高，差异显著。可见本申请所制备的ELP8-LN-5融合蛋白具有较好的抗皱功效。
2）ELP8-LN-5融合蛋白在人体皮肤上修护功效
将实施例2制备的ELP8-LN-5融合蛋白制备成ELP8-LN-5融合蛋白精华液，通过26名成年健康受试者在正常情况下连续使用该ELP8-LN-5融合蛋白精华液样品28天，检测皮肤经表皮水分流失TEWL值和皮肤角质层水分含量。
2.1具体实施方法：
使用样品前：测试开始前两天，受试者停用化妆品或外用药品，测试前一天晚上，受试者洗脸后脸上不再涂抹任何护肤品；测试当天早上，清水洗脸后脸上不涂抹任何护肤品；受试者在温度21±1℃，相对湿度50±10%RH的环境中休息30分钟；技术人员使用皮肤水分流失测试探头TewameterTM300检测皮肤经表皮水分流失TEWL值和皮肤水分测定仪CorneometerCM825检测皮肤角质层水分含量。受试者在技术员指导下使用测试样品；发放测试样品和使用说明。
分别使用样品14天和28天后：受试者在实验室用洁面产品清洁面部；受试者在温度21±1℃，相对湿度50±10%RH的环境中休息30分钟；使用皮肤水分流失测试探头TewameterTM300检测皮肤经表皮水分流失TEWL值；技术员使用皮肤水分测定仪CorneometerCM825检测皮肤角质层水分含量。
2.2评判依据：
皮肤角质层含水量：CorneometerCM825皮肤水分测试仪，检测皮肤角质层水分含量，测量值越大，说明皮肤角质层含水量越高。
皮肤经皮水分流失：皮肤水分流失测试探头TewameterTM300检测皮肤经表皮水分流失TEWL值，测量值越小，说明单位时间、单位横截面积的经表皮水分流失量减少。
2.3数据处理
经过统计学软件分析，比较在使用ELP8-LN-5融合蛋白精华液第14d和28d与使用前的差异性。结果如图13和图14所示。“*”表示皮肤弹性R2值、皮肤皱纹面积与使用前比较差异性显著，P<0.05。
由图13所示，受试者在使用ELP8-LN-5融合蛋白精华液使用第14d和28d后，皮肤角质层含水量明显升高，差异性显著。图14所示，使用第14d时和28d后皮肤经表皮水分流失TWEL值明显降低，差异显著。可见实施例2所制备的ELP8-LN-5融合蛋白具有保湿和修复功效。
综上，本申请提供一种毕赤酵母表达的人弹性蛋白与层粘连蛋白的融合蛋白，并利用连接短肽linker（GGGGS）串联表达弹性蛋白五肽重复片段序列和层粘连蛋白结构域功能区片段序列。利用毕赤酵母表达无内毒素、产率高、培养基简单、表达蛋白稳定且可分泌至胞外易于纯化，同时具有将异源蛋白进行正确加工、修饰、合理的空间折叠等功能。所以使用酵母表达异源蛋白具有较大优势。此外，本申请利用基因工程技术重组表达层粘连蛋白功能片段和弹性蛋白结构域片段，获得了一种可修复性弹性蛋白。经过体外细胞验证和人体功效验证，可修复性弹性蛋白同时具有的层粘连蛋白和弹性蛋白的功效，有明显提高细胞增殖、促细胞粘附和促细胞迁移活性。可以应用于生物护肤领域，有明显的抗皱修复功效。
以上仅为本申请的优选实施例，并非因此限制本申请的专利范围，凡是利用本申请说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本申请的专利保护范围内。
Claims (7)
1.一种兼具修复和抗皱活性的类弹性蛋白，其特征在于，所述兼具修复和抗皱活性的类弹性蛋白是将层粘连蛋白通过柔性linker连接在初始类弹性蛋白的C端所获得的；所述层粘连蛋白的蛋白序列如SEQ ID No.9所示；
当所述初始类弹性蛋白的核苷酸序列表达如SEQ ID No.6所示时，所述兼具修复和抗皱活性的类弹性蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示。
2.一种兼具修复和抗皱活性的类弹性蛋白，其特征在于，所述兼具修复和抗皱活性的类弹性蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示。
3.一种兼具修复和抗皱活性的类弹性蛋白，其特征在于，所述兼具修复和抗皱活性的类弹性蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.14所示。
4.一种如权利要求1-3任一项所述兼具修复和抗皱活性的类弹性蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
由权利要求1-3任一项所述兼具修复和抗皱活性的类弹性蛋白的氨基酸序列进行优化设计，获得对应的核苷酸序列；
再基于所述核苷酸序列，获得修复性重组人弹性蛋白重组质粒，将所述修复性重组人弹性蛋白重组质粒进行毕赤酵母电转化处理，并培养至出现单菌落，筛选获得高拷贝重组酵母工程菌株；将高拷贝重组酵母工程菌株进行诱导表达，获得表达目的蛋白；将所述表达目的蛋白进行纯化处理，获得兼具修复和抗皱活性的类弹性蛋白。
5.一种如权利要求1-3任一项所述兼具修复和抗皱活性的类弹性蛋白的应用，其特征在于，将所述兼具修复和抗皱活性的类弹性蛋白应用于制备护肤品；
由所述兼具修复和抗皱活性的类弹性蛋白制备的护肤品促Hacat细胞贴壁比活性为28500U/mg。
6.一种如权利要求1-3任一项所述兼具修复和抗皱活性的类弹性蛋白的应用，其特征在于，由所述兼具修复和抗皱活性的类弹性蛋白制备的护肤品促细胞增殖比活性为59500U/mg。
7.一种如权利要求1-3任一项所述兼具修复和抗皱活性的类弹性蛋白的应用，其特征在于，由所述兼具修复和抗皱活性的类弹性蛋白制备的护肤品促Hacat细胞迁移活性为46.40%。
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