CN118510549A - 具有减小的纳米颗粒尺寸和改善的多分散性指数的纳米颗粒药物组合物 - Google Patents

Abstract

提供了制作和使用包含组氨酸‑赖氨酸共聚物的纳米颗粒药物组合物的方法。当与核酸(诸如siRNA)混合时，溶液会自发形成纳米颗粒。提供了方法，其中在混合之前控制核酸溶液的pH，从而引起纳米颗粒直径减少到理想范围(通常为100‑150nm)并减少多分散性指数(PDI)，纳米颗粒直径减小和分散性指数减少两者都可以改善到靶细胞中的转运，以改善基因沉默的功效。

Description

具有减小的纳米颗粒尺寸和改善的多分散性指数的纳米颗粒 药物组合物

相关专利申请的交叉引用

本申请要求于2021年9月22日提交的美国临时专利申请号63/247,294的权益和优先权，该申请通过引用以其整体并入本发明。

技术领域

提供了制作和使用包含组氨酸-赖氨酸共聚物的纳米颗粒药物组合物的方法。当与核酸(诸如siRNA)混合时，溶液会自发形成纳米颗粒。提供了方法，其中在混合之前控制核酸溶液的pH，从而引起纳米颗粒直径减少到理想范围(通常为100-150nm)并减少多分散性指数(PDI)，纳米颗粒直径减小和分散性指数减少两者都可以改善核酸到靶细胞中的转运，以改善基因沉默的功效。优选的，使用微流体混合装置实现混合。

发明内容

提供了药物组合物以及制作和使用药物组合物的方法。对组氨酸-赖氨酸共聚物和核酸(siRNA、miRNA或mRNA)进行混合以形成纳米颗粒，作为药物组合物中用于基因沉默的组分。核酸(例如siRNA)溶液在与共聚物混合之前具有酸性pH，其中pH优选在约4.0与6.6之间，并且优选在约4.0与4.5之间。所得到的组合物含有大多数直径在约100nm与约150nm之间并且多分散性指数(PDI)在约0.02与0.07之间，有利地低于约0.06的纳米颗粒。

提供了药物组合物，该药物组合物通过对pH在约4.0与6.9之间的核酸溶液以及pH在5.5与6.0之间的组氨酸赖氨酸共聚物的溶液进行微流体混合来制备，其中所得到的组合物含有直径在约100cm与约150nm之间的纳米颗粒。至少40％、至少45％、至少50％、至少55％或至少60％的颗粒在此尺寸范围内。核酸溶液的pH通常在约5.0与约6.5之间，例如，在4.0与约5.0之间。核酸溶液可以含有一种或多种siRNA、miRNA和/或mRNA。例如，组氨酸-赖氨酸共聚物可以例如选自由以下项组成的组：HKP、HKP(+H)、H3K4b和H3K8b。有利地，纳米颗粒的多分散性指数(PDI)在约0.02与约0.06之间。

还提供了通过对pH在约4.0与6.9之间的核酸溶液以及pH在5.5与6.0之间的支链组氨酸-赖氨酸共聚物的溶液进行混合来制备药物纳米颗粒组合物的方法，其中组氨酸-赖氨酸共聚物与核酸的比例在约2.5:1与约3:1(w/w)之间。该核酸溶液的pH可选自由以下项组成的组：在约4.0与约6.9之间、在约6.0与约6.6之间、在约5.5与约6.2之间、在约4.5与约5.2之间、在约4.0与5.0之间以及在约4.0与约4.7之间。在具体实施例中，组氨酸-赖氨酸共聚物是HKP(+H)。组氨酸-赖氨酸溶液可含有乙酸铵，其中该乙酸铵以选自由以下项组成的组的量存在：在约11％与约20％之间、在约17％与约20％之间、在约14％与17％之间、在约12％与约14％之间以及在约11％与约14％之间。还可以将在约1nM与约2mM之间(或在组合物的约11％与约14％之间)的Na₂PO₄(磷酸钠)添加到药物组合物中，具有与乙酸铵相同的益处。

进一步提供了通过向受试者施用包含如上所述、或如上述制备的纳米颗粒组合物的药物组合物来治疗遭受疾病的受试者的方法，其中核酸是减少与该疾病相关的基因表达的siRNA。该疾病可以是癌症，并且可以是例如，isSCC(鳞状细胞癌)、BCC(基底细胞癌)、H&N(头颈癌)、肝脏肿瘤、NSCLC(非小细胞肺癌)、其他实体肿瘤、胰腺肿瘤、结肠肿瘤、乳腺肿瘤、前列腺肿瘤或CNS(中枢神经系统)肿瘤。该疾病可以是传染病。受试者可以是哺乳动物，例如人。

附图说明

通过参考如下图所示的实施例，更容易理解所公开的实施例。

图1(a)-1(g)是可用于所公开的实施例的组氨酸-赖氨酸共聚物结构的示例。(a):H³K4b；(b):H²K4b；(c):HK4b；(d):H³K8b_(+RGD)；(e):H³K8b_(+RGD)或_(K+)H³K8b_(+RGD)；(f)：H³K_(G)8b；以及(g):_(-HHHK)H³K8b或_(-HHHK)H³K8b_(+RGD)

图2的表格和图表显示了pH滴定及其对纳米颗粒尺寸和多分散性指数(PDI)的影响。

具体实施方式

提供了用于制作药物组合物的方法，该方法包括对组氨酸-赖氨酸共聚物和核酸分子进行混合，以及调节该组合物的pH以改变所得到的纳米颗粒的性质。还提供了方法，该方法用于通过使一个或多个基因沉默来将该组合物用于治疗患有任意数量的疾病或病症中的一种的受试者。具体地，提供了用于制作药物组合物的方法，该方法包括将包含组氨酸和赖氨酸的共聚物与核酸(诸如siRNA)在pH小于7的溶液中掺和以产生药物组合物。优选的，使用微流体混合装置实现混合。还提供了用于用此类药物组合物治疗受试者的方法。

当与核酸诸如小干扰RNA(siRNA)分子混合时，组氨酸-赖氨酸共聚物自发形成纳米颗粒，并且所得到的含有纳米颗粒的药物组合物可用于使受体受试者的靶细胞中的基因沉默。本发明所描述的方法提供通过调节混合以产生组合物的溶液的pH来控制纳米颗粒的尺寸和尺寸分布的方法。更具体地说，在与组氨酸-赖氨酸共聚物混合之前降低核酸溶液的pH会产生具有减小的纳米颗粒直径和改善的颗粒均匀性的组合物，从而产生更均匀的纳米颗粒(以多分散性指数，或PDI来反映)。此类特性改善了纳米颗粒组合物的药理学性质，并且允许更有效地转染受体受试者的siRNA靶细胞。

组氨酸-赖氨酸(HK)共聚物

在基础研究和临床应用中，用于将核酸转移到靶细胞中的有效手段都是重要的工具。目前需要多种核酸载体，因为具体载体的有效性取决于被转染的核酸的特性[Blakney等人，Biomacromolecules[生物大分子]2018,19:2870-2879.Goncalves等人，Mol Pharm[分子药剂学]2016；13:3153-3163.Kauffman等人，Biomacromolecules[生物大分子]2018；19:3861-3873.Peng等人，Biomacromolecules[生物大分子]2019；20:3613-3626.Scholz等人，J Control Release[控制释放期刊]2012；161:554-565]。在各种载体中，非病毒递送系统已经被开发出来，并被报道出在许多方面比病毒递送系统更有优势[Brito等人AdvGenet.[遗传学进展]2015；89:179-233]。例如，大分子量支链聚乙烯亚胺(PEI，25kDa)对于质粒DNA来说是优秀载体，但对于mRNA则不是。然而，通过降低PEI的分子量至2kDa，它成为mRNA的更有效的载体[Bettinger等人，Nucleic Acids Res[核酸研究]2001；29:3882-3891]。

四支链组氨酸-赖氨酸(HK)肽聚合物H²K4b已被证明是大分子量DNA质粒的良好载体[Leng等人，Nucleic Acids Res[核酸研究]2005；33:e40.]，但是是相对低分子量siRNA的较差载体[Leng等人，J Gene Med[基因医学杂志]2005；7:977-986]。H²K4b的两种富含组氨酸的肽类似物，即H³K4b和H3K(+H)4b，被证明是siRNA的有效载体[Leng等人，J Gene Med[基因医学杂志]2005；7:977-986.Chou等人，Biomaterials[生物材料]2014；35:846-855]，其中H3K(+H)4b似乎略微地更有效[Leng等人，Mol Ther[细胞治疗]2012；20:2282-2290]。另外，相较于H³K4b siRNA多聚物，siRNA的H³K(+H)4b载体在体外和体内将已经处于非常低水平的细胞因子诱导至显著更低的程度[Leng等人，Mol Ther[分子治疗]2012；20:2282-2290]。合适的HK多肽描述于WO/2001/047496、WO/2003/090719和WO/2006/060182中，这些专利各自的内容以其整体并入本发明。这些多肽具有赖氨酸骨架(三个赖氨酸残基)，其中赖氨酸侧链ε-氨基团和N末端与各种HK序列相偶联。HK多肽载体可以通过本领域公知的方法合成，包括，例如固相肽合成(SPPS)。图1示出可用于所公开的组合物和方法实施例的若干HK聚合物结构。

人们发现此类组氨酸-赖氨酸肽聚合物(“HK聚合物”)，除了它们包装和携带siRNA的能力之外，作为mRNA载体出人意料地有效，并且它们可以单独使用或与脂质体组合使用以提供mRNA到靶细胞中的有效递送。与PEI和其他载体类似，初步结果表明HK聚合物携带和释放核酸的能力不同。然而，由于HK聚合物可以在肽合成器上被重复地制作，其氨基酸序列可以很容易地被改变，从而允许精细控制siRNA、miRNA或mRNA的结合和释放以及含有HK聚合物和mRNA的多聚物的稳定性[Chou等人，Biomaterials[生物材料]2014；35:846-855.Midoux等人，Bioconjug Chem[生物共轭化学]1999；10:406-411.Henig等人，Journalof American Chemical Society[美国化学学会杂志]1999；121:5123-5126]。当siRNA、miRNA和/或mRNA分子与一个或多个HKP载体掺和时，这些组分会自组装成纳米颗粒。

如本发明在某些实施例中所述，HK聚合物的一个示例包含与三赖氨酸氨基酸核心相连的四个短肽分支。肽分支由组氨酸和赖氨酸氨基酸以不同的配置组成。这些组氨酸-赖氨酸肽聚合物(HK聚合物)的一般结构如式I所示，其中R代表肽分支，并且K是氨基酸L-赖氨酸。

在式I中，其中K是L-赖氨酸，并且R₁、R₂、R₃和R₄中的每一者独立地是组氨酸-赖氨酸肽。在本发明的HK聚合物中，R_1-4分支可以是相同或不同的。当R分支是“不同的”时，该分支的氨基酸序列与聚合物中的其他R分支中的每一者不同。在式I所示的本发明的HK聚合物中使用的合适的R分支包括但不限于以下R分支R_A-R-_J：

R_A＝KHKHHKHHKHHKHHKHHKHK– (SEQ ID NO:1)

RB＝KHHHKHHHKHHHKHHHK– (SEQ ID NO:2)

RC＝KHHHKHHHKHHHHKHHHK– (SEQ ID NO:3)

RD＝kHHHkHHHkHHHHkHHHk– (SEQ ID NO:4)

RE＝HKHHHKHHHKHHHHKHHHK– (SEQ ID NO:5)

RF＝HHKHHHKHHHKHHHHKHHHK– (SEQ ID NO:6)

RG＝KHHHHKHHHHKHHHHKHHHHK–(SEQ ID NO:7)

RH＝KHHHKHHHKHHHKHHHHK– (SEQ ID NO:8)

RI＝KHHHKHHHHKHHHKHHHK– (SEQ ID NO:9)

RJ＝KHHHKHHHHKHHHKHHHHK– (SEQ ID NO:10)

可用于siRNA、miRNA和/或mRNA组合物的特定HK聚合物包括但不限于这样的HK聚合物，其中R1、R2、R3和R4中的每一者是相同的并且选自R_A-R_J(表1)。这些HK聚合物分别被称为H²K4b、H³K4b、H³K(+H)4b、H³k(+H)4b、H-H³K(+H)4b、HH-H³K(+H)4b、H⁴K4b、H³K(1+H)4b、H³K(3+H)4b和H³K(1,3+H)4b。在这10个示例中的每一者中，大写字母“K”代表L-赖氨酸，并且小写字母“k”代表D-赖氨酸。与H³K4b相比，额外的组氨酸残基在分支序列内用下划线表示。HK聚合物的命名方法如下：

1)对于H³K4b，分支中的主要重复序列是-HHHK-，因此“H3K”是名称的一部分；“4b”是指分支的数量；

2)H3K4b和类似物的每个分支中都有四个-HHHK-基序；第一个-HHHK-基序(“1”)最接近赖氨酸核心；

3)H3K(+H)4b是H3K4b的类似物，其中一个额外的组氨酸被插入H3K4b的第二个-HHHK-基序(基序2)；

4)对于H3K(1+H)4b和H3K(3+H)4b肽而言，在第一基序(基序1)和第三基序(基序3)中分别存在额外的组氨酸；

5)对于H3K(1,3+H)4b，在分支的第一基序和第三基序两者中都存在两个额外的组氨酸残基。

表1：支链聚合物

表2：可以在所公开的实施例中使用的聚合物的附加的示例

可采用本领域熟知的方法，包括凝胶阻滞试验、肝素置换试验和流式细胞术，以评估含有HK聚合物加脂质体的不同制剂在成功递送mRNA方面的性能。合适的方法描述于，例如Gujrati等人，Mol.Pharmaceutics[分子药剂学杂志]11:2734-2744(2014),等人，Mol Ther Nucleic Acids.[分子疗法-核酸]7:1-10(2017)。

也可以使用技术(Millipore Sigma)实现摄取到细胞中的核酸的检测。这些智能光斑是附有序列的珠子，当识别到细胞中的RNA序列时，这些珠子产生可用荧光显微镜分析的荧光的增加。siRNA可以降低靶基因的表达，而mRNA可以增加靶基因的表达。miRNA可以增加或减少表达。

其他方法包括测量来自核酸的蛋白质表达，例如，编码荧光素酶的mRNA可以用于使用本领域公知的方法测量转染效率。参见，例如，这是在最新的出版物中用荧光素酶mRNA完成的(He等人，J Gene Med.[基因医学杂志]2021Feb；23(2):e3295)，以证明使用HKP和脂质体制剂递送mRNA的功效。

pH在纳米颗粒的形成中的作用–尺寸和均匀性

令人惊讶的是，研究证明控制pH、并且特别是在组合物的混合期间降低核酸溶液的pH，调节所得到的纳米颗粒的尺寸和均匀性。更具体地说，人们发现，在与HK聚合物溶液混合之前将核酸溶液的pH调节到6.9以下，不仅减小所得到的组合物中纳米颗粒的尺寸，而且改善组合物中纳米颗粒的PDI。在用于制作药物组合物的具体实施例中，混合之前的核酸溶液的pH保持在6.9以下、5.0以下以及在约4.0与约4.5之间。有利地，将组氨酸-赖氨酸共聚物的pH调节为在5.5与6.0之间。所得到的组合物中的纳米颗粒的直径在约100nm与约150nm之间。更具体地说，至少40％、至少45％、至少50％、至少55％或至少60％的颗粒的直径在100nm与150nm之间。在特定实施例中，组氨酸-赖氨酸共聚物与核酸的比例在约2.5:1与约3:1(w/w)之间。有利地，siRNA的浓度在约0.4-1.0mg/ml范围内，而HKP溶液的浓度是siRNA溶液的浓度的2.5-3.0倍。

下面的示例1提供实验的细节，在这个实验中，随着纳米颗粒被形成，siRNA的溶液的pH从6.6滴定到4.5。评估了所得到的纳米颗粒组合物中的纳米颗粒的尺寸和PDI。图2示出所得到的数据的表格和图形。

在没有理论约束的情况下，我们认为通过其降低核酸溶液的pH以减小并稳定纳米颗粒尺寸并降低PDI的作用机制至少部分是由于siRNA紧密结合并包装到HKP纳米颗粒中。pH影响siRNA包装到HKP纳米颗粒中，因为肽序列中的赖氨酸残基和组氨酸残基是带正电的基团，其可以与带负电的siRNA骨架中的磷酸基团相互作用。将siRNA封装到HKP纳米颗粒中可以通过首先结合并包装形成纳米颗粒并随后保护siRNA(过量的HKP肽完全保护siRNA)来处理。pH的增加可能导致HKP纳米颗粒的电荷中性条件，并且随着pH的增加，纳米颗粒的表面正电荷的减少导致纳米颗粒聚集。

通过本发明所描述的方法产生的纳米颗粒也表现出比使用传统混合方法获得的纳米颗粒更大的尺寸均匀性，这反映在降低的PDI值上。更具体地说，将溶液的PDI值降低至在约0.01与约0.2之间、在约0.1与约0.2之间、在约0.1与约0.15之间、在约0.15与约0.2之间、在约0.08与约0.1之间、在约0.06与约0.08之间、在约0.04与约0.06之间、在约0.02与约0.04之间或在约0.015与约0.02之间。

核酸–siRNA、miRNA和/或mRNA

本发明所描述的组合物和方法中使用的核酸包含靶向本领域熟知的各种症状和疾病中的感兴趣的基因的siRNA、miRNA和/或mRNA分子。所公开的实施例在每种共聚物组合物中包含这些分子中的至少一者，例如，如美国专利号9,642,873中所公开的。

在一些实施例中，基因靶向siRNA包含正义链和反义链，正义链和反义链各自含有长度为19、21、23或25个核苷酸的核心序列。siRNA的正义链和反义链通常退火以形成双链体。在互补双链体区内，正义链核心序列与反义核心序列100％互补。在一些实施例中，siRNA可以是不对称的，其中一条链比另一条链短(通常短2个碱基，例如，21个核苷酸与23个核苷酸或19个核苷酸与21个核苷酸或23个核苷酸与25个核苷酸)。可以通过在所选链的3'端包括dTdT悬垂基团来修改链。

在所公开的实施例中，可以设计和选择siRNA、miRNA和/或mRNA分子以靶向任何数量的感兴趣的基因的序列，例如，各种病毒株及其突变体。

在一些实施例中，双链siRNA可以是未经修饰的或在2'位置处用2'-OCH₃(或2'-OMe)或通过2'-F化学修饰的，和/或在5'位置处用-P(O)₂＝S、-P(S)₂＝O化学修饰的。其他化学修饰，诸如聚乙二醇化或脂质功能化，可用于改善RNAi的整体稳定性和生物利用度。在一些实施例中，siRNA双链体能够用单个效应子序列靶向多个基因。

在一些实施例中，在siRNA、miRNA和/或mRNA分子的每一者中，正义链或反义链的一个或多个核苷酸可以是经修饰的核苷酸。经修饰的核苷酸可以改善稳定性并减少siRNA对免疫的刺激。经修饰的核苷酸可以是例如2'-O-甲基、2'-甲氧基乙氧基、2'-氟、2'-烯丙基、2'-O-[2-(甲基氨基)-2-氧乙基]、4'-硫基、4'-CH2-O-2'-桥、4'-(CH2)2-O-2'-桥、2'-LNA、2'-氨基或2'-O-(N-甲基氨基甲酸酯)核糖核苷酸。在其他实施例中，核糖核苷酸之间的磷酸二酯键的一个或多个磷酸二酯键可以经修饰以改善对核酸酶消化的抗性。合适的修饰包括使用硫代磷酸和/或硫代磷酸修饰的键。

可用于各种实施例的药物组合物中的核酸包括以下非限制性示例。技术人员将认识到，许多其他miRNA、mRNA和/或siRNA分子可用于本发明所描述的组合物和方法中。

RNA序列正义链

hmMCL1_1 5'-GCUGGGAUGGGUUUGUGGAGUUCUU-3'(SEQ ID NO:38)

hmMCL1_2 5'-GCUAACAAGAAUAAAUACAUGGGAA-3'(SEQ ID NO:39)

hmMCL1_3 5'-GCAACCACGAGACGGCCUU-dTdT-3'(SEQ ID NO:40)

hmMCL1_4 5'-GGGAUGGGUUUGUGGAGUU-dTdT-3'(SEQ ID NO:41)

hmMCL1_5 5'-UAACACCAGUACGGACGGG-dTdT-3'(SEQ ID NO:42)

序列hmMCL1_5先前已被描述于(Zhang等人，J.Biol.Chem.[生物化学杂志],277:37430-37438(2002))中。如图2所示，序列hmMCL1_1、hmMCL1_2、hmMCL1_3和hmMCL1_4在使FaDu细胞中的MCL1基因沉默中显示出极好的活性，FaDu细胞是来源于下咽的鳞状细胞癌的细胞系。

核酸的功效的测定

根据特定的靶标RNA序列和递送的纳米颗粒组合物的剂量，可以观察到靶标RNA的部分或完全功能丧失。在至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％或更多的靶细胞中RNA水平或表达(RNA表达或编码的多肽表达)的降低或损失是示例性的。抑制靶标RNA水平或表达是指RNA或RNA编码的蛋白的水平的缺失(或明显降低)。特异性是指在对细胞的其他基因没有明显影响的情况下抑制靶RNA的能力。抑制的结果可以通过检测细胞或生物体的外在性质来确认，或者通过生物化学技术诸如RNA溶液杂交、核酸保护、Northern杂交、反转录、用微阵列的基因表达监测、抗体结合、酶联免疫吸附试验(ELISA)、Western印迹、放射免疫测定法(RIA)、其他的免疫测定法以及荧光活化细胞分析(FACS)来确认。本发明的dsRNA试剂对靶标RNA序列的抑制也可以基于施用此类dsRNA试剂在体内或体外对靶标RNA相关疾病或病症(例如，肿瘤形成、生长、转移等)的发展/进展的影响来测量。治疗和/或降低肿瘤或癌细胞水平可包括停止肿瘤或癌细胞的生长或降低肿瘤或癌细胞水平，或者使肿瘤或癌细胞水平降低例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％或者以上，并且还可以以对数项测量，例如可经由向细胞、组织或受试者施用纳米颗粒组合物来实现10倍，100倍，1000倍，105倍，106倍或107倍的癌细胞水平降低。受试者可以是哺乳动物，诸如人。

定义

如本发明所用，“一个(a)”或“一个(an)”可以表示一个或多个。如本发明所用，“另一个(another)”可以表示至少第二个或更多个。

术语“氨基酸”包括20种普通氨基酸以及“非标准氨基酸”，例如D-氨基酸和化学(或生物学)产生的“普通”氨基酸的衍生物，包括例如，β-氨基酸。

如果由于两种化合物之间共价或非共价相互作用，两种化合物已经形成复合物，则化合物与第二种化合物“相关联”。

术语“共聚物”是指含有两个或多个类型的单元的聚合物，不论单元沿链的排列(随机、交替、嵌段、接枝)如何，也不论它的分子结构(线性的或支链的)如何。术语“组氨酸共聚物”表示包含组氨酸作为其单元类型中的一种的共聚物。术语“转运聚合物”表示包含所公开的实施例的组氨酸共聚物的聚合物。

术语“分支”包括任何单体或其线性聚合物(包括共聚物)，其在至少一个端与分支单体的侧基团共价连接。本身包含一个或多个分支单体的分支被称为“非末端分支”。不包含分支单体的分支被称为“末端分支”。“末端分支”可以包括例如对分支的n-末端氨基酸的组氨酸或赖氨酸的支链的最终分化。末端分支可以包括非组氨酸或赖氨酸(例如，半胱氨酸或其他联结剂)，这帮助结合稳定剂(诸如PEG或HPMA)和/或靶向配体。

术语“支链聚合物”包括包含至少一个骨架和至少一个末端分支的任何聚合物。支链聚合物可以进一步包含一个或多个非末端分支。

术语“HK肽”、“HK聚合物”和“HK载体”意欲表示包括组氨酸和赖氨酸的转运聚合物，包括所公开的实施例涵盖的聚合物。

术语“体内”包括基于注射的疗法，不论是静脉的还是局部的(例如，直接瘤内、肌内、皮下、气管内、静脉内或眼内注射到器官或气道中，注射到器官的血管中，或雾化吸入气道中)。术语“体内”还包括基于对肿瘤、组织或器官的电穿孔的疗法。

术语“脂类”如其在本领域所使用并包括具有疏水和亲水部分的任何化合物种类。亲水性特性通常从磷酸基、羧基、硫酸基、氨基、巯基、硝基和其他类似基团的存在而得来。疏水性可以由胆固醇及其衍生物以及包含包括但不限于以下的基团赋予：长链饱和及不饱和脂肪烃基团以及由一个或多个芳香族、环脂肪族或杂环基团取代的此类基团。

术语“非阳离子脂类”是指在生理pH下以无电荷形式、中性的两性离子形式或阴离子形式存在的许多脂类的任何一者。此类脂类包括例如二芥酰磷脂酰胆碱、二乙酰磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、心磷脂、脑苷脂、DOPE和胆固醇。

术语“阳离子脂类”是指在生理pH下带有净正电荷的许多脂类的任何一者。此类脂类包括但不限于DODAC、DOTMA、DDAB、DOSPER、DOSPA、DOTAP、DC-胆固醇和DMRIE。另外，可以获得可用于所公开的实施例的许多商品化的阳离子脂类制剂。这些包括，例如，LIPOFECTIN.RTM.(可商业获得的阳离子脂质体，包括DOTMA和DOPE，来自GIBCO/BRL，美国纽约州格兰德岛)、LIPOFECTAMINE.RTM.(可商业获得的阳离子脂质体，包括DOSPA和DOPE，来自GIBCO/BRL)以及TRANSFECTAM.RTM.(可商业获得的阳离子脂质体，包括DOGS，来自Promega Corp.，美国威斯康星州麦迪逊)。

术语“多分散性指数”或PDI是指纳米颗粒的样品的异质性。PDI与纳米颗粒尺寸本身无关；相反，PDI越低，样品中纳米颗粒的尺寸就越均匀。(ISO标准ISO 22,412，颗粒尺寸分析-动态光散射(DLS))。

术语“肽”包括包含至少2个氨基酸残基的直链氨基酸链和支链氨基酸链以及环状氨基酸链。术语“肽”和“多肽”在本发明可互换使用。

“药剂”包括可用于预防、延缓疾病发作或降低疾病发作的严重度或者降低发作疾病的严重度或者提高正常生理功能的任何治疗剂以及诊断剂，例如标志基因(GFP，荧光素酶)。“药剂”可以由一种或多种治疗剂、一种或多种诊断剂或一种或多种治疗剂和一种或多种诊断剂的组合组成。

如本发明所用，根据本公开的实施例的药剂递送组合物的“药学上可接受的”组分(诸如盐、载体、赋形剂或稀释剂)为下述组分：(1)其与递送组合物的其他成分相容，由于其可以被包含在递送组合物中而不消除组合物递送药剂的能力；以及(2)在递送组合物意欲用于治疗用途的情况下，其适用于与动物(例如，人类)一起使用而无不当的有害副作用，诸如毒性、刺激和过敏反应。当副作用的危险超过由药剂所提供的益处时是“不当的”。

如本发明所用，术语“生理pH”被定义为在约7.2与约7.5之间的pH。

如本发明所用，术语“重组”表示具有基因工程化的DNA的细胞，其在体外制备并包括来自宿主生物体或更常见的来自与宿主生物体相比不同种、属、科、目、纲的DNA。

术语“siRNA”如其在本领域所使用，并且包括靶向mRNA的RNA的双链体(每条链19或25个碱基或更少)。siRNA可以是化学或酶合成的。根据本公开的实施例的siRNA可以被掺入RISC(RNA诱导的沉默复合物)中，并且然后在其中被活化。

“治疗有效量”是预防、延缓疾病发作或降低疾病发作的严重度所必需的量，或者阻止或降低发作疾病的严重度所必需的量，并且还包括增强正常生理功能所必需的量。

词语“转染”在本发明普遍使用以指将外源性化合物(诸如多聚核苷酸序列)导入原核或真核细胞中；该术语包括但不限于将外源性核酸导入细胞，其可以引起永生或非永生细胞系中基因型的永久或临时改变。

对于siRNA、miRNA或mRNA转运有效的HK聚合物的许多模式被分离、开发和评估。在具有4个分支的聚合物中，末端分支上的HHHK(例如，H³K4b)的重复模式比HHK(例如，H²K4b)或HK(例如，HK4b)重复模式似乎更有效地增加siRNA的摄取。结果，在构建高支链的H³K8b时采用了类似的模式，并发现其可高效用于制备siRNA的载体。

H³K8b具有八个末端分支，并且具有高百分比的组氨酸残基以及低百分比的赖氨酸残基。相较于HHK，由于较高比率的组氨酸残基，模式HHHK具有增加的缓冲能力，并且由于较低比率的赖氨酸残基，因此结合成都下降。末端分支中增加数量的组氨酸残基缓冲了酸性的内涵体区室的，这将允许内涵体裂解以及DNA从内涵体中逃逸。类似地，H³K8b中的组氨酸富集的结构域将有望通过增强聚合物的缓冲能力而增加细胞溶质的递送。然而，用甘氨酸或截短的组氨酸富集的结构域(-HHKHH)取代组氨酸富集的结构域产生HK聚合物，其是无效的siRNA的载体。相较于具有甘氨酸的聚合物，具有截短的组氨酸富集的结构域的HK聚合物并没有更有效，这表明组氨酸富集的结构域的缓冲能力可能不是该结构域的主要机制。另外，这些结果表明，高支链的HK肽的所有结构域(末端分支和组氨酸富集的结构域)对于开发有效的siRNA载体都是重要的。

尽管HHK的重复模式存在于H³K4b和H³K8b中，但N-末端赖氨酸残基在高支链聚合物H³K8b中被移除。H³K8b的末端分支中的赖氨酸残基的数目的减少可能导致siRNA结合减少并且使siRNA在细胞质中的量相对于其在细胞核中的量增加。通过将单个赖氨酸残基添加到H³K8b的各个末端分支(每个聚合物共八个赖氨酸残基)，新聚合物((+K)H³K8b)在减少靶mRNA中的功效与H³K8b相比显著受损。完成siRNA转运的较小聚合物序列(即，那些不具有添加至各个末端分支的赖氨酸的聚合物序列)有利于更容易地合成聚合物。结合调节siRNA释放的观点符合以下发现：具有对siRNA结合增加的载体肽作为用于siRNA的载体的效果较差(Simeoni F,Morris M C,Heitz F,Divita G.Insight into the mechanism of thepeptide-based gene delivery system MPG:implications for delivery of siRNAintomammalian cells.[深入了解基于肽的基因递送系统MPG的机制：siRNA递送到哺乳动物细胞中的意义]Nucleic Acids Res[核酸研究]2003；31:2717-2724)。然而，具有不同结合核酸能力的大量HK载体是无效的siRNA的载体。

与siRNA复合的H³K8b只是在尺寸上小于H²K4b/siRNA复合物。改变HKP/siRNA比率将ζ电位(颗粒表面电荷的量度)从正电荷变为负电荷，转染活性受到的影响最小。相比之下，对复合物的摄取与多聚物的转染水平更密切相关。组氨酸-赖氨酸聚合物增强质粒摄取和来自转染质粒的蛋白质表达比H³K8b显著更多。相比之下，H³K8b siRNA比其他HK聚合物或测试的非病毒载体更有效增加了摄取。尽管通过HK载体的核酸摄取在多数情况下与核酸的预期作用有关，但摄取与核酸的作用之间的差异可能在基于质粒的系统中比在siRNA递送系统中更常发生。

根据本公开的实施例的HK聚合物的非限制性示例包括但不限于选自由H³K8b和(-HHHK)H³K8b组成的组的一种或多种聚合物。本领域技术人员可以在本公开的实施例的范围内做出其他改变。例如，可以将除肽、适体、碳水化合物诸如靶向CD44受体的透明质酸(HA)之外的配体添加到本公开的实施例的范围内的一个或多个聚合物中。另外，尺寸在组氨酸-赖氨酸聚合物与(-HHHK)H³K8b聚合物之间并包括两者的聚合物在本公开的实施例的范围内。进一步地，第五或第六氨基酸可以从H³K8b移除并依然在本公开的实施例的范围内。

组氨酸-赖氨酸共聚物的合成

组氨酸-赖氨酸共聚物的合成在本领域是众所周知的(参见例如，美国专利号7,163,695和7,772,201)。简而言之，多肽可以通过本领域任何已知的方法制备，用于将任何天然存在的或合成的氨基酸共价连接至多肽链中的任何天然存在的或合成的氨基酸，该多肽链可以与氨基酸上的氨基或羧基基团反应，以便共价附接到该多肽链上。

例如但非限制性，支链多肽可以如下制备：(1)从主多肽链分支的氨基酸可以被制备为N-α-叔-丁氧羰基(Boc)保护的氨基酸五氟苯基(Opfp)酯，并且此支链氨基酸将连接到其的主链内的残基可以是N-Fmoc-2,4-二氨基丁酸；(2)Boc保护的氨基酸与二氨基丁酸的偶联可以通过将5克每种前体添加到含有150ml DMF连同2.25ml吡啶和50mg二甲基氨基吡啶的烧瓶中并允许溶液混合24小时来实现；(3)然后可以通过以下步骤从150ml偶联反应提取多肽：在1升分液漏斗中将反应与400ml二氯甲烷(DCM)和200ml 0.12N的HCl混合，并允许各相分开，保留底部水层并用200ml 0.12N的HCl再次提取上层两次；(4)含有多肽的溶液可以通过添加2-5克硫酸镁，滤出硫酸镁，并蒸发剩余溶液至体积为约2-5ml实现脱水；(5)然后二多肽可以通过添加乙酸乙酯和随后2倍体积的己烷而被沉淀，并且然后通过过滤而被收集并使用冷己烷洗涤两次；以及(6)所得到的滤液可以被冷冻干燥以获得预期的较轻的粉末形式的二多肽。通过该方法制备的支链多肽将在支链的氨基酸位置处具有二氨基丁酸的取代。使用N-F moc偶联形式的氨基酸或氨基酸类似物，类似于上述过程制备含有不同于二氨基丁酸的氨基酸或氨基酸类似物取代物的支链多肽。

转运聚合物的多肽也可以由病毒DNA编码并被表达在病毒表面上。或者，组氨酸可以通过与水溶性碳化二亚胺酰胺键合共价连接至蛋白质。

HK转运聚合物还可以包括多肽-“合成单体”共聚物。在这些实施例中，转运聚合物骨架可以包括共价连接的多肽片段以及合成单体或合成聚合物的片段。合成单体或聚合物可以是生物相容的和/或生物可降解的。合成单体的示例包括含有至少一个用于结合至多肽的反应位点的乙烯化或乙炔化不饱和单体。合适的单体以及用于制备多肽-“合成单体”共聚物的方法描述于Nowinski等人的题为“Polymerizable compounds and methods forpreparing synthetic polymers that integrally contain polypeptides(用于制备含多肽的合成聚合物的可聚合化合物及方法)”的美国专利号4,511,478中，该专利通过引用并入本发明。在转运聚合物包含支链聚合物的情况下，合成单体或聚合物可以被掺入一个或多个骨架和/或分支中。此外，骨架或分支可以包括合成单体或聚合物。最后，在该实施例中，分支单体可以是分支氨基酸或分支合成单体。支链合成单体可以包括例如含有至少一个取代反应性侧基团的乙烯化或乙炔化不饱和单体。另外，这些侧基团可能由肽(或非肽)序列组成，这些序列能够与细胞膜上的选定靶结合，从而提供将siRNA或其他核苷酸特异性递送到生物体内的特定细胞类型的能力。

根据本公开的实施例的转运HK聚合物可以通过本领域技术人员已知的方法合成。通过非限制性示例，本发明讨论的某些HK聚合物可以如下合成。在马里兰大学的生物聚合物核心设施可以用来在Ranin Voyager固相合成器(PTI，美国亚利桑那州图森市)上合成例如如下HK聚合物：(1)H²K4b(83mer；分子量11137Da)；(2)H³K4b(71mer；分子量9596Da)；(3)HK4b(79mer；分子量10896Da)；(4)H³K8b(163mer；分子量23218Da)；(5)H³K8b(166mer；分子量23564Da)；(6)(-HHHK)H³K8b(131mer；分子量18901Da)；(7)(-HHHK)H³K8b(134mer；分子量19243Da)；(8)(K+)H³K8b(174mer；分子量24594Da)。某些支链聚合物的结构在美国专利号7,772,201中示出。具有四个分支的聚合物(例如，H³K4b、HK4b)可以通过本领域已知的方法合成。对于具有八个末端分支的高支链聚合物的合成序列可以是如下：(1)RGD或其他配体(如果存在)；(2)3-赖氨酸核心；(3)组氨酸富集的结构域；(4)赖氨酸的添加；以及(5)末端分支。RGD序列可以首先通过仪器随后通过与(fmoc)-赖氨酸-(Dde)(赖氨酸核心)的三次人工偶联而被合成。(Dde)保护基团可以在自动脱保护循环过程中移除。然后，可以通过仪器将包含组氨酸富集的结构域的活化的氨基酸连续添加到赖氨酸核心。将(fmoc)-赖氨酸-(fmoc)氨基酸添加到组氨酸富集的结构域，然后将fmoc保护基团移除。然后可以将末端分支的活化的氨基酸添加到该赖氨酸的α和ε氨基团。通过本领域已知的方法将肽从树脂裂解并沉淀。

通过非限制性示例，本公开的实施例的聚合物可以进行如下分析。聚合物可以首先通过高效液相色谱法(HPLC；美国加利福尼亚州富勒顿贝克曼)进行分析，并且如果HPLC显示聚合物的纯度为95％或更高，则可以不用进一步纯化。聚合物可以例如用System Gold操作软件，使用具有二元溶剂系统的Dynamax 21-4.times.250mm C-18反相制备柱在HPLC柱上进行纯化。检测可以在214nm下进行。聚合物的进一步分析可以例如使用Voyager基质辅助的激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱仪(Applied Biosystems，美国加利福尼亚州福斯特城)和氨基酸分析(AAA实验室服务，美国俄勒冈州波尔林镇)来进行。可以根据制造商的说明使用转染剂，诸如SuperFect(Qiagen，加利福尼亚州瓦伦西亚)、Oligofectamine(Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德)、Lipofectamine 2000(Invitrogen)和Lipofectamine(Invitrogen)。DOTAP脂质体可以通过本领域已知的方法制备。

合适的HKP共聚物描述于WO/2001/047496、WO/2003/090719和WO/2006/060182中。HKP共聚物形成含有siRNA分子的纳米颗粒，通常直径为100-400nm。HKP和HKP(+H)两者都具有赖氨酸骨架(三个赖氨酸残基)，其中赖氨酸侧链ε-氨基团和N-末端与[KH₃]₄K(对于HKP)或KH₃KH₄[KH₃]₂K(对于HKP(+H))偶联。支链HKP载体可以通过本领域公知方法合成，包括，例如固相肽合成。

包含共聚物和siRNA的纳米颗粒的形成

优选的，形成纳米颗粒用于向受试者施用。各种形成纳米颗粒的方法在本领域中是公知的。参见例如，Babu等人,IEEE Trans Nanobioscience[IEEE纳米生物科学汇刊],15:849至-863(2016)。

优选的，纳米颗粒使用微流体混合器系统形成，其中对含有一种或多种siRNA分子的溶液和含有一种或者多种HKP共聚物的溶液以固定的流速进行混合。合适的混合器系统可从例如Precision NanoSystems Inc.商购。

转染

包含组氨酸和赖氨酸的支链载体4b可用于转染质粒。(参见Chen Q R、Zhang L、Stass S A、Mixson AJ.,Branched co-polymers of histidine and lysine areefficient carriers of plasmids[组氨酸和赖氨酸的支链共聚合物是质粒的有效载体].Nucleic Acids Res[核酸研究]2001；29:1334-1340)。在这些支链共聚物中，赖氨酸和组氨酸组分与质粒DNA形成复合物并部分中和质粒DNA的负电荷。另外，pKa为约6.0的组氨酸组分缓冲并帮助质粒DNA从内体小泡中释放。通常，线性HK肽对递送siRNA是无效的。在本公开的实施例中，涵盖了新型高支链的HK聚合物，其是具有意想不到的效果的siRNA的载体。本公开的实施例的HK聚合物是有利的，例如，因为它们毒性较小并提供比其他聚合物更有效的siRNA递送。

本公开的实施例的HK聚合物可以用于例如在体外递送siRNA至细胞的内部。然而，这些聚合物还可以具有体内应用。这些方法都包括将转染复合物与一种或多种细胞相接触以递送siRNA。转染复合物包括至少一种转运聚合物和siRNA。转运聚合物包括组氨酸和赖氨酸。

通常，被转染的细胞包括但不限于对转染敏感的任何动物、植物或细菌细胞，其使用本公开的实施例的转染复合物实现在体外或体内对siRNA的细胞内递送。例如，合适的细胞靶标包括但不限于上皮细胞、内皮细胞、角质细胞、成纤维细胞、肌细胞、肝细胞、血细胞(诸如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、粒细胞、各种干细胞或祖细胞，特别是造血干细胞或祖细胞，例如，如从骨髓、脐带血液、外周血液、胎儿肝等所获得的)。在某些方面，该细胞选自由以下项组成的组：肺细胞、肝细胞、内皮细胞、肌细胞、皮肤细胞、造血干细胞和肿瘤细胞。

根据某些实施例，这些细胞包括选自由以下项组成的组的一种或多种细胞：转化细胞系、重组细胞系、恶性细胞系和原代细胞系。通过非限制性示例，根据本公开的实施例的细胞可以包括选自SVR-bag4、MDA-MB-435、C6和HUVEC(人脐内皮静脉)细胞系的一种或多种细胞。

用基于质粒的疗法，核输入对于转录的发生是重要的，且这在几种细胞系中似乎是限速步骤(Pollard等人,J Biol Chem[生物化学杂志]1998；273:7507-7511；Zabner等人,J Biol Chem[生物化学杂志]1995；270:18997-19007)。因为核输入对于siRNA降解其靶mRNA是不必要的，我们认为本公开的实施例的聚合物在大多数细胞系中作为siRNA的载体是有效的。

根据本公开的实施例的转染细胞的方法还可以包括形成转染复合物并且在将该转染复合物与细胞接触之前允许该转染复合物在约室温下静置约15分钟至约1.5小时或从约15分钟至约45分钟。

根据本公开的实施例，包括组氨酸和赖氨酸的转运聚合物包括有效用于转运siRNA的一种或多种HK载体，包括例如具有在六与10个之间的末端分支的聚合物。根据某些实施例，本公开的实施例的转运聚合物包括八个末端分支和组氨酸富集的结构域。根据某些实施例，该转运聚合物包含具有序列-HHHKHHHKHHHKHHHKHHH-或其版本的末端分支。根据本公开的实施例的转运聚合物的非限制性示例包括选自H³K8b和结构类似物的一种或多种聚合物，包括一种或多种其他配体、(-HHHK)H³K8b等。

本公开的实施例的转运聚合物可以任选地包括一种或多种稳定剂。参考本公开内容，合适的稳定剂对于本领域技术人员来说将是显而易见的。根据本公开的实施例的稳定剂的非限制性示例包括聚乙二醇(PEG)或羟丙基甲基丙烯酰亚胺(HPMA)。

本公开的实施例的转运聚合物可以任选地包括一种或多种靶向配体。参考本公开内容，合适的靶向配体对于本领域技术人员来说将是显而易见的。

所公开的实施例进一步涉及组合物，其包含本公开的实施例的转染复合物。此类组合物可以包括例如与HK聚合物和/或siRNA相关联的一种或多种细胞内递送组分。该细胞内递送组分可以包括例如脂类(诸如阳离子脂类)、过渡金属或对于本领域技术人员来说将是显而易见的其他组分。

在某些实施例中，该组合物包含合适的载体，诸如药学上可接受的载体。在这些实施例中，可以存在或可以不存在病毒或脂质体组分。在这些实施例中，由转运聚合物和siRNA形成的复合物可以在约4.0与6.6或高达7.4之间的pH下稳定，但有利地是在低于约6.9的酸性范围内。siRNA组合物的pH保持在低于6.9，特别是在约4.0与约6.6的范围内，这有助于产生均匀且更小尺寸的纳米颗粒，例如，直径在约100nm与150nm之间，并将纳米颗粒的异质性降低(降低PDI值)到在约0.15与约0.75之间。

在所公开的实施例中，siRNA组合物的pH可以在酸性范围内，并且在约4.0与约6.9之间、在约6.0与约6.8之间、在约5.5与约6.6之间、在约5.7与约6.4之间、在约5.3与约5.7之间、在约5.0与约5.5之间、在约4.7与约5.2之间、在约4.5与约6.6之间、在约4.5与约4.8之间、在约4.2与约4.7之间以及在约4.0与约4.5之间的范围内。在一些实施例中，纳米颗粒性质诸如直径、均匀性和PDI可以在约4.0至4.5的pH以下继续保持稳定。

在某些实施例中，转染复合物组合物包括转运聚合物(其可以作为细胞内递送组分)和siRNA。在这些实施例中，转运聚合物可以充当细胞内递送组分而不需要附加的递送组分，或者可以与其他递送组分结合起作用。

在其他实施例中，转染复合物组合物可以包括：(i)转运聚合物、(ii)与该转运聚合物相关联的至少一种细胞内递送组分以及(iii)与该细胞内递送组分和/或转运聚合物相关联的siRNA。制作这些组合物的方法可以包括：将(i)和(ii)组合足以使转运聚合物和siRNA关联入稳定复合物中的时间。组分(i)、(ii)和(iii)也可以适当载体提供，诸如药学上可接受的载体。在包括除了转运聚合物之外的细胞内递送组分的实施例中，该转运聚合物可以通过非共价或共价相互作用与细胞内递送组分(诸如脂质体)相互作用。该转运聚合物可以通过非共价或共价相互作用与siRNA相互作用。或者，在整个复合物的上下文中，转运聚合物不需要与siRNA直接相互作用，而是转运聚合物可以与一个或多个细胞内递送组分相互作用，该细胞内递送组分反过来与siRNA相互作用。

本公开的实施例进一步包括用于确定用于转染到细胞中的siRNA的有效载体的测定。这些测定包括：将siRNA与转运聚合物混合以形成转染复合物；将该转染复合物与一种或多种细胞接触；以及检测细胞内siRNA活性的存在和不存在。在某些实施例中，siRNA指向β-半乳糖苷酶。

递送组分

本公开的实施例的细胞内递送组分包含转运聚合物本身。在除了转运聚合物之外的细胞内递送组分被使用的情况下，此类递送组分可以是病毒或非病毒组分。合适的病毒细胞内递送组分包括但不限于逆转录病毒(例如，鼠白血病病毒、禽类慢病毒)、腺病毒和腺伴随病毒、单纯疱疹病毒、鼻病毒、仙台病毒和痘病毒类。合适的非病毒细胞内递送组分包括但不限于脂类和各种基于脂类的物质，诸如脂质体和微胶粒，以及本领域已知的各种聚合物。

合适的脂类包括但不限于磷酸甘油酯、神经鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、溶血磷脂胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰卵磷脂、双亚油酰磷脂胆碱、鞘糖脂、两性脂。脂类可以呈单层或多层脂质体形式。

细胞内递送组分可以包括但不限于阳离子脂类。许多此类阳离子脂类在本领域是已知的。已经制作了多种阳离子脂类，其中二酰基甘油或胆固醇疏水部分通过代谢可降解的酯键与阳离子首基相连，例如：1,2-二(油酰氧基)-3-(4-'-三甲基铵)丙烷(DOTAP)、1,2-二油酰基-3-(4'-三甲基铵)丁酰-sn-甘油(DOTB)、1,2-二油酰基-3-sn-丁二酰-sn-甘油胆碱酯(DOSC)和胆固醇基(4'-三甲基铵)丁酸酯(ChoTB)。其他合适的脂类包括但不限于阳离子非pH敏感脂类，诸如：1,2-二油酰-3-二甲基-羟基乙基溴化铵(DORI)、1,2-二油酰氧丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DORIE)和1,2-二肉豆蔻氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DMRIE)。其他非pH敏感阳离子脂类包括但不限于：O,O'二月桂基-N-[p-(2-三甲基铵乙基氧)苯甲酰]-N,N,N-三甲基氯化铵、脂精氨、DC-胆固醇(3β[N-(N,N”-二甲基氨基乙烷)羰基]胆固醇)、脂多(L-赖氨酸)、含有N-(α-三甲基铵乙酰基)-二月桂基-D-谷氨酸氯化物的阳离子多层脂质体(TMAG)、转染ACE.^TM。(DDAB(双十八烷基二甲基溴化铵)和DOPE的比例为1:2.5(w:w))(Invitrogen)和脂质体转染AMINE.^TM。(DOSPA(2,3-油酰氧-N-[20([2,5-二[(3-氨基-丙基)氨基]-1-氧戊]氨基)乙基]-N,N-二甲基-2,3-二(9-十八碳烯基氧基)-1-丙基三氟乙酸铵)与DOPE的比例为3:1(w:w))(Invitrogen)。其他合适的脂类描述于美国专利号5,965,434中。

可以根据本公开的实施例使用的阳离子脂类包括但不限于在生理学上可相容的环境中形成的那些脂质体。合适的阳离子脂类包括但不限于选自由以下项组成的组的阳离子脂类：1,2-二油酰氧基丙基-3-三甲基溴化铵；1,2-二肉豆蔻氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵；二甲基双十八烷基溴化铵；1,2-二油酰基-3-(三甲铵基)丙烷(DOTAP)；3βN-(N',N'-二甲基氨基乙烷)氨甲酰]胆固醇(DC-胆固醇)；1,2二油酰基-sn-甘油-3-乙基磷脂酰胆碱；1,2二肉豆蔻基-sn-甘油-3-乙基磷脂酰胆碱；[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)；1,3-二油酰氧基-2-(6羧基精氨酸)丙基酰胺(DOSPER)；2,3-二油酰氧基-N-[2(精胺-羧基酰胺)乙基]-N,N,二甲基-1-丙基三氟乙酸铵(DOSPA)；以及1,2-二肉豆蔻氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DMRIE)。

阳离子脂类可以与一种或多种辅助脂类(诸如二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)或胆固醇)一起使用以增强转染。这些辅助脂类在阳离子脂质体中的摩尔百分比为在约5％与50％之间。另外，能够延长阳离子脂质体的体内半衰期的聚乙二醇化脂类可以在约0.05％与0.5％之间的摩尔百分比存在。

根据所公开的实施例的组合物可以可选地包括一种或多种组分以增强转染、保护试剂或增强递送复合物的稳定性。例如，在某些实施例中，稳定化合物诸如聚乙二醇可以共价连接到脂类或转运聚合物。

本公开的实施例的组合物还可以合适地包含各种本领域已知的增强递送的组分。例如，该组合物可以包含已知的进入经受受体介导的细胞内吞作用的细胞核或配体等的一种或多种化合物。例如，该配体可以包含融合病毒肽以破坏内涵体，允许核酸避免溶酶体降解。增强递送的组分的其他示例包括但不限于核蛋白、腺病毒颗粒、转铁蛋白、表面活性剂-B、抗血栓调节蛋白、插入试剂、血凝素、脱唾液酸糖蛋白、氯喹、秋水仙碱、整合素配体、LDL受体配体以及维持表达的病毒蛋白(例如，整合酶、LTR元件、rep蛋白、oriP和EBNA-1蛋白)或者与细胞表面蛋白相互作用的病毒组分(例如，ICAM、HA-1、MLV的gp70-磷酸盐运载体以及HIV的gpl20-CD4)。增强递送的组分可以与转运聚合物、细胞内递送组分或药剂共价或非共价相关联。例如，可以通过共价附接-RGD-或-NGR-基序来靶向到肿瘤脉管的递送。这可以使用肽合成器或通过用水溶性碳化二亚胺(例如，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)偶联到转运聚合物上的氨基团或羧基团来实现。这两种方法都是熟悉本领域的技术人员已知的。

本公开的实施例的组合物可以合适地包括过渡金属离子，诸如锌离子。本公开的实施例的复合物中过渡金属的存在可以增强转染效率。

施用

本发明所描述的药物组合物可以通过常规用于施用组合物的任何施用模式施用给受试者，包括人受试者。因此，组合物可以呈气溶胶、分散体、溶液或悬浮液的形式，并且可以配制用于吸入、肌内、口服、舌下、口腔、肠胃外、鼻腔、皮下、皮内或局部施用。如本发明所用的术语肠胃外包括经皮、皮下、血管内(例如，静脉内)、肌内或鞘内注射或输注技术等。

如本发明所用，组合物的有效剂量是向其施用药物组合物的受试者产生保护性免疫反应所需的剂量。本上下文中的保护性免疫反应是一种预防或改善多种疾病或病症的免疫反应。

该组合物可以施用一次或多次。通过测量受体受试者的循环或组织样品中的一种或多种化合物可以对组合物进行期望效果的初步测量。以这种方式测量多种化合物的方法也是本领域公知的，因为有效预防或抑制疾病状态的发生或对疾病状态进行治疗(在一定程度上减轻症状，优选所有症状)的合适剂量也是本领域公知的。

药学上有效剂量取决于疾病类型、所用组合物、施用途径、正在治疗的哺乳动物类型、所考虑的特定哺乳动物的身体特征、同时用药以及医学领域的技术人员将认识到的其他因素，通常，在0.1mg/kg与100mg/kg体重/天之间的活性成分的施用量取决于配制的组合物的效力，在约0.1mg/kg与约1.0mg/kg之间、在约1.0mg/kg与约2.0mg/kg之间、在约2.0mg/kg与3.0mg/kg之间、在约3.0mg/kg与5.0mg/kg之间、在约5mg/kg与约8mg/kg之间、在约8mg/kg与约15mg/kg之间、在约15mg/kg与约25mg/kg之间、在约25mg/kg与约35mg/kg之间、在约35mg/kg与约45mg/kg之间、在约45mg/kg与约55mg/kg之间、在约55mg/kg与约65mg/kg之间、在约65mg/kg与约75mg/kg之间、在约75mg/kg与约85mg/kg之间、在约85mg/kg与约95mg/kg之间以及在约95mg/kg与约105mg/kg之间。

然而，直到最近，它们的应用一直受到核酸(诸如siRNA分子)的不稳定性和低效体内递送的限制。本发明所描述的方法提供制作和使用具有HK共聚物纳米颗粒递送系统的药物组合物的方法。

本发明所描述的方法可以用于siRNA的临床应用，包括针对各种疾病，特别是传染性疾病和肿瘤适应症有效的预防性和治疗性组合物。

受试者的治疗

本公开的实施例还提供治疗疾病的方法，包括使用本公开的实施例的复合物或组合物。特别地，提供了通过向患者施用治疗有效量的本公开的实施例的复合物或组合物来治疗患有疾病或病症的患者的方法。还包括通过向患者施用通过本发明所公开的方法转染的细胞来治疗患由疾病的患者的方法。可能使用复合物、组合物和方法治疗的遗传和/或非肿瘤性疾病的示例包括但不限于以下：腺苷脱胺酶缺乏症、嘌呤核苷磷酸化酶缺乏症、具有p47phox缺陷的慢性肉芽肿性疾病、具有HbS的镰状细胞、β-地中海贫血、范康尼氏贫血、家族性高胆固醇血症、苯丙酮尿症、鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症、载脂蛋白E缺乏、血友病A和B、肌肉萎缩症、纤维囊泡症、帕金森症、色素性视网膜炎、溶酶体贮存病(例如，粘多糖1型、Hunter、Hurler和Gaucher)、糖尿病性视网膜病、人免疫缺陷病毒病病毒性感染、获得性贫血、心脏及外周血管疾病和关节炎。在这些疾病的示例中的一些示例中，治疗基因可以编码遗传或获得性疾病的替代酶或蛋白质、反义或核酶分子、诱饵分子或自杀基因产物。

用siRNA的体外和体内基因疗法还可用于治疗各种癌症。这些siRNA应用包括但不限于：1)减少生长因子的表达，减少增进细胞循环的蛋白质(例如，KRAS、Raf-1、PI-3激酶MEK或mTOR)，生长因子受体(例如，EGFR、Her-2)，或对肿瘤的支持细胞起关键作用的蛋白质(例如，用于肿瘤内皮细胞的VEGF、VEGFR1-2)；2)靶向或减少抗细胞凋亡的因子(例如，BCL-2或BCLXL)的表达；以及3)靶向减少对肿瘤的免疫活性的蛋白质或酶(PDL1、PD1或CTLA4等)。

本公开的实施例还提供体外基因疗法的方法，该方法包括：(i)从受试者取出细胞；(ii)通过将该细胞与转染复合物或含有本公开的实施例的此类转染复合物的组合物接触而将核酸(诸如siRNA)递送至该细胞内部；以及(iii)向该受试者施用包含该核酸(诸如siRNA)的细胞。

重组细胞可以使用本公开的实施例的复合物来产生。所得到的重组细胞可以通过本领域已知的各种方法递送至受试者。在某些实施例中，重组细胞被注射，例如皮下注射。在其他实施例中，重组皮肤细胞可以作为皮肤移植物被应用到患者。重组血液细胞(例如，造血干细胞或祖细胞)优选地通过静脉施用。细胞还可以被包封入合适的载体中，并且然后植入受试者中。施用的细胞的量取决于本领域已知的多种因素，例如预期效果、受试者状态、嵌合多肽的表达率等，并且可以容易地由本领域技术人员确定。

出于所有目的，本发明所公开的所有范围和比率可以并且必须确实描述其中的所有子范围和子比率，并且所有此类子范围和子比率也构成本公开的实施例的一部分和组成部分。任何列出的范围或比率都可以容易地被识别为充分描述并使得相同的范围或比率能够被分解为至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性示例，本发明讨论的每个范围或比率可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。

药物制剂的所公开的实施例可以单独使用或与其他治疗或治疗的组分联合使用以用于其他皮肤病或非皮肤病症。

通过参考以下示例将更好地理解所公开的实施例，这些示例旨在用于说明的目的，而不旨在以任何方式来解释以限制所附权利要求的范围。

词语“示例性”在本发明中用于表示“用作示例、实例或说明”。本发明描述为“示例性”的任何实施例不一定被解释为比其他实施例优选或有利。

类似地，应当理解，在实施例的上述描述中，各种特征有时被共同分组在单个实施例、图或其描述中，以简化本公开。然而，这种公开的方法不应被解释为反映意图：本申请中的任何权利要求或对本申请的任何申请优先权需要比该权利要求中明确记载的那些特征更多的特征。相反，如所附权利要求所反映的，创造性方面在于任何单一前述公开的实施例的少于所有特征的组合。因此，在该具体实施方案之后的权利要求特此明确并入该具体实施方案中，其中每个权利要求作为单独的实施例独立存在。本公开包括独立权利要求及其从属权利要求的所有排列组合。

在权利要求中的关于特征或元素的术语“第一”的叙述并不一定暗示第二或附加的此类特征或元素的存在。按照35U.S.C.§1126的规定，对以手段加功能形式列举的元素进行解释。对于本领域的技术人员显而易见的是，在不脱离所公开的实施例的基本原理的情况下，可以对上述实施例的细节进行改变。

虽然已经示出和描述了所公开的实施例的具体实施例和应用，但是应当理解，所公开的各实施例不限于本发明所公开的精确配置和组分。可以对本发明所公开的实施例的方法和系统的布置、操作和细节(包括所附权利要求的那些)进行对本领域技术人员而言显而易见的各种修改、改变和变化。最后，本发明所公开的实施例的各种特征可以组合以提供落入所公开的实施例的范围内的附加的配置。以下示例说明了测试的抑制性化合物的动态测量和疗效，包括本公开的实施例中的那些。

示例1

用1N HCl的添加降低几种siRNA水溶液(0.6mg/ml)的pH水平至逐渐降低的酸性pH水平：6.55、6.0、5.5、5.0和4.5。将siRNA溶液和HKP(+H)共聚物溶液(1.5mg/ml)以1:1的体积和10mL/min的流速进行混合。使用NanoAssemblr微流体仪器(Precision NanoSystemsInc.)制备HKP(+H)-siRNA纳米颗粒。用Zetasizer Ultra(Malvern Panalytical)通过DLS测定纳米颗粒直径。混合后，测量每种纳米颗粒溶液的pH。

图2示出siRNA溶液的pH滴定以及相应的纳米颗粒直径和PDI。与对照(碱性)siRNA溶液相比，酸性范围(4.5至6.55)内的溶液都引起纳米颗粒直径和PDI显著减小；特别是在酸性更强的范围(4.5至5.5)内，纳米颗粒直径降至低于200nm。PDI在pH 6.55(弱酸性)时显著下降，并且随着pH的降低而保持在类似的水平。

Claims (18)

1.一种药物组合物，所述药物组合物通过对pH在约4.0与6.9之间的核酸溶液以及pH在5.5与6.0之间的组氨酸赖氨酸共聚物的溶液进行微流体混合来制备，

其中所述组合物的所述混合产生形成的纳米颗粒，并且

其中至少40％、至少45％、至少50％、至少55％或至少约60％的所述形成的纳米颗粒具有选自由以下项组成的组的范围内的直径：在约40nm与约200nm之间、在约50nm与约150nm之间、在约50nm与约100nm之间以及在约60nm与约90nm之间。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述核酸溶液的所述pH在约5.0与约6.5之间。

3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述核酸溶液的所述pH在约4.0与约5.0之间。

4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述核酸溶液包含一种或多种siRNA、miRNA和/或mRNA。

5.根据任何前述权利要求所述的药物组合物，其中所述组氨酸-赖氨酸共聚物选自由以下项组成的组：HKP、HKP(+H)、H³K4b和H³K8b。

6.根据任何前述权利要求所述的药物组合物，其中所述核酸溶液包含至少一种siRNA。

7.根据任何前述权利要求所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒的多分散性指数(PDI)在约0.02与约0.06之间。

8.一种制备药物纳米颗粒组合物的方法，所述方法包括：对pH在约4.0于6.9之间的核酸溶液以及pH在5.5与6.0之间的支链组氨酸-赖氨酸共聚物溶液进行混合，其中组氨酸-赖氨酸共聚物与核酸的比例在约2.5:1与约3:1(w/w)之间。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述核酸溶液的pH选自由以下项组成的组：在约4.0与约6.9之间、在约6.0与约6.6之间、在约5.5与约6.2之间、在约4.5与约5.2之间、在约4.0与5.0之间以及在约4.0与约4.7之间。

10.根据权利要求8或权利要求9所述的方法，其中所述组氨酸-赖氨酸共聚物为HKP(+H)。

11.根据权利要求8-10中任一项所述的方法，其中所述组氨酸-赖氨酸溶液包含乙酸铵，其中所述乙酸铵以选自由以下项组成的组的量存在：在约11％与约20％之间、在约17％与约20％之间、在约14％与17％之间、在约12％与约14％之间以及在约11％与约14％之间。

12.根据权利要求8-10中任一项所述的方法，其中所述组氨酸-赖氨酸溶液包含Na₂PO₄(磷酸钠)，其中所述Na₂PO₄以约1mM与约2mM(w/w)之间存在于所述组合物中。

13.一种治疗患有疾病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含根据权利要求1-7中任一项所述的纳米颗粒组合物的药物组合物，其中所述核酸是减少与所述疾病相关的基因表达的siRNA。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述疾病为癌症。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述癌症选自由以下项组成的组：isSCC(鳞状细胞癌)、BCC(基底细胞癌)、H&N(头颈癌)、肝脏肿瘤、NSCLC(非小细胞肺癌)、其他实体肿瘤、胰腺肿瘤、结肠肿瘤、乳腺肿瘤、前列腺肿瘤和CNS(中枢神经系统)肿瘤。

16.根据权利要求13所述的方法，其中所述疾病为传染病。

17.根据权利要求13-16中任一项所述的方法，其中所述受试者为哺乳动物。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述受哺乳动物为人。