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CN1185251C - 具有改进溶解性能的新的lhrh－拮抗剂 - Google Patents

具有改进溶解性能的新的lhrh－拮抗剂 Download PDF

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CN1185251C CNB008067341A CN00806734A CN1185251C CN 1185251 C CN1185251 C CN 1185251C CN B008067341 A CNB008067341 A CN B008067341A CN 00806734 A CN00806734 A CN 00806734A CN 1185251 C CN1185251 C CN 1185251C
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T·里斯曼
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Abstract

本发明涉及含有N-甲基化氨基酸构建单元并具有改善的水溶性的肽。含有根据本发明肽的药物可用于治疗激素依赖性肿瘤和受激素影响的非恶性疾病。

Description

具有改进溶解性能的新的LHRH-拮抗剂
本发明涉及具有改进溶解性能的新的LHRH-拮抗剂、制备这些化合物的方法、包含这些化合物的药物以及这些药物治疗激素依赖性肿瘤和激素影响的非恶性疾病如良性前列腺增生(BPH)和子宫内膜易位的用途。
为定义肽应用的术语与IUPAC-IUB-委员会关于生物化学命名所解释的术语相符(European J.Biochem.1984，138，9-37)，其中与习惯的表示相符N-端的氨基在左边，C-端的羧基在右边。LH-RH-拮抗剂如按发明的肽包括天然存在的和合成的氨基酸，对此首先包括Ala，Val，Leu，IIe，Ser，Thr，Lys，Arg，Asp，Asn，Glu，Gln，Cys，Met，Phe，Tyr，Pro，Trp和His。每一氨基酸残基的缩写是基于氨基酸的普通名称，它们是Ala＝丙氨酸，Arg＝精氨酸，Gly＝甘氨酸，Leu＝亮氨酸，Lys＝赖氨酸，Pal(3)＝3-(3-吡啶基)丙氨酸，Nal(2)＝3-(2-萘基)丙氨酸，Phe＝苯丙氨酸，Cpa＝4-氯苯丙氨酸，Pro＝脯氨酸，Ser＝丝氨酸，Thr＝苏氨酸，Trp＝色氨酸，Tyr＝酪氨酸和Sar＝肌氨酸。如果无其它说明，所有这里描述的氨基酸都是L-系列。例如D-Nal(2)是3-(2-萘基)-D-丙氨酸的缩写以及Ser是L-丝氨酸的缩写。赖氨酸侧链中ε-氨基的取代是通过Lys后置于括号中的标志、任选用缩写表示。
所用的其它缩写是：
Ac     乙酰基
Atz    3-氨基-1，2，4-三唑-5-羰基
B      4-(4-脒基-苯基)-氨基-1，4-二氧代-丁基
Boc    叔丁基氧基羰基
Bop    苯并三唑-1-氧基-三-(二甲基氨基)-六氟磷酸鏻
DCC    双环己基碳化二亚胺
DCM    二氯甲烷
Ddz    二甲氧基苯基-二甲基亚甲基氧基-羰基(二甲氧基二甲
       基-Z)
DIC    二异丙基碳化二亚胺
DIPEA  N，N-二异丙基乙胺
DMF    二甲基甲酰胺
Fmoc   芴基甲基氧基羰基
HF     氢氟酸
HOBt   1-羟基苯并三唑
HPLC   高压液相色谱
Me     甲基
TFA    三氟乙酸
Z      苄基氧基羰基
Hci    高瓜氨酸
Cpa    4-氯苯丙氨酸
本发明的肽是黄体生成素释放激素(LH-RH)的类似物的，该激素具有p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2，[LH-RH，戈那瑞林]的结构。
在20多年中研究人员寻求LH-RH-十肽的选择性高效拮抗剂[M.Karten和J.E.Rivier，Endocrine Reviews 7，44-66(1986)]。对这些拮抗剂的高度兴趣是基于其在内分泌学、妇科学、避孕和癌症领域的有益作用。已合成了大量潜在的LH-RH-拮抗剂化合物。至今发现的最令人感兴趣的化合物是对LH-RH-结构进行修饰的那些。
第一批高效的拮抗剂是通过在1，2，3和6或2，3和6位引入芳香氨基酸基团得到的。这些化合物的一般描述如下：首先表明在LH-RH肽链中取代了原始存在的氨基酸的氨基酸，其中发生交换的位置通过数字上标标明。此外通过后置的符号″LH-RH″表明其涉及LH-RH-类似物，其中发生了交换。Meienhofer，J.(编辑)Peptides；Proceedings of the 6thAmerican Peptid Symposium，S.775-779，Pierce Chem.Co.，Rockville III.(1979)：[Ac-Pro1，D-Cpa2，D-Nal(2)3.6]LH-RH(US-Patent Nr.4.419.347)和[Ac-Pro1，D-Cpa2，D-Trp3.6]LH-RH(J.L.Pineda，等，J.Clin.Endocrinol.Metab.56，420，1983)。
为了改进拮抗作用后来引入碱性氨基酸，例如在6-位引入D-Arg。例如[Ac-D-Cpa1，2，D-Trp3，D-Arg6，D-Ala10]LH-RH(ORG-30276)(D.H.Coy，等，Endocrinology 100，1445，1982)；和[Ac-D-Nal(2)1，D-Phe(4-F)2，D-Trp3，D-Arg6]LH-RH(ORF18260)(J.E.Rivier等，在：Vickery B.H.Nestor，Jr.J.J.，Hafez，E.S.E(编辑).LHRH and its Analogs，S.11-22MTP Press，Lancaster，UK 1984)。
在WO92/19651、WO94/19370、WO92/17025、WO94/14841、WO94/13313、US-A5,300,492、US-A5,140,009、EP 0 413 209A1和DE195 44 212A1描述了其它高效的LH-RH-拮抗剂。
最近公开的具有6-位鸟氨酸-或赖氨酸构建单元修饰的化合物对应于如下分子式：
     Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-Tyr5-D-Xxx6-Leu7-Arg5-Pro9-D-Ala10-NH2，
其中D-Xxx是式(VI)的氨基酸残基
Figure C0080673400061
此外WO97/19953和EP-A20328090描述了LH-RH-拮抗剂。
其它已知的LH-RH-拮抗剂是Antarelix、Ganirelix和Cetrorelix。
Antarelix：
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-Tyr5-D-Hci6-Leu7-Lys(iPr)8-Pro9-D-Ala10-NH2
Ganirelix：
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-Tyr5-D-hArg(Et)2 6-Leu7-hArg(Et)2 8-Pro9-D-Ala10-NH2
Cetrorelix：
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-Tyr5-D-Cit6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2
本发明的目的是提供具有提高的酶稳定性和水溶性显著改善的新的LH-RH-拮抗剂。
这一目的通过下列通式(I)的化合物及其与可药用酸的盐，特别是乙酸盐、双羟萘酸盐(Embonate)和三氟乙酸盐得以实现，
A-Xxx1-Xxx2-Xxx3-Xxx4-Xxx5-Xxx6-Xxx7-Xxx8-Xxx9-Xxx10-NH2
                                                             (1)
其中
A为乙酰基或3-(4-氟苯基)-丙酰基，
Xxx1为D-Nal(1)或D-Nal(2)，
Xxx2-Xxx3为D-Cpa-D-Pal(3)或单键，
Xxx4为Ser，
Xxx5为N-Me-Tyr，
Xxx6为D-Cit、D-Hci或通式(II)的D-氨基酸残基
Figure C0080673400071
其中n为数字3或4，R1为通式III的基团，
-(CH2)p-CO-NR2R3                 (III)
其中p为1到4的整数，R2为氢或烷基和R3为未取代或取代的芳基或杂芳基，或R1为3-氨基-1，2，4-三唑-5-羰基或R1为通式(IV)的环
Figure C0080673400081
其中q为数字1或2，R4为氢原子或烷基，R5为氢原子或烷基和x为氧原子或硫原子，
Xxx7为Leu或Nle，
Xxx8为Arg或Lys(iPr)，
Xxx9为Pro以及
Xxx10为Ala或Sar。
在本发明化合物中，其中Xxx6为D-[ε-N’-(咪唑烷-2-酮-4-基)-甲酰基]-Lys、D-(3-氨基-1，2，4，-三唑-3-羰基)-Lys，缩写为D-Lys(Atz)或D-[ε-N’-4-(4-脒基苯基)-氨基-1，4-二氧代-丁基]-Lys，缩写为D-Lys(B)的那些是特别优选的。
此外特别优选的本发明化合物是：
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Nle7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2，
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(Atz)6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2，
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(B)6-Leu7-Lys(iPr)8-Pro9-D-Ala10-NH2，
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(B)6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2，
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Nle7-Lys(iPr)8-Pro9-Ala10-NH2，
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Nle7-Lys(iPr)8-Pro9-Sar10-NH2，
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Nle7-Arg8-Pro9-Sar10-NH2，
3-(4-氟苯基)-丙酰基-D-Nal(1)1-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(Atz)6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2，
及其与上述可药用酸的盐。
本发明化合物可用于治疗激素依赖性肿瘤，特别是前列腺癌或乳腺癌以及其治疗需要抑制LH-RH-激素的非恶性适应症。为此将这些化合物与常规载体或助剂混合并制成药物。
式(I)化合物的合成既可通过传统的片段缩合或者通过按Merrifield的方法经固相合成，用侧链中已经用通式R1-COOH的羧酸酰化的D-赖氨酸顺序合成，也可以通过十肽与相应的羧酸通过在D-赖氨酸6侧链上的成酰胺反应进行。因此可在该方法的三个不同阶段引入R1-CO-基：在单一构建单元缩合到肽上之前，在赖氨酸或鸟氨酸嵌入肽链之后，但在下一个构建单元缩合之前或在所有构建单元缩合之后。
式(I)化合物按已知方法合成，如通过纯粹固相合成技术、部分固相合成技术(所谓片段缩合)、或通过传统的溶液连接(参见M.Bodanszky，“Principles of Peptide Synthesis”，SpringerVerlag 1984)。
例如固相合成法在教科书“Solid Phase Peptide Synthesis”J.M.Stewart和J.D.Young，Pierce Chem.Company，Rockford，III，1984和在G.Barany和R.B.Merrifield的“ThePeptides”，Ch.1，S.1-285，1979，Academic Press Inc.中有描述。传统的溶液合成在“Methoden der OrganischenChemie(Houben-Weyl)，Synthese von Peptiden”E.Wünsch(Herausgeber)1974，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，BRD中详细讨论。
逐级合成例如通过如下进行：首先将其α-位的氨基被保护的羧基-端基氨基酸共价键连接到为此常用的不溶的载体上，脱去该氨基酸的α-氨基-保护基，在如此得到的游离氨基上连接下一个保护的氨基酸的羧基，按这种方式逐步将要合成肽的其余氨基酸按正确的顺序连接，连接完所有氨基酸后将制好的肽从载体上解离下来并任选将其它存在的侧功能保护基解离。逐级缩合通过用相应的、按常规方式保护的氨基酸按传统的方式进行合成。
单个氨基酸相互之间的连接按对此常规的方法进行，尤其考虑的方法是：
·在二环己基碳化二亚胺或二异丙基碳化二亚胺(DCC，DIC)的存在下的对称酸酐法
·普通碳化二亚胺法
·碳化二亚胺-羟基苯并三唑法(参见The Peptides，Volume 2，Ed.E.Gros s和J.Meienhofer编辑)。
在片段偶联中优选应用无外消旋化作用的叠氮化物偶联或DCC-1-羟基苯并三唑法，或DCC-3-羟基-4-氧代-3，4-二氢-1，2，3-苯并三嗪法。也可以使用片段的活性酯。
N-保护的氨基酸的活性酯特别适合于氨基酸的逐步缩合，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯或2，4，5-三氯苯基酯。氨解可很好的被具有大约乙酸酸性的N-羟基化合物，如1-羟基苯并三唑催化。
作为中间的氨基保护基可使用可氢化除去的基团，例如苄基氧基羰基(＝Z-基团)或弱酸可解离基团。作为α-位氨基的保护基可考虑的有例如：叔丁基氧基羰基，芴基甲基氧基羰基，苄酯基已及苄硫酯基(任选各具有对-溴或对-硝基-苄基)，三氟乙酰基，邻苯二甲酰基，邻-硝基苯氧基乙酰基，三苯甲基，对-甲苯磺酰基，苄基，苯环上取代的苄基(对-溴或对-硝基苄基)和α-苯基乙基。对此也可参阅Jesse P.Greenstein和Milton Winitz，Chemistry of Amino Acids，NewYork 1961，John Wiley and Sons，Inc.，Volume 2，例如883页和下列：“Principles of Peptide Synthesis”，SpringerVerlag 1984，“Solid Phase Peptide Synthesis”J.M.Stewart和J.D.Young，Pierce Chem.Company，Rockford，III，1984，G.Barany和R.B.Merrifield“The Peptides”，Ch.1，S.1-285，1979，Academic Press Inc.以及ThePeptides，Volume 2，Ed.E.Gross and J.Maienhofer，Academic Press，New York。这些保护基基本也适合保护相应氨基酸的其它侧功能基(OH-基，NH2-基)。
存在的羟基(丝氨酸，苏氨酸)优选用苄基和类似基团保护。其它非α-位氨基(例如ω-位氨基，精氨酸的胍基)优选正交保护。
除经R1-CO-基团修饰的赖氨酸或鸟氨酸外，单一的氨基酸构建单元可商购获得。制备最后提及化合物的可能方法如下：
1.将α-羧基酰胺化。
2.将ε-氨基用Z-基团保护。
3.将α-氨基用Boc-基团保护，以使得到稍后去掉氨基保护基时的选择性。
4.将ε-氨基上的Z-基团脱掉。
5.在ε-氨基上引入希望的R4-CO-基。
6.将α-氨基上的Boc-基团脱掉。
7.赋予α-氨基以Z-基团。
对于通过赖氨酸的氨基与相应的羧酸反应引入R1-CO-基一般适用与上述氨基酸的连接相同的方法。但特别优选的是应用碳化二亚胺，例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺和1-羟基苯并三唑的缩合。
用于连接氨基酸的反应在对此常规的惰性的溶剂或悬浮剂(例如二氯甲烷)中进行，其中为改善溶解性可任选加入二甲基甲酰胺。
不溶性聚合物适合用作合成载体，例如在有机溶剂中可溶胀的珠状聚苯乙烯树脂(例如聚苯乙烯和1％二乙烯基苯的共聚物)。在甲基二苯甲基酰胺树脂(MBHA-树脂，即具有甲基-二苯甲基酰胺基的聚苯乙烯树脂)上合成保护的十肽酰胺可按下列流程图进行，其在用HF从载体上解离后得到希望的肽C-端酰胺官能团：
流程图
肽合成法
  步骤   作用   溶剂/试剂(v/v)   时间
  1   洗涤   甲醇   2×2分钟
  2   洗涤   DCM   3×3分钟
  3   解离   DCM/TFA(1∶1)   1×30分钟
  4   洗涤   异丙醇   2×2分钟
  5   洗涤   甲醇   2×2分钟
  6   洗涤   DCM   2×3分钟
  7   中和   DCM/DIPEA(9∶1)   3×5分钟
  8   洗涤   甲醇   2×2分钟
  9   洗涤   DCM   3×3分钟
  10   停止   在DCM+DIC+HOBt中加入Boc-As
  11   偶联   DCM，任选DCM/DCF   约90分钟
  12   洗涤   甲醇   3×2分钟
  13   洗涤   DCM   2×3分钟
Nα-Boc-保护的氨基酸一般以三倍摩尔过量在二异丙基碳化二亚胺(DIC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)的存在下于CH2Cl2/DMF中、90分钟内偶联，Boc-保护基与50％三氟乙酸(TFA)CH2Cl2溶液反应半小时脱掉。为验证是否完全反应可用Christensen的氯醌试验和Kaiser的茚三酮试验。其它的游离氨基官能团通过在五倍过量的乙酰基咪唑的CH2Cl2溶液中乙酰化保护。肽在树脂上合成的反应步骤的顺序如流程图所示。为解离下树脂结合的肽将固相合成的各终产物在真空下用P2O5干燥并在0℃下用500倍过量的HF/苯甲醚10∶1/V∶V处理60分钟。
在真空下蒸出HF和苯甲醚后将肽酰胺与无水乙醚搅拌得到白色固体，与沉淀出的聚合物载体的分离通过用50％的乙酸水溶液洗涤进行。通过在真空下小心的浓缩乙酸溶液可得到粘稠油状的相应肽，这些粘稠油状物在冷却下加入无水乙醚转化成白色固体。
进一步的纯化通过常用的制备高压液相方法(HPLC)进行。
将肽转化成酸加成盐可通过肽与酸按已知的方法完成。反之，游离肽可通过其酸加成盐与碱反应得到。肽双羟萘酸盐可通过肽的三氟乙酸盐(TFA-盐)与游离的双羟萘酸或双羟萘酸相应的二钠盐反应制备。为此，将肽-TFA盐的水溶液与双羟萘酸二钠盐在极性、非质子传递介质，优选二甲基乙酰胺中的溶液混合并分离出形成的亮黄色沉淀。
下列实施例用于说明本发明，并不对本发明构成限制。
实施例1
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Nle7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2
合成按固相流程图进行(肽合成法，第9页)，由3.3g MBHA-树脂(负载密度为1.08mmol/g)，用DIC/HOBt-偶联。在用HF从聚合物载体上解离后得到3.4g粗品肽，并用标准的制备HPCI方法纯化。在冷冻干燥后得到1.43g HPLC纯的分子式为C72，H96，N17，O14，Cl的产物，具有正确的FAB-MS：1458.7(M+H+)(计算值：1457.7)，及相应的1H-NMR-谱。
1H-NMR(500MHz，D2O/DMSO-d6，δ用ppm表示)：
8.7-7.2，多个m，芳香H和未完全交换的NH；6.92和6.58，2d，2x2H，芳香H对-C1-Phe；5.2-3.5，多个m，Cα-H和脂族H；3.2-2.6，多个m，芳香Cβ-H，2.1-0.7，多个m，其余的脂族H；1.70，s，3H，乙酰基；1.20，d，3H，Cβ-H Ala；0.8，m，Cδ-H Leu
实施例2
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(B)6-Leu7-Lys(iPr)8-Pro9-D-Ala10-NH2
合成按流程图进行(肽合成法，第9页)，由4.0g MBHA-树脂(负载密度为1.11mmol/g)，用DIC/HOBt-偶联。在用HF从聚合物载体上解离后得到4.87g粗品肽，并用标准的制备HPCI方法纯化。在冷冻干燥后得到0.93g HPLC纯产物，该产物与4-脒基苯基氨基-4-氧代丁酸在BOP作为偶联剂存在下反应得到希望的化合物。再次用HPLC纯化得到148mg结构式为C85，H112，N17，O15，Cl的目标化合物，具有正确的ESI-MS：1647.6(M+H+)，(计算值：1645.8)和相应的1H-NMR谱。
1H-NMR(500MHz，DMSO-d6，δ用ppm表示)：10.4，s，1H和9.13，s，2H，和8.94，s，2H，4-脒基苯胺的NH；8.6-7.35，多个m，芳香H和NH；7.22和7.18，2d，4H，芳香H(对-Cl)Phe；6.95和6.58，2d，4H，芳香H Tyr；5.2-3.5，多个m，Cα-H和脂族H；3.3-2.4，多个m，Cβ-H和N-CH3，2.1-1.1，多个m，其余的脂族H，1.68，s，3H，乙酰基；1.20，d，3H，Cβ-H Ala；0.83，dd，6H，Cδ-H Leu
实施例3
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(B)6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2
合成按固相流程图进行(肽合成法，第9页)，由4.0g MBHA-树脂(负载密度为0.97mmol/g)，用DIC/HOBt-偶联。在用HF从聚合物载体上解离后得到4.0g粗品肽，并用标准的制备HPCI方法纯化。在冷冻干燥后得到1.39g HPLC纯产物，该产物与4-脒基苯基氨基-4-氧代丁酸在BOP作为偶联剂存在下反应得到希望的化合物。再次用HPLC纯化得到440mg结构式为C82，H106，N19，O15，Cl的目标化合物，具有正确的ESI-MS：1632.7(M+H+)，(计算值：1631.7)和相应的1H-NMR谱。
1H-NMR(500MHz，DMSO-d6，δ用ppm表示)：
10.4，s，1H和9.15，s，2H，和9.0，s，2H，4-脒基苯胺的NH；8.60，m，2H，芳香H；8.3-7.2，多个m，芳香H和NH；7.27和7.20，2d，4H，芳香H(对-Cl)Phe；6.96和6.60，2d，4H，芳香H Tyr；5.2-3.5，多个m，Cα-H和脂族H；3.2-2.4，多个m，Cβ-H和N-CH3，2.1-1.1，多个m，其余的脂族H，1.70，s，3H，乙酰基；1.20，d，3H，Cβ-H Ala；0.85，dd，6H，Cδ-H Leu
实施例4
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Nle7-Lys(iPr)8-Pro9-Ala10-NH2
合成按固相流程图进行(肽合成法，第9页)，由2.5g MBHA-树脂(负载密度为1.08mmol/g)，用DIC/HOBt-偶联。在用HF从聚合物载体上解离后得到2.78g粗品肽，并用标准的制备HPCI方法纯化。在冷冻干燥后得到400mg HPLC纯的分子式为C75，H102，N15，O14，Cl的产物，具有正确的ESI-MS：1472.6(M+H+)(计算值：1471.7)，及相应的1H-NMR-谱。
1H-NMR(500MHz，D2O/DMSO-d6，δ用ppm表示)：
8.62，m，2H，8.30，m，2H，7.80，m，4H，7.66，S，1H，7.47，m，2H，7.36，d，1H，芳香H；7.25和7.20，2d，4H，芳香H(对-Cl)Phe；6.96和6.63，2d，4H，芳香H Tyr；5.10-4.0，多个m，Cα-H和脂族H；3.75-2.65，多个m，Cβ-H和N-CH3；2.1-1.05，多个m，其余的脂族H；1.74，s，3H，乙酰基；1.23，d，3H，Cβ-HAla；1.20，m，CH3异丙基；0.8，m，3H，Cδ-H Nle
实施例5
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Nle7-Lys(iPr)8-Pro9-Sar10-NH2
合成按固相流程图进行(肽合成法，第9页)，由2.5g MBHA-树脂(负载密度为1.08mmol/g)，用DIC/HOBt-偶联。在用HF从聚合物载体上解离后得到2.74g粗品肽，并用标准的制备HPCI方法纯化。在冷冻干燥后得到840mg HPLC纯分子式为C75，H102，N15，O14，Cl的产物，具有正确的ESI-MS：1472.6(M+H+)(计算值：1471.7)，及相应的1H-NMR-谱。
1H-NMR(500MHz，D2O/DMSO-d6，δ用ppm表示)：
8.6，m，2H，8.3，m，2H，7.85，m，2H，7.8，m，2H，7.65，s，1H，7.46，m，2H，7.35，d，1H，芳香H；7.23和7.17，2d，4H，芳香H(对-Cl)Phe；7.0和6.6，2d，4H，芳香H Tyr；5.10-3.8，多个m，Cα-H和脂族H；3.75-2.6，多个m，Cβ-H和N-CH3；2.2-1.05，多个m，其余的脂族H；1.70，s，3H，乙酰基；1.23，d，3H，Cβ Ala；1.20，m，CH3异丙基；0.8，m，3H，Cδ Nle
实施例6
3-(4-氟苯基)-丙酰基-D-Nal(1)1-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(Atz)6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2
合成按固相流程图进行(肽合成法，第9页)，由9.2g MBHA-树脂(负载密度为1.08mmol/g)，用DIC/HOBt-偶联。在用HF从聚合物载体上解离后得到5.8g粗品肽，并用标准的制备HPCI方法纯化。在冷冻干燥后得到2.0gHPLC纯的未取代八肽，0.4mmol该产物与0.5mmol 3-氨基-1，2，4-三唑-5-甲酸在PyBOP作为偶联剂存在下反应得到790mg希望化合物的粗产物。再次用HPLC纯化得到200mg结构式为C64，H86，N17，O12，F的目标化合物，具有正确的FAB-MS：1304.6(M+H+)，(计算值：1303.6)。
1H-NMR(500MHz，D2O/DMSO-d6，δ用ppm表示：
8.14，m，1H，7.90，m，1H，7.80，m，1H，7.50，m，2H，7.35，m，2H，7.0，m，6H，7.63，m，2H，芳香H；5.0，m，1H，4.83，m，2H，4.41，m，1H，4.30-4.05，多个m，4H，Cα-H；3.66-2.25，多个m，脂族和芳香侧链H；2.95，s，和2.75，s，N-Me；2.05-1.1，多个m，其余的脂族H；1.20，d，Cβ-H Ala；0.75，m，6H，Cδ-H Leu
研究了本发明式I化合物在其受体上的结合。研究方法主要依据Beckers等，Eur.J.Bi ochem.231，535-543(1995)中描述的方法。按上述公开的合成得到的Cetrorelix应用IodoGen-试剂(Pierce)用[125I](Amersham；比活性为80.5Bq/fmol)碘化。反应混合物经反相高效液相色谱纯化，由此得到不含未标记肽的单碘化的Cetrorelix。各约80％的[I125]-Cetrorelix和未标记的本发明化合物适合用于特异性受体结合。
可以用下述方法1和2测定本发明化合物的体外作用。对此测定了在用[I125]-Cetrorelix(方法1)的结合试验中的结合亲和性和用曲普瑞林作为激动刺激剂(方法2)的功能活性。
方法1
受体结合试验按Beckers，T.，Marheineke，K.，Reilaender，H.，Hilgard P.(1995)“具有稳定超表达人类垂体受体促性腺激素释放素(GnRH)的哺乳动物细胞系的选择和表征(Selection andcharacterization of mammalian cell lines with stableoverexpression of human pituitary receptors forgonadoliberin(GnRH))”Eur.J.Biochem.231，535-543。
为研究受体结合，将Cetrorelix应用IodoGen-试剂(Pierce)用[125I](Amersham；比活性为80.5Bq/fmol)碘化，反应混合物经高效液相色谱用交换相纯化，由此得到不含未标记肽的单碘化的Cetrorelix。约80％的[125I]-Cetrorelix能够用于特异性受体结合。
受体结合试验用完整的细胞在生理条件下进行(如Beckers等1995描述的方法)。将表达人类LHRH-受体的稳定转染的LTK-细胞的亚铺满培养物通过在NaCl/Pi(137mM NaCl，2.7mM KCl，8.1mM Na2HPO4，11.47mM KH2PO4)/1mM EDTA中培养而分离出并通过离心收集。将细胞再分散到结合缓冲液(无H2CO3的DMEM，含有4.5g/1葡萄糖，10mMHepes pH7.5，0.5％(质量/体积)BSA，1g/l杆菌肽，0.1g/l SBTI，0.1％(质量/体积)NaN3)中。为进行竞争试验将0.25×106细胞/100μl与约225pM的[125I]-Cetrorelix(比活性为5-10×105dpm/pmol)和不同浓度的未标记的本发明化合物作为竞争剂一起温育。100μl结合介质中的细胞悬浮体在400μl的小试管中的200μl 84Vol.-％硅油(MerckTyp550)/16Vol.-％石蜡油上分层。在37℃、慢慢不停的摇动下温育1小时后通过9000rpm(Rotortyp HTA13.8；Heraeus S epatec，Osterode/Germany)离心2分钟将细胞从温育介质中分出。将包含细胞沉淀物的小管底部割下，然后用γ-射线计数分析细胞沉淀物和上清液。非特异性结合的量在包括未标记的Cetrorelix在内的情况下在最终浓度为1μM下测定，并且一般小于等于总结合的10％。结合数据的分析用EBDA/配体-分析软件(Biosoft V3.0)进行。
方法2
确定拮抗效力的功能分析
该试验按修改过的如Beckers，T.，Reilaender，H.，Hilgard，P.(1997)在“基于灵敏细胞虫荧光素酶报道基因试验的促性腺激素-释放激素类似物的表征(Characterization of gonadotropin-releasing hormone analogs based on a sensitive cellularluciferase reporter gene assay”，Analyt.Biochem.251，17-23(Beckers等.1997)描述的方法进行。每孔10,000个表达人类LHRH-受体和虫荧光素酶-报道基因的细胞在微量滴定板中用含有添加剂和1％(v∶v)FCSi的DMEM培养24小时。然后用1nM[D-Trp6]LHRH刺激细胞6小时。在刺激前加入拮抗性的本发明化合物，最后为了定量细胞的Luc-活性将细胞溶解。由剂量-作用-曲线计算IC50-值通过用Hill-模型(Programm EDX2.0 von C.Grunwald，Arzneimittelwerk Dresden)进行非线性回归分析完成。
Luc-活性的定量基本如(Promega Technical Bulletins#101/161)的描述用各虫荧光素酶-测试体系(Promega E4030)重复测定两次。通过加入辅酶A(CoA)发生有益动力学的虫荧光素(Luciferyl)-CoA的氧化。除去微孔滴定板中的培养介质后，加入100μl溶解缓冲液(25mM Tris-磷酸盐pH7.8，2mM二硫苏糖醇，2mM1，2-二氨基环己烷-N，N，N’，N’-四乙酸(CDTA)，10％(v∶v)甘油，1％(v∶v)Triton X-100)将细胞溶解。在室温下温育15分钟后将10μl细胞溶解液转移到适合于发光检测的白色微量滴定板(Dynatech)中。酶反应通过加入50μl测试缓冲液(20mM Tricin pH7.8，1.07mM(MgCO3)4Mg(OH)2，2.67mM MgSO4，0.1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，33.3mM二硫苏糖醇，270μM辅酶A，470μM萤火虫(PhotinusPyralis)-虫荧光素，530μM rATPNa2)引发。1分钟后用EG&GBerthold MicroLumat LB 96P测定具有5分钟信号半数时间的发光1秒钟。
用这种方式得到下列体外测定数据，其中KD为结合亲和性和IC50为功能活性和pM表示每升皮摩尔：
化合物     KD[pM]     IC50[pM]
Cetrorelix     170(21)     198(5)
实施例1(乙酸盐)     n.b.     242(3)
实施例2     181(1)     684(2)
实施例3     154(1)     492(2)
实施例6     n.b.     221(2)
n.b.＝未测定
(  )＝彼此独立试验次数

Claims (11)

1.通式I的化合物及其与可药用酸的盐
A-Xxx1-Xxx2-Xxx3-Xxx4-Xxx5-Xxx6-Xxx7-Xxx8-Xxx9-Xxx10-NH2
                                                            (I)
其中
A为乙酰基或3-(4-氟苯基)-丙酰基，
Xxx1为D-Nal(1)或D-Nal(2)，
Xxx2-Xxx3为D-Cpa-D-Pal(3)或单键，
Xxx4为Ser，
Xxx5为N-Me-Tyr，
Xxx6为D-Hci，
Xxx7为Nle，
Xxx8为Arg或Lys(iPr)，
Xxx9为Pro及
Xxx10为Ala或Sar。
2.权利要求1的化合物，其中的盐为乙酸盐，三氟乙酸盐，或双羟萘酸盐。
3.权利要求1的化合物，具有以下分子式：
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Nle7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2.
4.权利要求1的化合物，具有以下分子式：
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Nle7-Lys(iPr)8-Pro9-Ala10-NH2.
5.权利要求1的化合物，具有以下分子式：
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Nle7-Lys(iPr)8-Pro9-Sar10-NH2.
6.权利要求1的化合物，具有以下分子式：
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Nle7-Arg8-Pro9-Sar10-NH2.
7.一种药物组合物，其中包含权利要求1-6之任一项的化合物。
8.制备权利要求1的通式I化合物的方法，其中按常规方法在固相上或溶液中合成由用合适保护基保护的构建单元Xxxm构成的片段，其中m为1-10的整数且Xxx1是乙酰化的，然后将片段经节段偶联连接至固相上，偶联完成后按常规方法在在构建单元Xxx10上酰胺化的情况下将通式I化合物从固相载体上解离。
9.权利要求1-6的化合物在制备治疗激素依赖性肿瘤以及治疗需要抑制LH-RH-激素的非恶性适应症的药物中的用途。
10.权利要求9的用途，其中所述激素依赖性肿瘤为前列腺癌或乳腺癌。
11.制备药物的方法，其中将权利要求1-6的化合物与常规载体和助剂混合并加工成药物。
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