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CN118525097A - 组成型表达用新型启动子变异体及其用途 - Google Patents

组成型表达用新型启动子变异体及其用途 Download PDF

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CN118525097A
CN118525097A CN202380015888.3A CN202380015888A CN118525097A CN 118525097 A CN118525097 A CN 118525097A CN 202380015888 A CN202380015888 A CN 202380015888A CN 118525097 A CN118525097 A CN 118525097A
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recombinant
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CN202380015888.3A
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崔银硕
李芝河
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Daesang Corp
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Abstract

本发明提供在大肠杆菌(Escherichia coli)的tatA(双精氨酸转位酶A(twin arginine translocase A))基因启动子中插入、缺失或取代一部分核苷酸的新型启动子变异体。本发明的新型启动子变异体可以组成型地高水平表达目标蛋白质，尤其可以在大肠杆菌中组成型地高水平表达酶。因此，在利用由包含本发明的新型启动子变异体表达载体转化的重组菌株的情况下，可以经济地大量生产目标蛋白质，尤其是酶。例如，在利用由包含本发明的新型启动子变异体的表达载体转化的重组菌株的情况下，可以经济地大量生产阿洛酮糖差向异构酶或从果糖经济地大量生产阿洛酮糖。

Description

组成型表达用新型启动子变异体及其用途
技术领域
本发明涉及新型启动子变异体等，更详细地，涉及能够组成型地高水平表达目标蛋白质的新型启动子变异体及其多种用途。
背景技术
随着分子生物学的发展，查明了多种调节基因的表达的机制。基因的表达是指通过在细胞中发生的转录(transcription)及翻译(translation)并根据输入到基因中的密码来合成蛋白质的一系列过程。尤其，转录过程作为基因表达的初期阶段，通过核糖核酸(RNA)聚合酶在多种辅助因子的帮助下与存在于基因的上游的启动子(promoter)序列结合来开始，转录因子(TF，transcription factor)为上述辅助因子中的一种，已知与启动子序列直接结合。尤其在原核生物中，基因表达的调节主要在转录阶段发生，不断有新的转录因子及启动子被研究人员发现。
产业上为了生产酶等外源性蛋白质，主要使用通过由包含外源性蛋白质基因pET型的表达载体转化的大肠杆菌等原核生物来制备的转化体作为表达系统。由pET型的表达载体转化的原核生物表达系统通常需要异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)等昂贵的表达诱导剂(inducer)，具有需要细微地调节诱导剂浓度或设备、表达诱导时间等的缺点。
另一方面，为了大量生产具有将果糖转化为阿洛酮糖(allulose或Psicose)的活性的阿洛酮糖差向异构酶，提出了将作为普遍认为安全的(GRAS，Generally RecognizedAs Safe)菌株的棒状杆菌属菌株用作宿主细胞的表达系统。与基于棒状杆菌属菌株的阿洛酮糖差向异构酶表达系统相关的，韩国授权专利第10-1656063号公开了编码阿洛酮糖差向异构酶的核苷酸序列以及在其上游可操作地连接的包含在棒状杆菌属菌株中调节上述阿洛酮糖差向异构酶的表达的调节序列的基因表达盒，上述调节序列由转录启动子、第一核糖体结合位点(ribosome binding region，RBS)序列及第一空间序列、接头序列及第二核糖体结合位点(RBS)序列等构成。并且，韩国授权专利第10-1695830号公开了编码阿洛酮糖差向异构酶的核酸序列以及在其上游可操作地连接的包含在棒状杆菌属菌株中调节上述阿洛酮糖差向异构酶的表达的调节序列的基因表达盒，上述调节序列包含大肠杆菌(E.coli)来源的转录启动子(transcription promoter)。然而，基于棒状杆菌的阿洛酮糖差向异构酶表达系统的可使用的启动子的表达水平低且可选择的酶的范围窄，因此不适合酶的大量表达系统。
因此，为了大量生产阿洛酮糖差向异构酶或利用阿洛酮糖差向异构酶从果糖大量生产阿洛酮糖，不仅是将棒状杆菌用作宿主细胞的情况，还需要开发在大肠杆菌宿主细胞的通常培养条件下不受生长抑制地稳定且高水平地表达外源性蛋白质的组成型表达启动子及包含其的组成型表达系统。
发明内容
技术问题
本发明在以往的技术背景下导出，本发明的目的在于，提供能够组成型地高水平地表达目标蛋白质的新型启动子变异体。并且，本发明的目的在于，提供上述新型启动子变异体的多种用途。
技术方案
本发明的发明人将作为用于表达大肠杆菌(Escherichia coli)的tatA(双精氨酸转位酶A(twin arginine translocase A))基因的启动子的tatA基因启动子与编码阿洛酮糖差向异构酶的多核苷酸可操作地连接来制备重组表达载体并将其导入大肠杆菌来转化。在此情况下，在tatA启动子或阿洛酮糖差向异构酶基因序列中发生随机变异，本发明的发明人从而获得由多种重组表达载体转化的重组大肠杆菌。在通过上述随机变异获得的重组表达载体中，比较由阿洛酮糖差向异构酶基因序列中不发生变异而仅在tatA基因启动子中发生变异的重组表达载体转化的重组大肠杆菌的阿洛酮糖差向异构酶活性的结果，确认到tatA基因启动子的碱基序列中作为第160个核苷酸的胸腺嘧啶(T)后附加胞嘧啶(C)的启动子变异体或tatA基因启动子的碱基序列中作为第146个核苷酸的胞嘧啶(C)被鸟嘌呤(G)取代，作为第148个核苷酸的胞嘧啶(C)被腺嘌呤(A)取代，作为149个核苷酸的腺嘌呤(A)被鸟嘌呤(G)取代，作为第159个核苷酸及第160个核苷酸的鸟嘌呤(G)及胸腺嘧啶(T)缺失的启动子变异体能够组成型地高水平表达阿洛酮糖差向异构酶，从而完成本发明。
为了实现上述目的，本发明的一例提供由序列9的碱基序列或序列10的碱基序列构成的变异体。并且，本发明的一例提供包含由序列9的碱基序列或序列10的碱基序列构成的启动子变异体的重组载体。并且，本发明的一例提供包含编码目标蛋白质的多核苷酸及与其可操作地连接的由序列9的碱基序列或序列10的碱基序列构成的启动子变异体的表达载体。并且，本发明的一例提供由上述表达载体转化的重组菌株。并且，本发明的一例提供利用上述重组菌株来生产目标蛋白质的方法。并且，本发明的优选一例提供从底物制备酶转化反应产物的方法，包括向含底物溶液加入上述重组菌株并进行酶转化反应的步骤。
发明的效果
本发明的新型启动子变异体可以组成型地高水平表达目标蛋白质，尤其可以在大肠杆菌中组成型地高水平表达酶。因此，在利用由包含本发明的新型启动子变异体表达载体转化的重组菌株的情况下，可以经济地大量生产目标蛋白质，尤其是酶。例如，在利用由包含本发明的新型启动子变异体的表达载体转化的重组菌株的情况下，可以经济地大量生产阿洛酮糖差向异构酶或从果糖经济地大量生产阿洛酮糖。
附图说明
图1为本发明实施例中制备的重组表达载体pPtatAm1:FpDPE(W29K/A77S/G216S/M234I)的图谱。
图2为本发明实施例中制备的重组表达载体pPtatAm2:FpDPE(W29K/A77S/G216S/M234I)的图谱。
图3为本发明的实施例中制备的重组表达载体pPblma:FpDPE(W29K/A77S/G216S/M234I)的图谱。
图4示出利用本发明实施例中制备的重组大肠杆菌进行果糖向阿洛酮糖的转化反应时随反应时间的转化率。
具体实施方式
以下，具体说明本发明。
本发明中使用的术语“启动子”是指通过与作为转录对象的目标核苷酸序列可操作地连接来调节上述目标核苷酸序列的转录的最小的核酸序列。并且，在上述启动子中，为了表达通过细胞类型特异性、外部信号或制剂诱导的可调节的启动子依赖性基因，可以包含充分的启动子结构，这样的结构可以位于基因的5'或3'部分。上述启动子同时包含保护性启动子及诱导性启动子二者。启动子序列可以源自原核生物、真核生物或病毒。原核生物中的启动子大体定义为紧邻核糖核酸聚合酶结合的转录起始位点(Transcription StartSite)的结合部位。
本发明中使用的术语启动子变异体定义为通过基本启动子的核酸序列中的一部分核苷酸的缺失、附加或取代来具有与基本启动子不同或提高的目标蛋白质表达活性的启动子。
本发明中使用的术语“同源性”表示与野生型(wild type)或具有相同活性的变异体的核酸序列示出相同性，同源性的比较可以通过肉眼或者利用便于购买的比较程序来比较并以百分率(％)计算两个以上的序列间的同源性。
本发明中使用的术语“目标蛋白质”为外源性蛋白质，是指在表达上述蛋白质的转化的菌株(或宿主细胞)中无法正常存在的蛋白质。
本发明中使用的术语“多核苷酸”是指所有非变形(non-modified)或变形的(modified)核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)。上述多核苷酸包括单链或双链脱氧核糖核酸、作为单链及双链区域的混合物的脱氧核糖核酸、单链及双链核糖核酸、作为单链及双链区域的混合物的核糖核酸或它们的杂化分子，但不限定于此。
本发明中使用的术语“可操作地连接的(operably linked)”定义为启动子序列与编码所目标的蛋白质的核苷酸序列通过功能性连接来使启动子处于可调节目标蛋白质的表达的状态。例如，在启动子能够控制编码序列的表达的情况下(即，编码序列处于启动子的转录调节下时)，启动子通过与编码序列连接来启动，或者在核糖体结合位点能够促进翻译的情况下，核糖体结合位点与编码序列连接来启动。编码序列可以在正义方向或反义方向与调节序列连接来启动。
本发明中使用的术语“重组载体”定义为利用限制酶切割启动子变异体或目标基因后将其插入载体来制备的重组脱氧核糖核酸。
本发明中使用的术语“克隆载体”定义为能够向宿主细胞内搬运脱氧核糖核酸片段并再生产的物质。上述克隆载体可以包含多腺苷酸化信号(polyadenylation signal)、转录终止序列(transcription termination sequence)及多克隆位点(multiple cloningsite)。上述多克隆位点包含至少一个核酸内切酶(endonuclease)限制酶切位点(restriction site)。并且，克隆载体还可以包含启动子。并且，在克隆载体内，编码目标蛋白质的多核苷酸可以位于多腺苷酸化信号及转录终止序列的上游。
本发明中使用的术语“表达载体”定义为用来使克隆的脱氧核糖核酸在适当的宿主内转录和翻译所需的脱氧核糖核酸序列，具体地，在存在于个体的细胞内的情况下，是指与插入物可操作地连接以使插入物表达的包含必需调节要素的基因制成物。表达载体可以通过标准的重组脱氧核糖核酸技术来制备及纯化。上述表达载体的种类只要是能够在原核细胞及真核细胞的各种宿主细胞中表达所希望的基因、生产所希望的蛋白质的就不受特别限制。表达载体至少包含启动子、起始密码子、编码所希望的蛋白质的基因以及基因及终止密码子终止子。并且，除上述以外，表达载体还可以适当包含编码信号肽的脱氧核糖核酸、追加表达调节序列、所希望基因的5'侧及3'侧的非翻译区域、选择标记区域或可复制单位等。上述选择标记区域可以为用于筛选所目标的载体的抗生物质的选择标记基因。
本发明中使用的术语“重组菌株”是指通过向宿主细胞导入一种以上编码目标蛋白质的多核苷酸或具有上述多核苷酸的表达载体来转化的细胞。用于将上述表达载体导入宿主细胞来制备转化体的方法有瞬时转染(transient transfection)、显微注射、转导(transduction)、细胞融合、磷酸钙沉淀法、脂质体介导的转染(liposome mmediatedtransfection)、DEAE葡聚糖介导的转染(DEAE Dextran-mediated transfection)、聚凝胺介导的转染(polybrene-mediated transfection)、电穿孔法(electroporation)、电注射法(electroinjection)、聚乙二醇(PEG)等化学处理方法、利用基因枪(gene gun)等的方法、热冲击(heat shock)方法等，但不限定于此。
本发明中使用的术语“底物”是指通过酶的作用转化为或应转化为其他化合物的任意物质或化合物。上述术语不仅包括单一化合物，还包括溶剂、混合物及包含最少一种底物的其他材料等化合物的组合及它们的衍生物。
本发明的一实施方式涉及能够组成型地高水平表达目标蛋白质的新型启动子变异体。本发明一例的新型启动子变异体由序列9或序列10的碱基序列构成。本发明的发明人将由序列9的碱基序列构成的启动子变异体命名为“tatAm1”，将由序列10的碱基序列构成的启动子变异体命名为“tatAm2”。本发明一例的新型启动子变异体tatAm1是由序列1的碱基序列构成的来源于大肠杆菌的tatA基因启动子变异而来的，具体地，在序列1的碱基序列中，在作为第160个核苷酸的胸腺嘧啶(T)以后附加胞嘧啶(C)。并且，本发明一例的新型启动子变异体tatAm2为序列1的碱基序列中作为第146个核苷酸的胞嘧啶(C)被鸟嘌呤(G)取代，作为第148个核苷酸的胞嘧啶(C)被腺嘌呤(A)取代，作为第149个核苷酸的腺嘌呤(A)被鸟嘌呤(G)取代，作为第159个核苷酸及第160个核苷酸的鸟嘌呤(G)及胸腺嘧啶(T)缺失。上述由序列9的碱基序列构成的启动子变异体通过核糖体结合位点(Ribosome-BindingSite，RBS)间隔区(spacer)变异来发生，上述由序列10的碱基序列构成的启动子变异体通过核糖体结合位点周边序列变异来发生。包含本发明一例的新型启动子变异体的表达系统能够在大肠杆菌中组成型地高水平表达目标蛋白质。因此，本发明一例的新型启动子变异体可以用作组成型表达用启动子。本发明一例的新型启动子变异体虽由序列9的碱基序列或序列10的碱基序列构成，但本发明一例的新型启动子变异体的同等范围不限定于此。例如，在保持组成型地高水平表达目标蛋白质的功能的范围内，本发明一例的新型启动子变异体的同等范围包括序列9的碱基序列中的部分核苷酸被取代、插入和/或缺失的启动子。并且，本发明一例的新型启动子变异体的同等范围包括相对于序列9的碱基序列具有实质同源性的序列。上述实质同源性是指序列9的碱基序列或序列10的碱基序列与任意其他序列以最大对应的方式对齐后，通过序列分析确认上述任意其他序列与序列9的碱基序列或序列10的碱基序列具有70％以上、90％以上或98％以上的序列同源性。本发明所属技术领域的普通技术人员易于理解的是，可以利用本发明所属技术领域中公知的基因重组技术等取代、附加或缺失上述新型启动子变异体的碱基序列中的一个以上碱基来在具有实质同源性的范围内制备具有相同或相似活性的多核苷酸。上述同源性的比较可以利用市面上出售的计算机程序以百分比(％)计算两个以上序列间的同源性来进行。因此，本发明一例的新型启动子变异体的同等范围可以包括在能够保持组成型地高水平表达目标蛋白质的功能的范围内与序列9的碱基序列或序列10的碱基序列具有70％以上、80％以上、90％以上、95％以上或99％以上的同源性的碱基序列。
本发明的另一实施方式涉及本发明一例的新型启动子变异体的多种用途。本发明一例的新型启动子变异体的用途在于重组载体、表达载体、重组菌株、目标蛋白质的生产方法、利用重组菌株来发挥目标蛋白质的功能的方法等，但不限定于此。
本发明一例的重组载体包含由序列9的碱基序列或序列10的碱基序列构成的启动子变异体。
上述重组载体可以为克隆载体。上述克隆载体可以包含复制起点、用于克隆目标蛋白质基因的多克隆位点(Multi cloning site，MCS)、转录终止序列(transcriptiontermination sequence)及选择标记物(selection marker)。上述选择标记物用于筛选由载体转化的细胞，可以使用赋予耐药性、营养需求性、对细胞毒性剂的耐性或表面蛋白的表达等可选择表现型的标记物。在处理选择剂(selective agent)的环境中，只有表达选择标记物的细胞存活，从而可以筛选转化的细胞。例如，上述选择标记物可以为卡那霉素(Kanamycin)抗生素耐药性基因或氨苄西林(Ampicillin)抗生素耐药性基因等耐药性基因。
并且，上述重组载体可以为表达载体。上述表达载体包含编码目标蛋白质的多核苷酸以及与其可操作地连接的由序列9的碱基序列构成的启动子变异体。优选地，上述启动子变异体位于编码目标蛋白质的多核苷酸的上游。通过本发明一例的表达载体表达的目标蛋白质不受特别限制，例如，可以在有关碳水化合物的生物合成或代谢的蛋白质、有关脂质及脂肪酸的合成或代谢的蛋白质、有关蛋白质及肽的生物合成或代谢的蛋白质等中选择。并且，在考虑启动子变异体的调节活性时，优选地，上述目标蛋白质为酶。上述酶的种类不受特别限制，可以选自D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-allulose3-epimerase)、D-塔格糖3-差向异构酶(D-tagatose 3-epimerase)、(1→4)-α-D-葡聚糖1-α-D-葡萄糖基变位酶((1→4)-alpha-D-glucan 1-alpha-D-glucosylmutase)、4-α-D-{(1→4)-α-D-葡聚糖}海藻糖海藻糖水解酶(4-alpha-D-{(1→4)-alpha-D-glucano}trehalose trehalohydrolase)、L-鼠李糖异构酶(L-rhamnose isomerase)、6-磷酸果糖-3-差向异构酶(fructose-6-phosphate-3-epimerase)等中，优选地，可以选自D-阿洛酮糖3-差向异构酶、D-塔格糖3-差向异构酶、(1→4)-α-D-葡聚糖1-α-D-葡萄糖基变位酶、4-α-D-{(1→4)-α-D-葡聚糖}海藻糖海藻糖水解酶中。虽未在本发明的实施例中具体记载，但与由序列1的碱基序列构成的来源于大肠杆菌的tatA基因启动子相比时，本发明的新型启动子变异体以更高的水平表达(1→4)-α-D-葡聚糖1-α-D-葡萄糖基变位酶、4-α-D-{(1→4)-α-D-葡聚糖}海藻糖海藻糖水解酶等。只要是具有将果糖转化为阿洛酮糖的活性的酶，上述阿洛酮糖差向异构酶的种类就不受特别限制，例如，可以由序列3的氨基酸序列、序列5的氨基酸序列或序列7的氨基酸序列构成。并且，编码上述阿洛酮糖差向异构酶的多核苷酸可以由序列4的碱基序列、序列6的碱基序列或序列8的碱基序列构成。并且，本发明涉及阿洛酮糖差向异构酶及编码器的多核苷酸的有韩国授权专利公报第10-1919713号、韩国授权专利公报第10-2187354号、韩国授权专利公报第10-1656063号、韩国授权专利公报第10-1695830号、韩国授权专利公报第10-2189458号、韩国授权专利公报第10-1539097号、韩国授权专利公报第10-1539096号、韩国授权专利公报第10-1455759号、韩国授权专利公报第10-1318422号等公开的内容。本发明一优选例的表达载体具有图1的图谱或图2的图谱。具有图1的图谱的表达载体具有依次连接pUC来源的复制起点(replication origin，ori)、由序列9的碱基序列构成的启动子变异体(PtatAm1)、由序列8的碱基序列构成的编码阿洛酮糖差向异构酶的多核苷酸(FpDPE(W29K/A77S/G216S/M234I))、卡那霉素耐药性基因标记物(KanR)等的结构。并且，具有图2的图谱的表达载体具有依次连接pUC来源的复制起点、由序列10的碱基序列构成的启动子变异体(PtatAm2)、由序列8的碱基序列构成的编码阿洛酮糖差向异构酶的多核苷酸(FpDPE(W29K/A77S/G216S/M234I))、卡那霉素耐药性基因标记物(KanR)等的结构。
本发明一例的重组菌株通过向宿主细胞导入由编码目标蛋白质的多核苷酸以及与其可操作地连接的由序列9的碱基序列或序列10的碱基序列构成的启动子变异体形成的表达盒或包含上述表达盒的表达载体来转化。本发明中可以使用表达载体转化的宿主细胞只要是可以顺畅地启动本发明一例的新型启动子变异体的，其种类就不受特别限制，以原核生物为佳，考虑到新型启动子变异体的表达调节活性、脱氧核糖核酸的导入效率、导入的脱氧核糖核酸的表达效率等时，以大肠杆菌为佳。上述大肠杆菌有BL21、JM109、K-12、LE392、RR1、DH5α或W3110等，但不限定于此。
本发明一例的目标蛋白质的制备方法包括：培养前述重组菌株来表达目标蛋白质的步骤；以及从重组菌株的培养液或重组菌株的菌体分离目标蛋白质的步骤。上述目标蛋白质根据其种类可以在表达后存在于重组菌株的菌体内或分泌到重组菌株的菌体外。例如，在目标蛋白质为阿洛酮糖差向异构酶的情况下，通过重组菌株生产的阿洛酮糖差向异构酶存在于重组菌株的菌体内。本发明一优选例的阿洛酮糖差向异构酶的制备方法包括：培养通过导入由编码阿洛酮糖差向异构酶的多核苷酸及与其可操作地连接的由序列9的碱基序列构成的启动子变异体形成的表达盒或包含上述表达盒的表达载体转化的重组菌株来表达阿洛酮糖差向异构酶的步骤；以及从上述表达阿洛酮糖差向异构酶重组菌株的破碎物中分离阿洛酮糖差向异构酶的步骤。本发明一例的新型启动子变异体为组成型表达载体，可以在不使用作为蛋白质表达诱导因子的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷等的情况下诱导表达。在本发明中，阿洛酮糖差向异构酶可以从重组菌株的破碎物中回收。蛋白质表达中使用的细胞可以通过冷冻-解冻重复、超声波处理、机械性破坏或细胞裂解液等多种物理或化学手段来破碎，可以通过通常的生物化学分离技术来分离或纯化(Sambrook et al.,Molecular Cloning:A laboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989；Deuscher,M.,Guide to Protein Purification Methods Enzymology,Vol.182.Academic Press.Inc.,San Diego,CA,1990)。例如，分离或纯化通过宿主细胞表达的蛋白质的方法包括电泳、离心、凝胶过滤、沉淀、透析、色谱(离子交换色谱、亲和色谱、免疫吸附亲和色谱、反相高效液相色谱(HPLC)、凝胶渗透高效液相色谱)、等电聚焦以及它们的多种变化或复合方法，但不限定于此。另一方面，在本发明中，优选地，从重组菌株的破碎物中分离阿洛酮糖差向异构酶的步骤可以通过利用肽标签的亲和色谱(affinitychromatography)来进行。上述肽标签可以使用HA标签、FLAG标签、His标签、生物素羧基载体蛋白(BCCP，biotin carboxyl carrier protein)、c-myc标签、V5标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或麦芽糖结合蛋白(MBP，maltose binding protein)公知的多种标签，其中以His标签为优选。His-标签的蛋白质可以在镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)树脂柱特异性地被捕获，通过二乙胺四乙酸(EDTA)或咪唑来洗脱。
除为制备目标蛋白质而使用以外，本发明一例的重组菌株还可以为间接发挥目标蛋白质的功能而使用。例如，在上述目标蛋白质为酶的情况下，本发明一例的重组菌株可以为从底物制备通过酶转化反应的产物而使用。具体地，在目标蛋白质为阿洛酮糖差向异构酶的情况下，本发明提供包括向含果糖溶液中加入重组菌株并反应的步骤的从果糖制备阿洛酮糖的方法。上述重组菌株为通过导入由编码阿洛酮糖差向异构酶的多核苷酸及与其可操作地连接的由序列9的碱基序列或序列10的碱基序列构成的启动子变异体形成的表达盒或包含上述表达盒的表达载体来转化的宿主细胞，优选地，为重组大肠杆菌。并且，为了促进阿洛酮糖差向异构酶的活性，上述含果糖溶液还可以包含Ca2+、Mn2+等金属离子。并且，上述从果糖制备阿洛酮糖的方法中的反应温度为50～70℃，优选地，为55～65℃，考虑重组菌株的顺畅的酶表达、酶的稳定性及最大活性时，以55～60℃的范围为更优选，反应pH为6.5～8，优选地，为6.5～7.5，更优选地，为6.5～7的范围。并且，上述从果糖制备阿洛酮糖的方法中果糖的浓度不受特别限制，但考虑生产性及经济性时，优选地，以全部反应物为基准，浓度为1～75％(w/w)，更优选地，为35～45％(w/w)。
以下，通过实施例更为具体地说明本发明。但下述实施例仅用于明确例示本发明的技术特征，而不是限定本发明的保护范围。
实施例1：获得用于表达酶基因的启动子
1.1.获得tatA基因启动子
tatA基因启动子作为用于表达大肠杆菌的tatA基因的启动子，由序列1的碱基序列构成，已知为在大肠杆菌内诱导组成型表达的启动子。
为了从大肠杆菌中获得相当于tatA基因的启动子位点的多核苷酸片段，以大肠杆菌MG1655的基因组脱氧核糖核酸(genomic DNA)为模板利用下述表1记载的引物对进行聚合酶链式反应(PCR)。将获得的扩增产物克隆到pGEM-Teasy载体(vector)(PromegaCo.公司，美国(USA))并分析碱基序列的结果，确认为具有160bp长度的由序列1的碱基序列构成的多核苷酸片段。
表1
引物名称 引物说明 引物碱基序列(5'→3')
PtatA-F tatA启动子正向引物 ACCTGAATGGGGGTTGATGC
PtatA-R tatA启动子反向引物 ACATGTTCCTCTGTGGTAG
1.2.获得BLMA基因启动子
BLMA基因启动子作为用于表达地衣形芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的麦芽基因淀粉酶(maltogenic amylase)基因的启动子，由序列2的碱基序列构成，已知为在大肠杆菌内诱导外源性基因的稳定的高水平表达的启动子(参照TAE-JIP KIM et al(1999)Modes of Action of Acarbose Hydrolysis and Transglycosylation Catalyzed by aThermostable Maltogenic Amylase,the Gene for Which Was Cloned from a ThermusStrain)。
为了从地衣形芽孢杆菌中获得相当于麦芽基因淀粉酶基因的启动子位点的多核苷酸片段，以地衣形芽孢杆菌ATCC 14580的基因组脱氧核糖核酸为模板利用下述表2记载的引物对进行聚合酶链式反应。将获得的扩增产物克隆到pGEM-Teasy载体(PromegaCo.公司，美国)并分析碱基序列的结果，确认为具有115bp的长度的由序列2的碱基序列构成的多核苷酸片段。
表2
引物名称 引物说明 引物碱基序列(5'→3')
Pblma-F BLMA启动子正向引物 GGTGTCTCATTCTGTTACCG
Pblma-R BLMA启动子反向引物 GTTTCCCCCTTTTGGTTGTC
实施例2：获得阿洛酮糖差向异构酶变异体克隆载体
本发明的申请人通过韩国授权专利公报第10-14739180号公开了普氏梭杆菌(Flavonifractor plautii)来源的野生型D-阿洛酮糖差向异构酶及编码其的多核苷酸。上述野生型D-阿洛酮糖差向异构酶由序列3的氨基酸序列构成，编码其的多核苷酸由序列4的碱基序列构成。
并且，本发明的申请人通过韩国公开专利公报第10-2021-0132405号公开了从果糖向阿洛酮糖的转化率及热稳定性得到提高的D-阿洛酮糖差向异构酶变异体W29K/G216S/M234I以及编码其的多核苷酸。上述D-阿洛酮糖差向异构酶变异体W29K/G216S/M234I为普氏梭杆菌来源的野生型D-阿洛酮糖差向异构酶的氨基酸序列中的存在于第29个位置的色氨酸(Trp)被赖氨酸(Lys)取代，存在于第216个位置的甘氨酸(Gly)被丝氨酸(Ser)取代，同时，存在于第234个位置的甲硫氨酸(Met)被异亮氨酸(Ile)取代，由序列5的氨基酸序列构成，编码其的多核苷酸由序列6的碱基序列构成。
并且，本发明的申请人导出在高温条件下热稳定性非常优秀的D-阿洛酮糖差向异构酶变异体W29K/A77S/G216S/M234I并于2021年12月14日提出申请(韩国专利申请第10-2021-0178690号，未公开状态)。上述D-阿洛酮糖差向异构酶变异体W29K/A77S/G216S/M234I为在普氏梭杆菌来源的野生型D-阿洛酮糖差向异构酶的氨基酸序列中存在于第29个位置的色氨酸(Trp)被赖氨酸(Lys)取代，存在于第77个位置的丙氨酸(Als)被丝氨酸(Ser)取代，存在于第216个位置的甘氨酸(Gly)被丝氨酸(Ser)取代，同时，存在于第234个位置的甲硫氨酸(Met)被异亮氨酸(Ile)取代，由序列7的氨基酸序列构成，编码其的多核苷酸由序列8的碱基序列构成。
基于D-阿洛酮糖差向异构酶变异体W29K/G216S/M234I的多核苷酸(序列6)利用重叠延伸聚合酶链式反应(overlap extension polymerase chain reaction)方法制备编码D-阿洛酮糖差向异构酶变异体W29K/A77S/G216S/M234I的氨基酸序列的多核苷酸片段。具体地，向添加有100μM的脱氧核糖核苷三磷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)的反应液混合1pM的下述表3的寡核苷酸引物(A77S正向引物、A77S反向引物)、100ng的用作模板的D-阿洛酮糖差向异构酶变异体W29K/G216S/M234I的多核苷酸(序列6)并利用热循环仪(Thermocycler)(TP600，宝日医生物技术公司(TAKARA BIO Inc.)，日本(JAPAN))在1单位的pfu-X DNA聚合酶混合物(Bioneer公司)存在下以25～30个周期进行聚合酶链式反应。通过引物组合扩增变异体片段后，以扩增的片段为模板并使用导入下述表3的NdeI和XhoI限制酶识别位点的序列的寡核苷酸引物(NdeI正向引物、XhoI反向引物)并通过重叠延伸聚合酶链式反应(overlap extentention PCR)最终获得编码D-阿洛酮糖差向异构酶变异体W29K/A77S/G216S/M234I的氨基酸序列的多核苷酸片段(序列8)。然后，使用限制酶NdeI和XhoI将制备的多核苷酸片段插入pET28a载体(Novagen公司)的相同的限制酶位点后获得克隆载体。
表3
实施例3：制备启动子与阿洛酮糖差向异构酶变异体基因的连接片段
3.1.制备tatA启动子与阿洛酮糖差向异构酶变异体基因连接的脱氧核糖核酸片段
为了扩增tatA启动子，以克隆实施例1中获得的tatA启动子的pGEM-Teasy载体为模板利用下述表4的引物对(XhoI-PtatA、PtatA-FpDPE_R)进行聚合酶链式反应。
并且，为了扩增作为普氏梭杆菌来源的D-阿洛酮糖差向异构酶变异体的W29K/A77S/G216S/M234I的基因，以实施例2中获得的克隆D-阿洛酮糖差向异构酶变异体W29K/A77S/G216S/M234I的基因的pET28a载体(Novagen公司)为模板利用下述表4的引物对(PtatA-FpDPE_F、PstI-FpDPE)进行聚合酶链式反应。
表4
这样扩增的tatA启动子片段与D-阿洛酮糖差向异构酶变异体基因片段可以因扩增时使用的引物的互补序列而连接为一个片段。以两个片段为模板并使用导入上述表4的XhoI和PstI限制酶识别位点的序列的引物(XhoI-PtatA、PstI-FpDPE)进行重叠延伸聚合酶链式反应来获得一个扩增的片段。将获得的连接tatA启动子与阿洛酮糖差向异构酶变异体W29K/A77S/G216S/M234I的基因的脱氧核糖核酸片段命名为“PtatA-FpDPE”。
3.2.制备连接BLMA启动子与阿洛酮糖差向异构酶基因的脱氧核糖核酸片段。
为了扩增BLMA启动子，以克隆实施例1中获得的BLMA启动子的pGEM-Teasy载体为模板并利用下述表5的引物对(XhoI-Pblma、Pblma-FpDPE_R)进行聚合酶链式反应。
并且，为了扩增作为普氏梭杆菌来源的D-阿洛酮糖差向异构酶变异体的W29K/A77S/G216S/M234I的基因，以克隆实施例2中获得的D-阿洛酮糖差向异构酶变异体W29K/A77S/G216S/M234I的基因的pET28a载体(Novagen公司)为模板并利用下述表5的引物对(Pblma-FpDPE_F、PstI-FpDPE)进行聚合酶链式反应。
表5
这样扩增的BLMA启动子片段与D-阿洛酮糖差向异构酶变异体基因片段可以因扩增时使用的引物的互补序列而连接为一个片段。以两个片段为模板并使用导入上述表5的XhoI和PstI限制酶识别位点的序列的引物(XhoI-Pblma、PstI-FpDPE)进行重叠延伸聚合酶链式反应来获得一个扩增的片段。将连接获得的BLMA启动子与阿洛酮糖差向异构酶变异体W29K/A77S/G216S/M234I的基因的脱氧核糖核酸片段命名为“Pblma-FpDPE”。
实施例4：制备D-阿洛酮糖差向异构酶变异体表达载体
4.1.制备具有tatA启动子D-阿洛酮糖差向异构酶变异体表达载体
从pTrc99A载体(法玛西亚公司(Pharmacia)，美国(US))通过基因操作制备能够在大肠杆菌中复制的包含pUC来源复制起点、限制酶XhoI位点和PstI位点等多克隆位点、转录终止子(transcription terminator)及卡那霉素抗生素耐药性基因的重组质粒载体。然后，使用限制酶XhoI和PstI切割实施例3中制备的多核苷酸片段后，将其与具有相同的限制酶位点的上述重组质粒载体连接(ligation)来制备D-阿洛酮糖差向异构酶变异体表达载体pPtatA:FpDPE(W29K/A77S/G216S/M234I)。然后，通过热冲击方法(参照Sambrook andRussell:Molecular Cloning)向大肠杆菌DH5α转化D-阿洛酮糖差向异构酶变异体表达载体来获得具有卡那霉素耐药性的菌落，选择5个菌落来回收5种重组表达载体pPtatA:FpDPE(W29K/A77S/G216S/M234I)后分析碱基序列。5种pPtatA:FpDPE(W29K/A77S/G216S/M234I)重组表达载体的分析结果，分别在导入的tatA启动子或阿洛酮糖差向异构酶变异体W29K/A77S/G216S/M234I基因序列中确认到随机变异，随机变异内容如下述表6所示。
表6
如上述表6所示，在从菌落2、菌落3及菌落5中回收的重组表达载体的情况下，因阿洛酮糖差向异构酶变异体基因序列发生变异而预计无法进行用于制备所目标的阿洛酮糖差向异构酶变异体的翻译。相反，在从菌落1中回收的重组表达载体的情况下，在位于tatA启动子的核糖体结合位点与翻译启动密码子之间的间隔区序列发生变异，在从菌落4回收的重组表达载体的情况下，在tatA启动子的核糖体结合位点周边序列发生变异，酶基因序列一致，因此，判断为可以表达所目标的酶。将从菌落1中回收的重组表达载体内的变异启动子命名为“tatAm1”，将从菌落4中回收的重组表达载体内的变异启动子命名为“tatAm2”。tatAm1启动子由序列9的碱基序列构成，tatAm2启动子由序列10的碱基序列构成。并且，将从菌落1中回收的重组表达载体命名为“pPtatapAm1:FpDPE(W29K/A77S/G216S/M234I)”，将从菌落4中回收的重组表达载体命名为“pPtatAm2:FpDPE(W29K/A77S/G216S/M234I)”。图1为本发明的实施例中制备的重组表达载体pPtatAm1:FpDPE(W29K/A77S/G216S/M234I)的图谱。图2为本发明实施例中制备的重组表达载体pPtatAm2:FpDPE(W29K/A77S/G216S/M234I)的图谱。
4.2.制备具有BLMA启动子的D-阿洛酮糖差向异构酶变异体表达载体
从pTrc99A载体(法玛西亚公司，美国)通过基因操作制备能够在大肠杆菌中复制的包含pUC来源复制起点、限制酶XhoI位点和PstI位点等多克隆位点、转录终止子(transcription terminator)及卡那霉素抗生素耐药性基因的重组质粒载体。然后，使用限制酶XhoI和PstI切割实施例3中制备的核苷酸片段Pblma-FpDPE后，将其与具有相同的限制酶位点的上述重组质粒载体连接来制备D-阿洛酮糖差向异构酶变异体表达载体pPblma:FpDPE(W29K/A77S/G216S/M234I)。然后，通过热冲击方法(参照Sambrook and Russell:Molecular Cloning)向大肠杆菌DH5α转化D-阿洛酮糖差向异构酶变异体表达载体来获得具有卡那霉素耐药性的菌落，选择6个菌落来回收6种重组表达载体pPblma:FpDPE(W29K/A77S/G216S/M234I)后分析碱基序列。分析6种重组表达载体pPblma:FpDPE(W29K/A77S/G216S/M234I)的结果，确认到按照所希望的都存在BLMA启动子及阿洛酮糖差向异构酶变异体基因序列。图3为本发明的实施例中制备的重组表达载体pPblma:FpDPE(W29K/A77S/G216S/M234I)的图谱。
实施例5：制备通过D-阿洛酮糖差向异构酶变异体表达载体的转化体
使用热冲击方法向大肠杆菌分别导入实施例4中制备的重组表达载体pPtatAm1:FpDPE(W29K/A77S/G216S/M234I)、pPtatAm2:FpDPE(W29K/A77S/G216S/M234I)及pPblma:FpDPE(W29K/A77S/G216S/M234I)。然后，确认是否具有卡那霉素抗生素耐药性并筛选由上述重组表达载体转化的重组菌株。向制备的重组大肠杆菌加入甘油溶液使最终浓度为20％(v/v)，在实施用于酶表达的培养之前，在-70℃的温度下冷冻保管。
实施例6：测量通过重组菌株的果糖向阿洛酮糖的转化率及比较启动子的酶表达强度
D-阿洛酮糖差向异构酶可以将果糖转化为阿洛酮糖，通过测量与重组菌株的酶表达量成比例的果糖向阿洛酮糖转化率来比较重组菌株内各启动子的酶表达诱导强度。
为了培养由重组表达载体转化的重组大肠杆菌，在1L容量的烧瓶中收容100ml的以最终浓度为50μg/ml的包含卡那霉素的LB培养基，向其中接种1ml实施例5中制备的重组大肠杆菌。然后，将烧瓶移到振荡培养器，在保持30℃的温度条件及140rpm的振荡条件的情况下培养重组大肠杆菌14小时(hr)后，离心培养液来回收菌体。然后，将回收的菌体以1mg/ml的浓度加入包含30％(w/w)果糖及1mM的硫酸锰(MnSO4)的金属离子的50mM的PIPES缓冲溶液(pH7.0)中并在62℃的温度下反应规定时间后，将反应生成液的温度降至4℃来停止反应，在16600×g及4℃的条件下离心来回收上清液。然后，利用高效液相色谱测量上清液内阿洛酮糖浓度及果糖浓度，从测量的结果中计算果糖向阿洛酮糖的转化率后，将转化率用作酶活性的指标。图4示出利用本发明实施例中制备的重组大肠杆菌进行果糖向阿洛酮糖的转化反应时随反应时间的转化率。在图4中，“PtatAm1”表示由重组表达载体pPtatAm1:FpDPE(W29K/A77S/G216S/M234I)转化的重组大肠杆菌，“PtatAm2”表示由重组表达载体pPtatAm2:FpDPE(W29K/A77S/G216S/M234I)转化的大肠杆菌，“Pblma”表示由重组表达载体pPblma:FpDPE(W29K/A77S/G216S/M234I)转化的大肠杆菌。如图4所示，与导入BLMA启动子的重组大肠杆菌相比，导入tatAm1启动子的重组大肠杆菌及导入tatAm2启动子的重组大肠杆菌表现出非常高的果糖向阿洛酮糖的转化率，通过这样的结果可知，与BLMA启动子相比，tatAm1启动子及tatAm2启动子的酶表达诱导效果非常强。并且，若通过组成型表达启动子的目标基因的表达强度过强，则会给重组菌株带来负担，因此，尽管通过tatAm1启动子的表达强度比通过tatAm2启动子的表达强度略低，但从商业角度来看，判断为tatAm1启动子更为有利。
以上，通过上述实施例说明了本发明，但本发明不限定于此，无需赘言的是，在不脱离本发明的范畴和思想的范围内还可以实施多种变形。因此，本发明的保护范围应解释为包括属于本发明随附的发明要求保护范围的所有实施形态。

Claims (9)

1.一种启动子变异体，其特征在于，由序列9的碱基序列或序列10的碱基序列构成。
2.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求1所述的启动子变体。
3.一种表达载体，其特征在于，包含编码目标蛋白质的多核苷酸以及与其可操作地连接的权利要求1所述的启动子变异体。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，上述目标蛋白质为酶。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，上述酶为阿洛酮糖差向异构酶。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，上述阿洛酮糖差向异构酶由序列3的氨基酸序列、序列5的氨基酸序列或序列7的氨基酸序列构成。
7.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，编码上述阿洛酮糖差向异构酶的多核苷酸由序列4的碱基序列、序列6的碱基序列或序列8的碱基序列构成。
8.一种重组菌株，其特征在于，由权利要求5所述的表达载体转化而来。
9.一种从果糖制备阿洛酮糖的方法，其特征在于，包括向含果糖溶液中加入权利要求8所述的重组菌株并反应的步骤。
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