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CN118510522A - 经缀合的寡核苷酸和其用途 - Google Patents

经缀合的寡核苷酸和其用途 Download PDF

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CN118510522A
CN118510522A CN202280065333.5A CN202280065333A CN118510522A CN 118510522 A CN118510522 A CN 118510522A CN 202280065333 A CN202280065333 A CN 202280065333A CN 118510522 A CN118510522 A CN 118510522A
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CN
China
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oligomeric compound
modified
oligomeric
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modified oligonucleotide
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Pending
Application number
CN202280065333.5A
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English (en)
Inventor
普内特·P·塞思
M·厄斯特高
M·卡雷尔
M·塔诺维茨
M·里格比
M·斯凯纳
S·斯坦威
L·乌尔博纳斯
K·范里茨霍滕
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BicycleTx Ltd
Ionis Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
BicycleTx Ltd
Ionis Pharmaceuticals Inc
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Abstract

本文中提供了包括双环配体和经修饰的寡核苷酸的寡聚化合物。此化合物可以包括作为细胞靶向性部分的双环配体，并且还可以包括用于将所述双环配体与所述经修饰的寡核苷酸连接的缀合物接头。此化合物可以与药学上可接受的盐结合使用。

Description

经缀合的寡核苷酸和其用途
序列表
本申请与序列表一起以电子格式提交。序列表以于2022年9月29日创建的大小为3,314Kb的以CHEM0103WOSEQ.xml命名的文件提供。序列表的电子格式的信息通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明实施例提供了用于靶向具有寡核苷酸的所关注细胞的化合物和方法。
背景技术
如siRNA和单链反义寡核苷酸(ASO)等寡聚化合物已显示出可用于调节基因表达，并且已被证明是治疗有效的。寡聚化合物的某些化学修饰可以改进寡聚化合物的效力、功效和不期望的副作用，允许施用较低剂量、减少毒性的可能性并降低疗法的总体成本。寡聚化合物可以用缀合物基团，例如，在所关注细胞上表达的受体的配体修饰，所述缀合物基团使寡聚化合物靶向到一个或多个所关注组织。
1型转铁蛋白受体(TfR1)，还被称为CD71，是通过受体介导的内吞与铁结合的转铁蛋白结合并且使所述铁结合的转铁蛋白内化的跨膜糖蛋白。已使用了具有抗TfR1抗体的抗体-药物缀合物以将药物递送到各个组织，包含CNS和肌肉。
环状肽能够以高亲和力和特异性与蛋白质靶标结合并且因此是用于开发治疗剂的有吸引力的分子类别。实际上，临床上已经成功地将若干环状肽用作例如抗菌肽万古霉(vancomycin)、免疫抑制药物环孢菌素(cyclosporine)或抗癌药物奥曲肽(octreotide)(Driggers等人,(2008),《自然综述：药物发现(Nat.Rev.Drug.Discov.)》7(7),608-24)。良好的结合特性由肽与靶标之间形成的相对大的相互作用表面以及环状结构的构象灵活性降低产生。通常，大环结合到数百平方埃的表面，作为例如环状肽CXCR4拮抗剂CVX15(Wu等人(2007),《科学(Science)》330,1066-71)、具有与整合素αVb3结合的Arg-Gly-Asp基序的环状肽(Xiong等人(2002),《科学》296(5565),151-5)或与尿激酶型纤溶酶原激活剂结合的环状肽抑制剂upain-1(Zhao等人(2007),《结构生物学杂志(J.Struct.Biol.)》160(1),1-10)。
由于肽大环具有环状构型，所以其灵活性不如线性肽，从而导致与靶标结合时熵损失较小并且产生较高的结合亲和力。与线性肽相比，灵活性降低还导致锁定靶特异性构象，从而增加结合特异性。这种作用已通过基质金属蛋白酶8(MMP-8)的有效且有选择性的抑制剂得到了例证，当MMP-8的环打开时，其相比于其它MMP失去选择性(Cherney等人(1998),《药物化学杂志(J Med.Chem.)》41(11),1749-51)。通过大环化实现的有利结合特性在具有一个以上肽环的多环状肽中，例如，在万古霉素、尼辛(nisin)和放线菌素中甚至更加明显。
不同的研究团队先前已将具有半胱氨酸残基的多肽拴系到合成分子结构(Kemp和McNamara(1985),《有机化学杂志(J.Org.Chem)》；Timmerman等人(2005)《化学生物化学(ChemBioChem.)》。Meloen和其同事利用三(溴甲基)苯和相关分子将多个肽环路迅速且定量地环化到合成支架上以进行蛋白质表面的结构模拟(Timmerman等人(2005)《化学生物化学》)。用于产生候选药物化合物的方法，其中所述化合物是通过将含半胱氨酸的多肽连接到分子支架上生成的，例如1,1',1”-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三丙-2-烯-1-酮(TATA)(Heinis等人(2014)《德国应用化学国际版(Angewandte Chemie,InternationalEdition)》53(6)1602-1606)。
已经开发了用于产生和筛选针对所关注靶标的双环状肽的大文库的基于噬菌体展示的组合方法(Heinis等人(2009),《自然化学生物(Nat.Chem.Biol.)》5(7),502-7和WO2009/098450)。简而言之，在噬菌体上展示了含有三个半胱氨酸残基和两个由六个随机氨基酸构成的区的线性肽(Cys-(Xaa)6-Cys-(Xaa)6-Cys)的组合文库，并且通过将半胱氨酸侧链共价连接到小分子对其进行环化。
发明内容
本文中提供的实施例涉及包括寡核苷酸和缀合物基团的寡聚化合物。在某些实施例中，所述缀合物基团包括细胞靶向性部分。在某些实施例中，所述缀合物基团包括将所述细胞靶向性部分与所述寡核苷酸连接的缀合物接头。在某些实施例中，所述细胞靶向性部分包括以下或由以下组成：包括两个附接到分子支架的多肽环路的多肽。在某些实施例中，所述细胞靶向性部分包括双环配体或由双环配体组成。在某些实施例中，所述缀合物接头将所述寡核苷酸与所述多肽连接。通常，缀合物接头具有的长度和/或结构足以将所述寡核苷酸和所述双环配体分开，使得所述双环配体不抑制所述寡核苷酸的活性(例如，反义活性)，并且所述寡核苷酸不抑制所述双环配体的活性(例如，与转铁蛋白受体结合)。
具体实施方式
应当理解，前述一般性描述和以下详细说明都仅是示例性和解释性的，并且不限制所要求保护的实施例。在本文中，除非另外特别说明，否则单数的使用包含复数。如本文所用，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包含(including)”以及如“包含(includes)”和“包含(included)”等其它形式的使用不是限制性的。
在此使用的小节标题仅是为了编排的目的并且不应被解释为对所描述的主题进行限制。本申请中引用的所有文档或文档的部分，包含但不限于专利、专利申请、文章、书籍、论文以及GenBank、NCBI和ENSEMBL参考序列记录特此通过引用本文所讨论的文档的部分以及其整体明确并入。
应当理解，在本文所含有的实例中寡核苷酸的每个SEQ ID NO中列出的序列与对糖部分、核苷间键或核碱基的任何修饰无关。因此，由SEQ ID NO定义的寡核苷酸可以独立地包括一个或多个对糖部分、核苷间键或核碱基的修饰。
应当理解，在整个说明书中，除非另有说明，否则肽序列中的第一个字母是肽在N末端处的第一个氨基酸，并且肽序列中的最后一个字母是肽在C末端处的最后一个氨基酸。
定义
除非提供具体定义，否则与本文所描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学结合使用的命名以及实验室程序和技术是本领域公知和常用的那些。在允许的情况下，贯穿本公开提及的所有专利、申请、公开申请和其它出版物以及其它数据通过引用以其整体并入本文。
除非另有说明，否则以下术语具有以下含义：
如本文所用，“2'-脱氧核苷”意指包括2'-H(H)脱氧呋喃糖基糖部分的核苷。在某些实施例中，2'-脱氧核苷是2'-β-D-脱氧核苷，并且包括2'-β-D-脱氧核糖基糖部分，其具有在天然存在的脱氧核糖核酸(DNA)中发现的β-D核糖基构型。在某些实施例中，2'-脱氧核苷可以包括经修饰的核碱基或可以包括RNA核碱基(尿嘧啶)。
如本文所用，“2'-MOE”意指代替呋喃糖基糖部分的2'-OH基团的2'-OCH2CH2OCH3基团。“2'-MOE糖部分”意指用2'-OCH2CH2OCH3基团代替呋喃糖基糖部分的2'-OH基团的糖部分。除非另有说明，否则2'-MOE糖部分呈β-D-核糖基构型。“MOE”意指O-甲氧基乙基。
如本文所用，“2'-MOE核苷”意指包括2'-MOE糖部分的核苷。
如本文所用，“2'-OMe”意指代替呋喃糖基糖部分的2'-OH基团的2’-OCH3基团。“2'-O-甲基糖部分”或“2'-OMe糖部分”意指用2'-OCH3基团代替呋喃糖基糖部分的2'-OH基团的糖部分。除非另有说明，否则2'-OMe糖部分呈β-D-核糖基构型。
如本文所用，“2'-OMe核苷”意指包括2'-OMe糖部分的核苷。
如本文所用，“2'-F”意指代替呋喃糖基糖部分的2'-OH基团的2'-F基团。“2'-氟糖部分”或“2'-F糖部分”意指用2'-F基团代替呋喃糖基糖部分的2'-OH基团的糖部分。除非另有说明，否则2'-F糖部分呈β-D-核糖基构型。
如本文所用，“2'-F核苷”意指包括2'-F糖部分的核苷。
如本文所用，“2'-NMA”意指代替核糖基糖部分的2'-OH基团的–O-CH2-C(＝O)-NH-CH3基团。“2'-NMA糖部分”是用2'–O-CH2-C(＝O)-NH-CH3基团代替核糖基糖部分的2'-OH基团的糖部分。除非另有说明，否则2'-NMA糖部分成β-D构型。“NMA”意指O-N-甲基乙酰胺。
如本文所用，“2'-NMA核苷”意指包括2'-NMA糖部分的核苷。
如本文所用，“2'取代的核苷”意指包括2'取代的糖部分的核苷。如本文所用，关于糖部分的“2'取代的”意指包括除H或OH以外的至少一个2'-取代基的糖部分。
如本文所用，“5-甲基胞嘧啶”意指用附接到5位置上的甲基修饰的胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶是经修饰的核碱基。
如本文所用，“施用”意指向受试者提供寡聚物药剂或药物组合物。
如本文所用，“脂肪族氨基酸”是具有由H和C构成的侧链的氨基酸。脂肪族氨基酸包含但不限于甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、β-丙氨酸、2-氨基异丁酸。
如本文所用，“氨基酸”是具有氨基、羧基以及至少一个在氨基与羧基之间共价连接的碳的多肽的化合物或单体亚基，所述碳包括可选侧链。“α-氨基酸”在氨基与羧基之间含有恰好一个碳，所述碳携带任选侧链。“β-氨基酸”在氨基与羧基之间含有恰好两个任选地取代的碳。
如本文所用，“氨基酸模拟物”是具有氨基替代物、羧基替代物以及至少一个在氨基替代物与羧基替代物之间共价连接的碳的肽模拟物的化合物或单体亚基，所述碳包括任选侧链。
如本文所用，“芳香族氨基酸”是在其侧链中具有芳香族环的氨基酸。芳香族氨基酸包含但不限于苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。
如本文所用，“双环配体”意指包括在三个不同位点处与分子支架共价结合的多肽或肽模拟物，从而形成两个多肽环路的配体。典型地，此类肽或肽模拟物包括具有天然或非天然氨基酸或氨基酸模拟物，包含第一氨基酸、第二氨基酸和第三氨基酸的多肽，所述第一氨基酸、所述第二氨基酸和所述第三氨基酸包括与所述支架形成共价键的反应性基团。在某些实施例中，肽或肽模拟物包括至少三个半胱氨酸残基(在本文中被称为Ci、Cii和Ciii)，所述至少三个半胱氨酸残基为反应性基团。如本文所用，“环路多肽”是指形成两个多肽环路的，包含反应性基团，但不包括任何N末端或C末端延伸的双环配体的部分。如本文所用，“环路序列”是指位于反应性基团之间的氨基酸或氨基酸模拟物。
如本文所用，“双环状核苷”或“BNA”意指包括双环状糖部分的核苷。
如本文所用，“双环状糖”或“双环状糖部分”意指包括两个环的经修饰的糖部分，其中第二环是通过连接第一环中的原子中的两个原子从而形成双环状结构的桥形成的。在某些实施例中，双环状糖部分的第一环是呋喃糖基部分。在某些实施例中，双环状糖部分不包括呋喃糖基部分。
如本文所用，“细胞靶向性部分”意指能够与一种或多种特定细胞类型结合的缀合物基团或缀合物基团的一部分。在某些实施例中，细胞靶向性部分能够与细胞表面受体或细胞表面部分结合。在某些实施例中，当细胞靶向性部分与细胞表面受体或细胞表面部分相互作用或结合时，其能够被内化。在某些实施例中，细胞靶向性部分包括双环状多肽或双环配体。在某些实施例中，细胞靶向性部分由双环状多肽或双环配体组成。
如本文所用，“细胞表面部分”意指存在于细胞的表面上的可用于与细胞外部的物质相互作用的部分。在某些实施例中，细胞表面部分的一部分与细胞的细胞膜是一体的。细胞表面部分的非限制性实例是脂质、蛋白质和碳水化合物。在某些实施例中，细胞表面部分是细胞表面受体。在某些实施例中，细胞表面受体是转铁蛋白受体。
如本文所用，“细胞表面受体”意指在细胞的表面上表达的可用于与对应配体相互作用的蛋白质受体。配体可以是内源性的或外源性的。在某些实施例中，细胞表面受体是转铁蛋白受体。
如本文所用，“带电荷的氨基酸”是在处于pH＝7.0的溶液中时具有包括正电荷或负电荷的侧链的氨基酸。在pH＝7.0的溶液中时，“碱性氨基酸”具有包括正电荷的侧链。碱性氨基酸包含但不限于赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸。在pH＝7.0的溶液中时，“酸性氨基酸”具有包括负电荷的侧链。酸性氨基酸包含但不限于谷氨酸和天冬氨酸。
如本文所用，“手性富集的群体”意指多个具有相同分子式的分子，其中如果特定手性中心是立体随机的，则群体内在特定手性中心处含有特定立体化学构型的分子的数量或百分比大于预期所述群体内在同一特定手性中心处含有相同特定立体化学构型的分子的数量或百分比。在每个分子内具有多个手性中心的手性富集的分子的群体可以含有一个或多个立体随机手性中心。在某些实施例中，分子是本文中公开的寡聚化合物。在某些实施例中，寡聚化合物是反义化合物。在某些实施例中，分子是经修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，分子是包括经修饰的寡核苷酸的寡聚化合物。
如本文所用，“可切割部分”意指在生理条件下，例如在细胞内部或受试者体内被切割的键或原子基团。
如本文所用，关于寡核苷酸的“互补性”意指当寡核苷酸的核碱基序列与另一种核酸的核碱基序列在相反方向上对准时，所述寡核苷酸的核碱基与另一种核酸或其一个或多个区的核碱基中的至少70％能够彼此形成氢键合。关于寡核苷酸的区的“互补性区”意指当寡核苷酸的核碱基序列与另一种核酸的核碱基序列在相反方向上对准时，所述区的核碱基与另一种核酸或其一个或多个区的核碱基中的至少70％能够彼此形成氢键合。互补性核碱基是指能够彼此形成氢键的核碱基。互补性核碱基对包含腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)和尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)、5-甲基胞嘧啶(mC)和鸟嘌呤(G)。与天然核碱基或与其它经修饰的核碱基配对的某些经修饰的核碱基在本领域中是已知的，并且除非另有说明，否则不被视为本文定义的互补性核碱基。例如，肌苷可以与腺苷、胞嘧啶或尿嘧啶配对，但不被视为是互补的。互补性寡核苷酸和/或核酸不需要在每个核苷处具有核碱基互补性。相反，一些错配是可以容忍的。如本文所用，关于寡核苷酸的“完全互补”或“100％互补”意指寡核苷酸与另一寡核苷酸或核酸在寡核苷酸的每个核苷处互补。
如本文所用，“缀合物基团”意指直接附接到寡核苷酸的原子基团。在某些实施例中，缀合物基团包括缀合物部分和将缀合物部分附接到寡核苷酸的缀合物接头。在某些实施例中，缀合物基团包括双环配体。
如本文所用，“缀合物接头”意指包括至少一个将缀合物部分与寡核苷酸连接的键的单个键或原子基团。
如本文所用，“缀合物部分”意指通过缀合物接头附接到寡核苷酸的原子的基团。在某些实施例中，缀合物部分包括细胞靶向性部分。在某些实施例中，细胞靶向性部分包括双环配体或由双环配体组成。在某些实施例中，细胞靶向性部分包括双环状多肽或由双环状多肽组成。
如本文所用，在寡核苷酸的上下文中，“连续”是指彼此直接相邻的核苷、核碱基、糖部分或核苷间键。例如，“连续核碱基”意指在序列中彼此直接相邻的核碱基。
如本文所用，“环状氨基酸”是其中侧链连接到主酰胺以形成环状结构的氨基酸。“环状氨基酸”包含但不限于脯氨酸或羟脯氨酸。
如本文所用，“间隔体”意指包括具有多个支持定位在具有一个或多个核苷的外部区之间的RNA酶H切割的核苷的内部区的经修饰的寡核苷酸，其中包括内部区的核苷在化学上与包括外部区的核苷不同。内部区可以被称为“间隙”，并且外部区可以被称为“翼”。除非另有说明，否则“间隔体”是指糖基序。除非另有说明，否则间隙的每个核苷的糖部分是2'-β-D-脱氧核糖基糖部分。因此，举例来说，术语“MOE间隔体”表示具有包括2'-β-D-脱氧核苷的间隙和包括2'-MOE核苷的翼的间隔体。除非另有说明，否则MOE间隔体可以包括一个或多个经修饰的核苷间键和/或经修饰的核碱基，并且此类修饰不一定遵循糖修饰的间隔体图案。
如本文所用，“杂交”意指寡核苷酸和/或核酸的粘接。虽然不限于特定机制，但最常见的杂交机制涉及氢键合，所述氢键合可以是互补性核碱基之间的沃森-克里克(Watson-Crick)、胡斯坦(Hoogsteen)或反向胡斯坦氢键合。在某些实施例中，互补性核酸分子包含但不限于反义化合物和核酸靶标。在某些实施例中，互补性核酸分子包含但不限于寡核苷酸和核酸靶标。
如本文所用，关于氨基酸序列的“相同”或“相同百分比”意指当氨基酸序列对准以获得最大相似性时，两个氨基酸序列之间相同的氨基酸的百分比。“相同”意指氨基酸的每个原子是相同的；也就是说，具有取代或修饰的氨基酸不能算作“相同”的氨基酸。
如本文所用，术语“核苷间键”是寡核苷酸中的相邻核苷之间的共价键。如本文所用，“经修饰的核苷间键”意指除磷酸二酯核苷间键之外的任何核苷间键。“硫代磷酸酯核苷间键”是其中磷酸二酯核苷间键的非桥接氧原子之一被硫原子替代的经修饰的核苷间键。
如本文所用，“非双环状经修饰的糖部分”意指包括不在糖的两个原子之间形成桥以形成第二环的修饰，如取代基的经修饰的糖部分。
如本文所用，“N末端修饰”或“C末端修饰”意指在多肽的任一侧上对双环配体进行，如酰化或酰胺化，并且不成为缀合物接头的一部分的末端非肽性化学修饰。
如本文所用，“N末延伸”或“C末端延伸”意指在多肽的任一侧上对双环配体进行的位于双环配体的多肽的末端与在寡核苷酸缀合时为缀合物接头的一部分的官能团之间的非肽性化学修饰。
如本文所用，“错配”或“非互补性”意指当第一寡核苷酸和第二寡核苷酸对准时，第一寡核苷酸的核碱基与第二寡核苷酸或靶核酸的对应核碱基不互补。
如本文所用，“基序”意指寡核苷酸中的未经修饰的和/或经修饰的糖部分、核碱基和/或核苷间键的图案。
如本文所用，“天然氨基酸”意指Gly或以下中的每种的L-异构体：Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、His、Ile、Lys、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val。
如本文所用，“中性氨基酸”是在处于pH＝7.0的溶液中时具有不包括正电荷或负电荷的侧链的氨基酸。中性氨基酸包含但不限于甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苏氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、β-丙氨酸和2-氨基异丁酸。
如本文所用，“非天然氨基酸”意指除由人类遗传密码编码的标准二十种氨基酸以外的任何氨基酸，包含以下中的每种的D-异构体：Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、His、Ile、Lys、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val。
如本文所用，“核碱基”意指未经修饰的核碱基或经修饰的核碱基。核碱基是杂环部分。如本文所用，“未经修饰的核碱基”是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)或鸟嘌呤(G)。如本文所用，“经修饰的核碱基”是除未经修饰的A、T、C、U或G之外的能够与至少一种其它核碱基配对的原子基团。“5-甲基胞嘧啶”是经修饰的核碱基。通用碱基是可以与五种未经修饰的核碱基中的任一种配对的经修饰的核碱基。
如本文所用，“核碱基序列”意指与任何糖或核苷间键修饰无关的核酸或寡核苷酸中的一系列连续核碱基。
如本文所用，“核苷”意指包括核碱基和糖部分的化合物或化合物的片段。核碱基和糖部分各自独立地是未经修饰的或经修饰的。
如本文所用，“分子支架”意指与多肽的反应性基团形成共价键以形成至少两个由分子支架连接的多肽环路的化学基团。在某些实施例中，分子支架为1,1',1”-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三丙-2-烯-1-酮(TATA)。在某些实施例中，分子支架为1,1',1”-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三(2-溴乙酮)(TATB)。
如本文所用，“寡聚物药剂”意指寡聚化合物和任选地一种或多种额外特征，如第二寡聚化合物。寡聚物药剂可以是单链寡聚化合物，或者可以是由两种互补性寡聚化合物形成的寡聚双链体。
如本文所用，“寡聚化合物”意指寡核苷酸和任选地一种或多种额外特征，如缀合物基团或末端基团。寡聚化合物可以和与第一寡聚化合物互补的第二寡聚化合物配对，或者可以是未配对的。“单链寡聚化合物”是未配对的寡聚化合物。
术语“寡聚双链体”意指由两种具有互补性核碱基序列的寡聚化合物形成的双链体。
如本文所用，“寡核苷酸”意指通过核苷间键连接的连接的核苷的链，其中每个核苷和核苷间键独立地可以是经修饰的或未经修饰的。除非另有说明，否则寡核苷酸由8-50个连接的核苷组成。如本文所用，“经修饰的寡核苷酸”是指其中至少一个核苷或核苷间键被修饰的寡核苷酸。如本文所用，“未经修饰的寡核苷酸”意指不包括任何核苷修饰或核苷间修饰的寡核苷酸。
如本文所用，“多肽”或“肽”意指由3个或更多个通过酰胺键连接在一起的氨基酸组成的化合物或化合物的片段。除非另有说明，否则多肽由3-50个氨基酸组成。
如本文所用，“肽模拟物”意指由3个或更多个连接在一起的氨基酸或氨基酸模拟物组成的化合物或化合物的片段，其中至少两个亚基通过非酰胺键的键连接。除非另有说明，否则肽模拟物由3-50个氨基酸或氨基酸模拟物组成。
如本文所用，“药学上可接受的载体或稀释剂”意指适用于施用于受试者的任何物质。某些此类载体使药物组合物能够被调配为例如供受试者口服摄取的片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液和锭剂。在某些实施例中，药学上可接受的载体或稀释剂是无菌水、注射用蒸馏水、无菌盐水、无菌缓冲溶液或无菌人工脑脊液。
如本文所用，“药学上可接受的盐”意指寡聚化合物的生理上和药学上可接受的盐。药学上可接受的盐保留母体化合物的期望的生物活性并且不赋予其不期望的毒理学效应。
如本文所用，“药物组合物”意指适于施用于受试者的物质的混合物。例如，药物组合物可以包括寡聚化合物和无菌水溶液。在某些实施例中，药物组合物在游离摄取测定中在某些细胞系中显示出活性。
如本文所用，“前药”意指在体外呈第一形式的在受试者或其细胞内转化为第二形式的治疗剂。通常，前药在受试者内的转化通过酶(例如，内源性酶或病毒酶)或细胞或组织中存在的化学品的作用和/或生理条件促进。在某些实施例中，前药的第一形式比第二形式不太具有活性。
如本文所用，“反应性基团”意指可以与另一种化合物形成键的氨基酸的原子或原子的基团，例如，另一种氨基酸或另一种化合物的另一种原子或原子的基团。在某些实施例中，反应性基团是半胱氨酸氨基酸的硫原子。
如本文所用，关于寡核苷酸的“自互补性”意指至少部分地与其自身杂交的寡核苷酸。
如本文所用，“侧链”具有其在本领域的普通含义，并且意指不连接氨基酸的氨基和羧基，并且附接到例如氨基酸的α或β碳的氨基酸的子结构。
如本文所用，“稳定化的磷酸酯基团”是指相对于未经修饰的核苷的未经修饰的5'-磷酸酯在生物条件下的稳定性，导致寡核苷酸的5'-末端核苷的5'-磷酸酯部分稳定化的5'-化学部分。5'-磷酸酯基团的这种稳定化包含但不限于对通过磷酸酶实现的去除的抗性。稳定化的磷酸酯基团包含但不限于5'-膦酸乙烯酯和5'-磷酸环丙酯。
如本文所用，在具有相同分子式的分子的群体的上下文中，“立体随机手性中心”意指具有随机立体化学构型的手性中心。例如，在包括立体随机手性中心的分子的群体中，具有立体随机手性中心的(S)构型的分子的数量与具有立体随机手性中心的(R)构型的分子的数量可以是相同的，但不一定是相同的。当手性中心的立体化学构型是由未被设计成控制立体化学构型的合成方法产生的时，手性中心的立体化学构型被视为是随机的。在某些实施例中，立体随机手性中心是立体随机硫代磷酸酯核苷间键。
如本文所用，“标准细胞测定”意指实例和其合理变体中描述的测定。
如本文所用，“受试者”是指人类或非人动物，包含但不限于小鼠、大鼠、兔子、狗、猫、猪，以及非人灵长类动物，包含但不限于猴子和黑猩猩。
如本文所用，“糖部分”意指未经修饰的糖部分或经修饰的糖部分。如本文所用，“未经修饰的糖部分”意指如存在于RNA中的2'-OH(H)核糖基部分(“未经修饰的RNA糖部分”)，或如存在于DNA中的2'-H(H)脱氧核糖基糖部分(“未经修饰的DNA糖部分”)。未经修饰的糖部分具有位于1'、3'和4'位置中的每一个处的一个氢、位于3'位置处的一个氧以及位于5'位置处的两个氢。如本文所用，“经修饰的糖部分”或“经修饰的糖”意指经修饰的呋喃糖基糖部分或糖替代物。
如本文所用，“糖替代物”是指具有除了可以将核碱基与另一个基团，如寡核苷酸中的核苷间键、缀合物基团或末端基团连接的呋喃糖基部分以外的部分的经修饰的糖部分。包括糖替代物的经修饰的核苷可以并入到寡核苷酸内的一个或多个位置中，并且此类寡核苷酸能够与互补性寡聚化合物或靶核酸杂交。
如本文所用，“靶核酸”和“靶RNA”意指寡聚化合物被设计成影响其的核酸。靶RNA意指RNA转录物，并且包含前体mRNA和mRNA，除非另有说明。
如本文所用，“靶区”意指靶核酸的寡聚化合物被设计成与其杂交的一部分。
如本文所用，“末端基团”意指与寡核苷酸的末端共价连接的化学基团或原子的基团。
如本文所用，“转铁蛋白受体”、“TfR1”和“CD71”意指哺乳动物1型转铁蛋白受体。“人转铁蛋白受体”和“人TfR1”意指由ENSEMBL ID ENSG00000072274和/或GenBank基因ID7037表示的基因编码的蛋白质。“小鼠转铁蛋白受体”和“小鼠TfR1”意指由ENSEMBL IDENSMUSG00000022797和/或GenBank基因ID 22042表示的基因编码的蛋白质。
如本文所用，“反义活性”意指可归因于反义化合物与其靶核酸的杂交的任何可检测到的和/或可测量的变化。在某些实施例中，反义活性是相较于在不存在反义化合物的情况下靶核酸水平或靶蛋白水平，靶核酸或由此靶核酸编码的靶蛋白的量或表达的减少。在某些实施例中，反义活性是调节靶前体mRNA的剪接。
如本文所用，“反义药剂”意指反义化合物和任选地一种或多种额外特征，如有义化合物。
如本文所用，“反义化合物”意指反义寡核苷酸和任选地一种或多种额外特征，如缀合物基团。
如本文所用，“有义化合物”意指有义寡核苷酸和任选地一种或多种额外特征，如缀合物基团。
如本文所用，“反义寡核苷酸”意指包含反义化合物的寡核苷酸部分的能够与靶核酸杂交并且能够具有至少一种反义活性的寡核苷酸。反义寡核苷酸包含但不限于反义RNAi寡核苷酸和反义RNA酶H寡核苷酸。
如本文所用，“有义寡核苷酸”意指包含有义化合物的寡核苷酸部分的能够与反义寡核苷酸杂交的寡核苷酸。
如本文所用，“RNAi剂”意指至少部分地通过RISC或Ago2起作用以调节靶核酸和/或由靶核酸编码的蛋白质的反义药剂。RNAi剂包含但不限于双链siRNA、单链RNAi(ssRNAi)和microRNA，包含microRNA模拟物。RNAi剂可以包括缀合物基团和/或末端基团。在某些实施例中，RNAi剂调节靶核酸的量和/或活性。术语RNAi剂不包括通过RNA酶H起作用的反义药剂。
如本文所用，“RNA酶H剂”意指通过RNA酶H起作用以调节靶核酸和/或由靶核酸编码的蛋白质的反义药剂。在某些实施例中，RNA酶H剂是单链的。在某些实施例中，RNA酶H剂是双链的。RNA酶H剂可以包括缀合物基团和/或末端基团。在某些实施例中，RNA酶H剂调节靶核酸的量和/或活性。术语RNA酶H剂不包括主要通过RISC/Ago2起作用的反义药剂。
如本文所用，“剪接调节剂”意指至少部分地通过调节靶核酸的剪接起作用的反义药剂。“剪接调节”剂包括“剪接调节寡核苷酸”。
如本文所用，“立体阻断剂”意指至少部分地由于与靶核酸的直接结合而起作用，由此阻断靶核酸与其它核酸或蛋白质的相互作用的反义药剂。
如本文所用，“治疗”意指通过施用本文所述的寡聚物药剂或寡聚化合物来改善受试者的疾病或病状。在某些实施例中，相对于在不存在治疗的情况下的症状，治疗受试者改善相同症状。在某些实施例中，治疗降低症状的严重程度或频率、或延迟症状的发作、减缓症状的进展或减缓症状的严重程度或频率。
如本文所用，“治疗有效量”意指寡聚物药剂或药物组合物的向受试者提供治疗益处的量。例如，治疗有效量可改善疾病的症状。
某些实施例
本公开提供了以下非限制性编码实施例：
实施例1.一种寡聚化合物，其包括经修饰的寡核苷酸和缀合物基团，其中所述经修饰的寡核苷酸由10个至300个连接的核苷组成，并且所述缀合物基团包括双环配体和缀合物接头，其中
所述双环配体包括由13-22个连接的氨基酸或氨基酸模拟物组成的多肽和分子支架，其中
所述多肽的第一氨基酸、第二氨基酸和第三氨基酸中的每一个都包括反应性基团，所述反应性基团中的每个反应性基团单独地与所述分子支架形成键，由此形成两个附接到所述分子支架的多肽环路；并且
其中所述双环配体的一部分与1型转铁蛋白受体结合；并且
其中所述经修饰的寡核苷酸通过所述缀合物接头与所述双环配体共价连接。
实施例2.根据实施例1所述的寡聚化合物，其中所述缀合物基团由所述双环配体和缀合物接头组成。
实施例3.根据实施例1或2所述的寡聚化合物，其中所述寡聚化合物由所述经修饰的寡核苷酸和所述缀合物基团组成。
实施例4.根据实施例1至3中任一项所述的寡聚化合物，其中三个反应性基团各自是半胱氨酸的硫醇。
实施例5.根据实施例1至4中任一项所述的寡聚化合物，其中所述多肽从N末端到C末端具有下式：
[B]n-[Zi]-[J]m-[Zii]-[O]o-[Ziii]-[U]p，其中：
Zi、Zii和Ziii是包括反应性基团的所述第一氨基酸、所述第二氨基酸和所述第三氨基酸；
每个B、J、O和U是独立选择的氨基酸或氨基酸模拟物；
n是0至5；
m是3至7；
o是3至7；
p是0至5；
其中m+o的和小于12。
实施例6.根据实施例5所述的寡聚化合物，其中m是7，并且o是3。
实施例7.根据实施例5所述的寡聚化合物，其中m是2，并且o是9。
实施例8.根据实施例5所述的寡聚化合物，其中m和o两者是6。
实施例9.根据实施例5所述的寡聚化合物，其中m是3，并且o是8。
实施例10.根据实施例5至9中任一项所述的寡聚化合物，其中n是0。
实施例11.根据实施例5至9中任一项所述的寡聚化合物，其中n是3或4。
实施例12.根据实施例5至11中任一项所述的寡聚化合物，其中p是0。
实施例13.根据实施例5至11中任一项所述的寡聚化合物，其中p是3或4。
实施例14.根据实施例1至13中任一项所述的寡聚化合物，其中所述多肽具有N末端修饰。
实施例15.根据实施例14所述的寡聚化合物，其中所述N末端修饰是乙酰基。
实施例16.根据实施例14所述的寡聚化合物，其中所述N末端修饰是叠氮基丙基。
实施例17.根据实施例1至13中任一项所述的寡聚化合物，其中所述多肽具有C末端修饰。
实施例18.根据实施例14所述的寡聚化合物，其中所述C末端修饰是酰胺基。
实施例19.根据实施例1至18中任一项所述的寡聚化合物，其中所述缀合物接头附接到所述双环配体的N末端氨基酸。
实施例20.根据实施例1至19中任一项所述的寡聚化合物，其中所述缀合物接头附接到所述双环配体的C末端氨基酸。
实施例21.根据实施例1至20中任一项所述的寡聚化合物，其中所述缀合物接头在所述双环配体的所述多肽环路之一内附接到氨基酸的侧链。
实施例22.根据实施例1至21中任一项所述的寡聚化合物，其中所述双环配体包括C末端延伸。
实施例23.根据实施例22所述的寡聚化合物，其中所述C末端延伸选自PEG10或PEG24。
实施例24.根据实施例1至23中任一项所述的寡聚化合物，其中所述双环配体包括N末端延伸。
实施例25.根据实施例24所述的寡聚化合物，其中所述N末端延伸选自PEG10或PEG24。
实施例26.根据实施例1至25中任一项所述的寡聚化合物，其中所述缀合物基团附接到所述经修饰的寡核苷酸的5'末端核苷。
实施例27.根据实施例26所述的寡聚化合物，其中所述缀合物基团附接到所述经修饰的寡核苷酸的所述5'末端核苷的5'位置。
实施例28.根据实施例1至25中任一项所述的寡聚化合物，其中所述缀合物基团附接到所述经修饰的寡核苷酸的3'末端核苷。
实施例29.根据实施例28所述的寡聚化合物，其中所述缀合物基团附接到所述经修饰的寡核苷酸的所述3'末端核苷的3'位置。
实施例30.根据实施例1至25中任一项所述的寡聚化合物，其中所述缀合物基团附接到所述经修饰的寡核苷酸的内部核苷。
实施例31.根据实施例1至25所述的寡聚化合物，其中所述缀合物基团通过经修饰的核苷间键附接。
实施例32.根据实施例28至30所述的寡聚化合物，其中所述缀合物基团通过2'修饰的呋喃糖基糖部分附接。
实施例33.根据实施例1至32中任一项所述的寡聚化合物，其中所述双环配体具有与SEQ ID NO:26-27、36-56、58-65、67-76、79-88、90-152或192-246中任一项具有至少80％同一性的氨基酸序列。
实施例34.根据实施例33所述的寡聚化合物，其中所述双环配体具有与SEQ IDNO:26-27、36-56、58-65、67-76、79-88、90-152或192-246中任一项具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。
实施例35.根据实施例5至34中任一项所述的寡聚化合物，其中[Zi]-[J]m-[Zii]-[O]o-[Ziii]具有与SEQ ID NO 26-27、35-56、58-65、67-76、79-88、90-152或192-246中任一项具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。
实施例36.根据实施例5至35中任一项所述的寡聚化合物，其中[Zi]-[J]m-[Zii]-[O]o-[Ziii]具有CXXDXXXGCISYC(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列，其中每个“X”是独立选择的氨基酸。
实施例37.根据实施例1至36中任一项所述的寡聚化合物，其中所述双环配体包括至少一个、至少两个或至少三个非天然氨基酸。
实施例38.根据实施例37所述的寡聚化合物，其中至少一个非天然氨基酸选自D-氨基酸、别异亮氨酸、2-氨基-3-乙基-戊酸、氨基异丁酸、氨基丁酸、氮杂环丁烷、7-氮杂色氨酸、6-叠氮基赖氨酸、β-环丁基丙氨酸、β-甲基异亮氨酸、4,4-联苯基丙氨酸、顺式-羟基脯氨酸、环丁基甘氨酸、环己基甘氨酸、环戊基丙氨酸、环戊基甘氨酸、2,6-二甲基酪氨酸、3,3-二苯基丙氨酸、4-反式-羟基-L-脯氨酸、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、N-甲基丙氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、N-甲基-色氨酸、哌啶酸、4-吡啶基丙氨酸、肌氨酸、叔丁基丙氨酸或3-叔丁基酪氨酸。
实施例39.根据实施例38所述的寡聚化合物，其中至少一个非天然氨基酸选自4-反式-羟基-L-脯氨酸、6-叠氮基赖氨酸和叔丁基甘氨酸。
实施例40.根据实施例1至39中任一项所述的寡聚化合物，其中所述分子支架是1,1',1”-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三丙-2-烯-1-酮(TATA)。
实施例41.根据实施例1至39中任一项所述的寡聚化合物，其中所述分子支架是1,1',1”-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三(2-溴乙酮)(TATB)。
实施例42.根据实施例1至41中任一项所述的寡聚化合物，其中所述双环配体不抑制转铁蛋白与所述转铁蛋白受体的结合。
实施例43.根据实施例1至42中任一项所述的寡聚化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸的至少一个核苷包括经修饰的糖部分。
实施例44.根据实施例43所述的寡聚化合物，其中至少一个经修饰的糖部分包括双环状糖部分。
实施例45.根据实施例44所述的寡聚化合物，其中所述双环状糖部分包括选自以下的2'-4'桥：-O-CH2-；以及–O-CH(CH3)-。
实施例46.根据实施例43至45所述的寡聚化合物，其中至少一个经修饰的糖部分包括非双环状经修饰的糖部分。
实施例47.根据实施例46所述的寡聚化合物，其中所述非双环状经修饰的糖部分是2'-MOE糖部分或2'-OMe糖部分。
实施例48.根据实施例43至47中任一项所述的寡聚化合物，其中经修饰的寡核苷酸化合物的至少一个核苷包括糖替代物。
实施例49.根据实施例1至48中任一项所述的寡聚化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸包括至少一个经修饰的核苷间键。
实施例50.根据实施例49所述的寡聚化合物，其中至少一个经修饰的核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。
实施例51.根据实施例49至50中任一项所述的寡聚化合物，其中每个核苷间键是经修饰的核苷间键。
实施例52.根据实施例51所述的寡聚化合物，其中每个核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。
实施例53.根据实施例1至50中任一项所述的寡聚化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸包括至少一个磷酸二酯核苷间键。
实施例54.根据实施例1至50或53中任一项所述的寡聚化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸的每个核苷间键独立地选自磷酸二酯核苷间键或硫代磷酸酯核苷间键。
实施例55.根据实施例49所述的寡聚化合物，其中至少一个经修饰的核苷间键是甲磺酰基氨基磷酸酯核苷间键。
实施例56.根据实施例49至55中任一项所述的寡聚化合物，其中每个核苷间键独立地选自磷酸二酯核苷间键、硫代磷酸酯核苷间键或甲磺酰基氨基磷酸酯核苷间键。
实施例57.根据实施例49至55中任一项所述的寡聚化合物，其中每个核苷间键独立地选自硫代磷酸酯核苷间键或甲磺酰基氨基磷酸酯核苷间键。
实施例58.根据实施例1至57中任一项所述的寡聚化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸包括至少一个经修饰的核碱基。
实施例59.根据实施例58所述的寡聚化合物，其中所述经修饰的核碱基是5-甲基胞嘧啶。
实施例60.根据实施例1至59中任一项所述的寡聚化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸包括由5-12个连续2'-脱氧核苷组成的脱氧区。
实施例61.根据实施例60所述的寡聚化合物，其中所述脱氧区中的每个核苷是2'-β-D-脱氧核苷。
实施例62.根据实施例60或61所述的寡聚化合物，其中所述脱氧区由7个、8个、9个、10个或7-10个连接的核苷组成。
实施例63.根据实施例60至62中任一项所述的寡聚化合物，其中紧邻所述脱氧区的每个核苷包括经修饰的糖部分。
实施例64.根据实施例60至63中任一项所述的寡聚化合物，其中所述脱氧区在5'侧被由1-6个连接的5'区核苷组成的5'区侧接，并且在3'侧被由1-6个连接的3'区核苷组成的3'区侧接；其中
所述5'区中的最靠近3'的核苷包括经修饰的糖部分；并且
所述3'区中的最靠近5'的核苷包括经修饰的糖部分。
实施例65.根据实施例64所述的寡聚化合物，其中所述3'区中的每个核苷包括经修饰的糖部分。
实施例66.根据实施例64或65所述的寡聚化合物，其中所述5'区中的每个核苷包括经修饰的糖部分。
实施例67.根据实施例1至66中任一项所述的寡聚化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸具有包括以下的糖基序：
由1-6个连接的5'区核苷组成的5'区；
由6-10个连接的内部区核苷组成的内部区；以及
由1-6个连接的3'区核苷组成的3'区；
其中所述5'区核苷中的每一个与所述3'区核苷中的每一个包括经修饰的糖部分；并且所述内部区核苷中的每一个选自2'-脱氧核苷和2'取代的核苷。
实施例68.根据实施例67所述的寡聚化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸具有包括以下的糖基序：
由1-6个连接的5'区核苷组成的5'区；
由6-10个连接的内部区核苷组成的内部区；以及
由1-6个连接的3'区核苷组成的3'区；
其中所述5'区核苷中的每一个与所述3'区核苷中的每一个是cEt核苷或2'-MOE核苷；并且所述内部区核苷中的每一个是2'-β-D-脱氧核苷。
实施例69.根据实施例1至59中任一项所述的寡聚化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸的每个核苷包括2'糖部分。
实施例70.根据实施例69所述的寡聚化合物，其中每个2'糖部分选自2'-OMe、2'-MOE或2'-NMA。
实施例71.根据实施例69或70所述的寡聚化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸的每个核苷包括相同的2'糖部分。
实施例72.根据实施例1至71中任一项所述的寡聚化合物，其中所述缀合物接头是可切割的。
实施例73.根据实施例1至72中任一项所述的寡聚化合物，其中所述缀合物接头包括1-3个接头核苷。
实施例74.根据实施例1至72中任一项所述的寡聚化合物，其中所述缀合物接头不包括任何接头核苷。
实施例75.根据实施例1至74中任一项所述的寡聚化合物，其中所述缀合物基团包括：
实施例76.根据实施例1至74中任一项所述的寡聚化合物，其中所述缀合物基团包括：
实施例77.根据实施例1至74中任一项所述的寡聚化合物，其中所述缀合物基团包括：
实施例78.根据实施例1至74中任一项所述的寡聚化合物，其中所述缀合物基团包括：任选地，
实施例79.根据实施例1至74中任一项所述的寡聚化合物，其中所述缀合物基团包括：
实施例80.根据实施例1至74中任一项所述的寡聚化合物，其中所述缀合物基团包括：
实施例81.根据实施例1至74中任一项所述的寡聚化合物，其中所述缀合物基团包括：
实施例82.根据实施例1至74中任一项所述的寡聚化合物，其中所述缀合物基团包括：
实施例83.根据实施例1至82中任一项所述的寡聚化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸与在肌肉中表达的靶核酸互补。
实施例84.根据实施例1至83中任一项所述的寡聚化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸能够通过激活RNA酶H来减少靶核酸的量。
实施例85.根据实施例1至83中任一项所述的寡聚化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸能够通过激活RISC/Ago2来减少靶核酸的量。
实施例86.根据实施例1至83中任一项所述的寡聚化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸能够调节靶核酸的剪接。
实施例87.根据实施例1至83中任一项所述的寡聚化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸是向导RNA、tracrRNA或scout RNA。
实施例88.根据实施例1至87中任一项所述的寡聚化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸与在肌肉中表达的靶核酸的补体互补。
实施例89.根据实施例83至88中任一项所述的寡聚化合物，其中所述靶核酸与肌肉疾病相关。
实施例90.根据实施例83至89中任一项所述的寡聚化合物，其中所述靶核酸选自CaMK2d、NLRP3、PLN、DMD、DMPK、DNM2、DUX4或HPRT。
实施例91.根据实施例83至90中任一项所述的寡聚化合物，其中肌肉靶核酸具有选自SEQ ID NO:1-15中的任一项的序列。
实施例92.根据实施例83至91中任一项所述的寡聚化合物，其中所述靶核酸在以下组织中的至少一种中表达中的至少一种中表达：骨骼肌(包含但不限于四头肌、腓肠肌、胫骨前肌、三头肌、咬肌、趾长伸肌(EDL)、比目鱼肌、膈膜)、心脏、坐骨神经、主动脉或肝。
实施例93.根据实施例1至92中任一项所述的寡聚化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸的核碱基序列包括SEQ ID NO:167-191中的任一项的任何核碱基序列中的至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个连续核碱基。
实施例94.根据实施例1至93中任一项所述的寡聚化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸由10个至25个、10个至30个、12个至20个、12个至25个、12个至30个、13个至20个、13个至25个、13个至30个、14个至20个、14个至25个、14个至30个、15个至20个、15个至25个、15个至30个、16个至18个、16个至20个、16个至25个、16个至30个、17个至20个、17个至25个、17个至30个、18个至20个、18个至25个、18个至30个、19个至20个、19个至25个、19个至30个、20个至25个、20个至30个、21个至25个、21个至30个、21个至50个、22个至25个、22个至30个、23个至25个、23个至30个、20个至100个、40个至100个、50个至100个、50个至200个、100个至300个、150个至300个或200个至300个连接的核苷组成。
实施例95.一种寡聚双链体，其包括第一寡聚化合物和第二化合物寡聚物，所述第一寡聚化合物包括第一经修饰的寡核苷酸，所述第二化合物寡聚物包括由16个至30个连接的核苷组成的第二经修饰的寡核苷酸，其中所述第二经修饰的寡核苷酸的核碱基序列包括由至少12个核碱基构成的互补性区，所述互补性区与所述第一经修饰的寡核苷酸的相等长度部分至少90％互补，并且其中所述第二寡聚化合物是根据实施例1至86或89至94中任一项所述的寡聚化合物。
实施例96.根据实施例95所述的寡聚双链体，其中所述第一经修饰的寡核苷酸与肌肉靶核酸是互补的。
实施例97.根据实施例96所述的寡聚双链体，其中所述双链体能够通过激活RISC/Ago2来减少靶核酸的量。
实施例98.根据实施例95至97中任一项所述的寡聚双链体，其中所述第二经修饰的寡核苷酸的至少一个核苷包括经修饰的糖部分。
实施例99.根据实施例98所述的寡聚双链体，其中所述第二经修饰的寡核苷酸的所述经修饰的糖部分包括双环状糖部分。
实施例100.根据实施例99所述的寡聚双链体，其中所述第二经修饰的寡核苷酸的所述双环状糖部分包括选自以下的2'-4'桥：–O-CH2-；以及–O-CH(CH3)-。
实施例101.根据实施例100所述的寡聚双链体，其中所述第二经修饰的寡核苷酸的所述经修饰的糖部分包括非双环状经修饰的糖部分。
实施例102.根据实施例101所述的寡聚双链体，其中所述第二经修饰的寡核苷酸的所述非双环状经修饰的糖部分是2'-MOE糖部分、2'-F糖部分或2'-OMe糖部分。
实施例103.根据实施例95至102中任一项所述的寡聚双链体，其中所述第二经修饰的寡核苷酸的至少一个核苷包括糖替代物。
实施例104.根据实施例95至102中任一项所述的寡聚双链体，其中所述第二经修饰的寡核苷酸的至少一个核苷间键是经修饰的核苷间键。
实施例105.根据实施例104所述的寡聚双链体，其中所述第二经修饰的寡核苷酸的至少一个经修饰的核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。
实施例106.根据实施例95至105中任一项所述的寡聚双链体，其中所述第二经修饰的寡核苷酸的至少一个核苷间键是磷酸二酯核苷间键。
实施例107.根据实施例95至104或106中任一项所述的寡聚双链体，其中所述第二经修饰的寡核苷酸的每个核苷间键独立地选自磷酸二酯核苷间键或硫代磷酸酯核苷间键。
实施例108.根据实施例95至107中任一项所述的寡聚双链体，其中所述第二经修饰的寡核苷酸包括至少一个经修饰的核碱基。
实施例109.根据实施例108所述的寡聚双链体，其中所述第二经修饰的寡核苷酸的所述经修饰的核碱基是5-甲基胞嘧啶。
实施例110.根据实施例95至109中任一项所述的寡聚双链体，其中所述第一寡聚化合物包括5'稳定化的磷酸酯基团。
实施例111.根据实施例95至109中任一项所述的寡聚双链体，其中所述第二寡聚化合物包括5'稳定化的磷酸酯基团。
实施例112.根据实施例110或111所述的寡聚双链体，其中所述稳定化的磷酸酯基团包括膦酸环丙酯或膦酸乙烯酯。
实施例113.根据实施例95至112中任一项所述的寡聚双链体，其中所述第一经修饰的寡核苷酸包括乙二醇核酸(GNA)糖替代物。
实施例114.根据实施例95至113中任一项所述的寡聚双链体，其中第一经修饰的寡核苷酸包括2'-NMA糖部分。
实施例115.根据实施例95至114中任一项所述的寡聚双链体，其中所述第二经修饰的寡核苷酸包括乙二醇核酸(GNA)糖替代物。
实施例116.根据实施例95至115中任一项所述的寡聚双链体，其中所述第二经修饰的寡核苷酸化合物包括2'-NMA糖部分。
实施例117.一种调节受试者的核酸靶标的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据实施例1至94中任一项所述的寡聚化合物或根据实施例95至116中任一项所述的寡聚双链体。
实施例118.根据实施例117所述的方法，其中所述核酸靶标在以下中的至少一种中表达：骨骼肌(包含但不限于四头肌、腓肠肌、胫骨前肌、三头肌、咬肌、趾长伸肌(EDL)、比目鱼肌、膈膜)、心脏、坐骨神经、主动脉或肝。
实施例119.根据实施例117或118所述的方法，其中施用根据实施例1至94中任一项所述的寡聚化合物或根据实施例95至116中任一项所述的寡聚双链体引起所述核酸靶标的减少。
实施例120.根据实施例117或118所述的方法，其中施用根据实施例1至94中任一项所述的寡聚化合物或根据实施例95至116中任一项所述的寡聚双链体引起所述核酸靶标的剪接的变化。
实施例121.根据实施例117至120中任一项所述的方法，其中所述寡聚化合物或所述寡聚双链体通过静脉内给药或皮下给药施用。
实施例122.根据实施例117至120中任一项所述的方法，其中所述寡聚化合物或所述寡聚双链体以5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg、140mg、145mg、150mg、155mg、160mg、165mg、170mg、175mg、180mg、185mg、190mg、195mg、200mg、205mg、210mg、215mg、220mg、225mg、230mg、235mg、240mg、245mg、250mg、255mg、260mg、265mg、270mg、275mg、280mg、285mg、290mg、295mg、300mg、305mg、310mg、315mg、320mg、325mg、330mg、335mg、340mg、345mg或350mg的剂量施用。
实施例123.根据实施例117至122中任一项所述的方法，其包括每4周一次、每6周一次、每8周一次、每12周一次、每16周一次、每20周一次、每24周一次、每6个月一次或每年一次施用所述寡聚化合物或所述寡聚双链体。
实施例124.一种对转铁蛋白受体1(TfR1)具有特异性的双环配体，所述双环配体包括选自以下的氨基酸序列：CP[HyP]DAYLGC[tBuGly]SYCEPWK(SEQ ID NO:245，本文称为BCY21757)和CP[HyP]DAYLGC[tBuGly]SYCEPWC(SEQ ID NO:246，本文称为BCY21758)，其中HyP表示反式-4-羟基-L-脯氨酸，并且tBuGly表示叔丁基-甘氨酸。
实施例125.根据实施例124所述的双环配体，其包括N末端乙酰基和C末端CONH2基团。
实施例126.根据实施例124或125所述的双环配体，其是药学上可接受的盐。
实施例127.根据实施例126所述的药物盐，其中所述药学上可接受的盐选自钠盐、钾盐、钙盐或铵盐。
实施例128.根据实施例124所述的双环配体，其中所述肽配体内的第一半胱氨酸残基、第二半胱氨酸残基和第三半胱氨酸残基与分子支架共价键合，使得在所述分子支架上形成两个多肽环路。
实施例129.根据实施例125所述的双环配体，其中所述分子支架是1,1',1”-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三丙-2-烯-1-酮(TATA)。
某些化合物
在某些实施例中，本文中提供了包括一个或多个寡核苷酸和一个或多个缀合物基团的化合物。在某些实施例中，寡核苷酸是经修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，寡核苷酸是未经修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，化合物包括寡核苷酸、细胞靶向性部分和缀合物接头。在某些实施例中，寡聚化合物包括寡核苷酸、双环配体和缀合物接头。在某些实施例中，寡聚化合物包括寡核苷酸、多肽、缀合物接头以及对多肽的任选地N末端或C末端修饰。在某些实施例中，寡聚化合物包括寡核苷酸、两个或更多个多肽、分支基团、缀合物接头以及对多肽的任选地N末端或C末端修饰。在某些实施例中，缀合物接头将多肽和/或双环配体与寡核苷酸连接。
在某些实施例中，双环配体的N末端与缀合物接头共价连接，并且缀合物接头与寡核苷酸的3'端共价连接。在某些实施例中，双环配体的C末端与缀合物接头共价连接，并且缀合物接头与寡核苷酸的3'端共价连接。在某些实施例中，双环配体的内部氨基酸与缀合物接头共价连接，并且缀合物接头与寡核苷酸的3'端共价连接。在某些实施例中，双环配体的N末端与缀合物接头共价连接，并且所述缀合物接头与寡核苷酸的5'端共价连接。在某些实施例中，双环配体的C末端与缀合物接头共价连接，并且所述缀合物接头与寡核苷酸的5'端共价连接。在某些实施例中，双环配体的内部氨基酸与缀合物接头共价连接，并且所述缀合物接头与寡核苷酸的5'端共价连接。在某些实施例中，双环配体的N末端与缀合物接头共价连接，并且所述缀合物接头在寡核苷酸的内部位置处共价连接。在某些实施例中，双环配体的C末端与缀合物接头共价连接，并且所述缀合物接头在寡核苷酸的内部位置处共价连接。在某些实施例中，双环配体的内部氨基酸与缀合物接头共价连接，并且所述缀合物接头在寡核苷酸的内部位置处共价连接。在某些实施例中，寡核苷酸的内部位置是经修饰的糖部分的2'位置。在某些实施例中，寡核苷酸的内部位置是经修饰的核苷间键。
某些缀合物基团
在某些实施例中，缀合物部分修饰所附接的寡核苷酸的一种或多种特性，包含但不限于药效学、药代动力学、稳定性、结合、吸收、组织分布、细胞分布、细胞摄取、电荷和清除。在某些实施例中，缀合物部分赋予所附接的寡核苷酸新特性。
在某些实施例中，缀合物基团包括缀合物部分和缀合物接头。在某些实施例中，缀合物部分包括细胞靶向性部分或由细胞靶向性部分组成。在某些实施例中，细胞靶向性部分能够与细胞表面受体或细胞表面部分结合。在某些实施例中，当包括细胞靶向性部分的化合物与细胞表面受体或细胞表面部分相互作用或结合时，其能够被内化。在某些实施例中，细胞靶向性部分包括双环状多肽或双环配体。在某些实施例中，细胞靶向性部分由双环状多肽或双环配体组成。
在某些实施例中，双环配体包括多肽，所述多肽包括至少三个由至少两个环路序列隔开的反应性基团；以及分子支架，所述分子支架与所述多肽的所述反应性基团形成共价键，使得在所述分子支架上形成至少两个多肽环路。在某些实施例中，分子支架为1,1',1”-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三丙-2-烯-1-酮(TATA)。在某些实施例中，分子支架为1,1',1”-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三(2-溴乙酮)(TATB)。
在某些实施例中，反应性基团为半胱氨酸。在某些实施例中，环路序列包括2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸。在某些实施例中，环路序列包括三个由两个环路序列隔开的半胱氨酸残基，所述两个环路序列中的第一环路序列由2个氨基酸组成，并且所述两个环路序列中的第二环路序列由9个氨基酸组成。在某些实施例中，环路序列包括三个由两个环路序列隔开的半胱氨酸残基，所述两个环路序列均由6个氨基酸组成。在某些实施例中，环路序列包括三个由两个环路序列隔开的半胱氨酸残基，所述两个环路序列中的第一环路序列由3个氨基酸组成，并且所述两个环路序列中的第二环路序列由8个氨基酸组成。在某些实施例中，环路序列包括三个由两个环路序列隔开的半胱氨酸残基，所述两个环路序列中的第一环路序列由7个氨基酸组成，并且所述两个环路序列中的第二环路序列由3个氨基酸组成。
在某些实施例中，双环配体包括选自以下的氨基酸序列：
CiXXCiiXXXXXXXXXCiii；
CiXXXXXXCiiXXXXXXCiii；
CiXXXCiiXXXXXXXXiii；或
CiXXXXXXXCiiXXXCiii；
其中Ci、Cii和Ciii分别表示第一半胱氨酸残基、第二半胱氨酸残基和第三半胱氨酸残基，并且每个“X”表示独立选择的天然或非天然氨基酸或其药学上可接受的盐。在某些实施例中，双环配体进一步包括N末端延伸和/或C末端延伸。
在某些实施例中，双环配体包括与以下序列中的任一项至少80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列：
CiSPDAHLGCiiISYCiii(SEQ ID NO:26)；
CiSPDAYLGCiiISYCiii(SEQ ID NO:27)；
CiP[HyP]DAYLGCiiISYCiii(SEQ ID NO:93)；
CiS[HyP]DAHLGCiiISYCiii(SEQ ID NO:95)；
CiS[Aze]DAHLGCiiISYCiii(SEQ ID NO:128)；
CiP[HyP]DAYLGCii[tBuGly]SYCiii(SEQ ID NO:86)；
Ci[K(N3)]PDAHLGCiiISYCiii(SEQ ID NO:150)；
CiS[K(N3)]DAHLGCiiISYCiii(SEQ ID NO:151)；或
CiSPD[K(N3)]HLGCiiISYCiii(SEQ ID NO:152)；
Ci、Cii和Ciii分别表示第一半胱氨酸、第二半胱氨酸和第三半胱氨酸；[HyP]表示4-反式-羟基-L-脯氨酸；[Aze]表示氮杂环丁烷；[tBuGly]表示叔丁基甘氨酸；并且[K(N3)]表示6-叠氮基赖氨酸。在某些实施例中，双环配体进一步包括N末端延伸和/或C末端延伸。
在某些实施例中，双环配体包括以下的氨基酸序列：
CiXXDXXXGCiiISYCiii(SEQ ID NO:35)；其中每个X独立地选自天然或非天然氨基酸或其药学上可接受的盐。在某些实施例中，双环配体进一步包括N末端延伸和/或C末端延伸。
在某些实施例中，寡聚化合物包括两个或更多个通过缀合物接头附接的双环状配体，所述缀合物接头包含包括分支基团的二价接头。在某些实施例中，二价接头包括一个或多个PEG重复基序。在某些实施例中，二价接头以以下的结构示出：
在某些实施例中，双环配体能够与细胞上的细胞表面受体相互作用。在某些实施例中，双环配体能够与细胞上的细胞表面部分相互作用。在某些实施例中，双环配体能够与细胞上的细胞表面受体结合。在某些实施例中，双环配体能够与细胞上的细胞表面部分结合。在某些实施例中，当双环配体与细胞表面受体或细胞表面部分相互作用或结合时，其能够被内化。在某些实施例中，细胞表面受体不普遍地进行表达(例如，细胞表面受体在人类受试者的至少一种组织中不可检测到)，并且双环配体选择性地将寡核苷酸递送到所关注组织或所关注细胞。通过非限制性实例，所关注组织可以是以下中的任一种：脑、脊髓、视网膜、心脏、肾脏、肝脏、肺、骨骼肌、心肌、平滑肌、脂肪、白色脂肪、棕色脂肪、脾脏、骨骼、肠、结肠、睾丸、乳房、卵巢、胎盘、子宫、膀胱、胰腺、垂体、前列腺、皮肤、肾上腺和甲状腺。通过非限制性实例，所关注细胞可以是以下中的任一种：肌细胞、脂肪细胞、肝细胞、心肌细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞、神经元、血细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、癌细胞和免疫细胞。
在某些实施例中，双环配体能够与细胞表面受体相互作用或结合。在某些实施例中，细胞表面受体能够使双环配体内化。在某些实施例中，细胞表面受体能够使通过缀合物接头与双环配体连接的寡核苷酸内化。在某些实施例中，细胞表面受体是人转铁蛋白受体。
在某些实施例中，双环配体由式[B]n-[Zi]-[J]m-[Zii]-[O]o-[Ziii]-[U]p表示，其中：
Zi、Zii和Ziii是包括反应性基团的所述第一氨基酸、所述第二氨基酸和所述第三氨基酸；
每个B、J、O和U是独立选择的氨基酸或氨基酸模拟物；
n是0至5；
m是3至7；
o是3至7；
p是0至5；
其中m+o的和小于12。
在某些实施例中，双环配体包括以下结构：
其中每个Xaa是独立选择的氨基酸侧链；
每个Baa是独立选择的氨基酸或氨基酸模拟物；
n是0至5；
m是3至7；
o是3至7；
p是0至5；
其中m+o的和小于12。
在某些实施例中，缀合物接头通过N末端、C末端或通过环路氨基酸之一附接。
在某些实施例中，双环配体包括式[Zi]-[J]m-[Zii]-[O]o-[Ziii]。在某些实施例中，双环配体包括以下结构：
其中每个Xaa是独立选择的氨基酸侧链，每个Baa是独立选择的氨基酸或氨基酸模拟物；
M是3至7；并且
o是3至7。
在某些实施例中，双环配体进一步包括N末端延伸和/或C末端延伸。
在某些实施例中，缀合物接头通过N末端、C末端或通过环路氨基酸之一附接。
在某些实施例中，双环配体包括选自以下表的序列或由选自以下表的序列组成：
表1：双环配体
其中Ac表示乙酰基，AzPro表示叠氮基丙基，Abu表示氨基丁酸，Aib表示氨基异丁酸，Aze表示氮杂环丁烷，B-MeIle表示β-甲基异亮氨酸，C5g表示环戊基甘氨酸，Cba表示β-环丁基丙氨酸，Cbg表示环丁基甘氨酸，Chg表示环己基甘氨酸，Cpg表示环丙基甘氨酸，EPA表示2-氨基-3-乙基-戊酸，HyP表示反式-4-羟基-L-脯氨酸，K(N3)表示6-叠氮基赖氨酸，1Nal表示1-萘基丙氨酸，2Nal表示2-萘基丙氨酸，4Pal表示4-吡啶基丙氨酸，Pip表示哌啶酸；tBuAla表示叔丁基-丙氨酸，tBuGly表示叔丁基-甘氨酸，3tBuTyr表示3-叔丁基-酪氨酸，Sar表示肌氨酸，K-Fl表示在赖氨酸6位置处附接的荧光素，Fl-G表示在甘氨酸的N末端处附接的荧光素，NMeTrp表示N-甲基色氨酸，dP表示D-脯氨酸，dA表示D-丙氨酸，dW表示D-色氨酸，dS表示D-丝氨酸，dT表示D-苏氨酸，dD表示D-天冬氨酸，dN表示D-天冬氨酸，dQ表示D-谷氨酰胺，顺式-HyP表示顺式-L-4-羟基脯氨酸，DOPA表示3,4-二羟基-苯丙氨酸，Gla表示L-γ-羧基谷氨酸，HSer表示高丝氨酸，hTyr表示高-酪氨酸，3HyV表示3-羟基-L-缬氨酸，Oxa表示噁唑烷-4-羧酸，pCaPhe表示L-4-氨基甲酰基苯丙氨酸，pCoPhe表示4-羧基-L-苯丙氨酸，并且[K(N3)(PYA-马来酰亚胺)]表示具有以下结构的经修饰的赖氨酸：
在某些实施例中，双环配体具有以下结构：
或其盐，其中Q是N3(BCY17901，SEQ ID NO:92)、NH2(BCY21758，SEQ ID NO:245)、SH(BCY21758，SEQ ID NO:246)、缀合物接头或与寡核苷酸共价连接的缀合物接头。
在某些实施例中，双环配体包括选自以下的氨基酸序列：CP[HyP]DAYLGC[tBuGly]SYCEPWK(SEQ ID NO:245，本文称为BCY21757)和CP[HyP]DAYLGC[tBuGly]SYCEPWC(SEQ IDNO:246，本文称为BCY21758)，其中HyP表示反式-4-羟基-L-脯氨酸，并且tBuGly表示叔丁基-甘氨酸。在某些实施例中，双环配体包括N末端乙酰基和C末端CONH2基团。在某些实施例中，双环配体内的第一半胱氨酸残基、第二半胱氨酸残基和第三半胱氨酸残基与分子支架共价键合，使得在分子支架上形成两个多肽环路。在某些实施例中，分子支架为1,1',1”-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三丙-2-烯-1-酮(TATA)。
转铁蛋白受体
在某些实施例中，双环配体能够与1型转铁蛋白受体相互作用。在某些实施例中，双环配体能够与1型转铁蛋白受体结合。在某些实施例中，双环配体能够在不干扰天然配体转铁蛋白的结合的同时与1型转铁蛋白受体结合。在某些实施例中，双环配体抑制天然配体转铁蛋白的结合。
某些缀合物接头
在某些实施例中，寡聚化合物包括寡核苷酸和缀合物基团，其中缀合物基团包括缀合物部分和缀合物接头。在某些实施例中，缀合物接头将缀合物部分与寡核苷酸连接。在某些实施例中，缀合物接头为单一化学键(即，缀合物部分通过单个键直接附接到寡核苷酸)。在某些实施例中，缀合物接头包括一个或多个原子。在某些实施例中，缀合物接头包括化学基团。在某些实施例中，缀合物接头包括链结构，如烃基链，或重复单元，如乙二醇、核苷或氨基酸单元的寡聚物。在某些实施例中，寡核苷酸是经修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，缀合物部分是双环配体。在某些实施例中，缀合物部分包括两个附接到分子支架的多肽环路。
在某些实施例中，缀合物接头包括一个或多个选自以下的基团：烷基、氨基、氧代、酰胺、二硫、聚乙二醇、醚、硫醚和羟胺基。在某些此类实施例中，缀合物接头包括选自以下的基团：烷基、氨基、氧基、酰胺和醚基团。在某些实施例中，缀合物接头包括选自烷基和酰胺基团的基团。在某些实施例中，缀合物接头包括选自烷基和醚基团的基团。在某些实施例中，缀合物接头包括至少一个磷部分。在某些实施例中，缀合物接头包括至少一个磷酸酯基团。在某些实施例中，缀合物接头包含至少一个中性连接基团。
在某些实施例中，缀合物接头，包含以上描述的缀合物接头，是双官能连接基团，例如，本领域已知可用于将缀合物部分附接到亲本化合物，如本文提供的寡核苷酸的双官能连接基团。一般来说，双官能连接部分包括至少两个官能团。所述官能团中的一个官能团被选择为与母体化合物上的特定位点发生反应，并且另一个官能团被选择为与肽扩展剂发生反应。双官能连接部分中使用的官能团的实例包含但不限于用于与亲核基团发生反应的亲电体和用于与亲电基团发生反应的亲核体。在某些实施例中，双官能连接部分包括一个或多个选自以下的基团：氨基、羟基、羧酸、硫醇、烷基、烯基和炔基。
在某些实施例中，缀合物接头包括在第一官能团与第二官能团之间发生反应时形成的化学基团。在某些实施例中，在合成期间将经修饰的寡核苷酸附接到第一官能团，并且在合成期间将缀合物部分附接到第二官能团。然后，将这两种化合物在特定条件下混合以产生最终的寡聚化合物。在某些实施例中，缀合物部分是双环配体。在某些实施例中，缀合物部分包括两个附接到分子支架的多肽环路。此类与寡核苷酸和肽化学两者相容的反应先前已进行了描述，并且通常被称为“生物缀合”反应。这些反应包含应变促进的叠氮-炔烃环加成(SPAAC)、铜催化的点击反应(CuAAC)、与氨基修饰的寡核苷酸的活性酯缀合、马来酰亚胺-硫醇迈克尔加成(maleimide-thiol Michael addition)、酮醇/羟胺连接、施陶丁格连接(Staudinger ligation)、还原胺化、硫醚形成、二硫形成、还原烷基化、无催化剂的N-芳基化、氟化硫交换点击反应(SuFEx)和反需求的狄尔斯-阿尔德反应(inverse demandDiels Alder reaction)。某些此类反应描述于例如Jbara等人,“与双官能钯试剂的寡核苷酸生物缀合(Oligonucleotide Bioconjugation with Bifunctional PalladiumReagents)”,《德国应用化学国际版》2021,60(21)12109-12115；Dong等人,“硫(VI)氟交换(SuFEx)：点击化学的另一个好反应(Sulfur(VI)Fluoride Exchange(SuFEx):AnotherGood Reaction for Click Chemistry)”,《德国应用化学国际版》2014,53(36):9430-9448.4；Zhang等人,“用于生物缀合的芳基化化学(Arylation Chemistry forBioconjugation)”,《德国应用化学国际版(英文版)》2019；58(15):4810–4839；Walsh等人,“抗体-药物缀合物的位点选择性修饰策略(Site-selective modification strategiesin antibody-drug conjugates)”《化学学会评论(Chem.Soc.Rev.)》,2021,50:1305-1353；Tiefenbrunn等人,“化学选择性连接技术：历史悠久的化学的现代应用(Chemoselectiveligation techniques:modern applications of time-honored chemistry)”,《生物聚合物(Biopolymers)》,2010,94(1):95-106；Drake等人,《生物缀合化学》2014,25(7):1331-1341；Bode,《化学研究述评(Acc.Chem.Res.)》,2017,50,9,2104–2115；J.Magano,B.Bock等人,《有机工艺研究与开发(Org.Proc.Res.Dev.)》2014,18:142-151；Craig S.McKay和M.G.Finn,“复合混合物中的点击化学：生物正交生物缀合(Click Chemistry in ComplexMixtures:Bioorthogonal Bioconjugation)”,《化学与生物学(Chemistry&Biology)》2014；Mitchell P.Christy等人,《有机化学通讯(Org.Lett.)》2020,22:2365；Ren等人,《德国应用化学国际版(英文版)》2009,48,9658–9662；Rohrbacher,F.等人,《黑体化学学报(Helv.Chim.Acta.)》2018,101；Baalmaan等人,“用于靶向合成支化和定义良好的蛋白质-蛋白质缀合物的生物正交点击化学工具箱(A Bioorthogonal Click Chemistry Toolboxfor Targeted Synthesis of Branched and Well-Defined Protein–ProteinConjugates)”,《德国应用化学国际版》2020(59):12885-12893；Lang等人,“用于标记蛋白质的双正交反应(Biorthogonal Reactions for Labeling Proteins)”,《美国化学会志(J.Am.Chem.Soc)》,2014,9(1):16-20；Nair等人,“硫醇-迈克尔加成点击反应：材料化学中的强有力且广泛使用的工具(The Thiol-Michael Addition Click Reaction:A Powerfuland Widely Used Tool in Materials Chemistry”,《化学材料(Chem.Mater.)》2013 26(1):724-744；Kalia和Raines,“腙和肟的水解稳定性(Hydrolytic Stability ofHydrazones and Oximes)”,《德国应用化学国际版》,2008,47:7523-7526。
缀合物接头的实例包含但不限于吡啶、8-氨基-3,6-二噁辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)和6-氨基己酸(AHEX或AHA)。其它缀合物接头包含但不限于经取代的或未经取代的C1-C10烷基、经取代的或未经取代的C2-C10烯基或经取代的或未经取代的C2-C10炔基，其中优选取代基的非限制性列表包含羟基、氨基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基、硫醇、硫代烷氧基、卤素、烷基、芳基、烯基和炔基。
在某些实施例中，双环配体包括N末端或C末端延伸叠氮化物基团，所述叠氮化物基团任选地可以通过与双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基氨基甲酸甲酯-寡聚物或2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺-寡聚物的环加成而与寡聚化合物连接。在某些实施例中，双环配体包括N末端或C末端延伸酰胺基团，所述酰胺基团任选地可以通过与寡聚-7-氨基-7-氧代庚酸偶联而与寡聚化合物连接。在某些实施例中，双环配体包括N末端或C末端延伸2-(氨基氧基)乙酰胺基团，所述乙酰胺基团任选地可以通过与5-氧代-5-(4-氧代哌啶-1-基)戊酰胺-寡聚物缩合而与寡聚化合物连接。在某些实施例中，双环配体包括N末端或C末端延伸硫醇基，所述硫醇基任选地可以通过与3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡啶-1-基)丙烯酰胺-寡聚物的缩合而与寡聚化合物连接。
在某些实施例中，缀合物接头包括1-10个接头的核苷。在某些实施例中，缀合物接头包括2-5个接头的核苷。在某些实施例中，缀合物接头包括确切3个接头的核苷。在某些实施例中，缀合物接头包括TCA基序。在某些实施例中，此类接头核苷是经修饰的核苷。在某些实施例中，此类接头核苷包括经修饰的糖部分。在某些实施例中，接头核苷是未经修饰的。在某些实施例中，接头核苷包括任选地受保护的杂环碱基，所述任选地受保护的杂环碱基选自嘌呤、经取代的嘌呤、嘧啶或经取代的嘧啶。在某些实施例中，可切割部分是选自以下的核苷：尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、4-N-苯甲酰基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、4-N-苯甲酰基-5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤、6-N-苯甲酰基腺嘌呤、鸟嘌呤和2-N-异丁基鸟嘌呤。通常期望在接头核苷到达靶组织后从寡聚化合物中切割接头核苷。因此，接头核苷通常彼此连接并且通过可切割键与寡聚化合物的其余部分连接。在某些实施例中，此类可切割键是磷酸二酯键。
在此，接头核苷不被视为是寡核苷酸的一部分。因此，在其中寡聚化合物包括由特定数量或范围的连接的核苷和/或与参考核酸的特定互补性百分比组成的寡核苷酸并且寡聚化合物还包括包含接头核苷的缀合物接头的实施例中，这些接头核苷不计入寡核苷酸的长度，并且不用于确定寡核苷酸与参考核酸的互补性百分比。例如，寡聚化合物可以包括(1)由8-30个核苷组成的寡核苷酸以及(2)包括与寡核苷酸的核苷相邻的1-10个接头的核苷的缀合物接头。此类寡聚化合物中连续连接的核苷的总数超过30个。可替代地，寡聚化合物可以包括由8-30个核苷组成并且无缀合物接头的寡核苷酸。此类寡聚化合物中连续连接的核苷的总数不超过30个。除非另有说明，否则缀合物接头包括不超过10个接头的核苷。在某些实施例中，缀合物接头包括不超过5个接头的核苷。在某些实施例中，缀合物接头包括不超过3个接头的核苷。在某些实施例中，缀合物接头包括不超过2个接头的核苷。在某些实施例中，缀合物接头包括不超过1个接头的核苷。
在某些实施例中，期望从寡核苷酸中切割缀合物部分。例如，在某些情况下，包括特定缀合物部分的寡聚化合物更好地被特定细胞类型吸收，但是一旦寡聚化合物被吸收，则期望将缀合物部分切割以释放未缀合的或亲本寡核苷酸。因此，某些缀合物接头可以包括一个或多个可切割部分。在某些实施例中，可切割部分是可切割键。在某些实施例中，可切割部分是包括至少一个可切割键的原子的基团。在某些实施例中，可切割部分包括具有一个、两个、三个、四个或超过四个可切割键的原子的基团。在某些实施例中，可切割部分在细胞或亚细胞隔室，如溶酶体内部被选择性地切割。在某些实施例中，可切割部分被内源性酶，如核酸酶选择性地切割。
在某些实施例中，可切割键选自以下之中：酰胺、酯、醚、磷酸二酯、磷酸酯、氨基甲酸酯中的一种或两种酯或二硫化物。在某些实施例中，可切割键是磷酸二酯中的一种或两种酯。在某些实施例中，可切割部分包括磷酸酯或磷酸二酯。在某些实施例中，可切割部分是寡核苷酸与缀合物部分之间的磷酸二酯键。
在某些实施例中，可切割部分包括一个或多个接头的核苷或由一个或多个接头的核苷组成。在某些此类实施例中，一个或多个接头的核苷彼此连接和/或通过可切割键与寡聚化合物的其余部分连接。在某些实施例中，此类可切割键是未经修饰的磷酸二酯键。在某些实施例中，可切割部分是2'-脱氧核苷，其通过磷酸酯核苷间键附接到寡核苷酸的3'或5'末端核苷，并且通过磷酸酯键或硫代磷酸酯键共价附接到缀合物接头或缀合物部分的其余部分。在某些此类实施例中，可切割部分是2'-脱氧腺苷。
在某些实施例中，本文中公开的寡聚化合物包括通过缀合物接头与缀合物部分连接的寡核苷酸，其中所述寡聚化合物是使用本领域已知的点击化学制备的。已经使用点击化学制备了化合物，其中附接到固体载体上的寡聚化合物上的膦酸炔基酯核苷间键被转化为1,2,3-三唑基膦酸酯核苷间键，并且然后从固体载体中切割(Krishna等人,《美国化学会志》2012,134(28),11618-11631)，所述文献通过引用以其整体并入本文。适用于若干个实施例的额外缀合物接头可以通过以下所述的点击化学制备：“生物技术与材料科学的点击化学(Click Chemistry for Biotechnology and Materials Science)”编辑：乔治兰姆威利出版社(Joerg Laham,Wiley),2009，所述文献通过引用以其整体并入本文。
在某些实施例中，点击反应可以用于通过与以下发生反应来将缀合物部分与寡核苷酸连接：
具有末端胺的寡核苷酸，包含但不限于以下化合物：
其中Y为寡核苷酸的其余部分，以得到：
所述化合物可以与具有叠氮化物的缀合物部分发生反应以得到：
其中N-N＝N是由缀合物部分的叠氮基形成的，并且其中X表示缀合物部分的其余部分。在某些实施例中，缀合物部分包括双环配体。在某些实施例中，缀合物部分包括多肽。在某些实施例中，叠氮基附接到多肽的氨基酸侧链。在某些实施例中，叠氮基附接到多肽的N末端。在某些实施例中，叠氮基代替多肽的赖氨酸的氨基。
在某些实施例中，寡聚化合物包括通过缀合物接头与缀合物部分连接的寡核苷酸，其中所述缀合物接头是由以下化合物制备的：
在某些实施例中，寡聚化合物包括通过缀合物接头与缀合物部分连接的寡核苷酸，其中所述缀合物接头包括：
在某些实施例中，寡聚化合物包括通过缀合物接头与缀合物部分连接的寡核苷酸，其中所述缀合物接头包括：
在某些实施例中，寡聚化合物包括通过缀合物接头与缀合物部分连接的寡核苷酸，其中所述化合物包括：
其中N-N＝N是由缀合物部分的叠氮基形成的；X表示缀合物部分的其余部分；并且Y表示寡聚化合物的包括寡核苷酸的部分。在某些实施例中，缀合物部分包括双环配体。在某些实施例中，缀合物部分包括多肽。在某些实施例中，叠氮基附接到多肽的氨基酸侧链。在某些实施例中，叠氮基附接到多肽的N末端。在某些实施例中，叠氮基代替多肽的赖氨酸的氨基。
在某些实施例中，寡聚化合物包括通过缀合物接头与缀合物部分连接的寡核苷酸，其中所述寡聚化合物包括：
其中N-N＝N是由缀合物部分的叠氮基形成的；X表示缀合物部分的其余部分；并且Y表示寡核苷酸的其余部分。在某些实施例中，缀合物部分包括双环配体。在某些实施例中，缀合物部分包括多肽。在某些实施例中，叠氮基附接到多肽的氨基酸侧链。在某些实施例中，叠氮基附接到多肽的N末端。在某些实施例中，叠氮基代替多肽的赖氨酸的氨基。
在某些实施例中，寡聚化合物包括通过缀合物接头与缀合物部分连接的寡核苷酸，其中所述寡聚化合物包括：
其中N-N＝N是由缀合物部分的叠氮基形成的；X表示缀合物部分的其余部分；并且Y表示寡核苷酸的其余部分。在某些实施例中，缀合物部分包括双环配体。在某些实施例中，缀合物部分包括多肽。在某些实施例中，叠氮基附接到多肽的氨基酸侧链。在某些实施例中，叠氮基附接到多肽的N末端。在某些实施例中，叠氮基代替多肽的赖氨酸的氨基。
在某些实施例中，可以使用点击反应以通过使以下发生反应来将缀合物部分与寡核苷酸连接：
含的溶液与具有末端胺的寡核苷酸，包含但不限于以下化合物：
其中Y为寡核苷酸的其余部分，以得到：
所述化合物可以与具有叠氮化物的缀合物部分发生反应以得到：
其中N-N＝N是由缀合物部分的叠氮基形成的，并且其中X表示缀合物部分的其余部分。在某些实施例中，缀合物部分包括双环配体。在某些实施例中，缀合物部分包括多肽。在某些实施例中，叠氮基附接到多肽的氨基酸侧链。在某些实施例中，叠氮基附接到多肽的N末端。在某些实施例中，叠氮基代替多肽的赖氨酸的氨基。
在某些实施例中，寡聚化合物包括通过缀合物接头与缀合物部分连接的寡核苷酸，其中所述缀合物接头是由以下化合物制备的：
在某些实施例中，寡聚化合物包括通过缀合物接头与缀合物部分连接的寡核苷酸，其中所述缀合物接头包括：
在某些实施例中，寡聚化合物包括通过缀合物接头与缀合物部分连接的寡核苷酸，其中所述缀合物接头包括：
在某些实施例中，寡聚化合物包括通过缀合物接头与缀合物部分连接的寡核苷酸，其中所述化合物包括：
其中N-N＝N是由缀合物部分的叠氮基形成的；X表示缀合物部分的其余部分；并且Y表示寡聚化合物的包括寡核苷酸的部分。在某些实施例中，缀合物部分包括双环配体。在某些实施例中，缀合物部分包括多肽。在某些实施例中，叠氮基附接到多肽的氨基酸侧链。在某些实施例中，叠氮基附接到多肽的N末端。在某些实施例中，叠氮基代替多肽的赖氨酸的氨基。
在某些实施例中，寡聚化合物包括通过缀合物接头与缀合物部分连接的寡核苷酸，其中所述寡聚化合物包括：
其中N-N＝N是由缀合物部分的叠氮基形成的；X表示缀合物部分的其余部分；并且Y表示寡核苷酸的其余部分。在某些实施例中，缀合物部分包括双环配体。在某些实施例中，缀合物部分包括多肽。在某些实施例中，叠氮基附接到多肽的氨基酸侧链。在某些实施例中，叠氮基附接到多肽的N末端。在某些实施例中，叠氮基代替多肽的赖氨酸的氨基。
在某些实施例中，寡聚化合物包括通过缀合物接头与缀合物部分连接的寡核苷酸，其中所述寡聚化合物包括：
其中N-N＝N是由缀合物部分的叠氮基形成的；X表示缀合物部分的其余部分；并且Y表示寡核苷酸的其余部分。在某些实施例中，缀合物部分包括双环配体。在某些实施例中，缀合物部分包括多肽。在某些实施例中，叠氮基附接到多肽的氨基酸侧链。在某些实施例中，叠氮基附接到多肽的N末端。在某些实施例中，叠氮基代替多肽的赖氨酸的氨基。
在某些实施例中，寡聚化合物包括通过缀合物接头与缀合物部分连接的寡核苷酸，其中所述寡聚化合物包括：
其中X包括缀合物部分，并且Y包括寡核苷酸。
在某些实施例中，寡聚化合物包括通过缀合物接头与缀合物部分连接的寡核苷酸，其中所述寡聚化合物包括：
其中X包括寡核苷酸，并且Y包括缀合物部分。
在某些实施例中，寡聚化合物包括通过缀合物接头与缀合物部分连接的寡核苷酸，其中所述缀合物接头包括：
在某些实施例中，寡聚化合物包括通过缀合物接头与缀合物部分连接的寡核苷酸，其中所述缀合物接头包括：
在某些实施例中，寡聚化合物包括通过缀合物接头与缀合物部分连接的寡核苷酸，其中所述缀合物接头包括：
在某些实施例中，寡聚化合物包括通过缀合物接头与缀合物部分连接的寡核苷酸，其中所述缀合物接头包括：
在某些实施例中，寡聚化合物包括通过缀合物接头与缀合物部分连接的寡核苷酸，其中所述缀合物接头包括：
描述以上起始材料和中间体的制备的合成方法可以在以下中的一项或多项中找到：Agard等人,“用于在活体系中对生物分子进行共价修饰的应变促进的[3+2]叠氮-炔烃环加成(A Strain-Promoted[3+2]Azide-Alkyne Cycloaddition for CovalentModification of Biomolecules in Living Systems.”《美国化学会志》2004,126:15046–15047；Lang等人,“用于标记蛋白质的双正交反应”,《美国化学会志》,2014,9(1):16-20；Nair等人,“硫醇-迈克尔加成点击反应：材料化学中的强有力且广泛使用的工具”,《化学材料》201326(1):724-744；WO2011/136645；和Kool,“生物缀合中的肟和腙：机制和催化(Oximes and Hydrazones in Bioconjugation:Mechanism and Catalysis)”,《化学评论(Chem.Rev.)》,2017,117:10358-10376；Wang等人,“用于蛋白质缀合的多氟苯基酯末端的同双官能交联剂(Polyfluorophenyl Ester-Terminated HomobifunctionalCrossLinkers for Protein Conjugation)”,《合成有机化学快报(Synlett)》,2017,28:1934-1938；Kishimoto等人,“通过使用亲和肽进行抗体的位点特异性化学缀合以开发治疗性抗体格式(Site-Specific Chemical Conjugation of Antibodies by Using AffinityPeptide for the Development of Therapeutic Antibody Format)”,《生物缀合化学(Bioconj.Chem.)》,2019,30:698-702。
某些寡核苷酸
在某些实施例中，本文中提供了包括寡核苷酸的寡聚化合物，所述寡核苷酸由连接的核苷组成。寡核苷酸可以是未经修饰的寡核苷酸(RNA或DNA)，或者可以是经修饰的寡核苷酸。经修饰的寡核苷酸包括相对于未经修饰的RNA或DNA的至少一种修饰。也就是说，经修饰的寡核苷酸包括至少一个经修饰的核苷(包括经修饰的糖部分和/或经修饰的核碱基)和/或至少一个经修饰的核苷间键。
某些经修饰的核苷
经修饰的核苷包括经修饰的糖部分或经修饰的核碱基或经修饰的糖部分和经修饰的核碱基两者。
某些糖部分
在某些实施例中，经修饰的糖部分是非双环状经修饰的糖部分。在某些实施例中，经修饰的糖部分是双环状或三环状糖部分。在某些实施例中，经修饰的糖部分是糖替代物。此类糖替代物可以包括一个或多个与其它类型的经修饰的糖部分相对应的取代。
在某些实施例中，经修饰的糖部分是非双环状经修饰的糖部分，所述非双环状经修饰的糖部分包括具有一个或多个取代基的呋喃糖基环，所述一个或多个取代基中没有一个桥接呋喃糖基环的两个原子以形成双环状结构。此类非桥接取代基可以位于呋喃糖基的任何位置处，包含但不限于取代基位于2'、4'和/或5'位置处。在某些实施例中，非双环状经修饰的糖部分的一个或多个非桥接取代基是支化的。适用于非双环状经修饰的糖部分的2'取代基的实例包含但不限于：2'-F、2'-OCH3(“OMe”或“O-甲基”)和2'-O(CH2)2OCH3(“MOE”)。在某些实施例中，2'取代基选自以下之中：卤代、烯丙基、氨基、叠氮基、SH、CN、OCN、CF3、OCF3、O-C1-C10烷氧基、O-C1-C10取代的烷氧基、O-C1-C10烷基、O-C1-C10取代的烷基、S-烷基、N(Rm)-烷基、O-烯基、S-烯基、N(Rm)-烯基、O-炔基、S-炔基、N(Rm)-炔基、O-亚烷基-O-烷基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2ON(Rm)(Rn)或OCH2C(＝O)-N(Rm)(Rn)，其中每个Rm和Rn独立地为H、氨基保护基团或经取代的或未经取代的C1-C10烷基以及以下中描述的2'取代基：Cook等人,U.S.6,531,584；Cook等人,U.S.5,859,221；以及Cook等人,U.S.6,005,087。这些2'取代基的某些实施例可以进一步被一个或多个独立地选自以下之中的取代基取代：羟基、氨基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基(NO2)、硫醇、硫代烷氧基、硫代烷基、卤素、烷基、芳基、烯基和炔基。适于非双环状经修饰的糖部分的4'取代基的实例包含但不限于烷氧基(例如，甲氧基)、烷基和Manoharan等人,WO 2015/106128描述的取代基。适于非双环状经修饰的糖部分的5'取代基的实例包含但不限于：5'-甲基(R或S)、5'-乙烯基和5'-甲氧基。在某些实施例中，非双环状经修饰的糖部分包括一个以上非桥接糖取代基，例如，Migawa等人,WO 2008/101157和Rajeev等人,US2013/0203836中描述的2'-F-5'-甲基糖部分和经修饰的糖部分以及经修饰的核苷。
在某些实施例中，2'取代的非双环状经修饰的核苷包括糖部分，所述糖部分包括选自以下的非桥接2'取代基：F、NH2、N3、OCF3、OCH3、O(CH2)3NH2、CH2CH＝CH2、OCH2CH＝CH2、OCH2CH2OCH3、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2ON(Rm)(Rn)、O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2和N取代的乙酰胺(OCH2C(＝O)-N(Rm)(Rn))，其中每个Rm和Rn独立地为H、氨基保护基团或经取代的或未经取代的C1-C10烷基。
在某些实施例中，2'取代的非双环状核苷修饰的核苷包括糖部分，所述糖部分包括选自以下的非桥接2'取代基：F、OCF3、OCH3、OCH2CH2OCH3、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2ON(CH3)2、O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2和OCH2C(＝O)-N(H)CH3(“NMA”)。
在某些实施例中，2'取代的非双环状经修饰的核苷包括糖部分，所述糖部分包括选自以下的非桥接2'取代基：F、OCH3和OCH2CH2OCH3。
某些经修饰的糖部分包括桥接呋喃糖基环的两个原子以形成第二环，从而产生双环状糖部分的取代基。在某些此类实施例中，双环状糖部分包括位于4'呋喃糖环原子与2'呋喃糖环原子之间的桥。此类4'至2'桥接糖取代基的实例包含但不限于：4'-CH2-2'、4'-(CH2)2-2'、4'-(CH2)3-2'、4'-CH2-O-2'(“LNA”)、4'-CH2-S-2'、4'-(CH2)2-O-2'(“ENA”)、4'-CH(CH3)-O-2'(被称为“受约束的乙基”或“cEt”)、4'-CH2-O-CH2-2'、4'-CH2-N(R)-2'、4'-CH(CH2OCH3)-O-2'(“受约束的MOE”或“cMOE”)和其类似物(参见，例如，Seth等人,U.S.7,399,845、Bhat等人,U.S.7,569,686、Swayze等人,U.S.7,741,457和Swayze等人,U.S.8,022,193)、4'-C(CH3)(CH3)-O-2'和其类似物(参见，例如，Seth等人,U.S.8,278,283)、4'-CH2-N(OCH3)-2'和其类似物(参见，例如，Prakash等人,U.S.8,278,425)、4'-CH2-O-N(CH3)-2'(参见，例如，Allerson等人,U.S.7,696,345和Allerson等人,U.S.8,124,745)、4'-CH2-C(H)(CH3)-2'(参见，例如，Zhou等人,《有机化学杂志》,2009,74,118-134)、4'-CH2-C(＝CH2)-2'和其类似物(参见，例如，Seth等人,U.S.8,278,426)、4'C(-RaRb)-N(R)-O-2'、4'-C(RaRb)-O-N(R)-2'、4'-CH2-O-N(R)-2'和4'-CH2-N(R)-O-2'，其中每个R、Ra和Rb独立地为H、保护基团或C1-C12烷基(参见，例如，Imanishi等人,U.S.7,427,672)。
在某些实施例中，此类4'至2'桥独立地包括1个至4个独立地选自以下的连接的基团：-[C(Ra)(Rb)]n-、-[C(Ra)(Rb)]n-O-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、C(＝NRa)-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-O-、-Si(Ra)2-、-S(＝O)x-和-N(Ra)-；
其中：x为0、1或2；n为1、2、3或4；每个Ra和Rb独立地为H、保护基团、羟基、C1-C12烷基、经取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、经取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、经取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、经取代的C5-C20芳基、杂环基、经取代的杂环基、杂芳基、经取代的杂芳基、C5-C7脂环基、经取代的C5-C7脂环基、卤素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、酰基(C(＝O)-H)、经取代的酰基、CN、磺酰基(S(＝O)2-J1)或增效砜(S(＝O)-J1)；并且
每个J1和J2独立地为H、C1-C12烷基、经取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、经取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、经取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、经取代的C5-C20芳基、酰基(C(＝O)-H)、经取代的酰基、杂环基、经取代的杂环基、C1-C12氨基烷基、经取代的C1-C12氨基烷基或保护基团。
额外双环状糖部分在本领域中是已知的，参见例如：Freier等人,《核酸研究(Nucleic Acids Research)》,1997,25(22),4429-4443；Albaek等人,《有机化学杂志》2006,71,7731-7740；Singh等人,《化学通讯(Chem.Commun.)》,1998,4,455-456；Koshkin等人,《四面体快报(Tetrahedron)》,1998,54,3607-3630；Kumar等人,《生物有机与药物化学快报(Bioorg.Med.Chem.Lett.)》,1998,8,2219-2222；Singh等人,《有机化学杂志》,1998,63,10035-10039；Srivastava等人,《美国化学会志》20017,129,8362-8379；Wengel等人,U.S.7,053,207；Imanishi等人,U.S.6,268,490；Imanishi等人U.S.6,770,748；Imanishi等人,U.S.RE44,779；Wengel等人,U.S.6,794,499；Wengel等人,U.S.6,670,461；Wengel等人,U.S.7,034,133；Wengel等人,U.S.8,080,644；Wengel等人,U.S.8,034,909；Wengel等人,U.S.8,153,365；Wengel等人,U.S.7,572,582；以及Ramasamy等人,U.S.6,525,191；Torsten等人,WO 2004/106356；Wengel等人,WO 1999/014226；Seth等人,WO 2007/134181；Seth等人,U.S.7,547,684；Seth等人,U.S.7,666,854；Seth等人,U.S.8,088,746；Seth等人,U.S.7,750,131；Seth等人,U.S.8,030,467；Seth等人,U.S.8,268,980；Seth等人,U.S.8,546,556；Seth等人,U.S.8,530,640；Migawa等人,U.S.9,012,421；Seth等人,U.S.8,501,805；和美国专利公开号Allerson等人,US2008/0039618和Migawa等人,US2015/0191727。
在某些实施例中，双环状糖部分和并入此类双环状糖部分的核苷进一步通过异构体构型定义。例如，LNA核苷(本文中所述)可以呈α-L构型或β-D构型。
α-L-亚甲基氧基(4'-CH2-O-2')或α-L-LNA双环状核苷已并入到显示出反义活性的寡核苷酸中(Frieden等人,《核酸研究》,2003,21,6365-6372)。在本文中，双环状核苷的一般描述包含两种异构体构型。当在本文中的示例性实施例中鉴定特定双环状核苷(例如，LNA或cEt)的位置时，所述双环核苷呈β-D构型中，除非另有说明。
在某些实施例中，经修饰的糖部分包括一个或多个非桥接糖取代基和一个或多个桥接糖取代基(例如，5'取代的和4'-2'桥接的糖)。
在某些实施例中，经修饰的糖部分是糖替代物。在某些此类实施例中，糖部分的氧原子被例如硫、碳或氮原子替代。在某些此类实施例中，此类经修饰的糖部分还包括本文中描述的桥接和/或非桥接取代基。例如，某些糖替代物包括4'-硫原子和2'位置处的取代(参见，例如，Bhat等人,U.S.7,875,733和Bhat等人,U.S.7,939,677)和/或5'位置处的取代。
在某些实施例中，糖替代物包括具有除5个原子以外的环。例如，在某些实施例中，糖替代物包括六元四氢吡喃(“THP”)。此类四氢吡喃可以进一步修饰或取代。包括此类经修饰的四氢吡喃的核苷包含但不限于己糖醇核酸(“HNA”)、阿卓糖醇核酸(“ANA”)、甘露糖醇核酸(“MNA”)(参见，例如，Leumann,CJ.《生物有机与药物化学快报》2002,10,841-854)、氟代HNA：
(“F-HNA”，参见例如，Swayze等人,U.S.8,088,904；Swayze等人,U.S.8,440,803；Swayze等人,U.S.8,796,437；以及Swayze等人,U.S.9,005,906；F-HNA还可以被称为F-THP或3'-氟四氢吡喃)，以及包括具有下式的额外经修饰的THP化合物的核苷：
其中独立地，对于所述经修饰的THP核苷中的每一种：
Bx为核碱基部分；
T3和T4各自独立地是将经修饰的THP核苷与寡核苷酸的其余部分连接的核苷间连接基团，或者T3和T4中的一者为将经修饰的THP核苷与寡核苷酸的其余部分连接的核苷间连接基团，并且T3和T4中的另一者为H、羟基保护基团、连接的缀合物部分或5'或3'末端基团；
q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自独立地为H、C1-C6烷基、经取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、经取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或经取代的C2-C6炔基；并且
R1和R2中的每一者独立地选自以下之中：氢、卤素、经取代的或未经取代的烷氧基、NJ1J2、SJ1、N3、OC(＝X)J1、OC(＝X)NJ1J2、NJ3C(＝X)NJ1J2和CN，其中X为O、S或NJ1，并且每一个J1、J2和J3独立地为H或C1-C6烷基。
在某些实施例中，提供了经修饰的THP核苷，其中q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自为H。在某些实施例中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7中的至少一者不同于H。在某些实施例中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7中的至少一者为甲基。在某些实施例中，提供了经修饰的THP核苷，其中R1和R2中的一者为F。在某些实施例中，R1为F，并且R2为H，在某些实施例中，R1为甲氧基，并且R2为H，并且在某些实施例中，R1为甲氧基乙氧基，并且R2为H。
在某些实施例，糖替代物包括具有5个以上原子和一个以上杂原子的环。例如，已报告了包括吗啉代糖部分的核苷以及其在寡核苷酸中的用途(参见例如，Braasch等人,《生物化学(Biochemistry)》,2002,41,4503-4510以及Summerton等人,U.S.5,698,685；Summerton等人,U.S.5,166,315；Summerton等人,U.S.5,185,444；以及Summerton等人,U.S.5,034,506)。如此处所用，术语“吗啉代”意指具有以下结构的糖替代物：
在某些实施例中，可以对吗啉代进行修饰，例如通过添加或改变来自以上吗啉代结构的各种取代基。这种糖替代物在本文中被称为“经修饰的吗啉代”。
在某些实施例中，糖替代物包括无环部分。包括此类无环糖替代物的核苷和寡核苷酸的实例包含但不限于：肽核酸(“PNA”)、无环丁基核酸(参见，例如，Kumar等人,《有机与生物分子化学(Org.Biomol.Chem.》,2013,11,5853-5865)以及Manoharan等人,WO2011/133876中描述的核苷和寡核苷酸。
许多其它双环状和三环状糖和糖替代物环体系在本领域已知可以用于经修饰的核苷(参见例如评论文章：Leumann,《生物有机与药物化学快报》,2002,10,841-854)。
某些经修饰的核碱基
在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸包括一个或多个包括未经修饰的核碱基的核苷。在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸包括一个或多个包括经修饰的核碱基的核苷。在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸包括一种或多种不包括被称为无碱性核苷的核碱基的核苷。
在某些实施例中，经修饰的核碱基选自：5取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶、烷基或炔基取代的嘧啶、烷基取代的嘌呤和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤。在某些实施例中，经修饰的核碱基选自：2-氨基丙基腺嘌呤、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-N-甲基鸟嘌呤、6-N-甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-丙炔基(-C≡C-CH3)尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、6-偶氮基尿嘧啶、6-偶氮基胞嘧啶、6-偶氮基胸腺嘧啶、5-核糖基尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羟基、8-氮杂和其它8取代的嘌呤、5-卤代，具体地5-溴、5-三氟甲基、5-卤代尿嘧啶和5-卤代胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤、3-脱氮腺嘌呤、6-N-苯甲酰基腺嘌呤、2-N-异丁酰基鸟嘌呤、4-N-苯甲酰基胞嘧啶、4-N-苯甲酰基尿嘧啶、5-甲基4-N-苯甲酰基胞嘧啶、5-甲基4-N-苯甲酰基尿嘧啶、通用碱基、疏水性碱基、混杂碱基、大小扩展的碱基和氟化碱基。另外的经修饰的核碱基包含三环状嘧啶，如1,3-二氮杂吩噁嗪-2-酮、1,3-二氮杂吩噻嗪-2-酮和9-(2-氨基乙氧基)-1,3-二氮杂吩噁嗪-2-酮(G-夹)。经修饰的核碱基还可以包含其中嘌呤或嘧啶碱基被其它杂环替代的经修饰的碱基，例如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。另外的核碱基包含Merigan等人,U.S.3,687,808中公开的核碱基；《聚合物科学与工程简明百科全书(The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering)》,Kroschwitz,J.I.编辑,约翰威立父子公司(John Wiley&Sons),1990,858-859；Englisch等人,《德国应用化学国际版》,1991,30,613；Sanghvi,Y.S.,第15章,《反义研究与应用(Antisense Research and Applications)》,Crooke,S.T.和Lebleu,B.编辑,CRC出版社(CRC Press),1993,273-288中公开的核碱基；以及第6章和第15章,《反义药物技术(Antisense Drug Technology)》,Crooke S.T.编辑,CRC出版社,2008,163-166和442-443中公开的核碱基。
教导以上提到的经修饰的核碱基中的某些经修饰的核碱基以及其它经修饰的核碱基的制备的出版物包含但不限于，Manoharan等人,US2003/0158403；Manoharan等人,US2003/0175906；Dinh等人,U.S.4,845,205；Spielvogel等人,U.S.5,130,302；Rogers等人,U.S.5,134,066；Bischofberger等人,U.S.5,175,273；Urdea等人,U.S.5,367,066；Benner等人,U.S.5,432,272；Matteucci等人,U.S.5,434,257；Gmeiner等人,U.S.5,457,187；Cook等人,U.S.5,459,255；Froehler等人,U.S.5,484,908；Matteucci等人,U.S.5,502,177；Hawkins等人,U.S.5,525,711；Haralambidis等人,U.S.5,552,540；Cook等人,U.S.5,587,469；Froehler等人,U.S.5,594,121；Switzer等人,U.S.5,596,091；Cook等人,U.S.5,614,617；Froehler等人,U.S.5,645,985；Cook等人,U.S.5,681,941；Cook等人,U.S.5,811,534；Cook等人,U.S.5,750,692；Cook等人,U.S.5,948,903；Cook等人,U.S.5,587,470；Cook等人,U.S.5,457,191；Matteucci等人,U.S.5,763,588；Froehler等人,U.S.5,830,653；Cook等人,U.S.5,808,027；Cook等人,6,166,199；以及Matteucci等人,U.S.6,005,096。
某些经修饰的核苷间键
在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸的核苷可以使用任何核苷间键连接在一起。核苷间连接基团的两种主要类别由磷原子的存在或不存在来定义。代表性含磷的核苷间键包含但不限于磷酸二酯(“P＝O”)(还被称为未经修饰的或天然存在的键或磷酸酯键)、磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯和硫代磷酸酯(“P＝S”)以及二硫代磷酸酯(“HS-P＝S”)。代表性非含磷的核苷间连接基团包含但不限于亚甲基甲基亚氨基(-CH2-N(CH3)-O-CH2-)、硫代二酯、硫代氨基甲酸酯(-O-C(＝O)(NH)-S-)；硅氧烷(-O-SiH2-O-)；以及N,N'-二甲基肼(-CH2-N(CH3)-N(CH3)-)。相较于天然存在的磷酸二酯键，经修饰的核苷间键可以用于改变，通常是增加寡核苷酸的核酸酶抗性。在某些实施例中，具有手性原子的核苷间键可以制备为外消旋混合物，或制备为单独的对映异构体。制备含磷的和非含磷的核苷间键的方法是本领域的技术人员众所周知的。
在某些实施例中，经修饰的核苷间键是通过引用并入本文的WO2021/030778中描述的任何经修饰的核苷间键。在某些实施例中，经修饰的核苷间键包括式：
其中独立地对于经修饰的寡核苷酸的每个核苷间连接基团：
X选自O或S；
R1选自H、C1-C6烷基和经取代的C1-C6烷基；并且
T选自SO2R2、C(＝O)R3和P(＝O)R4R5，其中：
R2选自芳基、经取代的芳基、杂环、经取代的杂环、芳香族杂环、经取代的芳香族杂环、二唑、经取代的二唑、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基、C1-C6烯基、C1-C6炔基、经取代的C1-C6烷基、经取代的C1-C6烯基、经取代的C1-C6炔基和缀合物基团；
R3选自芳基、经取代的芳基、CH3、N(CH3)2、OCH3和缀合物基团；
R4选自OCH3、OH、C1-C6烷基、经取代的C1-C6烷基和缀合物基团；并且
R5选自OCH3、OH、C1-C6烷基和经取代的C1-C6烷基。
在某些实施例中，经修饰的核苷间键包括具有下式的甲磺酰基氨基磷酸酯连接基团：
在某些实施例中，甲磺酰基氨基磷酸酯核苷间键可以包括手性中心。在某些实施例中，包括(Rp)和/或(Sp)甲磺酰基氨基磷酸酯的经修饰的寡核苷酸分别包括以下式中的一者或多者，其中“B”表示核碱基：
具有手性中心的代表性核苷间键包含但不限于烷基膦酸酯、甲磺酰基氨基磷酸酯和硫代磷酸酯。包括具有手性中心的核苷间键的经修饰的寡核苷酸可以制备为包括立体随机核苷间键的经修饰的寡核苷酸的群体，或制备为包括含有呈特定立体化学构型的手性中心的硫代磷酸酯键或其它键的经修饰的寡核苷酸的群体。在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸的群体包括硫代磷酸酯核苷间键，其中所有硫代磷酸酯核苷间键是立体随机的。在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸的群体包括甲磺酰基氨基磷酸酯核苷间键，其中所有甲磺酰基氨基磷酸酯核苷间键是立体随机的。此类经修饰的寡核苷酸可以使用实现对每个硫代磷酸酯或甲磺酰基氨基磷酸酯键的立体化学构型的随机选择的合成方法产生。尽管如此，每个单个寡核苷酸分子的每个单个硫代磷酸酯或甲磺酰基氨基磷酸酯具有所定义的立体构型。在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸的群体针对包括一个或多个呈特定独立选择的立体化学构型的特定硫代磷酸酯或甲磺酰基氨基磷酸酯核苷间键的经修饰的寡核苷酸富集。在某些实施例中，特定硫代磷酸酯或甲磺酰基氨基磷酸酯键的特定构型以相对于群体中的分子的至少65％存在。在某些实施例中，特定硫代磷酸酯或甲磺酰基氨基磷酸酯键的特定构型以相对于群体中的分子的至少70％存在。在某些实施例中，特定硫代磷酸酯或甲磺酰基氨基磷酸酯键的特定构型以相对于群体中的分子的至少80％存在。在某些实施例中，特定硫代磷酸酯或甲磺酰基氨基磷酸酯键的特定构型以相对于群体中的分子的至少90％存在。在某些实施例中，特定硫代磷酸酯或甲磺酰基氨基磷酸酯键的特定构型以相对于群体中的分子的至少99％存在。此类此类手性富集的经修饰的寡核苷酸的群体可以使用本领域已知的合成方法，例如以下中描述的方法产生：Oka等人,《美国化学学会杂志(JACS)》125,8307(2003),Wan等人《核酸研究》42,13456(2014)以及WO 2017/015555。在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸的群体针对具有至少一个所指出的呈(Sp)构型的硫代磷酸酯或甲磺酰基氨基磷酸酯的经修饰的寡核苷酸富集。在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸的群体针对具有至少一个呈(Rp)构型的硫代磷酸酯或甲磺酰基氨基磷酸酯的经修饰的寡核苷酸富集。在某些实施例中，包括(Rp)和/或(Sp)硫代磷酸酯的经修饰的寡核苷酸分别包括以下式中的一者或多者，其中“B”表示核碱基：
除非另有说明，否则本文中描述的经修饰的寡核苷酸的手性核苷间键可以是立体随机的或可以呈特定立体化学构型。
中性核苷间键包含但不限于磷酸三酯、甲基膦酸酯、MMI(3'-CH2-N(CH3)-O-5')、酰胺-3(3'-CH2-C(＝O)-N(H)-5')、酰胺-4(3'-CH2-N(H)-C(＝O)-5')、甲缩醛(3'-O-CH2-O-5')、甲氧基丙基(MOP)和硫代甲缩醛(3'-S-CH2-O-5')。另外的中性核苷间键包含包括硅氧烷(二烷基硅氧烷)、羧酸酯、甲酰胺、硫化物、磺酸酯和酰胺的非离子键(参见例如：反义研究中的碳水化合物修饰(Carbohydrate Modifications in Antisense Research)；Y.S.Sanghvi和P.D.Cook编辑,ACS研讨会系列580(ACS Symposium Series 580)；第3章和第4章,40-65)。另外的中性核苷间键包含包括经混合的N、O、S和CH2组分部分的非离子键。
在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸包括一种或多种倒置核苷，如下所示：
其中每个Bx独立地表示任何核碱基。
在某些实施例中，倒置核苷是末端的(即，位于寡核苷酸的一个端部上的最后一个核苷)，并且因此将存在上面描绘的仅一个核苷间键。在某些此类实施例中，额外特征(如缀合物基团)可以附接到倒置核苷。这种末端倒置核苷可以附接到寡核苷酸的任一个或两个端部。
在某些实施例中，此类基团缺乏核碱基，并且在本文中被称为倒置糖部分。在某些实施例中，倒置糖部分是末端的(即，附接到寡核苷酸的一个端部上的最后一个核苷)，并且因此将存在上面的仅一个核苷间键。在某些此类实施例中，额外特征(如缀合物基团)可以附接到倒置糖部分。这种末端倒置糖部分可以附接到寡核苷酸的任一个或两个端部。
在某些实施例中，核酸可以将2'与5'连接，而非标准的3'到5'键。此类键在下面示出。
其中每个Bx表示任何核碱基。
某些基序
在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸包括一个或多个包括经修饰的糖部分的经修饰的核苷。在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸包括一个或多个包括经修饰的核碱基的经修饰的核苷。在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸包括一个或多个经修饰的核苷间键。在此类实施例中，经修饰的寡核苷酸的经修饰的、未经修饰的和经不同修饰的糖部分、核碱基和/或核苷间键限定图案或基序。在某些实施例中，糖部分、核碱基和核苷间键的图案彼此独立。因此，经修饰的寡核苷酸可以通过其糖基序、核碱基基序和/或核苷间键基序来描述(如本文所使用的，核碱基基序描述独立于核碱基的序列的对核碱基的修饰)。
某些糖基序
在某些实施例中，寡核苷酸包括一种或多种类型的沿寡核苷酸或其区以限定图案或糖基序布置的经修饰的糖和/或未经修饰的糖部分。在某些情况下，此类糖基序包含但不限于本文中讨论的任何糖修饰。
间隔体
在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸包括具有间隔体基序的区或由所述具有间隔体基序的区组成，所述间隔体基序由两个外部区或“翼”和一个中心或内部区或“间隙”定义。间隔体基序的三个区(5'翼、间隙和3'翼)形成连续核苷序列，其中每个翼的核苷的糖部分中的至少一些糖部分与间隙的核苷的糖部分中的至少一些糖部分不同。具体地，至少每个翼的最靠近间隙的核苷(5'翼的最靠近3'的核苷和3'翼的最靠近5'的核苷)的糖部分与相邻的间隙核苷的糖部分不同，由此限定翼与间隙之间的边界(即，翼/间隙连接部)。在某些实施例中，间隙内的糖部分彼此相同。在某些实施例中，间隙包含一个或多个具有的糖部分与间隙的一个或多个其它核苷的糖部分不同的核苷。在某些实施例中，两个翼的糖基序彼此相同(对称间隔体)。在某些实施例中，5'翼的糖基序与3'翼的糖基序不同(不对称间隔体)。
在某些实施例中，间隔体的翼包括1-5个核苷。在某些实施例中，间隔体的每个翼的每个核苷是经修饰的核苷。在某些实施例中，间隔体的每个翼的至少一个核苷是经修饰的核苷。在某些实施例中，间隔体的每个翼的至少两个核苷是经修饰的核苷。在某些实施例中，间隔体的每个翼的至少三个核苷是经修饰的核苷。在某些实施例中，间隔体的每个翼的至少四个核苷是经修饰的核苷。
在某些实施例中，间隔体的间隙包括7-12个核苷。在某些实施例中，间隔体的间隙的每个核苷是未经修饰的2'-脱氧核苷。
在某些实施例中，间隔体是脱氧间隔体。在实施例中，每个翼/间隙连接部的间隙侧上的核苷是未经修饰的2'-脱氧核苷，并且每个翼/间隙连接部的翼侧上的核苷是经修饰的核苷。在某些实施例中，间隙的每个核苷是未经修饰的2'-脱氧核苷。在某些实施例中，间隔体的每个翼的每个核苷是经修饰的核苷。
在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸包括具有经完全修饰的糖基序的区或由所述具有经完全修饰的糖基序的区组成。在此类实施例中，经修饰的寡核苷酸的经完全修饰的区的每个核苷包括经修饰的糖部分。在某些实施例中，整个经修饰的寡核苷酸的每个核苷包括经修饰的糖部分。在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸包括具有经完全修饰的糖基序的区或由所述具有经完全修饰的糖基序的区组成，其中经完全修饰的区内的每个核苷包括相同的经修饰的糖部分，本文中被称为经均匀修饰的糖基序。在某些实施例中，经完全修饰的寡核苷酸是经均匀修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，经均匀修饰的每个核苷包括相同的2'修饰。
在此，间隔体的三个区的长度(核苷的数量)可以使用符号[5'翼中的核苷的数量]-[间隙中的核苷的数量]-[3'翼中的核苷的数量]来提供。因此，5-10-5间隔体由每个翼中的5个连接的核苷和间隙中的10个连接的核苷组成。在此类命名遵循特定修饰的情况下，所述修饰是在每个翼的每个糖部分中的修饰，并且间隙核苷包括未经修饰的脱氧核苷糖。因此，5-10-5MOE间隔体由5'翼中的5个连接的MOE修饰的核苷、间隙中的10个连接的脱氧核苷和3'翼中的5个连接的MOE核苷组成。
在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸是5-10-5MOE间隔体。在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸是3-10-3BNA间隔体。在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸是3-10-3cEt间隔体。在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸是3-10-3LNA间隔体。
某些核碱基基序
在某些实施例中，寡核苷酸包括沿寡核苷酸或其区以限定图案或基序布置的经修饰的和/或未经修饰的核碱基。在某些实施例中，每个核碱基是经修饰的。在某些实施例中，核碱基都不是经修饰的。在某些实施例中，每个嘌呤或每个嘧啶是经修饰的。在某些实施例中，每个腺嘌呤是经修饰的。在某些实施例中，每个鸟嘌呤是经修饰的。在某些实施例中，每个胸腺嘧啶是经修饰的。在某些实施例中，每个尿嘧啶是经修饰的。在某些实施例中，每个胞嘧啶是经修饰的。在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸中的一些或全部胞嘧啶核碱基是5-甲基胞嘧啶。在某些实施例中，所有胞嘧啶核碱基都是5-甲基胞嘧啶，并且经修饰的寡核苷酸的所有其它核碱基都是未经修饰的核碱基。
在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸包括经修饰的核碱基的嵌段。在某些此类实施例中，嵌段位于寡核苷酸的3'端处。在某些实施例中，嵌段位于寡核苷酸的3'端的3个核苷内。在某些实施例中，嵌段位于寡核苷酸的5'端处。在某些实施例中，嵌段位于寡核苷酸的5'端的3个核苷内。
在某些实施例中，具有间隔体基序的寡核苷酸包括包含经修饰的核碱基的核苷。在某些此类实施例中，包括经修饰的核碱基的一个核苷位于具有间隔体基序的寡核苷酸的中心间隙中。在某些此类实施例中，所述核苷的糖部分是2'-脱氧核糖基部分。在某些实施例中，经修饰的核碱基选自：2-硫代嘧啶和5-丙炔嘧啶。
某些核苷间键基序
在某些实施例中，寡核苷酸包括沿寡核苷酸或其区以限定图案或基序布置的经修饰的和/或未经修饰的核苷间键。在某些实施例中，每个核苷间连接基团是磷酸二酯核苷间键(P＝O)。在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸的每个核苷间连接基团是硫代磷酸酯核苷间键(P＝S)。在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸的每个核苷间键独立地选自硫代磷酸酯核苷间键和磷酸二酯核苷间键。在某些实施例中，每个硫代磷酸酯核苷间键都独立地选自立体随机硫代磷酸酯、(Sp)硫代磷酸酯和(Rp)硫代磷酸酯。在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸的糖基序是间隔体，并且间隙内的核苷间键都是经修饰的。在某些此类实施例中，翼中的一些或全部核苷间键是未经修饰的磷酸二酯核苷间键。在某些实施例中，末端核苷间键是经修饰的。在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸的糖基序是间隔体，并且核苷间键基序在至少一个翼中包括至少一个磷酸二酯核苷间键，其中至少一个磷酸二酯键不是末端核苷间键，并且其余核苷间键为硫代磷酸酯核苷间键。在某些此类实施例中，所有硫代磷酸酯键是立体随机的。在某些实施例中，翼中的所有硫代磷酸酯键都是(Sp)硫代磷酸酯，并且间隙包括至少一个Sp、Sp、Rp基序。在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸的群体针对包括此类核苷间键基序的经修饰的寡核苷酸富集。
某些长度
可能的是在不消除活性的情况下增加或减小寡核苷酸的长度。例如，在Woolf等人(《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)》USA 89:7305-7309,1992)中，测试了一系列长度为13-25个核碱基的寡核苷酸诱导靶RNA在卵母细胞注射模型中的切割的能力。长度为25个核碱基的在寡核苷酸的端部附近具有8个或11个错配碱基的寡核苷酸能够指导靶RNA的特异性切割，尽管其程度低于不含有错配的寡核苷酸指导特异性切割的程度。类似地，使用13个核碱基寡核苷酸，包含具有1个或3个错配的核苷酸实现了靶特异性切割。
在某些实施例中，寡核苷酸(包含经修饰的寡核苷酸)可以具有多种长度范围中的任何长度范围。在某些实施例中，寡核苷酸由X个至Y个连接的核苷组成，其中X表示范围内的核苷的最少数量，并且Y表示范围内的核苷的最大数量。在某些此类实施例中，X和Y各自独立地选自8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50；条件是X≤Y。例如，在某些实施例中，寡核苷酸由以下组成：12个至13个、12个至14个、12个至15个、12个至16个、12个至17个、12个至18个、12个至19个、12个至20个、12个至21个、12个至22个、12个至23个、12个至24个、12个至25个、12个至26个、12个至27个、12个至28个、12个至29个、12个至30个、13个至14个、13个至15个、13个至16个、13个至17个、13个至18个、13个至19个、13个至20个、13个至21个、13个至22个、13个至23个、13个至24个、13个至25个、13个至26个、13个至27个、13个至28个、13个至29个、13个至30个、14个至15个、14个至16个、14个至17个、14个至18个、14个至19个、14个至20个、14个至21个、14个至22个、14个至23个、14个至24个、14个至25个、14个至26个、14个至27个、14个至28个、14个至29个、14个至30个、15个至16个、15个至17个、15个至18个、15个至19个、15个至20个、15个至21个、15个至22个、15个至23个、15个至24个、15个至25个、15个至26个、15个至27个、15个至28个、15个至29个、15个至30个、16个至17个、16个至18个、16个至19个、16个至20个、16个至21个、16个至22个、16个至23个、16个至24个、16个至25个、16个至26个、16个至27个、16个至28个、16个至29个、16个至30个、17个至18个、17个至19个、17个至20个、17个至21个、17个至22个、17个至23个、17个至24个、17个至25个、17个至26个、17个至27个、17个至28个、17个至29个、17个至30个、18个至19个、18个至20个、18个至21个、18个至22个、18个至23个、18个至24个、18个至25个、18个至26个、18个至27个、18个至28个、18个至29个、18个至30个、19个至20个、19个至21个、19个至22个、19个至23个、19个至24个、19个至25个、19个至26个、19个至27个、19个至28个、19个至29个、19个至30个、20个至21个、20个至22个、20个至23个、20个至24个、20个至25个、20个至26个、20个至27个、20个至28个、20个至29个、20个至30个、21个至22个、21个至23个、21个至24个、21个至25个、21个至26个、21个至27个、21个至28个、21个至29个、21个至30个、22个至23个、22个至24个、22个至25个、22个至26个、22个至27个、22个至28个、22个至29个、22个至30个、23个至24个、23个至25个、23个至26个、23个至27个、23个至28个、23个至29个、23个至30个、24个至25个、24个至26个、24个至27个、24个至28个、24个至29个、24个至30个、25个至26个、25个至27个、25个至28个、25个至29个、25个至30个、26个至27个、26个至28个、26个至29个、26个至30个、27个至28个、27个至29个、27个至30个、28个至29个、28个至30个或29个至30个连接的核苷。
某些经修饰的寡核苷酸
在某些实施例中，以上修饰(糖、核碱基、核苷间键)并入到经修饰的寡核苷酸中。在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸的特征在于其修饰基序和总长度。在某些实施例中，此类参数彼此独立。因此，除非另有说明，否则具有间隔体糖基序的寡核苷酸的每个核苷间键可以是经修饰的或未经修饰的，并且可以或可以不遵循糖修饰的间隔体修饰图案。例如，糖间隔体的翼区内的核苷间键可以彼此相同或不同，并且可以与糖基序的间隙区的核苷间键相同或不同。类似地，此类糖间隔体寡核苷酸可以包括一个或多个独立于糖修饰的间隔体图案的经修饰的核碱基。除非另有说明，否则所有修饰都独立于核碱基序列。
某些经修饰的寡核苷酸的群体
其中群体中的所有经修饰的寡核苷酸具有相同分子式的经修饰的寡核苷酸的群体可以是立体随机群体或手性富集的群体。所有经修饰的寡核苷酸的所有手性中心在立体随机群体中是立体随机的。在手性富集的群体中，至少一个特定手性中心在群体中的经修饰的寡核苷酸中不是立体随机的。在某些实施例中，手性富集的群体中的经修饰的寡核苷酸针对β-D核糖基糖部分富集，并且所有硫代磷酸酯核苷间键都是立体随机的。在某些实施例中，手性富集的群体中的经修饰的寡核苷酸针对β-D核糖基糖部分和至少一个特定的呈特定立体化学构型的硫代磷酸酯核苷间键富集。
核碱基序列
在某些实施例中，寡核苷酸(未经修饰的或经修饰的寡核苷酸)通过其核碱基序列进一步描述。在某些实施例中，寡核苷酸具有与第二寡核苷酸或经鉴定的参考核酸，如靶核酸互补的核碱基序列。在某些此类实施例中，寡核苷酸的区具有与第二寡核苷酸或经鉴定的参考核酸，如靶核酸互补的核碱基序列。在某些实施例中，寡核苷酸的区或整个长度的核碱基序列与第二寡核苷酸或核酸，如靶核酸的核碱基序列至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％互补。
寡聚双链体
在某些实施例中，本文中所述的寡聚化合物包括具有与靶核酸的核碱基序列互补的核碱基序列的寡核苷酸。在某些实施例中，一种寡聚化合物与第二寡聚化合物配对以形成寡聚双链体。此类寡聚双链体包括具有与靶核酸互补的区的第一寡聚化合物和具有与第一寡聚化合物互补的区的第二寡聚化合物。在某些实施例中，寡聚双链体的第一寡聚化合物包括经修饰的或未经修饰的寡核苷酸、缀合物接头和缀合物部分，或基本上由其组成。在某些实施例中，寡聚双链体的第一寡聚化合物包括经修饰的或未经修饰的寡核苷酸或基本上由其组成。在某些实施例中，寡聚双链体的第二寡聚化合物包括经修饰的或未经修饰的寡核苷酸、缀合物接头和缀合物部分，或基本上由其组成。寡聚双链体的任一种或两种寡聚化合物可以包括缀合物接头和缀合物部分。在某些实施例中，寡聚化合物与缀合物接头直接连接，缀合物接头与缀合物部分直接连接。寡聚双链体的每种寡聚化合物的寡核苷酸可以包含非互补性悬垂核苷。在某些实施例中，悬垂核苷可以与靶核酸互补。在某些实施例中，悬垂核苷不针对靶核酸。在某些实施例中，两种寡核苷酸相对于彼此具有至少一种错配。在某些实施例中，寡聚双链体是反义药剂。
在某些实施例中，第一寡聚化合物是反义化合物。在某些实施例中，第一经修饰的寡核苷酸是反义寡核苷酸。在某些实施例中，第二寡聚化合物是有义化合物。在某些实施例中，第二经修饰的寡核苷酸是有义寡核苷酸。在某些实施例中，第一经修饰的寡核苷酸是反义RNAi寡核苷酸。在某些实施例中，第二经修饰的寡核苷酸是有义RNAi寡核苷酸。在某些实施例中，第二经修饰的寡核苷酸的核碱基序列包括至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个或21个核碱基的与第一经修饰的寡核苷酸的相等部分的核碱基序列至少90％互补的互补性区。在某些实施例中，第二经修饰的寡核苷酸的核碱基序列包括至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个或21个核碱基的与第一经修饰的寡核苷酸的相等部分的核碱基序列至少95％互补的互补性区。在某些实施例中，第二经修饰的寡核苷酸的核碱基序列包括至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个或21个核碱基的与第一经修饰的寡核苷酸的相等部分的核碱基序列100％互补的互补性区。在某些实施例中，寡聚双链体是反义药剂。在某些实施例中，第一经修饰的寡核苷酸是长度为21-23个寡核苷酸的反义RNAi寡核苷酸。在某些实施例中，第二经修饰的寡核苷酸是长度为19-21个寡核苷酸的有义RNAi寡核苷酸。
在本文所述的任何寡聚双链体中，第一经修饰的寡核苷酸和/或第二经修饰的寡核苷酸的至少一个核苷可以包括经修饰的糖部分。合适的经修饰的糖部分的实例包含但不限于双环状糖部分，如选自–O-CH2-；以及–O-CH(CH3)-的2'-4'桥，以及非双环状糖部分，如2'-MOE糖部分、2'-F糖部分、2'-OMe糖部分或2'-NMA糖部分。在某些实施例中，第一经修饰的寡核苷酸和/或第二经修饰的寡核苷酸的至少一个核苷可以包括未经修饰的2'-脱氧核糖基糖部分。在某些实施例中，第一经修饰的寡核苷酸和/或第二经修饰的寡核苷酸的核苷中的至少80％、至少90％或100％包括选自2'-F和2'-OMe的经修饰的糖部分。在某些实施例中，一个或多个2'-F糖部分具有与2'-β-D-核糖基不同的构象。在某些实施例中，一个或多个2'-F糖部分呈2'-β-D-木糖基构象。
在本文所述的任何寡聚双链体中，第一经修饰的寡核苷酸和/或第二经修饰的寡核苷酸的至少一个核苷可以包括糖替代物。合适的糖替代物的实例包含但不限于：吗啉代、己糖醇核酸(HNA)、氟-己糖醇核酸(F-HNA)、乙二醇核酸(GNA)和未锁定核酸(UNA)的糖替代物。在某些实施例中，第一经修饰的寡核苷酸的至少一个核苷包括糖替代物，所述糖替代物可以是GNA。
在本文所述的任何寡聚双链体中，第一经修饰的寡核苷酸和/或第二经修饰的寡核苷酸的至少一个核苷间键可以包括经修饰的核苷间键。在某些实施例中，经修饰的核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。在某些实施例中，来自第一经修饰的寡核苷酸的5'端和/或3'端的第一核苷间键、第二核苷间键或第三核苷间键中的至少一个包括硫代磷酸酯键。在某些实施例中，来自第二经修饰的寡核苷酸的5'端和/或3'端的第一核苷间键、第二核苷间键或第三核苷间键中的至少一个包括硫代磷酸酯键。在某些实施例中，经修饰的核苷间键是甲磺酰基氨基磷酸酯核苷间键。在某些实施例中，来自第一经修饰的寡核苷酸的5'端和/或3'端的第一核苷间键或第二核苷间键中的至少一个包括甲磺酰基氨基磷酸酯核苷间键。在某些实施例中，来自第二经修饰的寡核苷酸的5'端和/或3'端的第一核苷间键或第二核苷间键中的至少一个包括甲磺酰基氨基磷酸酯核苷间键。
在本文所述的任何寡聚双链体中，第一经修饰的寡核苷酸和/或第二经修饰的寡核苷酸的至少一个核苷间键可以包括硫代磷酸二酯核苷间键。
在本文所述的任何寡聚双链体中，第一经修饰的寡核苷酸和/或第二经修饰的寡核苷酸的每个核苷间键可以独立地选自磷酸二酯、硫代磷酸酯或甲磺酰基氨基磷酸酯核苷间键。
在本文所述的任何寡聚双链体中，第一经修饰的寡核苷酸和/或第二经修饰的寡核苷酸的每个核苷间键可以独立地选自磷酸二酯或硫代磷酸酯核苷间键。
在本文所述的任何寡聚双链体中，第一经修饰的寡核苷酸和/或第二经修饰的寡核苷酸的每个核苷间键可以独立地选自磷酸二酯或甲磺酰基氨基磷酸酯核苷间键。
在本文所述的任何寡聚双链体中，第一经修饰的寡核苷酸的核苷间键基序可以是ssooooooooooooooooooss，其中每个“s”是硫代磷酸酯核苷间键，并且每个“o”是磷酸二酯核苷间键。在本文所述的任何寡聚双链体中，第二经修饰的寡核苷酸的核苷间键基序可以是ssooooooooooooooooss，其中每个“s”是硫代磷酸酯核苷间键，并且每个“o”是磷酸二酯核苷间键。
在本文所述的任何寡聚双链体中，第一经修饰的寡核苷酸和/或第二经修饰的寡核苷酸的至少一个核碱基可以是经修饰的核碱基。在某些实施例中，经修饰的核碱基是5-甲基胞嘧啶。
在本文所述的任何寡聚双链体中，第一经修饰的寡核苷酸可以包括附接到最靠近5'的核苷的5'位置的稳定化的磷酸酯基团。在某些实施例中，稳定化的磷酸酯基团包括膦酸环丙酯或(E)-膦酸乙烯酯。
在一些实施例中，寡聚双链体具有如国际公开第WO 2022/174053号中描述的基序。
在本文所述的任何寡聚双链体中，第一经修饰的寡核苷酸和/或第二经修饰的寡核苷酸可以包括缀合物基团。优选地，第二经修饰的寡核苷酸包括缀合物基团。在某些实施例中，缀合物基团包括缀合物接头和缀合物部分。在某些实施例中，缀合物基团在第一经修饰的寡核苷酸的5'端处附接到第一经修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，缀合物基团在经修饰的寡核苷酸的3'端处附接到第一经修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，缀合物基团在内部位置处附接到第一经修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，缀合物基团通过呋喃糖基糖部分的2'修饰附接到第一经修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，缀合物基团通过经修饰的核苷间键附接到第一经修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，缀合物基团在经修饰的寡核苷酸的5'端处附接到第二经修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，缀合物基团在经修饰的寡核苷酸的3'端处附接到第二经修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，缀合物基团在内部位置处附接到第二经修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，缀合物基团通过呋喃糖基糖部分的2'修饰附接到第二经修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，缀合物基团通过经修饰的核苷间键附接到第二经修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，缀合物基团包括对还被称为TfR1和CD71的转铁蛋白受体(TfR)具有亲和力的细胞靶向性部分。在某些实施例中，缀合物基团包括抗TfR1抗体或其片段。在某些实施例中，缀合物基团包括能够与TfR1结合的蛋白质或肽。在某些实施例中，缀合物基团是能够与TfR1结合的双环状肽。
反义活性
在某些实施例中，寡聚化合物和寡聚双链体能够与靶核酸杂交，从而产生至少一种反义活性；此类寡聚化合物和寡聚双链体是反义化合物。在某些实施例中，反义化合物在标准细胞测定中在将靶核酸的量或活性减少或抑制25％或更多时具有反义活性。在某些实施例中，反义化合物选择性地影响一种或多种靶核酸。此类反义化合物包括与一种或多种靶核酸杂交，从而产生一种或多种期望的反义活性，并且不与一种或多种非靶核酸杂交或者不以导致显著的不期望的反义活性的方式与一种或多种非靶核酸杂交的核碱基序列。
在某些反义活性中，反义化合物与靶核酸的杂交会导致切割靶核酸的蛋白质的募集。例如，某些反义化合物导致对靶核酸的RNA酶H介导的切割。RNA酶H是切割RNA:DNA双链体的RNA链的细胞核酸内切酶。此类RNA:DNA双链体中的DNA不需要是未经修饰的DNA。在某些实施例中，本文所述的反义化合物是“DNA样”的，其足以引发RNA酶H活性。在某些实施例中，在间隔体的间隙中的一个或多个非DNA样核苷是容许的。
在某些反义活性中，反义化合物或反义化合物的一部分被上样到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，最终导致对靶核酸的切割。例如，某些反义化合物导致靶核酸被Argonaute切割。上样到RISC中的反义化合物是RNAi化合物。RNAi化合物可以是双链的(siRNA)或单链的(ssRNA)。
在某些实施例中，反义化合物与靶核酸的杂交不会导致切割靶核酸的蛋白质的募集。在某些实施例中，反义化合物与靶核酸的杂交导致靶核酸剪接的改变。在某些实施例中，反义化合物与靶核酸的杂交导致对靶核酸与蛋白质或其它核酸之间的结合相互作用的抑制。在某些实施例中，反义化合物与靶核酸的杂交导致靶核酸翻译的改变。
反义活性可以直接或间接地观察到。在某些实施例中，对反义活性的观察或检测涉及对由此类靶核酸编码的靶核酸或蛋白质的量的变化、核酸或蛋白质的剪接变体比率的变化和/或细胞或受试者中的表型变化的观察或检测。
某些靶核酸
在某些实施例中，寡聚化合物包括包含与靶核酸互补的区的寡核苷酸或由所述寡核苷酸组成。在某些实施例中，靶核酸是内源性RNA分子。在某些实施例中，靶核酸编码蛋白质。在某些此类实施例中，靶核酸选择自：成熟mRNA和前体mRNA，包含内含子区、外显子区和非翻译区。在某些实施例中，靶RNA是成熟mRNA。在某些实施例中，靶核酸是前体mRNA。在某些此类实施例中，靶标区完全位于内含子内。在某些实施例中，靶标区跨越内含子/外显子连接部。在某些实施例中，靶标区至少50％位于内含子内。在某些实施例中，靶核酸是逆基因的RNA转录产物。在某些实施例中，靶核酸是非编码RNA。在某些此类实施例中，靶非编码RNA选自：长非编码RNA、短非编码RNA、内含子RNA分子。
与靶核酸的互补/错配
可能的是在不消除活性的情况下引入错配碱基。例如，Gautschi等人(《国家癌症研究所杂志(J.Natl.Cancer Inst.)》93:463-471,2001年3月)证明了与bcl-2mRNA具有100％互补性并且与bcl-xL mRNA具有3个错配的寡核苷酸能够在体外和体内降低bcl-2和bcl-xL两者的表达。此外，寡核苷酸在体内表现出强效的抗肿瘤活性。Maher和Dolnick(《核酸研究》16:3341-3358,1988)在兔网织红细胞测定中测试了一系列串联14个核碱基寡核苷酸以及分别包含串联的寡核苷酸中的两个或三个寡核苷酸的序列的28个和42个核碱基寡核苷酸阻止人DHFR的翻译的能力。三种14个核碱基寡核苷酸中的每一种单独都能够抑制翻译，尽管其水平比28个或42个核碱基寡核苷酸的水平更温和。
在某些实施例中，寡核苷酸与靶核酸在寡核苷酸的整个长度上互补。在某些实施例中，寡核苷酸与靶核酸99％、95％、90％、85％或80％互补。在某些实施例中，寡核苷酸与靶核酸在寡核苷酸的整个长度上至少80％互补，并且包括与靶核酸100％或完全互补的区。在某些实施例中，完全互补的区的长度为6个至20个、10个至18个或18个至20个核碱基。
在某些实施例中，寡核苷酸包括一个或多个相对于靶核酸的错配的核碱基。在某些实施例中，针对靶标的反义活性通过这种错配而减少，但是针对非靶标的活性减少更大量。因此，在某些实施例中，寡核苷酸的选择性得到改进。在某些实施例中，错配被特异性地定位在具有间隔体基序的寡核苷酸内。在某些实施例中，错配位于距间隙区的5'端的位置1、2、3、4、5、6、7或8处。在某些实施例中，错配位于距间隙区的3'端的位置9、8、7、6、5、4、3、2、1处。在某些实施例中，错配位于距翼区的5'端的位置1、2、3或4处。在某些实施例中，错配位于距翼区的3'端的位置4、3、2或1处。
某些靶核酸
先前已描述了靶向肌肉核酸的经修饰的寡核苷酸可以与所提供的本发明结合使用，并且特别地，经修饰的寡核苷酸可以包含在本发明的组合物中。在某些实施例中，靶核酸是肌肉靶核酸。在某些实施例中，靶核酸选自ACTC1、ACTN2、ACVR1、ACVR1B、C9ORF72、CALR3、CaMK2d、CSRP3、DMD、DMPK、DNM2、DUX4、FBX032、FLNC、FXN、GYS1、HPRT、INHBA、JPH2、KLF15、LDB3、MED1、MED13、MEF2D、MSTN、MYBPC3、MYH6、MYH7、MYL2、MYL3、MLCK1、MYOZ2、MYPN、NEXN、NLRP3、PLN、PPP1R3A、PRKAG2、RYR、SOD1、TCAP、TNN、TNNC1、TNNI3、TNNT2、TPM1、TRIM64或VCL。在某些实施例中，靶向一种或多种此类靶核酸的经修饰的寡核苷酸包括国际专利公开第WO2019/090160号、第WO2020/028842号、第WO2020/028841号、第WO2020/028831号、第WO2021/142260号、第WO2021/142227号、第WO2020/028840号、第WO2021/142217号、第WO2021/142331号或第WO2021/142269号中所述和所示的一种或多种经修饰的寡核苷酸。
在某些实施例中，肌肉靶核酸选自CaMK2d、NLRP3、PLN、DMD、DMPK、DNM2、DUX4或HPRT。在某些实施例中，CaMK2d核酸具有以下中所示的序列：SEQ ID NO:1(GENBANK登录号NC_000004.12的补体，从核苷113448001至113765000截短)或SEQ ID NO:2(GENBANK登录号NM_001321571.2)。在某些实施例中，NLRP3核酸具有以下中所示的序列：SEQ ID NO:3(GENBANK登录号NC_000001.11，从核苷247413001至247454000截短)或SEQ ID NO:4(GENBANK登录号NM_004895.4)。在某些实施例中，PLN核酸具有以下中所示的序列：SEQ IDNO:5(GENBANK登录号NC_000006.12，从核苷118545001至118565000截短)或SEQ ID NO:6(GENBANK登录号NM_002667.4)。在某些实施例中，DMD核酸具有以下中所示的序列：SEQ IDNO:7(GENBANK NT_011757.15的补体，从核苷28916001至31142000截短)。在某些实施例中，DMPK核酸具有以下中所示的序列：SEQ ID NO:8(GenBank登录号NT_011109.15，从核苷18540696至18555106截短)或SEQ ID NO:9(GENBANK登录号NM_001081560.1)。在某些实施例中，DNM2核酸具有以下中所示的序列：SEQ ID NO:10(GenBank登录号NC_000019.10，从核苷10715001至10835000截短)或SEQ ID NO:11(GENBANK登录号NM_004945.3)。在某些实施例中，DUX4核酸具有以下中所示的序列：SEQ ID NO:12(GENBANK登录号NC_000004.12,，从核苷190171001至190187000截短)或SEQ ID NO:13(GENBANK登录号NM_001306068.2)。在某些实施例中，HPRT1核酸具有以下中所示的序列：SEQ ID NO:253(ENSEMBL IDENSG00000165704.15，发行版107(2022年7月))。
在某些实施例中，靶向CaMK2d的经修饰的寡核苷酸包括国际专利公开第WO2019/165067号、第WO2021/158810号或第WO2022/058386号中所述和所示的一种或多种经修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，靶向NLRP3的经修饰的寡核苷酸包括通过引用并入本文的国际专利公开第WO2022178146A1号中所述和所示的一种或多种经修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，靶向PLN的经修饰的寡核苷酸包括通过引用并入本文的国际专利公开第WO2022/173976号或国际专利公开第WO2001/16312号中所述和所示的一种或多种经修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，靶向DMD的经修饰的寡核苷酸包括通过引用并入本文的WO2018/014042或国际专利公开第WO2022/020107号、第WO2021/025899号、第WO2021/003573号、第WO2021/142307号、第WO2020/257489号、第WO2020/219820号、第WO2020/214763号、第WO2020/198268号、第WO2020/089325号、第WO2020/028832号、第WO2019/200185号、第WO2019/090160号、第WO2019/060775号、第WO2019/014772号、第WO2018/129384号、第WO2018/067973号、第WO2018/055577号、第WO2018/014043号、第WO2018/014042号、第WO2018/007475号、第WO2018/005805号、第WO2017/210647号、第WO2017/192679号、第WO2017/047707号、第WO2015/137409号、第WO2014/153220号、第WO2013/112053号、第WO2013/100190号、第WO2012/029986号、第WO2011/057350号、第WO2010/123369号、第WO2010/048586号、第WO2009/054725号、第WO2007/135105号、第WO2006/000057号、第WO2004/083446号、第WO2004/048570号或第WO2002/024906号中所述和所示的一种或多种寡核苷酸。在某些实施例中，靶向DMPK的经修饰的寡核苷酸包括通过引用并入本文的国际专利公开第WO 2012/012443号、第WO2012/012467号、第WO2015/021457号或国际专利公开第WO2022/147209号、第WO2022/026152号、第WO2021142234号、第WO2021/076856号、第WO2020/028861号、第WO2019/113393号、第WO2006/006948号、第WO 2005/116204号、第WO2018/002812号、第WO2018/078131或第WO2018/078134号中所述和所示的一种或多种寡核苷酸。在某些实施例中，靶向DNM2的经修饰的寡核苷酸包括通过引用并入本文的国际专利公开第WO2019/140452号或国际专利公开第WO2020/028844号、第WO2015/055859号或第WO2016/170162号中所述和所示的一种或多种寡核苷酸。在某些实施例中，靶向DUX4的经修饰的寡核苷酸包括通过引用并入本文的国际专利公开第WO2016/115490号、第WO2022/159712号、或美国专利公开第US2021220479号或国际专利公开第WO2022/147207号、第WO2022/020106号、第WO2021/142275号、第WO2020/028840号、第WO2020/203880号、第WO2020/028864号、第WO2019/060432号、第WO 2017/050836号、第WO2016/115490号或第WO2012/024535号中所述和所示的一种或多种寡核苷酸。
某些药物组合物
在某些实施例中，本文中所述的药物组合物包括一种或多种寡聚化合物。在某些实施例中，一种或多种寡聚化合物各自包括经修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，药物组合物包括药学上可接受的稀释剂或载体。在某些实施例中，药物组合物包括无菌盐水溶液和一种或多种寡聚化合物。在某些实施例中，药物组合物由或主要由无菌盐水溶液和一种或多种寡聚化合物组成。在某些实施例中，无菌盐水是药用级盐水。在某些实施例中，药物组合物包括一种或多种寡聚化合物和无菌水。在某些实施例中，药物组合物由或主要由一种或多种寡聚化合物和无菌水组成。在某些实施例中，无菌水是药用级盐水。在某些实施例中，药学上可接受的稀释剂或载体是注射用蒸馏水。在某些实施例中，药物组合物包括一种或多种寡聚化合物和磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在某些实施例中，药物组合物由或主要由一种或多种寡聚化合物和PBS组成。在某些实施例中，无菌PBS是药用级PBS。在某些实施例中，药物组合物包括一种或多种寡聚化合物和人工脑脊液。在某些实施例中，无菌PBS是药用级PBS。在某些实施例中，药物组合物由或主要由人工脑脊液组成。在某些实施例中，人工脑脊液为药用级。
在某些实施例中，药物组合物包括本文公开的一种或多种寡聚化合物和一种或多种赋形剂。在某些实施例中，赋形剂选自水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、淀粉酶、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘稠石蜡、羟甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。
在某些实施例中，寡聚化合物可以与药学上可接受的活性和/或惰性物质混合，用于制备药物组合物或制剂。用于调配药物组合物的组合物和方法取决于许多标准，包含但不限于施用途径、疾病的程度或要施用的剂量。
在某些实施例中，包括本文公开的寡聚化合物的药物组合物涵盖寡聚化合物的任何药学上可接受的盐、寡聚化合物的酯或此类酯的盐。在某些实施例中，包括包含一种或多种寡核苷酸的寡聚化合物的药物组合物在施用于包含人在内的受试者时能够提供(直接或间接)生物活性代谢物或其残余物。因此，例如，本公开还被绘制成寡聚化合物的药学上可接受的盐、前药、此类前药的药学上可接受的盐和其它生物等效物。合适的药学上可接受的盐包含但不限于钠盐和钾盐。在某些实施例中，前药包括附接到寡核苷酸的缀合物部分，其中所述缀合物部分在体内被内源性核酸酶切割。
脂质部分已用于各种方法中的核酸疗法。在某些此类方法中，将如寡聚化合物等核酸引入到由阳离子脂质和中性脂质的混合物制成的预先形成的脂质体或脂质体复合物中。在某些方法中，在不存在中性脂质的情况下形成具有单阳离子或多阳离子脂质的DNA复合物。在某些实施例中，脂质部分被选择为增加寡聚物药剂向特定细胞或组织的分布。在某些实施例中，脂质部分被选择为增加寡聚物药剂向脂肪组织的分布。在某些实施例中，脂质部分被选择为增加寡聚物药剂向肌肉组织的分布。
在某些实施例中，本文中公开的药物组合物包括递送系统。递送系统的实例包含但不限于脂质体和乳剂。某些递送系统可用于制备某些药物组合物，包含包括疏水性化合物的药物组合物。在某些实施例中，使用某些有机溶剂，如二甲基亚砜。
在某些实施例中，药物组合物包括一种或多种被设计成将本文中所述的寡聚化合物递送到特定组织或细胞类型的组织特异性递送分子。例如，在某些实施例中，药物组合物包含用组织特异性抗体涂覆的脂质体。
在某些实施例中，药物组合物包括共溶剂系统。某些此类共溶剂系统包括，例如，苯甲醇、非极性表面活性剂、水混溶性有机聚合物和水相。在某些实施例中，此类共溶剂系统用于疏水性化合物。这种共溶剂系统的一非限制性实例是VPD共溶剂系统，所述VPD共溶剂系统是包括3％w/v的苯甲醇、8％w/v非极性表面活性剂聚山梨酯80TM和65％w/v的聚乙二醇300的绝对乙醇的溶液。这种共溶剂系统的比例可以在不显著改变其溶解度和毒性特性的情况下发生相当大的变化。此外，共溶剂组分的身份可以改变：例如，可以使用其它表面活性剂来代替聚山梨酯80TM；聚乙二醇的级分大小可以改变；其它生物相容性聚合物可以代替聚乙二醇，例如，聚乙烯醇吡咯烷酮；并且其它糖或多糖可以取代右旋糖。
在某些实施例中，本文中公开的药物组合物被制备成用于口服施用。在某些实施例中，药物组合物被制备成用于颊施用。在某些实施例中，药物组合物被制备成用于通过注射(例如，静脉内、皮下、肌内、鞘内(IT)、脑室内(ICV)等)施用。在某些此类实施例中，药物组合物包括载体并且在水溶液，如水或生理上相容的缓冲液，如汉克氏溶液(Hank'ssolution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或生理盐水缓冲液中调配。在某些实施例中，其它成分被包含在内(例如，帮助溶解或充当防腐剂的成分)。在某些实施例中，使用适当的液体载体、悬浮剂等制备可注射悬浮液。某些注射用药物组合物以单位剂型形式，例如，在安瓿或多剂量容器中呈现。某些注射用药物组合物是油性或水性媒剂中的悬浮液、溶液或乳剂，并且可以含有如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂的制剂。某些适合用于注射用药物组合物的溶剂包含但不限于亲脂性溶剂和如芝麻油等脂肪油、如油酸乙酯或甘油三酯的合成脂肪酸酯以及脂质体。可以含有水性注射悬浮液。
在某些条件下，本文中公开的某些化合物充当酸。尽管此类化合物可以以质子化(游离酸)形式、离子化(阴离子)形式或离子化并且与阳离子缔合(盐)的形式绘制或描述，但此类化合物的水溶液在此类形式之间平衡存在。例如，寡核苷酸的磷酸酯键在水溶液中以游离酸、阴离子和盐形式平衡存在。除非另有说明，否则本文中描述的化合物旨在包含所有此类形式。此外，某些寡核苷酸具有几个此类键，每个键都处于平衡中。因此，寡核苷酸在溶液中以形式的集合均平衡存在于多个位置处。术语“寡核苷酸”旨在包含所有此类形式。绘制的结构必然描绘单一形式。然而，除非另有说明，否则此类绘制同样旨在包含对应形式。在此，描绘之后是术语“或其盐”的化合物的游离酸的结构明确地包含可以完全地或部分地质子化/去质子化/与阳离子缔合的所有此类形式。在某些情况下，鉴定出一个或多个特异性阳离子。
在某些实施例中，本文中公开的寡聚化合物与钠处于水溶液中。在某些实施例中，寡聚化合物与钾处于水溶液中。在某些实施例中，寡聚化合物处于PBS中。在某些实施例中，寡聚化合物处于水中。在某些此类实施例中，用NaOH和/或HCl调节溶液的pH以实现期望的pH。
在此，描述了某些特定剂量。剂量可以呈剂量单位的形式。为了清楚起见，以毫克为单位的经修饰的寡核苷酸或寡聚化合物的剂量(或剂量单位)表示经修饰的寡核苷酸的游离酸形式的质量，不包括任何缀合物基团的质量。如以上描述的，在水溶液中，游离酸以阴离子和盐形式处于平衡中。然而，出于计算剂量的目的，假定经修饰的寡核苷酸或寡聚化合物以不含溶剂不含乙酸钠的无水游离酸的形式存在。例如，在经修饰的寡核苷酸或寡聚化合物处于包括钠(例如，盐水)的溶液的情况下，经修饰的寡核苷酸或寡聚化合物可以部分地或完全地去质子化并且与Na+离子缔合。然而，质子的质量仍然计入剂量的重量，并且Na+离子的质量不计入剂量的重量。此外，在计算本文中所述的剂量的重量时，不包括缀合物基团或双环配体的质量；也就是说，剂量仅与寡核苷酸或寡聚双链体有关。因此，例如，3.5mg的化合物第486178号或化合物第1590463-BCY17868号的剂量或剂量单位等于重量为3.5mg的分子的完全质子化的寡核苷酸部分的分子的数量。这相当于3.7mg不含溶剂不含乙酸钠的无水钠化的化合物第486178号；并且其相当于4.7mg经缀合的化合物1590463-BCY17868。
实例
以下实例说明了本公开的某些实施例并且不是限制性的。此外，在提供具体实施例的情况下，发明人已经考虑这些具体实施例的一般应用。例如，具有特定基序的寡核苷酸的公开为具有相同或类似基序的另外的寡核苷酸提供了合理的支持。并且例如，当特定高亲和力修饰出现在特定位置时，除非另有说明，否则相同位置的其它高亲和力修饰被认为是合适的。
实例1：双环配体的设计与合成
使用标准Fmoc(9-芴甲氧羰基)固相肽合成，通过手动偶联(用于大规模)或使用Biotage SyroII自动肽合成器(用于小规模)，在Rink酰胺树脂上合成多肽。在从树脂上进行基于TFA的切割之后，将肽用二乙醚沉淀并溶解于50:50的乙腈/水中。然后使用碳酸氢铵(100mM)作为碱，用1.3当量的分子支架1,1',1”-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三(2-溴乙酮)(TATB)将粗肽(浓度为约1mM)环化。环化的完成通过基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)或LC-MS来确定。一旦完成，使用N-乙酰基半胱氨酸(相对于肽为10当量)将环化反应淬灭，并将溶液冻干。将残余物溶解于适当的溶剂中并通过RP-HPLC纯化。将具有足够纯度和正确分子量(通过MALDI-TOF和HPLC或LC MS验证)的肽级分合并并冻干。使用基于Trp/Tyr含量的280nm处的消光系数通过UV吸收来确定浓度。除非另外指出，否则所有氨基酸呈L构型。每个C末端是酰胺化的。
表2：双环配体
dY表示D-酪氨酸；[HyP]表示4-反式-羟基-L-脯氨酸；[Aze]表示氮杂环丁烷；[tBuGly]表示叔丁基甘氨酸；[K(N3)]表示6-叠氮基赖氨酸；[Pip]表示哌啶酸；并且[K(N3)(PYA-马来酰亚胺)]表示具有以下结构的经修饰的赖氨酸：
实例2：与小鼠DMPK互补的经修饰的寡核苷酸的设计
设计并合成与小鼠DMPK互补的经修饰的寡核苷酸(如下表所指示的)。对下表中的所选化合物在5'端上进行修饰，以允许与双环配体缀合。第486178号化合物先前在WO2014/120861中公开。
表3与小鼠DMPK互补的经修饰的寡核苷酸的设计
下标“k”表示cEt核苷，下标“d”表示立体标准DNA核苷，下标“s”指示硫代磷酸酯核苷间键，下标“o”指示磷酸二酯核苷间键，C前面的上标“m”表示5-甲基胞嘧啶，“[nC6o]”指示6-氨基己醇接头，“[BCN]”指示(双环[6.1.0]壬炔)-甲酰基接头，“[sC6o]”指示6-巯基己醇接头，“[PEG1炔烃]”指示炔丙基-PEG1-酸，“[Tdo mCdoAd]”指示TCA三核苷酸接头，并且“[马来酰亚胺C3酰基]”指示具有以下结构的马来酰亚胺基丙酰基接头：
设计(如下表所描述的)并合成与486178(上文所描述的)互补的经修饰的寡核苷酸。对下表中的化合物在5'端上进行修饰，以允许与双环配体缀合。
表4与486178互补的具有接头的经修饰的寡核苷酸的设计，用于与CD71双环配体缀合。
下标“k”表示cEt核苷，下标“d”表示立体标准DNA核苷，下标“o”指示磷酸二酯核苷间键，C前面的上标“m”表示5-甲基胞嘧啶，“[nC6o]”指示6-氨基己醇接头，并且“[BCN]”指示(双环[6.1.0]壬炔)-甲酰基接头。
设计并合成与小鼠MALAT互补的经修饰的寡核苷酸(如下表所指示的)。对下表中的化合物在3'端上进行修饰，以允许与双环配体缀合。
表5与小鼠MALAT互补的经修饰的寡核苷酸的设计
下标“e”表示2'-MOE修饰的核苷，下标“s”指示硫代磷酸酯核苷间键，下标“o”指示磷酸二酯核苷间键，C前面的上标“m”表示5-甲基胞嘧啶，“[BCN]”指示(双环[6.1.0]壬炔)-甲酰基接头，“[5Cy3cHex]”指示5'-Cy3环己烷部分(吉玛基因公司(GenePharma)11-4100)，并且而“[3nC7]”表示具有以下结构的3'-C7氨基修饰体：
实例3：靶向HPRT1的RNAi化合物的设计
设计并合成与小鼠HPRT互补的反义链修饰的寡核苷酸，如下表所指示的。
表6靶向人/小鼠HPRT1的反义链修饰的寡核苷酸的设计
在上表中，下标“f”表示2'-F修饰的核苷，下标“y”表示2'-OMe修饰的核苷，下标“s”表示硫代磷酸酯核苷间键，并且下标“o”表示磷酸二酯核苷间键。
有义寡核苷酸与反义寡核苷酸的21个核苷中的第一核苷互补(从5'至3')，其中反义寡核苷酸的最后两个3'-核苷不与有义寡核苷酸配对(是悬垂核苷)。
表7靶向含C16修饰的核苷的人/小鼠HPRT1的有义链修饰的寡核苷酸的设计
在上表中，下标“f”表示2'-F修饰的核苷，下标“y”表示2'-OMe修饰的核苷酸，下标“s”表示硫代磷酸酯核苷间键，下标“o”表示磷酸二酯核苷间键，“[BCN]”指示(双环[6.1.0]壬炔)-甲酰基接头，“[3nC7]”表示3'-C7氨基修饰体，并且“[马来酰亚胺C3酰基]”指示马来酰亚胺基丙酰基接头。
表8
靶向人/小鼠HPRT1的RNAi化合物的设计
双链体化合物编号 反义链化合物编号 有义链化合物编号
1453015:1550983 1453015 1550983
1453015:1547771 1453015 1547771
实例4：包括CD71双环配体的寡聚化合物与人转铁蛋白受体CD71结合的体外结合测定
开发了nanoBRET测定，以获得与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸和与CD71双环配体缀合的RNAi化合物的抑制常数Ki。先前已经描述了使用nanoBRET测定将寡核苷酸与蛋白质结合(参见例如Vickers和Crooke,《公共科学图书馆·综合(PloS One)》,2016,11(8):e061930)。
通过使用GGGSGGSSG柔性接头将NanoLuc(普洛麦格公司(ProMega))通过其N末端Val与h-CD71的C末端F760残基连接来构建hCD71-Nluc融合蛋白。荧光标记的(Cy3)修饰的寡核苷酸1598988通过应变促进的叠氮-炔烃环加成(SPAAC)反应与双环配体BCY17871缀合。
将来自稳定表达hCD71-Nluc的HEK293细胞的粗膜级分重悬于PBS中，并将100μL分配到白色96孔测定板(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)，目录号136101)中，其量与10,000个细胞/孔相对应。将膜用11.1μL的BCY17871-1598988以1000-0.006nM的连续稀释最终浓度处理。将混合物在室温下温育3小时以达到平衡。为了启动BRET，向每个孔中添加12.4μL的100μM的Nluc底物furimazine，并且将混合物温育5-30分钟。在普洛麦格公司GlowMax Discover板阅读器上以450nm和600nm的波长读取测定板，并使用波长450/600的发射比来产生％BRET效率。数据经过非线性回归，然后拟合到单个位点结合的双曲线函数。BC17871-1598988的解离常数KD确定为57-58nM。
为了评估与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸和与CD71双环配体缀合的RNAi化合物，对测定进行如下修改。将100μL的来自稳定转染的hCD71-Nluc HEK293细胞的粗膜级分分配到白色96孔测定板(赛默飞世尔科技公司，目录号136101)中。BCY17871-1598988用作示踪剂化合物并以60nM的最终浓度添加到每个孔中。通过SPAAC反应将经修饰的寡核苷酸与双环配体缀合，然后将这些寡核苷酸以一定浓度范围添加到一式三份的测定点中，并且将混合物在室温下温育3小时。通过添加furimazine启动BRET并如上文所描述完成测定。使用在同一运行中获得的BCY17871-1598988的估计KD值，抑制常数(Ki)是通过将％BRET效率值拟合到竞争性抑制模型来获得的。在下表中，值以一式三份数据的平均值呈现。每个实验在单独的表中呈现。
双环配体通过BCN接头附接到经修饰的寡核苷酸。化合物1590463-BCY17901作为实例如下所示：
(SEQ ID No:92和176)
表9通过nanoBRET与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸的抑制常数
表10
通过nanoBRET与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸的抑制常数
化合物编号 双环配体 Ki(nM)
1590463 BCY17882 23
1590463 BCY17890 17
1590463 BCY17892 11
1590463 BCY17894 8
1590463 BCY17896 2
1590463 BCY17899 4
1590463 BCY17901 1
1590463 BCY17903 125
1590463 BCY17904 31
1590463 BCY17905 148
1590463 BCY17873 7
表11
通过nanoBRET与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸的抑制常数
表12
通过nanoBRET与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸的抑制常数
化合物编号 双环配体 Ki(nM)
1590463 BCY17882 55
1590463 BCY17890 20
1590463 BCY17892 11
1590463 BCY17894 10
1590463 BCY17896 2
1590463 BCY17899 4
1590463 BCY17901 1
1590463 BCY17904 60
1614439 BCY17906 23
1590463 BCY17873 10
1602000 BCY17873 36
1609732 BCY17873 10
表13
通过nanoBRET与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸的抑制常数
表14
通过nanoBRET与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸的抑制常数
化合物编号 双环配体 Ki(nM)
1598988 BCY17896 9.9
1591118 BCY17896 3.1
1598988 BCY17901 4.4
1591118 BCY17901 1.4
通过将第486178号和第1614438号化合物混合以产生第486178:1614438号化合物来产生经修饰的寡核苷酸的双链体。
表15
通过nanoBRET与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸双链体的抑制常数
化合物编号 双环配体 Ki(nM)
486178:1614438 BCY17873 95
表16
通过nanoBRET与CD71双环配体缀合的RNAi化合物的抑制常数
化合物编号 双环配体 Ki(nM)
1453015:1550983 BCY17873 9
表17
通过nanoBRET与CD71双环配体缀合的RNAi化合物的抑制常数
化合物编号 双环配体 Ki(nM)
1453015:1550983 BCY17873 38
实例5：与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸的结合亲和力
在Biacore X100表面等离子体共振(SPR)仪器上测试与CD71双环配体缀合的以下经修饰的寡核苷酸中的每个经修饰的寡核苷酸的结合亲和力。通过注射和与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸形成双链体的5'-生物素标记的DNA(与经修饰的寡核苷酸互补的5'-生物素TEG-DNA)于HBS-P(10mM HEPES，pH 7.4，150mM NaCl，0.0005％表面活性剂P20)运行缓冲液中的20nM溶液，将200单位的与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸固定在链霉亲和素芯片上。然后，在25℃下，以6.25nM、12.5nM、25nM、50nM和100nM的递增浓度，将运行缓冲液中的CD71注射到与CD71双环配体双链体固定化的链霉亲和素芯片缀合的经修饰的寡核苷酸上。使用Biacore X100评估软件进行动力学和平衡结合测定，应用1:1结合拟合。结合亲和力在下表中表达为平衡解离常数(KD)。
表18
与CD71双环配体SPR缀合的经修饰的寡核苷酸的结合亲和力
化合物编号 双环配体 KD(nM)
1590463 BCY17868 0.9
1590463 BCY17869 14.5
1590463 BCY17870 0.1
1590463 BCY17871 2.4
1590463 BCY17872 77.1
1590463 BCY17873 12
1590463 BCY17874 32
1590463 BCY17875 4.5
1590463 BCY17876 95.4
1590463 BCY17877 12.5
1590463 BCY17878 126
1590463 BCY17879 31.2
1590463 BCY17880 8.2
实例6：hTFRKI/+敲入小鼠的与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸的活性和耐受性
根据NCBI转录物NM_001128148.2，这些研究中使用的人转铁蛋白受体(hTFR)/CD71敲入小鼠的小鼠外显子2的编码区以及小鼠内含子2的剪接供体位点被人TFR开放阅读框替代。转铁蛋白受体基因的人源化通过CRISPR/Cas-9介导的基因编辑完成，允许产生具有人源化转铁蛋白受体基因的组成型表达的模型。靶向策略基于NCBI转录物NM_011638.4(小鼠)和NM_001128148.2(人)。将允许表达Cas9 mRNA、特异性gRNA和嘌呤霉素抗性盒的质粒；以及含小鼠转铁蛋白受体基因的同源区、FRT位点和替代的人区的质粒共转染到泰康利生物科学公司(Taconic Biosciences)C57BL/6N Tac ES细胞系中。人源化小鼠在本文中被称为hTFRKI/+敲入小鼠。所述小鼠在内源性小鼠启动子的控制下表达一个拷贝的小鼠TFR基因和一个拷贝的人源化TFR基因。
对hTFRKI/+敲入小鼠测试了与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸的活性和耐受性。另外，测试了与靶向人CD71的OKT9抗体(BioXCell公司(BioXCell)，目录号：BE0023)的Fab'片段缀合的第1468770号化合物(上文所描述的)的活性。
处理
将hTFRKI/+小鼠分成每组3只小鼠的组。每只小鼠以下表所指示的剂量接受总共3个剂量(第1天、第8天和第15天)的经缀合的经修饰的寡核苷酸的静脉内施用。一组3只小鼠以下表所指示的剂量接受总共3个剂量(第1天、第8天和第15天)的未经缀合的经修饰的寡核苷酸第486178号化合物的静脉内施用。一组4只小鼠接受PBS作为阴性对照。
RNA分析
在最终施用后一周(第22天)将小鼠处死，并从各种肌肉组织(包含四头肌(Quad)、胫骨前肌(TA)、膈膜、三头肌、心脏、腓肠肌(gastroc))、主动脉、坐骨神经和肝组织中提取RNA，用于定量实时RTPCR分析，以使用小鼠引物探针组RTS3181(正向序列GACATATGCCAAGATTGTGCACTAC，本文指定为SEQ ID NO:16；反向序列CACGAATGAGGTCCTGAGCTT，本文指定为SEQ ID NO:17；探针序列AACACTTGTCGCTGCCGCTGGC，本文指定为SEQ ID NO:18)测量小鼠DMPK RNA的量。结果以小鼠DMPK RNA相对于PBS对照的百分比呈现，相对于小鼠GAPDH(对照％)归一化。
表19用与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸减少hTFRKI/+敲入小鼠的小鼠DMPK RNA
血浆化学标志物
为了评估经修饰的寡核苷酸对肝和肾功能的影响，在将小鼠处死的当天(第22天)，使用自动临床化学分析仪(Hitachi Olympus AU400c，纽约州梅尔维尔(Melville,NY))测量白蛋白(ALB)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、血尿素氮(BUN)、总胆红素(TBIL)、总蛋白(PROT)、肌酸(CREAT)和肌酸激酶(CK)的血浆水平。对每个组的小鼠的结果取平均值并在下表中呈现。从另外的研究中排除导致肝或肾功能标志物中的任何肝或肾功能标志物的水平变化超出经修饰的寡核苷酸的预期范围的寡聚化合物。
表20hTFRKI/+敲入小鼠的血浆化学标志物
指示可用样品少于4个
血液学测定
在将小鼠处死的当天(第22天)将从小鼠获得的血液送至美国爱德士生物研究公司(IDEXX BioResearch)进行血细胞计数测量。进行计数包含红细胞(RBC)计数、白细胞(WBC)计数、血红蛋白(HGB)、血细胞比容(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)和平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)。评估单个白细胞计数，如单核细胞(MON)、嗜中性粒细胞(NEU)、淋巴细胞(LYM)、嗜酸性粒细胞(EOS)、嗜碱性粒细胞(BAS)、网织红细胞和血小板的计数。结果在下表中呈现。从另外的研究中排除导致血细胞计数变化超出预期范围的寡聚化合物。
表21hTFRKI/+敲入小鼠的血液学参数
指示可用样品少于4个
表22hTFRKI/+敲入小鼠的血细胞计数
指示可用样品少于4个
身体重量和器官重量
在第1天和第22天测量hTFRKI/+小鼠的体重，并且每个组的平均体重在下表中呈现。在将小鼠处死的当天(第22天)测量肝、肾和脾重量，并且每个组的平均器官重量在下表中呈现。从另外的研究中排除导致器官重量变化超出经修饰的寡核苷酸的预期范围的寡聚化合物。
表23身体重量和器官重量(以克为单位)
指示可用样品少于4个
实例7：hTFRKI/+敲入小鼠的与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸和与CD71双环配体缀合的经修饰的双链体寡核苷酸的活性和耐受性
对hTFRKI/+敲入小鼠测试了与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸的活性和耐受性(上文所描述的)。另外，测试了与靶向人CD71的OKT9抗体(BioXCell公司，目录号：BE0023)的Fab'片段缀合的第1468770号化合物(上文所描述的)的活性。
处理
将hTFRKI/+小鼠分成每组3只小鼠的组。每只小鼠以下表所指示的剂量接受总共3个剂量(第1天、第8天和第15天)的经缀合的经修饰的寡核苷酸的静脉内施用。一组3只小鼠以下表所指示的剂量接受总共3个剂量(第1天、第8天和第15天)的未经缀合的经修饰的寡核苷酸第486178号化合物的静脉内施用。一组4只小鼠接受PBS作为阴性对照。
RNA分析
在最终施用后四天(第19天)将小鼠处死，并从各种肌肉组织(包含四头肌(Quad)、胫骨前肌(TA)、膈膜(Diaphr)、三头肌、心脏、腓肠肌(gastroc))、主动脉、坐骨神经和肝组织中提取RNA，用于定量实时RTPCR分析，以使用小鼠引物探针组RTS3181测量小鼠DMPK RNA的量(上文所描述的)。结果以小鼠DMPK RNA相对于PBS对照的百分比呈现，相对于小鼠GAPDH(对照％)归一化。
表24用与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸减少hTFRKI/+敲入小鼠的小鼠DMPK RNA
指示可用样品少于3个
血浆化学标志物
为了评估经修饰的寡核苷酸对肝和肾功能的影响，在将小鼠处死的当天(第19天)，使用自动临床化学分析仪(Hitachi Olympus AU400c，纽约州梅尔维尔)测量白蛋白(ALB)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、血尿素氮(BUN)、总胆红素(TBIL)、总蛋白(PROT)、肌酸(CREAT)和肌酸激酶(CK)的血浆水平。对每个组的小鼠的结果取平均值并在下表中呈现。从另外的研究中排除导致肝或肾功能标志物中的任何肝或肾功能标志物的水平变化超出经修饰的寡核苷酸的预期范围的寡聚化合物。
表25hTFRKI/+敲入小鼠的血浆化学标志物
指示可用样品少于3个
血液学测定
在将小鼠处死的当天(第19天)将从小鼠获得的血液送至美国爱德士生物研究公司进行血细胞计数测量。进行计数包含红细胞(RBC)计数、白细胞(WBC)计数、血红蛋白(HGB)、血细胞比容(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)和平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)。评估单个白细胞计数，如单核细胞(MON)、嗜中性粒细胞(NEU)、淋巴细胞(LYM)、嗜酸性粒细胞(EOS)、嗜碱性粒细胞(BAS)、网织红细胞和血小板的计数。结果在下表中呈现。从另外的研究中排除导致血细胞计数变化超出预期范围的寡聚化合物。
表26hTFRKI/+敲入小鼠的血液学参数
指示可用样品少于3个
表27hTFRKI/+敲入小鼠的血细胞计数
指示可用样品少于3个
身体重量和器官重量
在第1天和第19天测量hTFRKI/+小鼠的体重，并且每个组的平均体重在下表中呈现。在将小鼠处死的当天(第19天)测量肝、肾和脾重量，并且每个组的平均器官重量在下表中呈现。从另外的研究中排除导致器官重量变化超出经修饰的寡核苷酸的预期范围的寡聚化合物。
表28身体重量和器官重量(以克为单位)
指示可用样品少于3个
实例8：hTFRKI/+敲入小鼠的与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸的活性和耐受性，多剂量
对hTFRKI/+敲入小鼠测试了与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸的活性和耐受性(上文所描述的)。另外，测试了与靶向人CD71的OKT9抗体(BioXCell公司，目录号：BE0023)的Fab'片段缀合的第1468770号化合物(上文所描述的)的活性和耐受性。
处理
将hTFRKI/+小鼠分成每组3-4只小鼠的组。每只小鼠以下表所指示的剂量接受总共3个剂量(第1天、第5天和第9天)的经缀合的经修饰的寡核苷酸的静脉内(i.v.)施用或皮下(s.c.)施用。一组3只小鼠以下表所指示的剂量接受总共3个剂量(第1天、第5天和第9天)的未经缀合的经修饰的寡核苷酸第486178号化合物的静脉内施用。一组4只小鼠接受PBS作为阴性对照。
RNA分析
在最终施用后六天(第15天)将小鼠处死，并从各种肌肉组织(包含四头肌(Quad)、胫骨前肌(TA)、膈膜、三头肌、心脏、腓肠肌(gastroc))、主动脉、坐骨神经和肝组织中提取RNA，用于定量实时RTPCR分析，以使用小鼠引物探针组RTS3181测量小鼠DMPK RNA的量(上文所描述的)。结果以小鼠DMPK RNA相对于PBS对照的百分比呈现，相对于小鼠GAPDH(对照％)归一化。
表29用与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸减少hTFRKI/+敲入小鼠的小鼠DMPK RNA
表30用与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸减少hTFRKI/+敲入小鼠的小鼠DMPK RNA
血浆化学标志物
为了评估经修饰的寡核苷酸对肝和肾功能的影响，在将小鼠处死的当天(第15天)，使用自动临床化学分析仪(Hitachi Olympus AU400c，纽约州梅尔维尔)测量白蛋白(ALB)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、血尿素氮(BUN)、总胆红素(TBIL)、总蛋白(PROT)、肌酸(CREAT)和肌酸激酶(CK)的血浆水平。对每个组的小鼠的结果取平均值并在下表中呈现。从另外的研究中排除导致肝或肾功能标志物中的任何肝或肾功能标志物的水平变化超出经修饰的寡核苷酸的预期范围的寡聚化合物。
表31hTFRKI/+敲入小鼠的血浆化学标志物
血液学测定
在将小鼠处死的当天(第15天)将从小鼠获得的血液送至美国爱德士生物研究公司进行血细胞计数测量。进行计数包含红细胞(RBC)计数、白细胞(WBC)计数、血红蛋白(HGB)、血细胞比容(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)和平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)。评估单个白细胞计数，如单核细胞(MON)、嗜中性粒细胞(NEU)、淋巴细胞(LYM)、嗜酸性粒细胞(EOS)、嗜碱性粒细胞(BAS)、网织红细胞和血小板的计数。结果在下表中呈现。从另外的研究中排除导致血细胞计数变化超出预期范围的寡聚化合物。
表32hTFRKI/+敲入小鼠的血液学参数
表33hTFRKI/+敲入小鼠的血细胞计数
身体重量和器官重量
在第1天和第15天测量hTFRKI/+小鼠的体重，并且每个组的平均体重在下表中呈现。在将小鼠处死的当天(第15天)测量肝、肾和脾重量，并且每个组的平均器官重量在下表中呈现。从另外的研究中排除导致器官重量变化超出经修饰的寡核苷酸的预期范围的寡聚化合物。
表34身体重量和器官重量(以克为单位)
实例9：hTFRKI/+敲入小鼠的与CD71双环配体缀合的RNAi化合物的活性和耐受性
对hTFRKI/+敲入小鼠测试了与CD71双环配体缀合的RNAi化合物的活性和耐受性(上文所描述的)。另外，测试了与靶向人CD71的OKT9抗体(BioXCell公司，目录号：BE0023)的Fab'片段缀合的第1468770号化合物(上文所描述的)的活性和耐受性。
处理
将hTFRKI/+小鼠分成每组3只小鼠的组。每只小鼠以下表所指示的剂量接受总共3个剂量(第1天、第8天和第15天)的RNAi化合物的寡核苷酸的静脉内施用。一组4只小鼠接受PBS作为阴性对照。
RNA分析
在最终施用后四天(第19天)将小鼠处死，并从各种肌肉组织(包含四头肌(Quad)、胫骨前肌(TA)、膈膜(Dia.)、三头肌、心脏、腓肠肌(gastroc))、主动脉和肝组织中提取RNA，用于定量实时RTPCR分析，以使用小鼠引物探针组RTS43125(正向序列CTCCTCAGACCGCTTTTTGC，本文指定为SEQ ID NO:19；反向序列TAACCTGGTTCATCATCGCTAATC，本文指定为SEQ ID NO:20；探针序列CCGTCATGCCGACCCGCAGT，本文指定为SEQ ID NO:21)测量小鼠HPRT RNA的量。结果以小鼠HPRT RNA相对于PBS对照的百分比呈现，相对于小鼠GAPDH(对照％)归一化。
表35用与CD71双环配体缀合的RNAi化合物减少hTFRKI/+敲入小鼠的小鼠HPRT RNA
血浆化学标志物
为了评估经修饰的寡核苷酸对肝和肾功能的影响，在将小鼠处死的当天(第19天)，使用自动临床化学分析仪(Hitachi Olympus AU400c，纽约州梅尔维尔)测量白蛋白(ALB)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、血尿素氮(BUN)、总胆红素(TBIL)、总蛋白(PROT)、肌酸(CREAT)和肌酸激酶(CK)的血浆水平。对每个组的小鼠的结果取平均值并在下表中呈现。从另外的研究中排除导致肝或肾功能标志物中的任何肝或肾功能标志物的水平变化超出经修饰的寡核苷酸的预期范围的寡聚化合物。
表36hTFRKI/+敲入小鼠的血浆化学标志物
血液学测定
在将小鼠处死的当天(第19天)将从小鼠获得的血液送至美国爱德士生物研究公司进行血细胞计数测量。进行计数包含红细胞(RBC)计数、白细胞(WBC)计数、血红蛋白(HGB)、血细胞比容(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)和平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)。评估单个白细胞计数，如单核细胞(MON)、嗜中性粒细胞(NEU)、淋巴细胞(LYM)、嗜酸性粒细胞(EOS)、嗜碱性粒细胞(BAS)、网织红细胞和血小板的计数。结果在下表中呈现。从另外的研究中排除导致血细胞计数变化超出预期范围的寡聚化合物。
表37hTFRKI/+敲入小鼠的血液学参数
表38hTFRKI/+敲入小鼠的血细胞计数
身体重量和器官重量
在第1天和第19天测量hTFRKI/+小鼠的体重，并且每个组的平均体重在下表中呈现。在将小鼠处死的当天(第19天)测量肝、肾和脾重量，并且每个组的平均器官重量在下表中呈现。从另外的研究中排除导致器官重量变化超出经修饰的寡核苷酸的预期范围的寡聚化合物。
表39身体重量和器官重量(以克为单位)
实例10：具有各种接头化学的hTFRKI/+敲入小鼠的与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸的设计、活性和耐受性
对hTFRKI/+敲入小鼠测试了与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸的活性和耐受性(上文所描述的)。用C末端延伸设计几个CD71双环配体，以增加寡核苷酸与双环配体的多肽环路之间的距离，如下表所指示的。
表40：双环配体
[PEG10]表示乙二醇的十个重复序列；[PEG24]表示乙二醇的24个重复序列，并且Biv表示根据以下结构的二价接头，所述二价接头附接到两个多肽：
二价接头
处理
将hTFRKI/+小鼠分成每组4只小鼠的组。每只小鼠以下表所指示的剂量接受总共3个剂量(第1天、第8天和第15天)的经缀合的经修饰的寡核苷酸的静脉内施用。一组4只小鼠以下表所指示的剂量接受总共3个剂量(第1天、第8天和第15天)的未经缀合的经修饰的寡核苷酸第486178号化合物的静脉内施用。一组4只小鼠接受PBS作为阴性对照。
RNA分析
在最终施用后7天(第22天)将小鼠处死，并从各种肌肉组织(包含四头肌(Quad)、胫骨前肌(TA)、膈膜(Diaphr)、心脏、腓肠肌(gastroc))、主动脉、坐骨神经和肝组织中提取RNA，用于定量实时RTPCR分析，以使用小鼠引物探针组RTS3181测量小鼠DMPK RNA的量(上文所描述的)。结果以小鼠DMPK RNA相对于PBS对照的百分比呈现，相对于小鼠GAPDH(对照％)归一化。
表41用与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸减少hTFRKI/+敲入小鼠的小鼠DMPK RNA
体重
在第1天和第22天测量hTFRKI/+小鼠的体重，并且每个组的平均体重在下表中呈现。
表42体重(以克为单位)
实例11：hTFRKI/+敲入小鼠的与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸的活性，单剂量
对杂合hTFRKI/+敲入小鼠测试了与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸的活性(上文所描述的)。
处理
将hTFRKI/+小鼠分成每组4只小鼠的组。每只小鼠接受总共3个剂量(第1天、第8天和第15天)的3.5mg/kg的经缀合的经修饰的寡核苷酸的静脉内(i.v.)施用。一组4只小鼠接受总共3个剂量(第1天、第8天和第15天)的35mg/kg的未经缀合的经修饰的寡核苷酸第486178号化合物的静脉内施用。一组4只小鼠接受PBS作为阴性对照。
RNA分析
在最终施用后一周(第22天)将小鼠处死，并从包含四头肌(quad)、胫骨前肌(TA)、腓肠肌(gastroc)、心脏和膈膜、肝组织和坐骨神经的各种肌肉组织中提取RNA，用于定量实时RTPCR分析，以使用小鼠引物探针组RTS3181测量小鼠DMPK RNA的量(上文所描述的)。小鼠DMPK RNA水平相对于小鼠GAPDH归一化。使用小鼠引物探针组mGapdh_LTS00102扩增小鼠GAPDH(上文所描述的)。结果以小鼠DMPK RNA相对于PBS处理的对照动物中的小鼠DMPK RNA的量的百分比呈现，相对于小鼠GAPDH RNA(对照％)归一化。
表43用与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸减少hTFRKI/+敲入小鼠的小鼠DMPK RNA
体重
在第1天和第22天测量hTFRKI/+小鼠的体重，并且每个组的平均体重在下表中呈现。
表44体重(以克为单位)
实例12：hTFRKI/+敲入小鼠的与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸的活性，多剂量
对杂合hTFRKI/+敲入小鼠测试了与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸的活性和耐受性(上文所描述的)。
处理
将hTFRKI/+敲入小鼠分成每组3只小鼠的组。每只小鼠以下表所指示的剂量接受总共3个剂量(第1天、第8天和第15天)的第1590463-BCY17901号化合物的静脉内施用。一组3只小鼠接受总共3个剂量(第1天、第8天和第15天)的未经缀合的经修饰的寡核苷酸第486178号化合物的静脉内施用。一组4只小鼠接受PBS作为阴性对照。
RNA分析
在最终施用后一周(第22天)将小鼠处死，并从包含四头肌(quad)、腓肠肌(gastroc)和心脏的各种肌肉组织中提取RNA，用于定量实时RTPCR分析，以使用小鼠引物探针组RTS3181测量小鼠DMPK RNA的量(上文所描述的)。小鼠DMPK RNA水平相对于小鼠GAPDH归一化。使用小鼠引物探针组mGapdh_LTS00102扩增小鼠GAPDH(上文所描述的)。结果以小鼠DMPK RNA相对于PBS处理的对照动物中的小鼠DMPK RNA的量的百分比呈现，相对于小鼠GAPDH RNA(对照％)归一化。ED50值在GraphPad Prism中使用具有可变希尔斜率(四参数)的非线性拟合进行计算，Y＝底部+(顶部-底部)/(1+(10^logEC50/X)^斜率)，具有以下约束条件：顶部＝100，底部＝0，斜率<-1。
表45用与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸减少hTFRKI/+敲入小鼠的小鼠DMPK RNA
指示可用样品少于3个
体重
在第1天和第22天测量hTFRKI/+小鼠的体重，并且每个组的平均体重在下表中呈现。
表46体重(以克为单位)
实例13：纯合hTFRKI/KI敲入小鼠的与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸的活性，多剂量
对纯合hTFRKI/KI敲入小鼠测试了与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸的活性和耐受性。
根据NCBI转录物NM_001128148.2，这些研究中使用的人转铁蛋白受体(hTFR)/CD71敲入小鼠的小鼠外显子2的编码区以及小鼠内含子2的剪接供体位点被人TFR开放阅读框替代。转铁蛋白受体基因的人源化通过CRISPR/Cas-9介导的基因编辑完成，允许产生具有人源化转铁蛋白受体基因的组成型表达的模型。靶向策略基于NCBI转录物NM_011638.4(小鼠)和NM_001128148.2(人)。将允许表达Cas9 mRNA、特异性gRNA和嘌呤霉素抗性盒的质粒；以及含小鼠转铁蛋白受体基因的同源区、FRT位点和替代的人区的质粒共转染到泰康利生物科学公司C57BL/6N Tac ES细胞系中。纯合人源化小鼠在本文中被称为hTFRKI/KI敲入小鼠。所述小鼠在内源性小鼠启动子的控制下表达两个拷贝的人源化TFR基因。
处理
将hTFRKI/KI敲入小鼠分成每组3只小鼠的组。每只小鼠以下表所指示的剂量接受总共3个剂量(第1天、第8天和第15天)的第1590463-BCY17901号化合物的静脉内施用。一组3只小鼠接受总共3个剂量(第1天、第8天和第15天)的未经缀合的经修饰的寡核苷酸第486178号化合物的静脉内施用。一组4只小鼠接受PBS作为阴性对照。
RNA分析
在最终施用后一周(第22天)将小鼠处死，并从包含四头肌(quad)、腓肠肌(gastroc)和心脏的各种肌肉组织中提取RNA，用于定量实时RTPCR分析，以使用小鼠引物探针组RTS3181测量小鼠DMPK RNA的量(上文所描述的)。小鼠DMPK RNA水平相对于小鼠GAPDH归一化。使用小鼠引物探针组mGapdh_LTS00102扩增小鼠GAPDH(上文所描述的)。结果以小鼠DMPK RNA相对于PBS处理的对照动物中的小鼠DMPK RNA的量的百分比呈现(如下表所指示的)，相对于小鼠GAPDH RNA(对照％)归一化。ED50值在GraphPad Prism中使用具有可变希尔斜率(四参数)的非线性拟合进行计算，Y＝底部+(顶部-底部)/(1+(10^logEC50/X)^斜率)，具有以下约束条件：顶部＝100，底部＝0，斜率<-1。
表47
用与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸、相对于PBS组的数据减少hTFRKI/KI敲入小鼠的小鼠DMPK RNA
血浆化学标志物
为了评估经修饰的寡核苷酸对肝和肾功能的影响，在将小鼠处死的当天(第22天)，使用自动临床化学分析仪(Hitachi Olympus AU400c，纽约州梅尔维尔)测量白蛋白(ALB)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBIL)、总蛋白(PROT)、肌酸(CREAT)和肌酸激酶(CK)的血浆水平。对每个组的小鼠的结果取平均值并在下表中呈现。
表48hTFRKI/KI敲入小鼠的血浆化学标志物
血液学测定
在将小鼠处死的当天(第22天)将从小鼠获得的血液送至美国爱德士生物研究公司进行血细胞计数测量。进行计数包含红细胞(RBC)计数、白细胞(WBC)计数、血红蛋白(HGB)、血细胞比容(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)和平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)。评估单个白细胞计数，如单核细胞(MON)、嗜中性粒细胞(NEU)、淋巴细胞(LYM)、嗜酸性粒细胞(EOS)、嗜碱性粒细胞(BAS)和血小板(PLT)的计数。结果在下表中呈现。“N.D.”指示未确定的值。
表49hTFRKI/KI敲入小鼠的血液学参数
指示可用样品少于3个
表50
hTFRKI/KI敲入小鼠的血细胞计数
指示可用样品少于3个
身体重量和器官重量
在第1天和第22天测量hTFRKI/KI小鼠的体重，并且每个组的平均体重在下表中呈现。在将小鼠处死的当天(第22天)测量肝、肾和脾重量，并且每个组的平均器官重量在下表中呈现。
表51
身体重量和器官重量(以克为单位)
实例14：靶向DMPK的RNAi化合物的设计
设计并合成与小鼠DMPK互补的反义链修饰的寡核苷酸，如下表所指示的。
表52靶向小鼠DMPK的反义链修饰的寡核苷酸的设计
在上表中，“vP”表示5'膦酸乙烯酯部分，下标“f”表示2'-F修饰的核苷，下标“y”表示2'-OMe修饰的核苷，下标“e”表示2'MOE修饰的核苷，下标“s”表示硫代磷酸酯核苷间键，并且下标“o”表示磷酸二酯核苷间键。
有义寡核苷酸与反义寡核苷酸的21个核苷中的第一核苷互补(从5'至3')，其中反义寡核苷酸的最后两个3'-核苷不与有义寡核苷酸配对(是悬垂核苷)。经修饰的寡核苷酸第1652967号化合物与BCY17901缀合，如上文所描述的。
表53靶向小鼠DMPK的有义链修饰的寡核苷酸的设计
在上表中，下标“f”表示2'-F修饰的核苷，下标“y”表示2'-OMe修饰的核苷酸，下标“s”表示硫代磷酸酯核苷间键，下标“o”表示磷酸二酯核苷间键，“[3nC7]”表示3'-C7氨基修饰体，“[BCN]”指示(双环[6.1.0]壬炔)-甲酰基接头，并且“[马来酰亚胺C3酰基]”指示马来酰亚胺基丙酰基接头。
表54
与双环配体缀合的有义链修饰的寡核苷酸的设计
经缀合的化合物编号 未经缀合的化合物编号 配体
1678385 1652967 BCY17901
表55
靶向人/小鼠DMPK的RNAi化合物的设计
双链体化合物编号 反义链化合物编号 有义链化合物编号
1653456:1547300 1653456 1547300
1653456:1678385 1653456 1678385
实例15：hTFRKI/+敲入小鼠的与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸的活性，多剂量
对杂合hTFRKI/+敲入小鼠测试了与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸的活性和耐受性(上文所描述的)。
处理
将hTFRKI/+敲入小鼠分成每组3只小鼠的组。每只小鼠以下表所指示的剂量接受总共3个剂量(第1天、第8天和第15天)的化合物1590463-BCY17901的静脉内施用。一组3只小鼠接受总共3个剂量(第1天、第8天和第15天)的未经缀合的经修饰的寡核苷酸第486178号化合物的静脉内施用。一组4只小鼠接受PBS作为阴性对照。
RNA分析
在最终施用后一周(第22天)将小鼠处死，并从包含四头肌(quad)、腓肠肌(gastroc)、心脏和膈膜和肝组织的各种肌肉组织中提取RNA，用于定量实时RTPCR分析，以使用小鼠引物探针组RTS3181测量小鼠DMPK RNA的量(上文所描述的)。小鼠DMPK RNA水平相对于小鼠GAPDH归一化。使用小鼠引物探针组mGapdh_LTS00102扩增小鼠GAPDH(上文所描述的)。结果以小鼠DMPK RNA相对于PBS处理的对照动物中的小鼠DMPK RNA的量的百分比呈现，相对于小鼠GAPDH RNA(对照％)归一化。ED50值在GraphPad Prism中使用具有可变希尔斜率(四参数)的非线性拟合进行计算，Y＝底部+(顶部-底部)/(1+(10^logEC50/X)^斜率)，具有以下约束条件：顶部＝100，底部＝0，斜率<-1。
表56用与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸减少hTFRKI/+敲入小鼠的小鼠DMPK RNA
表57用与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸减少hTFRKI/+敲入小鼠的小鼠DMPK RNA
血浆化学标志物
为了评估经修饰的寡核苷酸对肝和肾功能的影响，在将小鼠处死的当天(第22天)，使用自动临床化学分析仪(Hitachi Olympus AU400c，纽约州梅尔维尔)测量白蛋白(ALB)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBIL)、血尿素氮(BUN)、总蛋白(PROT)、肌酸(CREAT)和肌酸激酶(CK)的血浆水平。对每个组的小鼠的结果取平均值并在下表中呈现。
表58hTFRKI/+敲入小鼠的血浆化学标志物
血液学测定
在将小鼠处死的当天(第22天)将从小鼠获得的血液送至美国爱德士生物研究公司进行血细胞计数测量。进行计数包含红细胞(RBC)计数、白细胞(WBC)计数、血红蛋白(HGB)、血细胞比容(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)和平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)。评估单个白细胞计数，如单核细胞(MON)、嗜中性粒细胞(NEU)、淋巴细胞(LYM)、嗜酸性粒细胞(EOS)、嗜碱性粒细胞(BAS)和血小板(PLT)的计数。结果在下表中呈现。
表59hTFRKI/+敲入小鼠的血液学参数
表60hTFRKI/+敲入小鼠的血细胞计数
体重
在第1天和第22天测量hTFRKI/+小鼠的体重，并且每个组的平均体重在下表中呈现。
表61体重(以克为单位)
实例16：hTFRKI/+敲入小鼠的与CD71双环配体缀合的RNAi化合物的活性，多剂量
对杂合hTFRKI/+敲入小鼠测试了与CD71双环配体缀合的RNAi第1653456:1547300号化合物的活性(上文所描述的)。另外，测试了与靶向人CD71的OKT9抗体(BioXCell公司，目录号：BE0023)的Fab'片段缀合的第1653456:1547300号化合物(上文所描述的)的活性。
处理
将hTFRKI/+敲入小鼠分成每组3-4只小鼠的组。一组3只小鼠接受总共3个剂量(第1天、第8天和第15天)的经缀合的RNAi第1653456:1547300-OKT9号化合物Fab的静脉内施用。一组3只小鼠以下表所指示的剂量接受总共3个剂量(第1天、第8天和第15天)的经缀合的RNAi化合物1653456:1678385的静脉内施用。一组4只小鼠以10mg/kg接受总共3个剂量(第1天、第8天和第15天)的经缀合的RNAi化合物1653456:1678385的皮下施用。一组4只小鼠接受PBS作为阴性对照。
RNA分析
在最终施用后一周(第22天)将小鼠处死，并从包含四头肌(quad)、腓肠肌(gastroc)、心脏和膈膜和肝组织的各种肌肉组织中提取RNA，用于定量实时RTPCR分析，以使用小鼠引物探针组RTS3181测量小鼠DMPK RNA的量(上文所描述的)。小鼠DMPK RNA水平相对于小鼠GAPDH归一化。使用小鼠引物探针组mGapdh_LTS00102扩增小鼠GAPDH(上文所描述的)。结果以小鼠DMPK RNA相对于PBS处理的对照动物中的小鼠DMPK RNA的量的百分比呈现，相对于小鼠GAPDH RNA(对照％)归一化。ED50值在GraphPad Prism中使用具有可变希尔斜率(四参数)的非线性拟合进行计算，Y＝底部+(顶部-底部)/(1+(10^logEC50/X)^斜率)，具有以下约束条件：顶部＝100，底部＝0，斜率<-1。“N.C.”指示未计算的值。
表62用与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸减少hTFRKI/+敲入小鼠的小鼠DMPK RNA
表63用与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸减少hTFRKI/+敲入小鼠的小鼠DMPK RNA
血浆化学标志物
为了评估经修饰的寡核苷酸对肝和肾功能的影响，在将小鼠处死的当天(第22天)，使用自动临床化学分析仪(Hitachi Olympus AU400c，纽约州梅尔维尔)测量白蛋白(ALB)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBIL)、血尿素氮(BUN)、总蛋白(PROT)、肌酸(CREAT)和肌酸激酶(CK)的血浆水平。对每个组的小鼠的结果取平均值并在下表中呈现。
表64hTFRKI/+敲入小鼠的血浆化学标志物
血液学测定
在将小鼠处死的当天(第22天)将从小鼠获得的血液送至美国爱德士生物研究公司进行血细胞计数测量。进行计数包含红细胞(RBC)计数、白细胞(WBC)计数、血红蛋白(HGB)、血细胞比容(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)和平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)。评估单个白细胞计数，如单核细胞(MON)、嗜中性粒细胞(NEU)、淋巴细胞(LYM)、嗜酸性粒细胞(EOS)、嗜碱性粒细胞(BAS)和血小板(PLT)的计数。结果在下表中呈现。
表65hTFRKI/+敲入小鼠的血液学参数
表66hTFRKI/+敲入小鼠的血细胞计数
体重
在第1天和第22天测量hTFRKI/+小鼠的体重，并且每个组的平均体重在下表中呈现。
表67体重(以克为单位)
实例17：靶向与CD71双环配体缀合的DMPK的RNAi化合物的设计
设计并合成有义修饰的寡核苷酸，如下表所指示的。有义寡核苷酸与反义寡核苷酸第1653456号化合物(上文所描述的)的21个核苷(从5'至3')中的第一核苷互补，其中反义寡核苷酸的最后两个3'-核苷不与有义寡核苷酸配对(是悬垂核苷)。
表68靶向小鼠DMPK的有义链修饰的寡核苷酸的设计
在上表中，下标“f”表示2'-F修饰的核苷，下标“y”表示2'-OMe修饰的核苷酸，下标“s”表示硫代磷酸酯核苷间键，下标“o”表示磷酸二酯核苷间键，“[nC6o]”指示6-氨基己醇接头，并且“[BCN]”指示(双环[6.1.0]壬炔)-甲酰基接头。
经修饰的寡核苷酸第1709195号和第1590463号化合物进一步与BCY17901缀合，如下表所描述的。
表69与双环配体缀合的有义链修饰的寡核苷酸的设计
表70
靶向人/小鼠DMPK的RNAi化合物的设计
双链体化合物编号 反义链化合物编号 有义链化合物编号
1710872 1653456 1709196
1678710 1653456 1678385
实例18：杂合hTFRKI/+敲入小鼠的与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸的活性，多剂量
对杂合hTFRKI/+敲入小鼠测试了与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸的活性和耐受性(上文所描述的)。
处理
将hTFRKI/+敲入小鼠分成每组3只小鼠的组。每只小鼠以下表所指示的剂量接受总共3个剂量(第1天、第8天和第15天)的经缀合的经修饰的寡核苷酸的静脉内(i.v.)施用或皮下(s.c.)施用。一组3只小鼠接受总共3个剂量(第1天、第8天和第15天)的未经缀合的经修饰的寡核苷酸第486178号化合物的皮下施用。一组4只小鼠接受PBS作为阴性对照。
RNA分析
在最终施用后一周(第22天)将小鼠处死，并从各种肌肉组织(包含四头肌(quad)、腓肠肌(gastroc)、心脏、肝)中提取RNA，用于定量实时RTPCR分析，以使用小鼠引物探针组RTS3181测量小鼠DMPK RNA的量(上文所描述的)。小鼠DMPK RNA水平相对于小鼠GAPDH归一化。使用小鼠引物探针组mGapdh_LTS00102扩增小鼠GAPDH(上文所描述的)。结果以小鼠DMPK RNA相对于PBS处理的对照动物中的小鼠DMPK的量的百分比呈现，相对于小鼠GAPDHRNA(对照％)归一化。ED50值在GraphPad Prism中使用具有可变希尔斜率(四参数)的非线性拟合进行计算，Y＝底部+(顶部-底部)/(1+(10^logEC50/X)^斜率)，具有以下约束条件：顶部＝100，底部＝0，斜率<-1。
表71
用与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸减少hTFRKI/+敲入小鼠的小鼠DMPKRNA
表72
用与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸减少hTFRKI/+敲入小鼠的小鼠DMPKRNA
体重
在第1天和第22天测量hTFRKI/+小鼠的体重，并且每个组的平均体重在下表中呈现。
表73
体重(以克为单位)
实例19：杂合hTFRKI/+敲入小鼠的与CD71双环配体缀合的RNAi化合物的活性和耐受性，多剂量
对杂合hTFRKI/+敲入小鼠测试了与CD71双环配体缀合的RNAi化合物的活性和耐受性(上文所描述的)。
处理
将hTFRKI/+敲入小鼠分成每组3只小鼠的组。每只小鼠以下表所指示的剂量接受总共3个剂量(第1天、第8天和第15天)的经缀合的RNAi化合物的静脉内(i.v.)施用或皮下(s.c.)施用。一组4只小鼠接受PBS作为阴性对照。
RNA分析
在最终施用后一周(第22天)将小鼠处死，并从各种肌肉组织(包含四头肌(quad)、腓肠肌(gastroc)、心脏、肝)中提取RNA，用于定量实时RTPCR分析，以使用小鼠引物探针组RTS3181测量小鼠DMPK RNA的量(上文所描述的)。小鼠DMPK RNA水平相对于小鼠GAPDH归一化。使用小鼠引物探针组mGapdh_LTS00102扩增小鼠GAPDH(上文所描述的)。结果以小鼠DMPK RNA相对于PBS处理的对照动物中的小鼠DMPK的量的百分比呈现，相对于小鼠GAPDHRNA(对照％)归一化。ED50值在GraphPad Prism中使用具有可变希尔斜率(四参数)的非线性拟合进行计算，Y＝底部+(顶部-底部)/(1+(10^logEC50/X)^斜率)，具有以下约束条件：顶部＝100，底部＝0，斜率<-1。
表74用与CD71双环配体缀合的RNAi化合物减少hTFRKI/+敲入小鼠的小鼠DMPK RNA
指示可用样品少于3个
表75用与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸减少hTFRKI/+敲入小鼠的小鼠DMPK RNA
血浆化学标志物
为了评估经修饰的寡核苷酸对肝和肾功能的影响，在将小鼠处死的当天(第18天)，使用自动临床化学分析仪(Hitachi Olympus AU400c，纽约州梅尔维尔)测量白蛋白(ALB)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBIL)、总蛋白(PROT)、肌酸(CREAT)、铁和肌酸激酶(CK)的血浆水平。对每个组的小鼠的结果取平均值并在下表中呈现。
表76hTFRKI/+敲入小鼠的血浆化学标志物
身体重量和器官重量
在第1天和第22天测量hTFRKI/+小鼠的体重，并且每个组的平均体重在下表中呈现。在将小鼠处死的当天(第22天)测量肝、肾和脾重量，并且每个组的平均器官重量在下表中呈现。“N.D.”指示未确定的值。
表77身体重量和器官重量(以克为单位)
实例20：靶向与CD71双环配体缀合的MALAT的经修饰的寡核苷酸的设计
设计并合成与小鼠MALAT互补的经修饰的寡核苷酸(如下表所指示的)。对下表中的化合物在5'端上进行修饰，以允许与双环配体缀合。
表78
与小鼠MALAT互补的经修饰的寡核苷酸的设计
在上表中，下标“k”表示cEt核苷，下标“d”表示立体标准DNA核苷，下标“s”指示硫代磷酸酯核苷间键，下标“o”指示磷酸二酯核苷间键，C前面的上标“m”表示5-甲基胞嘧啶，“[nC6o]”指示6-氨基己醇接头，并且“[BCN]”指示(双环[6.1.0]壬炔)-甲酰基接头。
经修饰的寡核苷酸进一步与BCY17901缀合，如下表所描述的。
表79
与双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸的设计
经缀合的化合物编号 未经缀合的化合物编号 配体
1694082 1694083 BCY17901
实例21：靶向与CD71双环配体缀合的HPRT的RNAi化合物的设计
设计并合成与小鼠HPRT互补的反义链修饰的寡核苷酸，如下表所指示的。
表80靶向人/小鼠HPRT1的反义链修饰的寡核苷酸的设计
在上表中，“vP”表示5'膦酸乙烯酯部分，下标“f”表示2'-F修饰的核苷，下标“y”表示2'-OMe修饰的核苷，下标“e”表示2'MOE修饰的核苷，下标“s”表示硫代磷酸酯核苷间键，并且下标“o”表示磷酸二酯核苷间键。
设计并合成有义修饰的寡核苷酸，如下表所指示的。有义寡核苷酸与反义寡核苷酸的21个核苷(从5'至3')中的第一核苷互补，其中反义寡核苷酸的最后两个3'-核苷不与有义寡核苷酸配对(是悬垂核苷)。对有义修饰的寡核苷酸在3'端上进行修饰，以允许与双环配体缀合。
表81靶向小鼠HPRT的有义链修饰的寡核苷酸的设计
在上表中，下标“f”表示2'-F修饰的核苷，下标“y”表示2'-OMe修饰的核苷酸，下标“s”表示硫代磷酸酯核苷间键，下标“o”表示磷酸二酯核苷间键，“[BCN]”指示(双环[6.1.0]壬炔)-甲酰基接头，并且“[3nC7]”表示具有以下结构的3'-C7氨基修饰体：
有义修饰的寡核苷酸化合物1653454进一步与BCY17901缀合，如下表所描述的。
表82与双环配体缀合的有义链修饰的寡核苷酸的设计
表83
靶向小鼠HPRT的RNAi化合物的设计
双链体化合物编号 反义链化合物编号 有义链化合物编号
1694595 1586322 1694090
实例22：包括CD71双环配体的寡聚物药剂对食蟹猴的影响
用选自上述实例中描述的研究的与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸或与CD71双环配体缀合的RNAi化合物处理食蟹猴。
处理
在研究之前，将猴隔离，期间每天观察动物的总体健康状况。猴年龄为2-4岁并且体重为2-4kg。将雌性食蟹猴分成4组，每组3只猴。每只猴通过经皮放置的导管接受经缀合的经修饰的寡核苷酸或经缀合的RNAi化合物的静脉内(i.v.)输注(1小时)。在每次给药之前放置新的无菌留置导管。对猴以25mg/kg每周给药一次10mL/kg，总共3个剂量(第1天、第8天、第15天)。
在研究时段期间，每天至少观察一次猴是否有疾病或痛苦的迹象。在与研究负责人协商之后，兽医工作人员使用经批准的止痛剂或药剂对由于治疗、损伤或疾病而经历不止短暂或轻微疼痛或痛苦的任何动物进行了治疗。任何健康状况不佳或可能处于濒死状态的动物被鉴定进行另外的监测，并可能在参加兽医咨询后尽快实施安乐死。在第28天(最后一次给药之后大约13天)通过在深度麻醉下同时放血对动物实施预定的安乐死。实例中描述的方案得到机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and UseCommittee，IACUC)的批准。
RNA分析
为了评估经缀合的经修饰的寡核苷酸或经缀合的RNAi化合物对靶RNA表达水平的影响，从所有动物收集骨骼肌组织(四头肌(quad)、腓肠肌(gastroc)、胫骨前肌(TA)、膈膜、比目鱼肌)和心脏组织的横截面切片。从所有研究动物收集大约8mm2或300mg的肝组织，并放置到2mL螺旋盖试管(150mg x 2试管)中。
在最终施用后两周(第28天)将猴处死，并从肌肉组织(包含四头肌(quad)、膈膜、比目鱼肌、胫骨前肌(TA)、腓肠肌(gastroc)、心脏)和肝中提取RNA，用于定量实时RTPCR分析以测量靶RNA的量。
使用NHP引物探针组MALAT1_LTS01104(正向序列AAGGAGTGTACCGCTGTACTGTTG，本文指定为SEQ ID NO:247；反向序列CCAAAGCTGCACTGTGCTGTA，本文指定为SEQ ID NO:248；探针序列ACACCTTCAGGGACTGGAGCTGCTTTTATC，本文指定为SEQ ID NO:249)测量MALAT RNA水平。猴MALAT RNA水平相对于总RNA含量归一化，如通过所测量的。结果以猴MALAT RNA相对于未用MALAT靶向缀合的经修饰的寡核苷酸处理的所有组中的猴MALATRNA的量的百分比呈现。使用NHP引物探针组DMPK_RTS4447(正向序列AGCCTGAGCCGGGAGATG，本文指定为SEQ ID NO:250；反向序列GCGTAGTTGACTGGCAAAGTT，本文指定为SEQ ID NO:251；探针序列AGGCCATCCGCATGGCCAACC，本文指定为SEQ ID NO:252)测量DMPK RNA水平。猴DMPK RNA水平相对于总RNA含量归一化，如通过所测量的。结果以猴DMPKRNA相对于未用DMPK靶向缀合的经修饰的寡核苷酸或经缀合的RNAi化合物处理的所有组中的猴DMPK RNA的量的百分比呈现。使用NHP引物探针组Rh02800695_m1(赛默飞世公司)测量HPRT RNA水平。猴HPRT RNA水平相对于总RNA含量归一化，如通过所测量的。结果以猴HPRT RNA相对于未用HPRT靶向缀合的RNAi化合物处理的所有组中的猴HPRTRNA的量的百分比呈现。
表84
用包括CD71双环配体的寡聚物药剂减少食蟹猴的靶RNA
实例23：靶向与CD71双环配体缀合的DMPK的经修饰的寡核苷酸的设计
设计并合成与小鼠DMPK互补的经修饰的寡核苷酸(如下表所指示的)。对下表中的化合物在5'端上进行修饰，以允许与双环配体缀合。
表85
与小鼠DMPK互补的经修饰的寡核苷酸的设计
在上表中，下标“k”表示cEt核苷，下标“d”表示立体标准DNA核苷，下标“z”表示甲磺酰基氨基磷酸酯核苷间键，下标“s”指示硫代磷酸酯核苷间键，下标“o”指示磷酸二酯核苷间键，C前面的上标“m”表示5-甲基胞嘧啶，“[nC6o]”指示6-氨基己醇接头，并且“[BCN]”指示(双环[6.1.0]壬炔)-甲酰基接头。
经修饰的寡核苷酸进一步与BCY17901缀合，如下表所描述的。
表86
与双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸的设计
经缀合的化合物编号 未经缀合的化合物编号 配体
1731582 1730822 BCY17901
1731583 1730823 BCY17901
1731584 1730824 BCY17901
实例24：杂合hTFRKI/+敲入小鼠的与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸的活性
对杂合hTFRKI/+敲入小鼠测试了与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸的活性和耐受性(上文所描述的)。
处理
将hTFRKI/+敲入小鼠分成每组4只小鼠的组。每只小鼠接受总共3个剂量(第1天、第8天和第15天)的3.5mg/kg经缀合的经修饰的寡核苷酸的静脉内(i.v.)施用或皮下(s.c.)施用，如下表所指示的。一组4只小鼠接受PBS作为阴性对照。
RNA分析
在最终施用后一周，在第22天将小鼠处死，用于经缀合的经修饰的寡核苷酸组。从各种肌肉组织(包含四头肌(quad)和腓肠肌(gastric))中提取RNA，用于定量实时RTPCR分析，以使用小鼠引物探针组RTS3181测量小鼠DMPK RNA的量(上文所描述的)。小鼠DMPK RNA水平相对于小鼠GAPDH归一化。使用小鼠引物探针组mGapdh_LTS00102扩增小鼠GAPDH(上文所描述的)。结果以小鼠DMPK RNA相对于s.c-PBS处理的对照动物中的小鼠DMPK的量的百分比呈现，相对于小鼠GAPDH RNA(对照％)归一化。
表89
用与CD71双环配体缀合的经修饰的寡核苷酸减少hTFRKI/+敲入小鼠的小鼠DMPKRNA
实例25：与CD71双环配体缀合的RNAi化合物的设计和活性
表90：双环配体
双环配体ID 序列(N至C) N末端修饰 SEQ ID NO:
BCY21757 CP[HyP]DAYLGC[tBuGly]SYCEPWK 乙酰基 245
BCY21758 CP[HyP]DAYLGC[tBuGly]SYCEPWC 乙酰基 246
设计了各种有义修饰的寡核苷酸。有义寡核苷酸与反义寡核苷酸的21个核苷(从5'至3')中的第一核苷互补，其中反义寡核苷酸的最后两个3'-核苷不与有义寡核苷酸配对(是悬垂核苷)。有义修饰的寡核苷酸在5'端上与双环配体缀合，以形成以下缀合物：
表91：与各种接头缀合
Y表示双环配体并且X表示由21个在5'端处缀合的连接的核酸组成的经修饰的寡核苷酸。
活性
对杂合hTFRKI/+敲入小鼠测试了与CD71双环配体缀合的RNAi化合物的活性(上文所描述的)。
处理
将hTFRKI/+敲入小鼠分成每组2-4只小鼠的组。每只小鼠接受经缀合的经修饰的寡核苷酸或经缀合的RNAi化合物的单次静脉内(i.v.)施用或皮下(s.c.)施用。一组4只小鼠接受PBS作为阴性对照。
RNA分析
施用后一周将小鼠处死。从各种肌肉组织(包含四头肌(quad)、腓肠肌(gastroc)、心脏、肝)中提取RNA，用于定量实时RTPCR分析以测量小鼠靶RNA的量。小鼠靶RNA水平相对于小鼠GAPDH归一化。使用小鼠引物探针组mGapdh_LTS00102扩增小鼠GAPDH(上文所描述的)。

Claims (129)

1.一种寡聚化合物，其包括经修饰的寡核苷酸和缀合物基团，其中所述经修饰的寡核苷酸由10个至300个连接的核苷组成，并且所述缀合物基团包括双环配体和缀合物接头，其中
所述双环配体包括由13-22个连接的氨基酸或氨基酸模拟物组成的多肽和分子支架，其中
所述多肽的第一氨基酸、第二氨基酸和第三氨基酸中的每一个都包括反应性基团，所述反应性基团中的每个反应性基团单独地与所述分子支架形成键，由此形成两个附接到所述分子支架的多肽环路；并且
其中所述双环配体的一部分与1型转铁蛋白受体结合；并且
其中所述经修饰的寡核苷酸通过所述缀合物接头与所述双环配体共价连接。
2.根据权利要求1所述的寡聚化合物，其中所述缀合物基团由所述双环配体和缀合物接头组成。
3.根据权利要求1或2所述的寡聚化合物，其中所述寡聚化合物由所述经修饰的寡核苷酸和所述缀合物基团组成。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的寡聚化合物，其中三个反应性基团各自是半胱氨酸的硫醇。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的寡聚化合物，其中所述多肽从N末端到C末端具有下式：
[B]n-[Zi]-[J]m-[Zii]-[O]o-[Ziii]-[U]p，其中：
Zi、Zii和Ziii是包括反应性基团的所述第一氨基酸、所述第二氨基酸和所述第三氨基酸；
每个B、J、O和U是独立选择的氨基酸或氨基酸模拟物；
n是0至5；
m是3至7；
o是3至7；
p是0至5；
其中m+o的和小于12。
6.根据权利要求5所述的寡聚化合物，其中m是7，并且o是3。
7.根据权利要求5所述的寡聚化合物，其中m是2，并且o是9。
8.根据权利要求5所述的寡聚化合物，其中m和o两者是6。
9.根据权利要求5所述的寡聚化合物，其中m是3，并且o是8。
10.根据权利要求5至9中任一项所述的寡聚化合物，其中n是0。
11.根据权利要求5至9中任一项所述的寡聚化合物，其中n是3或4。
12.根据权利要求5至11中任一项所述的寡聚化合物，其中p是0。
13.根据权利要求5至11中任一项所述的寡聚化合物，其中p是3或4。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的寡聚化合物，其中所述多肽具有N末端修饰。
15.根据权利要求14所述的寡聚化合物，其中所述N末端修饰是乙酰基。
16.根据权利要求14所述的寡聚化合物，其中所述N末端修饰是叠氮基丙基。
17.根据权利要求1至13中任一项所述的寡聚化合物，其中所述多肽具有C末端修饰。
18.根据权利要求14所述的寡聚化合物，其中所述C末端修饰是酰胺基。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的寡聚化合物，其中所述缀合物接头附接到所述双环配体的N末端氨基酸。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的寡聚化合物，其中所述缀合物接头附接到所述双环配体的C末端氨基酸。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的寡聚化合物，其中所述缀合物接头在所述双环配体的所述多肽环路之一内附接到氨基酸的侧链。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的寡聚化合物，其中所述双环配体包括C末端延伸。
23.根据权利要求22所述的寡聚化合物，其中所述C末端延伸选自PEG10或PEG24。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的寡聚化合物，其中所述双环配体包括N末端延伸。
25.根据权利要求24所述的寡聚化合物，其中所述N末端延伸选自PEG10或PEG24。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的寡聚化合物，其中所述缀合物基团附接到所述经修饰的寡核苷酸的5'末端核苷。
27.根据权利要求26所述的寡聚化合物，其中所述缀合物基团附接到所述经修饰的寡核苷酸的所述5'末端核苷的5'位置。
28.根据权利要求1至25中任一项所述的寡聚化合物，其中所述缀合物基团附接到所述经修饰的寡核苷酸的3'末端核苷。
29.根据权利要求28所述的寡聚化合物，其中所述缀合物基团附接到所述经修饰的寡核苷酸的所述3'末端核苷的3'位置。
30.根据权利要求1至25中任一项所述的寡聚化合物，其中所述缀合物基团附接到所述经修饰的寡核苷酸的内部核苷。
31.根据权利要求1至25所述的寡聚化合物，其中所述缀合物基团通过经修饰的核苷间键附接。
32.根据权利要求28至30所述的寡聚化合物，其中所述缀合物基团通过2'修饰的呋喃糖基糖部分附接。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的寡聚化合物，其中所述双环配体具有与SEQ IDNO:26-27、36-56、58-65、67-76、79-88、90-152或192-246中任一项具有至少80％同一性的氨基酸序列。
34.根据权利要求33所述的寡聚化合物，其中所述双环配体具有与SEQ ID NO:26-27、36-56、58-65、67-76、79-88、90-152或192-246中任一项具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。
35.根据权利要求5至34中任一项所述的寡聚化合物，其中[Zi]-[J]m-[Zii]-[O]o-[Ziii]具有与SEQ ID NO 26-27、35-56、58-65、67-76、79-88、90-152或192-246中任一项具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。
36.根据权利要求5至35中任一项所述的寡聚化合物，其中[Zi]-[J]m-[Zii]-[O]o-[Ziii]具有CXXDXXXGCISYC(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列，其中每个“X”是独立选择的氨基酸。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的寡聚化合物，其中所述双环配体包括至少一个、至少两个或至少三个非天然氨基酸。
38.根据权利要求37所述的寡聚化合物，其中至少一个非天然氨基酸选自D-氨基酸、别异亮氨酸、2-氨基-3-乙基-戊酸、氨基异丁酸、氨基丁酸、氮杂环丁烷、7-氮杂色氨酸、6-叠氮基赖氨酸、β-环丁基丙氨酸、β-甲基异亮氨酸、4,4-联苯基丙氨酸、顺式-羟基脯氨酸、环丁基甘氨酸、环己基甘氨酸、环戊基丙氨酸、环戊基甘氨酸、2,6-二甲基酪氨酸、3,3-二苯基丙氨酸、4-反式-羟基-L-脯氨酸、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、N-甲基丙氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、N-甲基-色氨酸、哌啶酸、4-吡啶基丙氨酸、肌氨酸、叔丁基丙氨酸或3-叔丁基酪氨酸。
39.根据权利要求38所述的寡聚化合物，其中至少一个非天然氨基酸选自4-反式-羟基-L-脯氨酸、6-叠氮基赖氨酸和叔丁基甘氨酸。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的寡聚化合物，其中所述分子支架是1,1',1”-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三丙-2-烯-1-酮(TATA)。
41.根据权利要求1至39中任一项所述的寡聚化合物，其中所述分子支架是1,1',1”-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三(2-溴乙酮)(TATB)。
42.根据权利要求1至41中任一项所述的寡聚化合物，其中所述双环配体不抑制转铁蛋白与所述转铁蛋白受体的结合。
43.根据权利要求1至42中任一项所述的寡聚化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸的至少一个核苷包括经修饰的糖部分。
44.根据权利要求43所述的寡聚化合物，其中至少一个经修饰的糖部分包括双环状糖部分。
45.根据权利要求44所述的寡聚化合物，其中所述双环状糖部分包括选自以下的2'-4'桥：-O-CH2-；以及–O-CH(CH3)-。
46.根据权利要求43至45所述的寡聚化合物，其中至少一个经修饰的糖部分包括非双环状经修饰的糖部分。
47.根据权利要求46所述的寡聚化合物，其中所述非双环状经修饰的糖部分是2'-MOE糖部分或2'-OMe糖部分。
48.根据权利要求43至47中任一项所述的寡聚化合物，其中经修饰的寡核苷酸化合物的至少一个核苷包括糖替代物。
49.根据权利要求1至48中任一项所述的寡聚化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸包括至少一个经修饰的核苷间键。
50.根据权利要求49所述的寡聚化合物，其中至少一个经修饰的核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。
51.根据权利要求49至50中任一项所述的寡聚化合物，其中每个核苷间键是经修饰的核苷间键。
52.根据权利要求51所述的寡聚化合物，其中每个核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。
53.根据权利要求1至50中任一项所述的寡聚化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸包括至少一个磷酸二酯核苷间键。
54.根据权利要求1至50或53中任一项所述的寡聚化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸的每个核苷间键独立地选自磷酸二酯核苷间键或硫代磷酸酯核苷间键。
55.根据权利要求49所述的寡聚化合物，其中至少一个经修饰的核苷间键是甲磺酰基氨基磷酸酯核苷间键。
56.根据权利要求49至55中任一项所述的寡聚化合物，其中每个核苷间键独立地选自磷酸二酯核苷间键、硫代磷酸酯核苷间键或甲磺酰基氨基磷酸酯核苷间键。
57.根据权利要求49至55中任一项所述的寡聚化合物，其中每个核苷间键独立地选自硫代磷酸酯核苷间键或甲磺酰基氨基磷酸酯核苷间键。
58.根据权利要求1至57中任一项所述的寡聚化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸包括至少一个经修饰的核碱基。
59.根据权利要求58所述的寡聚化合物，其中所述经修饰的核碱基是5-甲基胞嘧啶。
60.根据权利要求1至59中任一项所述的寡聚化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸包括由5-12个连续2'-脱氧核苷组成的脱氧区。
61.根据权利要求60所述的寡聚化合物，其中所述脱氧区中的每个核苷是2'-β-D-脱氧核苷。
62.根据权利要求60或61所述的寡聚化合物，其中所述脱氧区由7个、8个、9个、10个或7-10个连接的核苷组成。
63.根据权利要求60至62中任一项所述的寡聚化合物，其中紧邻所述脱氧区的每个核苷包括经修饰的糖部分。
64.根据权利要求60至63中任一项所述的寡聚化合物，其中所述脱氧区在5'侧被由1-6个连接的5'区核苷组成的5'区侧接，并且在3'侧被由1-6个连接的3'区核苷组成的3'区侧接；其中
所述5'区中的最靠近3'的核苷包括经修饰的糖部分；并且
所述3'区中的最靠近5'的核苷包括经修饰的糖部分。
65.根据权利要求64所述的寡聚化合物，其中所述3'区中的每个核苷包括经修饰的糖部分。
66.根据权利要求64或65所述的寡聚化合物，其中所述5'区中的每个核苷包括经修饰的糖部分。
67.根据权利要求1至66中任一项所述的寡聚化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸具有包括以下的糖基序：
由1-6个连接的5'区核苷组成的5'区；
由6-10个连接的内部区核苷组成的内部区；以及
由1-6个连接的3'区核苷组成的3'区；
其中所述5'区核苷中的每一个与所述3'区核苷中的每一个包括经修饰的糖部分；
并且所述内部区核苷中的每一个选自2'-脱氧核苷和2'取代的核苷。
68.根据权利要求67所述的寡聚化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸具有包括以下的糖基序：
由1-6个连接的5'区核苷组成的5'区；
由6-10个连接的内部区核苷组成的内部区；以及
由1-6个连接的3'区核苷组成的3'区；
其中所述5'区核苷中的每一个与所述3'区核苷中的每一个是cEt核苷或2'-MOE核苷；并且所述内部区核苷中的每一个是2'-β-D-脱氧核苷。
69.根据权利要求1至59中任一项所述的寡聚化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸的每个核苷包括2'糖部分。
70.根据权利要求69所述的寡聚化合物，其中每个2'糖部分选自2'-OMe、2'-MOE或2'-NMA。
71.根据权利要求69或70所述的寡聚化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸的每个核苷包括相同的2'糖部分。
72.根据权利要求1至71中任一项所述的寡聚化合物，其中所述缀合物接头是可切割的。
73.根据权利要求1至72中任一项所述的寡聚化合物，其中所述缀合物接头包括1-3个接头核苷。
74.根据权利要求1至72中任一项所述的寡聚化合物，其中所述缀合物接头不包括任何接头核苷。
75.根据权利要求1至74中任一项所述的寡聚化合物，其中所述缀合物基团包括：
76.根据权利要求1至74中任一项所述的寡聚化合物，其中所述缀合物基团包括：
77.根据权利要求1至74中任一项所述的寡聚化合物，其中所述缀合物基团包括：
78.根据权利要求1至74中任一项所述的寡聚化合物，其中所述缀合物基团包括：任选地，
79.根据权利要求1至74中任一项所述的寡聚化合物，其中所述缀合物基团包括：
80.根据权利要求1至74中任一项所述的寡聚化合物，其中所述缀合物基团包括：
81.根据权利要求1至74中任一项所述的寡聚化合物，其中所述缀合物基团包括：
82.根据权利要求1至74中任一项所述的寡聚化合物，其中所述缀合物基团包括：
83.根据权利要求1至82中任一项所述的寡聚化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸与在肌肉中表达的靶核酸互补。
84.根据权利要求1至83中任一项所述的寡聚化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸能够通过激活RNA酶H来减少靶核酸的量。
85.根据权利要求1至83中任一项所述的寡聚化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸能够通过激活RISC/Ago2来减少靶核酸的量。
86.根据权利要求1至83中任一项所述的寡聚化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸能够调节靶核酸的剪接。
87.根据权利要求1至83中任一项所述的寡聚化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸是向导RNA、tracrRNA或scout RNA。
88.根据权利要求1至87中任一项所述的寡聚化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸与在肌肉中表达的靶核酸的补体互补。
89.根据权利要求83至88中任一项所述的寡聚化合物，其中所述靶核酸与肌肉疾病相关。
90.根据权利要求83至89中任一项所述的寡聚化合物，其中所述靶核酸选自CaMK2d、NLRP3、PLN、DMD、DMPK、DNM2、DUX4或HPRT。
91.根据权利要求83至90中任一项所述的寡聚化合物，其中肌肉靶核酸具有选自SEQID NO:1-15中的任一项的序列。
92.根据权利要求83至91中任一项所述的寡聚化合物，其中所述靶核酸在以下组织中的至少一种中表达中的至少一种中表达：骨骼肌(包含但不限于四头肌、腓肠肌、胫骨前肌、三头肌、咬肌、趾长伸肌(EDL)、比目鱼肌、膈膜)、心脏、坐骨神经、主动脉或肝。
93.根据权利要求1至92中任一项所述的寡聚化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸的核碱基序列包括SEQ ID NO:167-191中的任一项的任何核碱基序列中的至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个连续核碱基。
94.根据权利要求1至93中任一项所述的寡聚化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸由10个至25个、10个至30个、12个至20个、12个至25个、12个至30个、13个至20个、13个至25个、13个至30个、14个至20个、14个至25个、14个至30个、15个至20个、15个至25个、15个至30个、16个至18个、16个至20个、16个至25个、16个至30个、17个至20个、17个至25个、17个至30个、18个至20个、18个至25个、18个至30个、19个至20个、19个至25个、19个至30个、20个至25个、20个至30个、21个至25个、21个至30个、21个至50个、22个至25个、22个至30个、23个至25个、23个至30个、20个至100个、40个至100个、50个至100个、50个至200个、100个至300个、150个至300个或200个至300个连接的核苷组成。
95.一种寡聚双链体，其包括第一寡聚化合物和第二化合物寡聚物，所述第一寡聚化合物包括第一经修饰的寡核苷酸，所述第二化合物寡聚物包括由16个至30个连接的核苷组成的第二经修饰的寡核苷酸，其中所述第二经修饰的寡核苷酸的核碱基序列包括由至少12个核碱基构成的互补性区，所述互补性区与所述第一经修饰的寡核苷酸的相等长度部分至少90％互补，并且其中所述第二寡聚化合物是根据权利要求1至86或89至94中任一项所述的寡聚化合物。
96.根据权利要求95所述的寡聚双链体，其中所述第一经修饰的寡核苷酸与肌肉靶核酸是互补的。
97.根据权利要求96所述的寡聚双链体，其中所述双链体能够通过激活RISC/Ago2来减少靶核酸的量。
98.根据权利要求95至97中任一项所述的寡聚双链体，其中所述第二经修饰的寡核苷酸的至少一个核苷包括经修饰的糖部分。
99.根据权利要求98所述的寡聚双链体，其中所述第二经修饰的寡核苷酸的所述经修饰的糖部分包括双环状糖部分。
100.根据权利要求99所述的寡聚双链体，其中所述第二经修饰的寡核苷酸的所述双环状糖部分包括选自以下的2'-4'桥：–O-CH2-；以及–O-CH(CH3)-。
101.根据权利要求100所述的寡聚双链体，其中所述第二经修饰的寡核苷酸的所述经修饰的糖部分包括非双环状经修饰的糖部分。
102.根据权利要求101所述的寡聚双链体，其中所述第二经修饰的寡核苷酸的所述非双环状经修饰的糖部分是2'-MOE糖部分、2'-F糖部分或2'-OMe糖部分。
103.根据权利要求95至102中任一项所述的寡聚双链体，其中所述第二经修饰的寡核苷酸的至少一个核苷包括糖替代物。
104.根据权利要求95至102中任一项所述的寡聚双链体，其中所述第二经修饰的寡核苷酸的至少一个核苷间键是经修饰的核苷间键。
105.根据权利要求104所述的寡聚双链体，其中所述第二经修饰的寡核苷酸的至少一个经修饰的核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。
106.根据权利要求95至105中任一项所述的寡聚双链体，其中所述第二经修饰的寡核苷酸的至少一个核苷间键是磷酸二酯核苷间键。
107.根据权利要求95至104或106中任一项所述的寡聚双链体，其中所述第二经修饰的寡核苷酸的每个核苷间键独立地选自磷酸二酯核苷间键或硫代磷酸酯核苷间键。
108.根据权利要求95至107中任一项所述的寡聚双链体，其中所述第二经修饰的寡核苷酸包括至少一个经修饰的核碱基。
109.根据权利要求108所述的寡聚双链体，其中所述第二经修饰的寡核苷酸的所述经修饰的核碱基是5-甲基胞嘧啶。
110.根据权利要求95至109中任一项所述的寡聚双链体，其中所述第一寡聚化合物包括5'稳定化的磷酸酯基团。
111.根据权利要求95至109中任一项所述的寡聚双链体，其中所述第二寡聚化合物包括5'稳定化的磷酸酯基团。
112.根据权利要求110或111所述的寡聚双链体，其中所述稳定化的磷酸酯基团包括膦酸环丙酯或膦酸乙烯酯。
113.根据权利要求95至112中任一项所述的寡聚双链体，其中所述第一经修饰的寡核苷酸包括乙二醇核酸(GNA)糖替代物。
114.根据权利要求95至113中任一项所述的寡聚双链体，其中第一经修饰的寡核苷酸包括2'-NMA糖部分。
115.根据权利要求95至114中任一项所述的寡聚双链体，其中所述第二经修饰的寡核苷酸包括乙二醇核酸(GNA)糖替代物。
116.根据权利要求95至115中任一项所述的寡聚双链体，其中所述第二经修饰的寡核苷酸化合物包括2'-NMA糖部分。
117.一种调节受试者的核酸靶标的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1至94中任一项所述的寡聚化合物或根据权利要求95至116中任一项所述的寡聚双链体。
118.根据权利要求117所述的方法，其中所述核酸靶标在以下中的至少一种中表达：骨骼肌(包含但不限于四头肌、腓肠肌、胫骨前肌、三头肌、咬肌、趾长伸肌(EDL)、比目鱼肌、膈膜)、心脏、坐骨神经、主动脉或肝。
119.根据权利要求117或118所述的方法，其中施用根据权利要求1至94中任一项所述的寡聚化合物或根据权利要求95至116中任一项所述的寡聚双链体引起所述核酸靶标的减少。
120.根据权利要求117或118所述的方法，其中施用根据权利要求1至94中任一项所述的寡聚化合物或根据权利要求95至116中任一项所述的寡聚双链体引起所述核酸靶标的剪接的变化。
121.根据权利要求117至120中任一项所述的方法，其中所述寡聚化合物或所述寡聚双链体通过静脉内给药或皮下给药施用。
122.根据权利要求117至120中任一项所述的方法，其中所述寡聚化合物或所述寡聚双链体以5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg、140mg、145mg、150mg、155mg、160mg、165mg、170mg、175mg、180mg、185mg、190mg、195mg、200mg、205mg、210mg、215mg、220mg、225mg、230mg、235mg、240mg、245mg、250mg、255mg、260mg、265mg、270mg、275mg、280mg、285mg、290mg、295mg、300mg、305mg、310mg、315mg、320mg、325mg、330mg、335mg、340mg、345mg或350mg的剂量施用。
123.根据权利要求117至122中任一项所述的方法，其包括每4周一次、每6周一次、每8周一次、每12周一次、每16周一次、每20周一次、每24周一次、每6个月一次或每年一次施用所述寡聚化合物或所述寡聚双链体。
124.一种对转铁蛋白受体1(TfR1)具有特异性的双环配体，所述双环配体包括选自以下的氨基酸序列：CP[HyP]DAYLGC[tBuGly]SYCEPWK(SEQ ID NO:245，本文称为BCY21757)和CP[HyP]DAYLGC[tBuGly]SYCEPWC(SEQ ID NO:246，本文称为BCY21758)，其中HyP表示反式-4-羟基-L-脯氨酸，并且tBuGly表示叔丁基-甘氨酸。
125.根据权利要求124所述的双环配体，其包括N末端乙酰基和C末端CONH2基团。
126.根据权利要求124或125所述的双环配体，其是药学上可接受的盐。
127.根据权利要求126所述的药物盐，其中所述药学上可接受的盐选自钠盐、钾盐、钙盐或铵盐。
128.根据权利要求124所述的双环配体，其中所述肽配体内的第一半胱氨酸残基、第二半胱氨酸残基和第三半胱氨酸残基与分子支架共价键合，使得在所述分子支架上形成两个多肽环路。
129.根据权利要求125所述的双环配体，其中所述分子支架是1,1',1”-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三丙-2-烯-1-酮(TATA)。
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