CN118510910A - 用于处理含核酸样品的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于处理含核酸样品的方法，该方法包括以下步骤：a)将含核酸样品与离子交换树脂、蛋白酶和白蛋白接触；b)在60℃至120℃的温度下加热；c)允许沉积物和上清液的形成；以及d)回收含有核酸的上清液。本发明还提供了包含离子交换树脂、蛋白酶和白蛋白的组合物；试剂盒；该组合物用于处理含核酸样品的用途；用于扩增核酸的方法，以及可通过该方法获得的经处理的含核酸样品。
Description
本申请要求2022年1月10日提交的欧洲专利申请EP22382008的优先权权益。
技术领域
本发明属于生物样品处理领域，特别是包含核酸的样品的处理。本发明的方法特别适用于制备通过遗传分析诊断传染病的生物样品。
背景技术
在当今的全球医疗保健环境中，分子诊断的作用至关重要。在发展中国家，大部分死亡是由于缺乏正确的诊断和相关的传染病后续治疗，如急性呼吸道感染、疟疾、艾滋病和结核病。此外，最近的SARS-CoV-2大流行病强调了在世界任何地方有效检测和控制传染病的工具的必要性。
分子诊断程序通常需要检测生物样品中存在的特定核酸序列。在可以检测或定量核酸分子之前，必须通过处理样品使其可用。事实上，样品制备是基因检测的主要成本和时间组成部分。
通常，目标核酸包含在病毒颗粒、细菌细胞、真菌细胞或更复杂的生物体的细胞内，例如人类白细胞。
因此，用于核酸分析的样品制备方法通常需要第一步裂解以将核酸释放到溶液中，随后是核酸纯化步骤。
传统的样品制备方法涉及费力的提取程序，包括几个洗涤和离心步骤，使其繁琐、劳动密集且缓慢。此外，有机提取方法通常涉及使用离液剂如硫氰酸铵和有机溶剂来裂解细胞和使蛋白质变性，这使得它们具有危险性和高污染性。此外，残留在洗脱样品中的这些物质会干扰分离核酸的后续酶促处理，例如核酸测序或扩增。因此，这些方法具有局限性，因为它们会产生扩增问题，原因是不能去除抑制剂、试剂的不良干扰或仅仅是因为该方法不够有效。
此外，还开发了几种无机方法，包括使用高盐浓度、玻璃粉或硅胶悬浮液，但是这些方法非常耗时，需要几个步骤、清洗和脱盐程序或将样品多次转移到不同的容器中。
核酸提取试剂盒相对昂贵，在资源匮乏的地区几乎不可获得。此外，由于COVID-19大流行病，基因检测的临床应用急剧增加，导致全球试剂和试剂盒短缺，这也是发达国家疾病诊断的主要瓶颈。
出于所有这些原因，世界各地的许多研究小组都致力于简化或取消基因检测的核酸提取步骤。然而，现有技术中公开的方法要么太慢和麻烦，要么不能有效地从样品中去除足够的污染物，导致随后的基因分析结果不可靠。
此外，允许在发展中国家快速和非常简单地提取核酸的方法仍然是必要的，因为在发展中国家，贫穷和不良的卫生条件会传播可能导致突发流行病情况的某些疾病。
因此，尽管到目前为止已经取得了进展，但是仍然需要快速、有效和安全的方法来处理允许直接检测核酸的样品。
发明概述
本发明人开发了用于处理含核酸样品的方法，该方法能够直接检测DNA或RNA，而不需要进行繁琐的核酸提取步骤或使用危险的化学品。
如下面的实施例所示，通过大量的实验，本发明人出乎意料地发现，将样品与包含离子交换树脂、蛋白酶和白蛋白的三元组合混合，然后进行短暂的热处理，可以快速且安全地获得适用于遗传分析技术如PCR的含有核酸的上清液，而不需要复杂的纯化步骤。因此，任何人都可以在不暴露于危险化学品的情况下从样品中获取核酸。
有利的是，本发明人已发现，向混合物中加入白蛋白协同增强了抑制性或降解性酶和其它污染物的去除，这允许获得可直接用于检测分析的样品，而不需要任何进一步的纯化步骤(见表2和表5)。值得注意的是，当向混合物中加入其他试剂时，没有获得这种效果(见表3)。
本发明提供了前所未有的快速、简单和有效的方法来提供可立即用作诊断分析试剂的核酸。与常规提取方法相比，本文提供的方法提供了等同的遗传结果，具有缩短分析时间和降低成本的优点。事实上，本发明的方法可以在少于20分钟内进行。
本文提供的免提取方法非常通用，因为它可以处理从组织拭子到唾液样品的各种样品，并且它可以与各种核酸扩增和检测试剂盒结合使用。
在试剂短缺的情况下，如由COVID-19大流行病引起的短缺，由本发明的方法实现的感染患者的快速识别可能特别重要。
总之，本文提供的结果表明，本发明提供了有效的方法，该方法允许绕过传统的核酸提取程序，并有助于提高检测能力，特别是在卫生紧急情况下或在资源有限的国家。
因此，在第一方面，本发明提供了处理含核酸样品的方法，该方法包括以下步骤：a)将含核酸样品与离子交换树脂、蛋白酶和白蛋白接触；b)在60℃至120℃的温度下加热；c)允许形成沉积物(即沉淀物)和上清液；d)回收含有核酸的上清液。
在第二方面，本发明提供了组合物，其包含离子交换树脂、蛋白酶和白蛋白；具体而言，用于处理含核酸样品的组合物包含离子交换树脂、蛋白酶和白蛋白。
在第三方面，本发明提供了试剂盒，其包含离子交换树脂、蛋白酶、白蛋白、任选地，其使用说明、以及任选的PCR缓冲液；特别是其中该试剂盒用于处理含核酸的样品。
在第四方面，本发明提供了离子交换树脂、蛋白酶和白蛋白用于处理含核酸样品的用途。
在第五方面，本发明提供了从含核酸样品中扩增核酸的方法，该方法包括以下步骤：a)用第一方面限定的方法处理样品，从而获得含核酸的上清液；和b)扩增上清液中包含的核酸。
在第六方面，本发明提供了通过第一方面限定的方法获得的经处理的含核酸样品。
发明详述
除非另有说明，否则本申请中使用的所有术语应理解为本领域已知的普通含义。本申请中使用的某些术语的其他更具体的定义如下所述，并且旨在统一适用于整个说明书和权利要求书，除非另外明确列出的定义提供了更广泛的定义。
出于本发明的目的，给出的任何范围包括该范围的下限和上限。给定的范围，例如浓度等，应该被认为是近似的，除非特别说明。
如本文所用，不定冠词“一”和“一个”与“至少一个”或“一个或多于一个”同义。除非另有说明，这里使用的定冠词，例如“该”也包括名词的复数。如本文所用，术语“约”是指比固定值大15％或小15％的数值范围。
如上所述，本发明在第一方面提供了基于离子交换树脂、蛋白酶和白蛋白的协同作用处理含核酸样品的方法。本领域技术人员将会理解，该方法不排除在所示步骤之前、之后或之间插入额外的步骤。此外，本领域技术人员将理解，与样品混合的组合物的组分可以一起提供或分开提供。本文所用的表述“处理含核酸样品”是指去除或灭活阻碍核酸检测的化合物(如抑制性或降解性酶和其他污染物)的过程，从而产生可直接用于检测分析的处理样品，而无需任何进一步的纯化步骤。特别是，它意味着包括“从含有核酸的样品中提取核酸”，但不包括随后的检测步骤如PCR扩增。
在本发明的方法中，将含有核酸的样品与三元组合混合，然后将其加热以裂解样品并使蛋白酶失活。然后，允许树脂沉积物，含有核酸的上清液现在看起来基本上没有污染物。因此，本发明的方法产生了含有核酸的提取物。
在第一方面的方法的具体实施方案中，任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合，该方法包括以下顺序的步骤：a)将含核酸样品与离子交换树脂、蛋白酶和白蛋白接触；b)在60℃至120℃的温度下加热；c)允许形成沉积物和上清液；d)回收上清液。
在第一方面的方法的具体实施方案中，任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合，该方法包括以下步骤：a)将含核酸样品与离子交换树脂、蛋白酶和白蛋白接触；b)在60℃至120℃的温度下加热步骤(a)中获得的混合物；c)允许在步骤(b)中获得的加热混合物中形成沉淀物或沉积物和上清液；d)回收步骤(c)中获得的上清液。
在第一方面的方法的具体实施方案中，任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合，该方法由以下步骤组成：a)将含核酸的样品与离子交换树脂、蛋白酶和白蛋白接触；b)在60℃至120℃的温度下加热；c)允许沉积物和上清液的形成；d)回收上清液。
在第一方面的方法的具体实施方案中，该方法用于从含核酸的样品中提取核酸。
在第一方面的方法的具体实施方案中，样品选自全血、血浆、血清、尿液、唾液、痰、鼻黏液、呼吸灌洗液、眼泪、绒毛膜绒毛、羊水、脑脊液、脊髓液、灌洗液、粪便、前列腺液、精液、淋巴液、胆汁、汗液、母乳、乳腺液、非人胚胎细胞、非人胎儿细胞、人或非人干细胞、培养的细胞、培养的细菌、培养的酵母、组织活检(如结肠直肠活检、上皮活检、皮肤活检)，组织拭子或涂片(例如鼻咽拭子、口咽拭子、阴道拭子、尿道拭子或宫颈拭子)、宫颈细胞学检查、滑液、食物、饲料、土壤、农产品、水(例如饮用水、家庭用水系统、储水或储水罐、食品加工用水或食品生产用水、娱乐用水、灌溉用水、农业用水系统或农业用水、配水系统、来自井、河流、湖泊、游泳和沐浴区的水)、表面拭子、表面冲洗液、及其组合。
在第一方面的方法的具体实施方案中，任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合，样品是生物样品。如本文所用，“生物样品”是指包含生物材料的任何样品其中存在核酸。
在更具体的实施方案中，样品是液体样品或固体或半固体稀释样品，特别地是液体生物样品。在更具体的实施方案中，生物样品包含病原体，例如病毒、类病毒体或病毒颗粒、朊病毒、细菌、真菌、酵母、原生动物、蠕虫、寄生虫、蛲虫、吸虫、组织细胞、或其组合。
本发明方法涵盖的病原体和/或由病原体引起的疾病的非限制性实例包括单纯疱疹、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、EB病毒、巨细胞病毒(CMV)、人类多瘤病毒8、人类疱疹病毒8、嗜肺军团菌、绿脓杆菌病、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、曲霉菌、球菌性肺炎、微孢子虫、轮状病毒、肝炎、生殖器疣(人乳头瘤病毒或HPV、流行性感冒(流感)和BK病毒、霍乱(由霍乱弧菌引起)、腹泻、结肠炎和严重的肠道疾病(由艰难梭菌引起)、细菌性痢疾(由志贺氏菌引起)、沙门氏菌病(由伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌或肠炎沙门氏菌引起)、副溶血弧菌引起的胃肠疾病)、肠胃炎、尿路感染、新生儿脑膜炎、出血性结肠炎、克罗恩病、革兰氏阴性肺炎(由大肠杆菌、产肠毒素性大肠杆菌引起)、弯曲杆菌感染(由空肠弯曲杆菌、猪肠弯曲杆菌、海鸥弯曲菌、直肠弯曲杆菌、乌普萨拉弯曲杆菌或结肠弯曲杆菌引起)、念珠菌病(由白色念珠菌引起)、肝炎(由甲型肝炎病毒或戊型肝炎病毒引起)、普通感冒、手足口病、急性出血性结膜炎、无菌性脑膜炎、心肌炎(由肠道病毒A-L、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒引起)、呕吐病毒和诺如病毒急性胃肠炎(由诺如病毒或诺沃克病毒引起)、脊髓灰质炎(由脊髓灰质炎病毒1、脊髓灰质炎病毒2、脊髓灰质炎病毒3引起)、呼吸系统疾病，包括严重急性呼吸综合征(由冠状病毒如229E、OC43、SARS-CoV、HCoV NL63、HCoV HKU1、MERS-CoV和SARS-CoV-2引起)、胃流感和胃肠炎(由轮状病毒A-J引起)、轻度感冒或流感样疾病(由腺病毒引起)、阿米巴病(由溶组织内阿米巴引起)、贾第虫病(由贾第鞭毛虫引起)、隐孢子虫病(由隐孢子虫引起)、弓形虫病(由刚地弓形虫引起)、绦虫病(由绦虫引起)、蠕虫病、鞭虫病或鞭虫和土壤传播蠕虫病(由美洲板口虫、十二指肠钩虫和毛首鞭形线虫引起)、食源性吸虫病(由几种寄生虫引起，如华支睾吸虫、片形吸虫、后睾吸虫、并殖吸虫)、疟疾(由疟原虫引起)、结核病(由结核分枝杆菌引起)、南美锥虫病(由克氏锥虫引起)、血吸虫病(由扁虫或血吸虫引起)、寨卡热(由寨卡病毒引起)、登革热(由登革热病毒DENV引起)、日本脑炎(由日本脑炎病毒引起)、西尼罗河热(由西尼罗河病毒引起)、蛔虫病(由蛔虫引起)、利什曼病(由利什曼原虫引起)、足菌肿(由巴西诺卡菌、索马里链霉菌、马杜拉放线菌和白乐杰马杜拉放线菌引起的放线菌瘤，或由足马杜拉分枝菌引起的真菌性骨脓肿)、布鲁里溃疡(由溃疡分枝杆菌引起)、麻风病或汉森氏病(由麻风分枝杆菌引起)、着色芽生菌病(由裴氏着色霉、斑替枝孢瓶霉、疣状瓶霉、卡氏枝孢霉、紧密着色霉、副球孢子菌病(由副球孢子菌引起)、沙眼(由沙眼衣原体引起)、雅司病、梅毒或非性病梅毒(由梅毒螺旋体引起)、龙线虫病或麦地那龙线虫病(由几内亚龙线虫引起)、棘球蚴病(由细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、少节棘球绦虫或福氏棘球绦虫引起)、淋巴丝虫病(由班氏吴策线虫、马来布鲁线虫和帝汶布鲁线虫等丝虫引起)、盘尾丝虫病(由盘尾丝虫引起)、狂犬病(由狂犬病丽莎病毒和澳大利亚蝙蝠丽莎病毒等丽沙病毒引起)。
在更具体的实施方案中，该病原体引起选自以下的疾病：COVID-19(由严重急性呼吸综合征冠状病毒-2，SARS-CoV-2引起)、曲霉病(由烟曲霉引起)、获得性免疫缺陷综合征(艾滋病，由人类免疫缺陷病毒，HIV引起)、衣原体、淋病、梅毒、滴虫病、唇疱疹、水痘、麻疹、流感、某些类型的癌症等。
在更具体的实施方案中，生物样品是在病毒转运介质(VTM)中稀释的鼻咽或口咽拭子。如本文所用，“病毒转运培养基”或“VTM”是任何适于病毒非繁殖转运的培养基。在另一个具体实施方案中，样品可以在任何运输介质中稀释，例如通用运输介质(UTM)。
在第一方面的方法的具体实施方案中，任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合，样品包含聚合酶链式反应抑制剂，并且在步骤(d)中回收的上清液基本上不含聚合酶链式反应抑制剂，特别是阳离子。如本文所用，“聚合酶链式反应抑制剂”是防止核酸通过聚合酶链式反应扩增的试剂；“基本上不含聚合酶链式反应抑制剂的上清液”是指含有聚合酶链式反应抑制剂的上清液，其浓度足够低，不会显著阻碍聚合酶链式反应。
在第一方面的方法的具体实施方案中，任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合，核酸选自DNA、RNA及其组合。在更具体的实施方案中，核酸是基因组DNA、质粒DNA、病毒DNA、从DNA扩增反应获得的DNA、RNA、病毒RNA、从RNA扩增反应获得的RNA、从RNA样品逆转录的DNA(即cDNA)及其组合。
在第一方面的方法的具体实施方案中，任选与上文或下文提供的任何实施方案组合，步骤(a)包括将含核酸样品与离子交换树脂、蛋白酶和白蛋白混合。
在第一方面的方法的具体实施方案中，任选与上文或下文提供的任何实施方案组合，步骤(b)在步骤(a)或(a’)之后直接进行；和/或步骤(c)在步骤(b)或(b’)之后直接进行。
在第一方面的方法的具体实施方案中，任选与上文或下文提供的任何实施方案组合，步骤(b)中的温度为70℃至110℃、80℃至105℃、90℃至100℃或约100℃。
在第一方面的方法的具体实施方案中，任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合，进行步骤(b)直到蛋白酶失活和/或样品被裂解。本领域技术人员可以进行常规测试来计算灭活蛋白酶和裂解样品的合适孵育时间。本领域的技术人员可以调整技术参数以获得最佳结果。为了说明的目的，可以通过在适合蛋白酶活性的条件下将蛋白酶与含蛋白质的样品一起孵育，然后通过蛋白质印迹分析反应产物来测量蛋白酶的失活。
在第一方面的方法的具体实施方案中，任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合，步骤(b)进行至少1分钟、至少3分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少15分钟或至少20分钟。在另一个具体实施方案中，步骤(b)进行1分钟至30分钟，5分钟至20分钟，10分钟至15分钟，或约10分钟。
在第一方面的方法的具体实施方案中，任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合，步骤(C)在15℃至25℃的温度下进行，特别是在约室温下。
在第一方面的方法的具体实施方案中，任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合，步骤(c)包括允许加热的混合物静置直到形成沉积物和上清液；或者离心加热混合物，直到形成沉积物和上清液。离子交换树脂的较高密度将导致其沉积或沉降，这可以通过离心混合物来加速。本领域的技术人员可以通过简单的视觉检查知道沉积物和上清液何时形成。
在第一方面的方法的具体实施方案中，任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合，步骤(c)包括允许形成沉积物或包含离子交换树脂的沉积物和包含核酸、白蛋白和灭活蛋白酶的上清液。在更具体的实施方案中，步骤(c)包括允许形成沉积物或沉积物和上清液，其中上清液基本上不含聚合酶链反应抑制剂。
回收上清液的步骤(d)可以通过本领域已知的任何常规方法进行，例如倾析、过滤或移液。在第一方面的方法的具体实施方案中，任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合，步骤(d)包括通过倾析回收上清液。
在第一方面的方法的具体实施方案中，任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合，该方法进一步包括涡旋步骤(a)中获得的混合物的步骤(a’)。在更具体的实施方案中，步骤(a’)的涡旋进行至少1秒、至少2秒、至少3秒、至少4秒或至少5秒。在更具体的实施方案中，步骤(a’)的涡旋进行1秒至10秒、2秒至8秒或约5秒。
在第一方面的方法的具体实施方案中，任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合，该方法还包括涡旋步骤(b)中获得的混合物的步骤(b’)。在更具体的实施方案中，步骤(b’)的涡旋进行至少1秒、至少2秒、至少3秒、至少4秒或至少5秒。在更具体的实施方案中，步骤(b’)的涡旋进行1秒至10秒、2秒至8秒或约5秒。
在第一方面的方法的具体实施方案中，任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合，该方法包括或由以下步骤组成：a)将含核酸样品与离子交换树脂、蛋白酶和白蛋白接触；a’)涡旋步骤(a)中获得的混合物；b)在60℃至120℃的温度下加热；b’)涡旋步骤(b)中获得的混合物；c)允许形成沉积物和上清液；和d)回收含有核酸的上清液。
在第一方面的方法的具体实施方案中，任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合，该方法还包括在步骤(c)之后纯化或分离核酸的步骤(c’)。本领域技术人员已知的任何核酸纯化或分离方法都可用于步骤(c’)。
在第一方面的方法的具体实施方案中，任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合，步骤(a)包括使含核酸样品与包含离子交换树脂、蛋白酶和白蛋白的组合物接触，接触的体积比(含核酸样品:组合物)为1:0.1至1:10、1:0.2至1:8、1:0.3至1:7、1:0.4至1:6、1:0.5至1:5、1:0.6至1:4、1:0.7至1:3、1:0.8至1:2或体积比为约1:1。
在第一方面的方法的具体实施方案中，任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合，该方法附带条件是不进行核酸分离或纯化步骤。在更具体的实施方案中，该方法附带条件是该方法不包括有机溶剂提取步骤，特别是苯酚-氯仿提取步骤或苯酚-氯仿-异戊醇提取步骤。
在第一方面的方法的具体实施方案中，任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合，该方法包括以下步骤：a)将含核酸样品与螯合树脂，特别是Chelex-100；蛋白酶(protease)，特别是蛋白水解酶K(proteinase)；和白蛋白，特别是牛血清白蛋白，接触；b)在60℃至120℃的温度下加热；c)允许形成沉积物和上清液；和d)回收含有核酸的上清液。
如上所述，在第二方面，本发明提供了用于处理含核酸样品的组合物，其包含离子交换树脂、蛋白酶和白蛋白。
在第二方面的组合物的具体实施方案中，任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合，该组合物是冻干的。
在第二方面的组合物的具体实施方案中，任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合，该组合物还包含极性溶剂。本文所用的“极性溶剂”是指容易与水和其他极性溶剂混溶的溶剂。极性溶剂是众所周知的，可以通过测量本领域技术人员已知的任何参数来评估，包括介电常数、极性指数和偶极矩。考虑到极性溶剂必须适合负载离子交换树脂、蛋白酶、白蛋白和核酸，本领域技术人员将知道为本发明的组合物选择哪种极性溶剂。
在第二方面的组合物的具体实施方案中，任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合，极性溶剂是水或棉塞缓冲液(tampon buffer)。在更具体的实施方案中，极性溶剂是milli-Q水，棉塞缓冲液是TE缓冲液或CAPS。如本文所用，“TE缓冲液”是分子生物学中常用的缓冲溶液，尤其是在涉及DNA、cDNA或RNA的程序中，其包含Tris和EDTA。
在第二方面的组合物的具体实施方案中，任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合，该组合物包含以下至少一种：
-浓度为4重量％至99重量％、10重量％至80重量％、20重量％至60重量％、30重量％至50重量％或约40重量％的离子交换树脂。
-浓度为0.05重量％至5重量％、0.1重量％至1重量％；0.2重量％至0.8重量％，0.3重量％至0.7重量％或约0.5重量％的蛋白酶。
-浓度为0.2重量％至20重量％，0.5重量％至10重量％；1重量％至4重量％、1.5重量％至3重量％或约2重量％的白蛋白，
成分的总和达到100％。
在第二方面的组合物的具体实施方案中，任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合，离子交换树脂的浓度为10重量％至80重量％，特别是约40重量％；蛋白酶的浓度为0.1重量％至1重量％，特别是约0.5重量％；和/或白蛋白的浓度为0.5重量％至4重量％，特别是约2重量％；成分的总和达到100％。
如本文所用，术语组分的“重量％”或“重量百分比”是指单一组分相对于组合物总重量的量，或者如果具体提及的话，相对于另一组分总重量的量。
如上所述，在第三方面，本发明提供了试剂盒，包括离子交换树脂；蛋白酶；白蛋白，任选地，其使用说明；和任选的PCR缓冲液。如本文所用，“PCR缓冲液”是指允许DNA聚合酶活性并因此产生DNA扩增子的任何缓冲溶液。在更具体的实施方案中，PCR缓冲液包含硫酸铵、Tris/HCl、MgCl2、Tween 20和任选的PEG-200；特别是26.67mM硫酸铵、111.6mM Tris/HCl pH 8.8、5mM MgCl2和0.33％ Tween 20。
如上所述，在第四方面，本发明提供了离子交换树脂、蛋白酶和白蛋白用于处理含核酸样品的用途。上述方面也可以表述为使用离子交换树脂、蛋白酶和白蛋白从含核酸样品中提取核酸。本发明还提供了第二方面限定的组合物或第三方面限定的试剂盒用于处理含核酸样品的用途，特别是在权利要求1限定的方法中。
在第四方面提供的用途的具体实施方案中，样品同时与离子交换树脂、蛋白酶和白蛋白接触。
在任一前述方面的具体实施方案中，任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合，离子交换树脂、蛋白酶和白蛋白的重量比(重量/重量/重量)(阳离子交换树脂/蛋白酶/白蛋白)为1:0.25:2至1:25:200；1:1:5至1:10:80；1:2:10至1:5:40，或者约1:2.5:20。
在前述任一方面的具体实施方案中，任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合，离子交换树脂是螯合树脂。在甚至更具体的实施方案中，螯合树脂选自Chelex-100、琼脂糖凝胶2B、SP琼脂糖凝胶FF、Ni琼脂糖凝胶6FF、DEAE琼脂糖凝胶FF、AG 50W、AG MP-50、Bio-Rex 70、Lewatit TP 260、Diaion CR11、Ambersep M4195及其组合。在更具体的实施方案中，离子交换树脂是阳离子交换树脂。在更具体的实施方案中，阳离子交换树脂是含有亚氨基二乙酸基团的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物。在更具体的实施方案中，阳离子交换树脂是Chelex-100，特别是Chelex-100 50-100目或Chelex-100 200-400目。如本文所用，“离子交换树脂”是能够交换离子的树脂，“阳离子交换树脂”是能够交换阳离子的树脂。本文所用的“螯合树脂”是离子交换树脂，其包含共价连接到聚合物基质上的螯合剂。这些树脂可以从商业来源获得(例如，Chelex-100可以从BioRad或Merk获得，CAS 11139-85-8)。
在前述任一方面的具体实施方案中，任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合，蛋白酶是蛋白水解酶。在更具体的实施方案中，蛋白酶选自溶菌酶、蛋白水解酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶。如本文所用，“蛋白酶”指通过肽键水解降解蛋白质的酶。术语“蛋白水解酶”或“内肽酶”是指水解内部肽键的特定类型的蛋白酶。蛋白酶，特别是蛋白水解酶K，可以从商业来源获得(例如来自Merk#70663的蛋白水解酶K)或按照分子生物学中的标准方法生产。
在前述任一方面的具体实施方案中，任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合，白蛋白是血清白蛋白，特别是选自牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)和小鼠血清白蛋白(MSA)的血清白蛋白。在另一个特定的实施方案中，白蛋白是粉末状脱脂奶粉的形式。白蛋白，特别是BSA、HSA和MSA可以从商业来源获得或按照分子生物学中的标准方法生产。
在任一前述方面的具体实施方案中，任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合，离子交换树脂是螯合树脂，特别是Chelex-100；蛋白酶是蛋白水解酶，特别是蛋白水解酶K；白蛋白是血清白蛋白，特别是BSA。
在任一前述方面的具体实施方案中，任选地与上文或下文的任一实施方案组合，试剂盒还包含聚乙二醇(PEG)、N-乙酰半胱氨酸和/或硫酸铵。在任一前述方面的另一个具体实施方案中，任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合，该方法的步骤(a)包括将含核酸样品与阳离子交换树脂、蛋白酶、白蛋白和聚乙二醇(PEG)接触；或者用阳离子交换树脂、蛋白酶、白蛋白和硫酸铵处理含核酸的样品；或者用阳离子交换树脂、蛋白酶、白蛋白和N-乙酰半胱氨酸处理含核酸的样品。
如上所述，在第五方面，本发明提供了扩增样品中所含核酸的方法，包括用第一方面限定的方法处理样品。
在第五方面的具体实施方案中，任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合，核酸扩增是RT-PCR、PCR、qPCR、RT-qPCR、SDA、iSDA、HDA、RPA、NASBA、LAMP或EXPAR.。
在第五方面的具体实施方案中，任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合，核酸是RNA，扩增反应包括以下步骤：(i)用逆转录酶将RNA逆转录成cDNA，和(ii)通过PCR、qPCR、LAMP或EXPAR扩增cDNA。
在第五方面的具体实施方案中，任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合，该方法进一步包括检测或定量扩增的核酸的步骤(c)。
在第六方面，本发明提供了可通过第一方面限定的方法获得的经处理的含核酸样品。根据本发明的方法处理的含核酸样品特别适合于直接核酸扩增，如以下实施例中所示的较低Cq值所证明的。根据本发明制备的加工样品基本上不含核酸酶活性和聚合酶链式反应抑制剂，因此它们是聚合酶的优良底物。
如上定义的方法“可获得的”经处理的含核酸样品在本文中用于通过其制备方法来限定样品，并涉及通过包括上述步骤a)、b)和c)的方法获得的样品。为了本发明的目的，表达“可获得的”、“获得的”和等同表达可互换使用，并且在任何情况下表达“可获得的”包括表达“获得的”。
在第六方面的具体实施方案中，任选地与上文或下文提供的任何实施方案组合，经处理的含核酸样品还包含PCR缓冲液。在更具体的实施方案中，PCR缓冲液包含硫酸铵、PEG-200、Tris/HCl、MgCl2和Tween 20，特别是26.67mM硫酸铵、111.6mM Tris/HCl pH8.8、5mM MgCl2和0.33％Tween 20。
上文公开的关于本发明第一方面的方法的所有实施方案也旨在适用于本发明第六方面的经处理的含核酸样品。
在整个说明书和权利要求书中，词语“包括”及其变体并不旨在排除其他技术特征、添加剂、成分或步骤。此外，“包括”一词包含“由……组成”的情况。本发明的其它目的、优点和特征对于本领域的技术人员来说，在阅读了说明书之后将变得显而易见，或者可以通过本发明的实践来了解。以下实施例是以举例说明的方式提供的，并且它们不旨在限制本发明。此外，本发明覆盖了这里描述的特定和优选实施方案的所有可能的组合。
实施例
实施例1
将掺有热灭活的SARS-CoV-2(ATCC，VR-1986HK)的200μl唾液样品或VTM样品(TM011，Vircell)加入到具有200μl处理混合物的小瓶中，所述处理混合物含有在milli-Q水中的40重量％Chelex 200-400目(95621-100G-F Merck)和5mg/ml蛋白水解酶K(A3830.0500Panreac Applichem)，含有或不含2％ BSA(1010-30-100ML Seqens)
将小瓶涡旋5秒钟，然后在100℃加热10分钟，再次涡旋5秒钟。然后让小瓶静置，直到内容物通过重力分离(即，树脂被允许沉积)。通过倾析回收含有经处理的样品(即核酸)的上清液。上清液直接用于适于通过PCR检测感染的试剂盒中，无需进一步纯化。
作为对照，按照制造商的说明，用自动提取平台(12gC仪器，使用Dx SV试剂盒，称为MagLEAD onwards)提取同等的含核酸样品。
使用VIASURE SARS-CoV-2实时PCR检测试剂盒(Certest Biotec)按照制造商的说明进行RT-qPCR。具体地，用12μl包含26.67mM硫酸铵、111.6mM Tris/HCl pH8.8、5mM MgCl2和0.33％吐温20的再水合缓冲液对试剂盒的冻干qPCR小瓶进行再水合。然后，将8μl经处理的样品加入qPCR小瓶中。使用的热循环仪是CFX96TM实时PCR检测系统(Bio-Rad)和AriaMx实时PCR系统(Agilent Technologies)。
为了检测Sars-CoV-2，靶向基因ORF1ab和N。使用的引物和探针如下(中国疾控中心用于检测2019-nCoV的引物和探针，靶向1和2，发布于2020年1月24日)：
-ORF1ab基因：Fw CCCTGTGGGTTTTACACTTAA(SEQ ID NO:1)；RvACGATTGTGCATCAGCTGA (SEQ ID NO:2)，Pr CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG(SEQ ID NO:3)。
-N基因：Fw GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT(SEQ ID NO:4)；RVCAGACATTTTGCTCTCAAGCTG(SEQ ID NO:5)；Pr TTGCTGCTGCTTGACAGATT(SEQ ID NO:6)。
使用的qPCR热方案如表1所示：
表1
FAMTM、ROX和Hex被用作qPCR的染料。在FAM通道中检测到目标基因ORF1ab，在ROX通道中检测到N基因，在Hex通道中检测到内部对照。qPCR结果用热循环仪软件使用标准程序进行分析。特别是，阈值是手动调整的。阈值计算为3个至15个循环之间平均基线荧光信号标准偏差的10倍。检测到的高于阈值的荧光信号被认为是真实信号，可用于限定样品的定量循环(Cq)值。在每个实验中手动改变阈值，以便找到所有存在的曲线的指数扩增区域。
Cq值是实验中用于评估样品处理最佳试剂组合的最重要参数。较低的Cq值表示较好的样品处理(即qPCR的污染物或抑制性酶的浓度较低)。在实验中使用终点荧光作为qPCR抑制问题的量度。荧光的显著下降会导致检测限(LOD)内的样品检测出现问题。ΔCq值是通过将通过本发明方法处理的样品中获得的Cq值减去参考中获得的Cq值来计算的(ΔCq＝本发明方法-参考对照)。
如下表2所示，向处理缓冲液中添加BSA显著改善了qPCR结果，将Cq值降低了1个完整循环(FAM的Cq＝29对Cq＝30)，并且提供了比用MagLEAD提取的样品更好的结果(FAM的Cq＝29对Cq＝29.5)。
表2
给定的浓度值是在将样品以1:1的体积比加入处理缓冲液后给出的；*ΔCq(条件-MagLEAD)；RFU指相对荧光单位。
这些结果清楚地表明，BSA协同增强了树脂和蛋白酶去除抑制性或降解性酶和其他污染物的作用，从而获得了比在昂贵设备(MagLEAD)中通过费力的纯化步骤获得的样品更适合核酸检测分析的样品。
实施例2
改变处理缓冲液的组分，如实施例1所述处理和分析样品。特别地，BSA被亚精胺(S0266-1G)、十二烷基肌氨酸钠(L7414-50ML)或PEG(BioUltra，200，88440-250ML-F)取代。如表3所示，只有BSA增强了树脂和蛋白酶的作用。其他试剂的加入未能改善树脂和蛋白酶的作用，如RFU降低和Cq值增加所示：
表3
给定的浓度值是在将样品以1:1的体积比加入处理缓冲液后给出的；*ΔCq(条件-MagLEAD)。
实施例3
为了放弃添加BSA获得的改进的qPCR结果是在qPCR反应期间而不是在样品处理期间BSA作用的结果，如实施例1所述在处理缓冲液或qPCR缓冲液中添加BSA(即在处理后)处理和分析样品。
如下表4所示，仅在处理缓冲液中加入BSA(第6行)显著改善了qPCR结果(即Cq＝29对Cq＝30.56)。当向qPCR缓冲液中加入BSA时，没有观察到这种效应。
表4
给定的浓度值是在将样品以1:1的体积比加入处理缓冲液后给出的；*ΔCq(条件-对照(再水合缓冲液))。DILBM指16.16mM硫酸铵、67.63mM Tris/HCl pH8.8、3mM MgCl2和0.2％Tween 20。
这些结果清楚地表明，BSA在样品处理过程中协同作用，产生非常适合于进一步核酸检测的含核酸上清液。
实施例4
在VTM用真正的SARS-CoV-2鼻咽拭子重复实施例1中描述的相同程序。用于扩增的引物和探针与实施例1中的相同。用根据本发明的方法处理的样品和用MagLEAD提取的对照样品获得的qPCR结果如表5所示：
表5
给定的浓度值是在将样品以1:1的体积比加入处理缓冲液后给出的；*ΔCq(条件-MagLEAD)。
这些结果表明，与用不含白蛋白的缓冲液处理的样品相比，用本发明的方法处理的被SARS-CoV-2污染的真实临床样品提供了明显更好的病毒检测结果，并且值得注意的是，比用MagLEAD处理的样品提供了更好的检测结果。
实施例5
本发明的方法用于处理被不同微生物污染的各种类型的样品，包括病毒和细菌，其提供了等同于甚至优于MagLEAD的qPCR结果。
实施例6
本发明的方法进一步用于处理包含在不同缓冲液中的生物样品，包括临床上常用的几种商业缓冲液。下表6显示了按照上述实施例1中描述的方法，在不依赖于用于样品收集的缓冲液的情况下，通过本发明的方法处理的样品中成功的核酸检测。
表6
*ΔCq(条件-MagLEAD)。
实施例7
如实施例1所述，用不同的蛋白酶、离子交换树脂和白蛋白进行本发明的方法。
如下表7所示，当用小鼠白蛋白或脱脂奶粉代替BSA时，获得了相同的结果。类似地，蛋白酶溶菌酶和胰蛋白酶以及螯合树脂Ni琼脂糖凝胶6FF也提供了良好的结果。
表7
给定的浓度值是在将样品以1:1的体积比加入处理缓冲液后得到的。
总之，这些结果表明本发明的方法可以用不同的离子交换树脂、蛋白酶和白蛋白成功地实施。
实施例8
按照以上实施例1中所述的方案，本发明的方法进一步用于处理掺有单核细胞增生利斯特菌或沙门氏菌的不同食物样品。下表8显示了本发明的方法也可用于处理食物样品，并且BSA增强了食物样品中树脂和蛋白酶的作用，而与食物样品和检测到的病原体的类型无关。
表8
实施例9
如实施例1中所述，本发明的方法还用于处理各种类型的临床样品。下表9显示了通过本发明的方法处理的所有样品的成功检测。
表9
实施例10
如实施例1所述处理和分析样品(掺有热灭活SARS-CoV-2的唾液样品)，但是改变处理缓冲液的组成。下表10的结果清楚地表明，BSA和蛋白水解酶K协同增强了交换树脂的作用(第1栏对第2栏至第4栏)，这使得在随后的核酸检测中出现了意想不到的改进。
表10
Claims (15)
1.一种用于处理含核酸样品的方法，其包括以下步骤：
a)将含核酸样品与离子交换树脂、蛋白酶和白蛋白接触；
b)在60℃至120℃的温度下加热；
c)允许形成沉积物和上清液；以及
d)回收含有核酸的上清液。
2.根据权利要求1所述的方法，其中样品选自全血、血浆、血清、尿液、唾液、痰、鼻黏液、呼吸灌洗液、眼泪、绒毛膜绒毛、羊水、脑脊液、脊髓液、灌洗液、粪便、前列腺液、精液、淋巴液、胆汁、汗液、母乳、乳腺液、非人胚胎细胞、非人胎儿细胞、人或非人干细胞、培养的细胞、培养的细菌、培养的酵母、组织活检、组织拭子、宫颈细胞学检查、滑液、食物、饲料、土壤、农产品、水、表面拭子、表面冲洗液、及其组合。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中核酸是DNA、RNA或其组合。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中：
-步骤(b)中的温度为70℃至110℃，特别是80℃至105℃；
-步骤(b)中的加热进行1分钟至30分钟，特别是5分钟至20分钟；和/或
-步骤(c)包括允许加热的混合物静置，直到形成沉积物和上清液；或者，将加热的混合物离心，直到形成沉积物和上清液。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其还包括：
-涡旋步骤(a)中获得的混合物的步骤(a’)；和/或
-涡旋步骤(b)中获得的加热的混合物的步骤(b’)。
6.一种用于处理含核酸样品的组合物，其包含离子交换树脂、蛋白酶和白蛋白。
7.根据权利要求6所述的组合物，其为冻干的。
8.根据权利要求6所述的组合物，其还包含极性溶剂，特别是水。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的组合物，其中：
-离子交换树脂的浓度为10重量％至80重量％，特别是约40重量％；
-蛋白酶的浓度为0.1重量％至1重量％，特别是约0.5重量％；和/或
-白蛋白的浓度为0.5重量％至4重量％，特别是约2重量％。
10.一种试剂盒，其包含：
-离子交换树脂；
-蛋白酶；
-白蛋白，
-任选的，其使用说明；和
-任选的，PCR缓冲液。
11.离子交换树脂、蛋白酶和白蛋白用于处理含核酸样品的用途。
12.根据权利要求1至5中任一项所限定的方法、根据权利要求6至9中任一项所限定的组合物、根据权利要求10所限定的试剂盒或根据权利要求11所限定的用途，其中所述离子交换树脂、蛋白酶和白蛋白的重量比(重量/重量/重量)为1:1:5至1:10:80；特别是1:2:10至1:5:40。
13.根据权利要求1至5和12中任一项所限定的方法、根据权利要求6至9和12中任一项所限定的组合物、根据权利要求10和12中任一项所限定的试剂盒或根据权利要求11至12中任一项所述的用途，其中：
-离子交换树脂是螯合树脂，特别是Chelex-100；
-蛋白酶是蛋白水解酶，特别是蛋白水解酶K；和/或
-白蛋白选自牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)和小鼠血清白蛋白(MSA)。
14.一种用于从含核酸样品扩增核酸的方法，其包括以下步骤：
a)用根据权利要求1至5中任一项所述限定的方法处理样品，从而获得含有核酸的上清液；和
b)扩增上清液所包含的核酸。
15.根据权利要求14所述的方法，其中步骤(b)中的扩增选自RT-PCR、PCR、qPCR、RT-qPCR、SDA、iSDA、HDA、RPA、NASBA、LAMP和EXPAR。
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