CN118497421B

CN118497421B - 基于数字pcr的hiv-1检测方法

Info

Publication number: CN118497421B
Application number: CN202410685934.7A
Authority: CN
Inventors: 金聪; 王宇
Original assignee: NATIONAL CENTER FOR AIDS/STD CONTROL AND PREVENTION CHINESE CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION
Current assignee: NATIONAL CENTER FOR AIDS/STD CONTROL AND PREVENTION CHINESE CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION
Priority date: 2024-05-30
Filing date: 2024-05-30
Publication date: 2025-02-18
Anticipated expiration: 2044-05-30
Also published as: CN118497421A

Abstract

本发明公开了用于扩增HIV‑1核酸的引物对、与扩增引物对结合使用以检测HIV‑1的探针及内参引物对和探针组合，以及使用它们的高灵敏度和高特异性的HIV‑1数字PCR检测方法。本发明的引物对和探针能够适用于我国常见的HIV‑1流行亚型的扩增和检测，检出限能够低至单拷贝/mL，对低病毒载量样本检测的精密度高，适用于低HIV‑1病毒载量样本的定量检测。

Description

基于数字PCR的HIV-1检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体地，本发明涉及用于扩增和检测、尤其是基于dPCR原理的HIV-1核酸的扩增引物对和检测探针、相关检测方法及试剂盒。

背景技术

1型艾滋病病毒(HIV-1)的核酸检测是通过检测人体内是否存在HIV-1核酸来确定感染状态，这样可以更早的发现HIV-1感染者，并及时地对其进行抗病毒治疗，延缓HIV-1病情的进展，减少HIV-1的传播。基于探针法的实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法是HIV-1病毒载量检测最常用的方法。目前市面上基于qPCR原理的HIV-1病毒载量检测试剂检出限最低为22IU/mL，基本满足绝大多数情况下对HIV-1RNA定量检测的需求。

然而，现有技术检测艾滋病病毒仍存在如下缺点，包括但不限于：

1.现有技术对低病毒载量样本的检测效果较差，检出限较高，检测精密度较低，低病载患者的检测结果不准确，易出现假阴性等；

2.现有技术方法的实验操作及数据处理复杂，例如，对于外标定量检测试剂，需要消耗额外的试剂耗材计算标准曲线；对于内标定量检测试剂，需要额外的算法，且同一孔中内标可能会和待测样本发生竞争和干扰，导致实验失败；

3.现有技术如qPCR在扩增的过程中有可能受到反应抑制剂的干扰，导致定量结果下降甚至扩增失败；

4.国内现有的商购试剂对于国内常见流行亚型的样本会出现漏检的情况。长期以来，我国普遍使用的HIV-1病毒载量试剂为基于qPCR的国外进口试剂，这些试剂所使用的引物探针均是针对国外常见的流行亚型进行设计，对于国内常见流行亚型的样本可能会出现漏检的情况。

此外，HIV-1为单链RNA病毒，其逆转录酶保真性差，在复制过程中存在高突变率、高错误率及高重组率等特点，导致HIV序列之间的高度多样性。由于HIV-1基因的多样性，没有通用的引物探针可以覆盖所有HIV-1序列，使检测的灵敏度受到限制。虽然可以通过设立简并碱基增加保守区域，但会在一定程度上降低引物探针的特异性。

现有技术如Falak S,Macdonald R,Busby EJ,et al.An assessment of thereproducibility of reverse transcription digital PCR quantification of HIV-1.Methods.2022May；201:34-40.doi:10.1016/j.ymeth.2021.03.006.Epub 2021Mar12.PMID:33722693构建了RT-dPCR方法用于定量检测WHO第四代HIV-1RNA标准品，并公开了其建立的双重dPCR方法的检出限为16拷贝/mL，用于检测精密度评估的变异系数(coefficient of variation，CV)在10-12％之间。但是，本申请发明人在研究中发现，该文献中所设计的gag区和pol区的引物之间存在非特异性扩增，这也表明该文献所公开的gag区和pol区的引物和探针事实上是不适宜进行双靶点检测的。

因此，本领域需要一种针对国内流行亚型通用的HIV-1的高灵敏度、高特异性和高精密度的检测方法。

发明内容

为了解决现有检测方法所存在的缺陷，本发明人通过对国内常见HIV-1流行亚型序列全序进行分析，在有限的保守片段设计了尽可能多的引物和探针，在后续的筛选中进行引物和探针性能的验证，比较符合要求的引物和探针组合，最终选择出扩增效率和亚型覆盖率高的引物和探针组，构建了基于数字PCR(dPCR)的HIV-1的检测方法。由此，得到本发明。

因此，在第一方面，提供了用于扩增HIV-1核酸的一个或多个引物对，所述引物对为：

Ψ区引物对，包括序列如SEQ ID NO.1所示的Ψ区上游引物和序列如SEQ ID NO.2所示的Ψ区下游引物；

LTR区引物对，包括序列如SEQ ID NO.4所示的LTR区上游引物和序列如SEQ IDNO.5所示的LTR区下游引物；

pol区引物对，包括序列如SEQ ID NO.7所示的pol区上游引物和序列如SEQ IDNO.8所示的pol区下游引物；或

gag区引物对，包括序列如SEQ ID NO.10所示的gag区上游引物和序列如SEQ IDNO.11所示的gag区下游引物。

在第二方面，提供了用于检测HIV-1核酸的一个或多个探针，所述探针包括：

序列如SEQ ID NO.3所示的Ψ区探针；

序列如SEQ ID NO.6所示的LTR区探针；

序列如SEQ ID NO.9所示的pol区探针；或

序列如SEQ ID NO.12所示的gag区探针。

在第三方面，提供了用于HIV-1核酸检测的内参引物对和探针组合，其包括：序列如SEQ ID NO.13所示的内参上游引物，序列如SEQ ID NO.14所示的内参下游引物，以及序列如SEQ ID NO.15所示的内参探针。

在第四方面，提供了用于检测HIV-1核酸的反应体系，所述反应体系包括第一方面的一个或多个引物对。

在第五方面，提供了本发明第一方面的一个或多个引物对在制备用于检测HIV-1的检测体系中的用途。

在第六方面，提供了一种用于检测HIV-1的方法，所述方法用于非诊断目的或诊断目的，包括：

1)提供HIV-1核酸样本；

2)以所述HIV-1核酸样本为模板，使用第一方面的一个或多个引物对对HIV-1核酸扩增。

在第七方面，提供了一种用于检测HIV-1的试剂盒，包括：

a)第一方面的一个或多个引物对；以及

b)用于指示如何使用该试剂盒的使用说明。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了用于扩增和检测、尤其是用于dPCR的HIV-1核酸的四组扩增引物对和检测探针，由此建立了基于单重dPCR和双重dPCR的HIV-1核酸扩增和检测方法，具有高的扩增效率、低检出限、高精密度、以及高灵敏度和特异性。基于本发明的引物对和探针组合的双重dPCR方法的检出限甚至可以达到单拷贝/mL，由此可以用于低HIV-1病毒载量样本的高精度定量检测。并且本发明的检测所针对的亚型覆盖率广，对于国内常见的流行亚型的样本、毒株及阴性样本的阳性检出率和阴性检出率均为100％。

基于本发明的引物对和探针组合的dPCR检测方法由于其高灵敏度和高精密度，对于HIV-1感染者的诊断应用可以有效缩短HIV-1病毒感染至检出所需的时间，将HIV-1检测窗口期提前，从而避免处于HIV-1复制初期的感染者体内的病毒载量低于现有方法的检出限时出现的漏检，在急性感染者的发现和更灵敏的血液筛查中具有重要作用。并且，对于HIV-1感染者治疗效果评估的应用，基于本发明的引物对和探针组合的dPCR检测方法可以对HIV-1感染者抗病毒治疗后体内的病毒水平进行高精密度的定量，更准确的监测抗病毒治疗效果，有助于及时发现治疗后低病毒载量耐药的情况。因此，本发明的基于dPCR的HIV-1检测方法是对目前常用的HIV-1检测方法的有益补充，在超敏诊断以及精准监测抗逆转录病毒治疗(ART)效果方面拥有其独特优势。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1-图4示出对本发明的引物对和探针的筛选验证。

图5-图9示出本发明的内参引物对和探针的筛选验证。

图10示出本发明的Ψ区引物对和探针的单靶点的dPCR扩增反应的优化。

图11示出对本发明的LTR区、gag区和pol区的引物进行两两组合的扩增结果。

图12-图13分别示出本发明的LTR+gag和LTR+pol的引物对和探针组合的扩增结果。

图14-16示出本发明的LTR+pol的引物对和探针组合在不同退火温度的扩增结果。

图17示出本发明的LTR+pol的引物对和探针组合分别采用“40个循环，30秒”和“45个循环，30秒”的扩增结果。

图18示出本发明的LTR+pol的引物对和探针组合在不同的引物对和探针浓度下的扩增结果。

具体实施方式

在下文中，将结合附图对本发明进行详细的描述。需理解，以下描述仅以示例方式来对本发明进行说明，而无意于对本发明的范围进行限制，本发明的保护范围以随附权利要求为准。并且，本领域技术人员理解，在不背离本发明的精神和主旨的情况下，可以对本发明的技术方案进行修改。若并未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在对本发明进行详细描述之前，提供以下定义以更好地理解本发明。

在提供数值范围的情况中，例如浓度范围、百分比范围或比率范围，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限与下限之间的、到下限单位的十分之一的各中间值以及在所述范围内的任何其他所述值或中间值包含在所述主题内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围中，并且此类实施方案也包括在所述主题内，受限于所述范围中的任何特定排除的极限值。在所述范围包括一个或两个极限值的情况中，排除那些所包括的极限值中的任一个或两个的范围也包括在所述主题中。

在本发明的上下文中，很多实施方案使用表述“包含”、“包括”或者“基本/主要由……组成”。表述“包含”、“包括”或“基本/主要由……组成”通常情况下可以理解为开放式表述，表示不仅包括该表述后面具体列出的各元素、组分、组件、方法步骤等外，还包括其他的元素、组分、组件、方法步骤。另外，在本文中，表述“包含”、“包括”或者“基本/主要由……组成”在某些情况下也可以理解为封闭式表述，表示仅包括该表述后面具体列出的各元素、组分、组件、方法步骤，而不包括任何其他的元素、组分、组件、方法步骤。此时，该表述等同于表述“由……组成”。

为了更好地理解本教导并且不限制本教导的范围，除非另外指出，否则在说明书和权利要求中使用的表示数量、百分比或比例的所有数字以及其他数值在所有情况下都应理解为由术语“约”进行修饰。因此，除非相反地指出，否则在以下说明书和所附权利要求书中阐述的数值参数为近似值，其可以根据寻求获得的所需性质而变化。至少，每个数值参数应该至少根据所报告的有效数字的数值并通过应用普通的舍入技术来进行解释。

在本发明的上下文中，针对HIV-1基因组序列的四个保守区，即：LTR区、Ψ区、gag区和pol区，分别设计了引物对和探针。在HIV-1参考序列(HXB2)中，LTR区位于1-634bp，gag区位于790-2292bp，pol区位于2085-5096bp，包装信号Ψ区位于LTR区和gag区之间，常和env区(6045-8795bp)相结合用于检测HIV-1完整前病毒。

基于这四个保守区，本发明的发明人找到了7个保守片段，在HXB2参考序列上的位置分别为：保守片段1：522-544bp；保守片段2：577-603bp；保守片段3：622-649bp；保守片段4：682-709bp；保守片段5：761-807bp；保守片段6：890-909bp；保守片段7：4896-4980bp。基于这7个保守片段，设计出了本发明的引物对和探针。

在一个优选的实施方案中，所述多个引物对为LTR区引物对和pol区引物对的组合或者LTR区引物对和gag区引物对的组合。

在第二方面，提供了用于检测HIV-1核酸的一个或多个探针，其包括：

序列如SEQ ID NO.3所示的Ψ区探针；

序列如SEQ ID NO.6所示的LTR区探针；

序列如SEQ ID NO.9所示的pol区探针；或

序列如SEQ ID NO.12所示的gag区探针。

在一个优选的实施方案中，所述多个探针为所述LTR区探针和pol区探针的组合或所述LTR区探针和所述gag区探针的组合。

由于HIV-1基因的多样性，没有通用的引物和探针可以覆盖所有HIV-1序列，这使得检测的灵敏度受到限制。虽然可以通过设立简并碱基增加保守区域，但会在一定程度上降低引物探针的特异性。因此，在本发明中，基于HIV-1基因组的不同保守区域设计的引物对与探针是一一对应的，也就是说，当第一方面的引物对是Ψ区引物对时，则选择与引物对对应的Ψ区探针，当第一方面的引物对是LTR区引物对和gag区引物对时，则选择与这两个引物对对应的LTR区探针和gag区探针，由此确保了探针的特异性以及检测的灵敏度。

因此，在一个具体的实施方案中，Ψ区引物对与序列如SEQ ID NO.3所示的Ψ区探针联合使用以用于HIV-1的检测。

在又一个具体的实施方案中，LTR区引物对与序列如SEQ ID NO.6所示的LTR区探针联合使用以用于HIV-1的检测。

在又一个具体的实施方案中，pol区引物对与序列如SEQ ID NO.9所示的pol区探针联合使用以用于HIV-1的检测。

在又一个具体的实施方案中，gag区引物对与序列如SEQ ID NO.12所示的gag区探针联合使用以用于HIV-1的检测。

具体序列如下所示：

SEQ ID NO.1：TAGCAGTGGYGCCCGAACAG

SEQ ID NO.2：GCTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCTA

SEQ ID NO.3：CAGGACTCGGCTTGCTGA-MGB

SEQ ID NO.4：GCCTCAATAAAGCTTGCCTT

SEQ ID NO.5：GCRCCACTGCTAGAGATTTT

SEQ ID NO.6：ACTCTGGTAWCTAGAGATCCCTCAG-MGB

SEQ ID NO.7：GGTTTATTACAGRGACARCAGA

SEQ ID NO.8：CYGCYCCTTCACCTTTCCA

SEQ ID NO.9：TGGAAAGGACCAGC-MGB

SEQ ID NO.10：GCGGAGGCTAGAAGGAGA

SEQ ID NO.11：CYCTGCTTGCCCATACTA

SEQ ID NO.12：ATGGGTGCGAGAGCGTC-MGB。

在第三方面，提供了用于HIV-1核酸检测的内参引物对和探针组合，其包括：序列如SEQ ID NO.13所示的内参上游引物，序列如SEQ ID NO.14所示的内参下游引物，以及序列如SEQ ID NO.15所示的内参探针。具体序列如下所示：

SEQ ID NO.13：GTTAGTACACGGGAATTTCATG

SEQ ID NO.14：CATTATTTTTGCTACAATTCAGTC

SEQ ID NO.15：ATTTCACCGGGAAGTTTCTT-MGB。

可以理解，对于内参引物对和探针的设计与筛选除了需要考虑其作为内参本身的用途之外，还需要避免内参自身的引物对和探针之间的非特异性二聚或错配而造成的非特异性扩增，也要避免其与扩增的引物对和探针之间的非特异性二聚或错配而造成的非特异性扩增。在本发明所采用的dPCR扩增方法中，尤其是双重dPCR扩增方法中，本发明的内参引物对经染料法验证并不会与所选择的两对扩增引物对产生非特异性二聚体，由此具有更高的扩增效率和准确性。

在第四方面，提供了用于检测HIV-1核酸的反应体系，所述反应体系包括本发明第一方面的一个或多个引物对，即，Ψ区引物对、LTR区引物对pol区引物对、gag区引物对、或其组合。

在一个优选的实施方案中，所述反应体系还包括本发明第二方面的一个或多个探针，即，Ψ区探针、LTR区探针、pol区探针、gag区探针、或其组合。

在一个更优选的实施方案中，所述反应体系还包括内参引物对和探针组合。

在本发明的上下文中，设计了与HIV-1无交叉反应的外源性内参序列以及相应的内参引物对和内参探针，用于对核酸扩增过程进行内部质量控制，以保证检测结果的可靠性。

可以理解，对于内参引物对和内参探针的设计与筛选，除了需要考虑其作为内参本身的用途之外，还需要避免内参自身的的引物对和探针之间的非特异性二聚或错配以及其与扩增目标基因的引物对和探针之间的非特异性二聚或错配而造成的非特异性扩增。为此，本发明的发明人使用内参序列来源于非人源性的胡萝卜基因组(GenBank:CM004278.1)，使用SnapGene软件进行序列比对，并通过染料法和探针法确认其特异性，由此获得了可以用于本发明的内参引物对和内参探针。

因此，在一个优选的实施方案中，所述内参引物对和探针组合是本发明第三方面的内参引物对和探针组合。

经本发明的发明人的验证可知，在本发明所采用的dPCR扩增方法中，尤其是在双重dPCR扩增方法中，本发明的内参引物对经染料法验证并不会与所选择的两对扩增引物对产生非特异性二聚体，由此具有更高的扩增效率和准确性。

在第五方面，提供了第一方面的一个或多个引物对在制备用于检测HIV-1的检测体系中的用途。

在一个具体的实施方案中，所述检测体系还包括本发明第二方面的一个或多个探针。

如前所述，本领域技术人员会知道，基于HIV-1基因组的不同保守区域设计的引物对与探针是一一对应的，也就是说，当第一方面的引物对是Ψ区引物对时，则选择与引物对对应的Ψ区探针，当第一方面的引物对是LTR区引物对和gag区引物对时，则选择与这两个引物对对应的LTR区探针和gag区探针，由此确保了探针的特异性以及检测的灵敏度。

在又一个具体的实施方案中，所述检测体系还包括内参引物对和探针组合。

在一个优选的实施方案中，所述内参引物对和探针组合是本发明第三方面的内参引物对和探针组合。

在一个优选的实施方案中，所述检测通过基于数字PCR(dPCR)的引物扩增和探针杂交来进行。可以理解，在本发明的上下文中，通过dPCR扩增反应可以实现对HIV-1病毒的检测。所述dPCR扩增可以包括单重dPCR扩增或双重dPCR扩增，由此实现HIV-1的单靶点或双靶点检测。

在一个进一步优选的实施方案中，所述检测可以是基于使用Ψ区引物对、LTR区引物对、gag区引物对或pol区引物对的单重dPCR扩增进行的检测。

在又一个进一步优选的实施方案中，所述检测可以是基于使用LTR区引物对和gag区引物对的双重dPCR扩增进行的检测，或者是基于使用LTR区引物对和pol区引物对的双重dPCR扩增进行的检测。

在一个更进一步优选的实施方案中，所述检测可以是基于使用LTR区引物对、LTR区探针、gag区引物对和gag区探针的双重dPCR扩增进行的检测，或者是基于使用LTR区引物对、LTR区探针、pol区引物对和pol区探针的双重dPCR扩增进行的检测。

在第六方面，提供了一种用于检测HIV-1的方法，所述方法包括：

1)提供HIV-1核酸样本；

2)以HIV-1核酸样本为模板，使用本发明第一方面的一个或多个引物对对HIV-1核酸进行扩增。

在一个具体的实施方案中，所述扩增是通过数字PCR(dPCR)进行的扩增。

可以理解，本发明第一方面的引物对通过dPCR扩增反应可以实现对HIV-1病毒的检测。所述dPCR扩增可以包括单重dPCR扩增或双重dPCR扩增，由此实现HIV-1的单靶点或双靶点检测。

可以理解，本发明的上下文中使用的HIV-1核酸样本可以是任何来源的，例如来自血液样本如全血、血清、血浆、干血斑等，来自体液样本如分泌物等，也可以是基于已知的核酸序列经人工合成的样本。另外，还可以理解，所述HIV-1核酸样本可以通过本领域常规的核酸提取技术来进行提取获得，并且本发明对核酸提取方法和试剂无特殊限定。因此，在一个具体的实施方案中，可以通过从血液样本、体液样本或基于已知的核酸序列经人工合成的样本中提取HIV-1核酸。

还可以理解，本发明所涉及的HIV-1核酸样本可以是HIV-1RNA样本，也可以是HIV-1DNA样本。本领域技术人员熟知，HIV-1是单链RNA病毒，通常针对HIV-1的核酸检测为检测血浆中的HIV-1RNA，但在HIV-1感染初期，HIV-1RNA会整合到细胞内形成HIV-1DNA。本发明所设计的引物和探针既可以成功扩增HIV-1RNA，也可以成功扩增HIV-1DNA，仅需要选用不同的样本类型和核酸提取试剂即可。例如，HIV-1RNA样本可以是血浆样本或RNA提取试剂，HIV-1DNA样本可以是全血、细胞、组织等样本，或者DNA提取试剂，但不限于此。

在又一个具体的实施方案中，所述检测可以是基于使用Ψ区引物对、LTR区引物对、gag区引物对或pol区引物对的单重dPCR扩增进行的检测。

在又一个具体的实施方案中，所述检测可以是基于使用LTR区引物对和gag区引物对的双重dPCR扩增进行的检测，或者是基于使用LTR区引物对和pol区引物对的双重dPCR扩增进行的检测。

在又一个具体的实施方案中，所述方法还包括使用本发明第二方面的一个或多个探针。

在一个优选的实施方案中，所述检测可以是基于使用LTR区引物对、LTR区探针、gag区引物对和gag区探针的双重dPCR扩增进行的检测，或者是使用LTR区引物对、LTR区探针、pol区引物对和pol区探针的双重dPCR扩增进行的检测。

如前所述，本领域技术人员会知道，基于HIV-1基因组的不同保守区域设计的引物对与探针是一一对应的，也就是说，当第一方面的引物对是Ψ区引物对时，则选择与该引物对对应的Ψ区探针，当第一方面的引物对是LTR区引物对和gag区引物对时，则选择与这两个引物对对应的LTR区探针和gag区探针，由此确保了探针的特异性以及检测的灵敏度。

在又一个具体的实施方案中，所述检测还包括使用内参引物对和探针组合。

在一个优选的实施方案中，所述内参引物对和探针组合是本发明第三方面的内参引物对和探针组合。如前所述，内参引物对和探针组合用于对核酸提取和扩增过程进行内部质量控制，以保证检测结果的可靠性。在本发明所采用的dPCR检测方法中，尤其是在双重dPCR检测方法中，本发明的内参引物对和探针组合经染料法验证并不会与所选择的两对扩增引物对产生非特异性二聚体，由此具有更高的扩增效率和准确性。

在又一个具体的实施方案中，所述扩增反应的退火温度为50℃-60℃，退火延伸时间为30-60秒，循环数为40-45次。

可以理解，对于单重dPCR和双重dPCR，优选的退火温度、退火延伸时间以及循环数可以是相同或者不同的。例如，当进行单重dPCR扩增反应时，退火温度可以为57℃-60℃，优选为60℃，退火延伸时间可以为30秒，循环数可以为40次。当进行双重dPCR扩增反应时，退火温度可以为50℃-56℃，优选为52℃，退火延伸时间可以为30秒，循环数可以为45次。

在又一个具体的实施方案中，所述扩增反应中引物与探针的浓度比值为2：2：1。

在又一个具体的实施方案中，所述引物的浓度为0.2μM-0.6μM。

在一个优选的实施方案中，所述引物的浓度为0.4μM-0.45μM。

在又一个具体的实施方案中，所述探针的浓度0.1μM-0.3μM。

在一个优选的实施方案中，所述探针的浓度为0.2μM-0.225μM。

本发明的扩增反应中所需要的其他试剂例如缓冲液、dNTP等均可以使用本领域常用试剂，本发明对此并无特别限定。

同样可以理解，本发明用于检测HIV-1的方法可以用于诊断目的，也可以用于“非诊断目的”，所述“非诊断目的”包括但不限于检验检疫和疫情防控等。

本发明的发明人经反复研究得出，本发明的HIV-1检测的引物对和探针组合无论是进行单靶点检测还是双靶点检测，都表现出低检出限、高灵敏度和高特异性，能够适用于我国HIV-1常见流行毒株如CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B、CRF55_01B等亚型的扩增，亚型覆盖范围广，因此相比现有方法，更适合用于我国HIV-1疾病的检验检疫和疫情防控等工作的开展。

在第七方面，提供了一种用于检测HIV-1的试剂盒，包括：

a)第一方面的一个或多个引物对；以及

b)用于指示如何使用该试剂盒的使用说明。

在一个优选的实施方案中，所述试剂盒还包括第二方面的一个或多个探针。本领域技术人员会知道，当第一方面的引物对是Ψ区引物对时，则选择与该引物对对应的Ψ区探针，当第一方面的引物对时LTR区引物对和gag区引物对时，则选择与这两个引物对对应的LTR区探针和gag区探针。

在一个进一步优选的实施方案中，所述试剂盒还包括内参引物对和探针组合，以用于对核酸提取和扩增过程进行内部质量控制，以保证检测结果的可靠性。

在一个更进一步优选的实施方案中，所述内参引物对和探针组合是本发明第三方面的内参引物对和探针组合。

实施例

在下述实施例中，示出了本发明的引物对和探针组合、扩增与检测方法。如无特殊说明，其中采用的试验方法均为常规方法，并且如无特殊说明，下述实施例中所用的试验材料均为自常规化试剂，自商店购买所得。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。

应注意，本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，而并非旨在限制本发明。上文的发明内容部分、具体实施方式以及下文的实施例仅为具体阐释本发明之目的，无意于以任何方式对本发明进行限制。在不背离本发明的精神和主旨的情况下，本发明的范围由随附的权利要求书确定。

实施例1：引物和探针的设计及筛选

(1)HIV-1基因序列分析

从Los Alamos数据库中下载了我国的HIV-1全基因序列610条，以及亚洲地区的HIV-1LTR区和gag区基因序列237条，分别构建基因序列集。使用Bioedit软件分别以“shadethreshold 99％”和“shade threshold 100％”的条件对比基因序列库，找出保守片段，用于引物和探针的设计。

(2)引物探针设计情况

使用亚洲地区LTR区和gag区基因序列集以及国内全基因序列集在保守区共找到了7个保守片段，设计出了20组引物和探针的组合，如下表1所示(F表示上游引物，R表示下游引物，P表示探针)。

表1：初步设计的引物和探针序列

(3)参考序列HXB2质粒构建

基于序列分析结果，设计参考质粒HXB2(GenBank:K03455.1)，具体步骤如下：

使用Bioedit软件分析我国的HIV-1全基因序列集。以pUC57为载体，插入7个保守区片段，它们在HXB2参考序列上的位置分别为：保守片段1：522-544bp；保守片段2：577-603bp；保守片段3：622-649bp；保守片段4：682-709bp；保守片段5：761-807bp；保守片段6：890-909bp；保守片段7：4896-4980bp，以保证设计的引物探针可以扩增成功。在插入保守区片段时，保守片段的长度要超过引物探针的扩增片段长度，避免出现依据该保守区设计的上游引物5’端与下游引物的3’端与保守区的起始和终止位置相同，引物和探针相邻的情况，可能会导致扩增失败。确定基因片段后，使用SnapGene软件分析拟合成的质粒全序(pUC57+保守区片段)，确保引物探针的特异性结合，避免同一组引物探针可以扩增成功两个片段的情况。

(4)引物和探针筛选

一轮筛选：以步骤(3)制备的参考序列质粒(HXB2)为模板，使用步骤(2)中设计的20组引物和探针进行扩增，双孔复测，具体步骤如下：

将装有质粒干粉的样本管以13000rpm离心10-15分钟，使干粉沉降至管底。缓慢打开管盖，加入一定量的RNase-Free ddH₂O溶解质粒并混匀。使用NanoDrop One分光光度计定量(ng/μL)，并根据质粒全长计算DNA拷贝数(拷贝/μg)，使用分光光度计定量值和DNA拷贝数计算质粒的浓度(拷贝/μL)。以理论浓度为10⁵拷贝/μL的参考质粒(HXB2)为模板，使用TaKaRa One Step PrimeScript^TM RT-PCR试剂盒及步骤(2)中设计的20组引物探针进行双孔复测，避免因实验操作导致的单孔扩增失败造成的不准确结果，反应体系及反应条件如下表2所示：

表2：一轮筛选扩增试剂的反应体系和反应条件

扩增结果如图1所示。由图1可知，第1组至第4组的Ct值均大于30，第9组至第12组的Ct值大于25，高于其他12组的Ct值(均小于25)，且最终荧光值明显偏低。因此，在此轮筛选中，保留了12组扩增效果较好的引物探针，分别为第5组至第8组和第13组至第20组。

二轮筛选：使用QIAamp Viral RNA Mini Kit(250)试剂盒从各亚型毒株及HIV-1感染者血浆样本中提取RNA，其中毒株包括：CRF01_AE亚型、CRF07_BC亚型、CRF55_01B亚型和B亚型毒株样本各2例；HIV-1感染者血浆样本包括：CRF01_AE亚型、CRF07_BC亚型、CRF08_BC亚型和B亚型样本血浆样本各2例，CRF85_BC亚型血浆样本1例。

以理论浓度为10⁵拷贝/mL的B亚型毒株(SF33)RNA为模板，使用TaKaRa One StepPrimeScript^TM RT-PCR试剂盒及一轮筛选后的12组引物和探针进行双孔复测，以避免因实验操作导致的单孔扩增失败造成的不准确结果，反应体系及反应条件如下表3所示。

表3：二轮筛选扩增试剂的反应体系和反应条件

扩增结果如图2A所示。第13组至第16组在扩增其中一例B亚型毒株RNA时，无法扩增成功。根据图2A的扩增结果，综合引物和探针在qPCR上的扩增效果以及靶点的位置，最终分别在LTR区、gag区、pol区和Ψ区分别选择一组引物探针，即表1中的第6组、第18组、第19组和第20组。

以理论浓度为10⁵拷贝/mL的各亚型毒株RNA和病毒载量未知的各亚型血浆样本RNA为模板，使用TaKaRa One Step PrimeScript^TM RT-PCR试剂盒及最终确定的4组引物和探针进行双孔复测，以避免因实验操作导致的单孔扩增失败造成的不准确结果，反应体系及反应条件如上表3所示。

扩增结果如图2B所示。使用这4组引物探针在扩增各亚型毒株样本和各亚型HIV-1感染者血浆样本时均扩增成功。

实施例2：引物和探针的验证

扩增效率验证：对实施例1筛选出的这四组引物和探针的扩增效率和线性进行验证，具体步骤如下：将理论浓度为10¹⁰拷贝/μL的参考序列质粒(HXB2)进行10倍梯度稀释，得到10⁷拷贝/μL、10⁶拷贝/μL、10⁵拷贝/μL、10⁴拷贝/μL和10³拷贝/μL的质粒，使用TaKaRa OneStep PrimeScript^TM RT-PCR试剂盒及表1中的第6组、第18组、第19组和第20组引物和探针对每个浓度的质粒平行检测3次，反应体系及反应条件如下表4所示：

表4：扩增效率和线性验证的反应体系和反应条件

结果如图3所示。根据图3的结果，这四组引物和探针的扩增效率和线性均符合E处于90-110％、R²≥0.98的要求，这表明这四组引物和探针的扩增效果接近理想情况，检测结果与Ct值之间的相关性越高。

特异性验证：当引物之间存在引物二聚体时，扩增时可能会形成非特异性产物，一般基于探针法的qPCR结果无法分辨是否产生非特异性扩增。在本实施例中，采用染料法通过观察熔解曲线的出峰情况分辨是否产生了非特异性扩增，以目标片段为模板时若仅出现一个峰，表明未产生非特异性扩增；若产生多个峰，表明产生了非特异性扩增。

以水为模板，使用Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix试剂对表1中的第6组、第18组、第19组和第20组的上游引物和下游引物进行特异性验证，双孔复测。反应体系及反应条件如下表5所示：

表5：特异性验证的反应体系和反应条件

熔解曲线采集程序使用仪器默认程序即可。

扩增结果如图4所示。由图4可知，当以水为模板时，所测试的四组上游引物和下游引物经染料法的扩增结果在该图中均未出峰，表明这四组上游引物和下游引物之间不存在非特异性扩增。

实施例3：HIV-1体外转录RNA标准品的制备

HIV-1为RNA病毒，HIV-1的核酸检测通常是检测血浆中的HIV-1RNA来确认感染状态。为了避免不同的模板类型影响最佳反应条件的优化，在优化反应条件之前，对HIV-1的质粒进行体外转录试验，构建HIV-1体外转录RNA标准品，具体步骤如下：

1.扩增含有目的片段的线性化DNA片段

(1)前期构建的质粒以pUC57为载体，将目的片段插入载体序列之间构成质粒全序。分析质粒全序，在目的片段上游和下游分别设计一组各质粒通用的转录引物。引物合成时，在上游引物的5’端引入T7启动子(5’-GGATCCTAATACGACTCACTATAGG-3’)，引物序列如表6所示。

表6：体外转录实验使用的引物序列

(2)使用TaKaRa Ex试剂盒，以F-T7和R-T7为引物，各质粒为模板进行扩增。反应体系共50μL，包括：0.25μL TaKaRa Ex Taq(5U/μL)；5μL 10×Ex Taq Buffer(Mg²⁺free)；4μL MgCl₂(25mM)；4μL dNTP Mixture；4μL F-T7和R-T7(10μM)；模板和水补足50μL，模板可以过量，但要确保回收的PCR产物总量达到1μg；反应条件为：①98℃，10秒；②55℃，30秒；72℃，60秒，30个循环。

(3)配制浓度为1％-1.2％的琼脂糖凝胶，将50μL的PCR产物加入样本槽进行凝胶电泳实验。试验结束后将目的片段切下用于后续回收。

2.回收PCR产物

使用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根#DP209)对扩增产物进行纯化回收。

3.体外转录HIV-1RNA标准品

使用NanoDrop One分光光度计对回收产物进行定量，取适量体积为模板(保证总模板量约为1μg)，使用Promega T7 RiboMAX Express Large Scale RNA ProductionSystem试剂进行体外转录。向模板中加入10μL RiboMAXTM Express T7 2×Buffer，2μLEnzyme Mix,T7 Express，加水补齐至30μL后轻柔混匀，37℃孵育30分钟；加入RQ1 RNase-Free DNase，至终浓度为1U/μg模板DNA，轻柔混匀，37℃孵育15分钟，去除DNA模板。使用RNAsimple总RNA提取试剂盒(天根#DP419)提取转录产物中的RNA。

实施例4：内参质粒的引物和探针的设计及验证

为了保证检测结果的可靠性，避免由于实验过程中的系统误差或失败导致检测结果与真实结果相差较大或不一致的情况，构建内参序列及相应的引物探针用于对核酸扩增过程进行内部质量控制。

内参质粒构建：参考国家药监局注册的商品化HIV-1病毒载量检测试剂盒如RocheCobas AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1Test,version 2.0及Abbott RealTime HIV-1Kit，选择非人源性的序列(如SEQ ID NO.16所示)构建内参质粒，具体步骤如下：

为避免内参质粒与扩增的引物对和探针之间的非特异性二聚或错配而造成的非特异性扩增，使用非人源性的胡萝卜基因组(GenBank:CM004278.1)设计内参质粒。选择多个约200bp的基因片段，初步设计引物和探针。使用PrimerSelect软件进行筛选，确保内参质粒自身的引物对和探针之间不产生非特异性二聚，同时还确保其与HIV-1引物和探针之间不产生非特异性二聚。使用SnapGene软件进行序列比对，选择内参引物和探针与HIV-1序列不匹配且与HIV-1的引物和探针不匹配的基因片段作为内参质粒。

内参引物和探针的设计：在设计内参质粒的引物和探针时，参照引物和探针的设计原则，针对SEQ ID NO.16所示的内参质粒序列设计引物和探针，如下表7所示。

表7：内参质粒的引物和探针

内参	序列
		上游引物：	GTTAGTACACGGGAATTTCATG(SEQ ID NO.13)
下游引物：	CATTATTTTTGCTACAATTCAGTC(SEQ ID NO.14)
		探针：	ATTTCACCGGGAAGTTTCTT-MGB(SEQ ID NO.15)

内参质粒线性化：为了避免在封闭的质粒结构中无法获得目标基因，并最终影响检测性能和最终定量，在优化反应条件之前，对内参的质粒进行如下步骤的线性化试验：

分析内参质粒序列，内参质粒以pUC57为载体，为保证酶切后内参基因的完整性，选择EcoRI位点进行酶切。

酶切选用的试剂为NEB EcoRI-HF。取适量体积环状质粒为模板(保证总模板量约为1μg)，加入5μL 10×NEBuffer，1μL限制性内切酶，加水补齐至50μL后轻柔混匀，37℃孵育5-15分钟后，65℃加热孵育20分钟，得到线性质粒和酶切试剂混合物。使用普通DNA产物纯化试剂盒(天根#DP204)进行纯化，得到线性化内参质粒。

内参引物和探针的扩增：参考实施例2中的步骤，分别以水和理论浓度为10⁵拷贝/μL的内参质粒为模板，使用TaKaRa One Step PrimeScript^TM RT-PCR试剂盒及内参引物和探针进行双孔复测，具体反应体系及反应条件如上表4所示。扩增结果如图5所示，由图5可知，质粒模板均扩增成功，水模板均未扩增成功。

内参引物和探针的验证：参考实施例2中的步骤对内参引物和探针的扩增效率和线性进行验证，结果如图6所示。由图6可知，该组内参引物和探针的扩增效率和线性符合E处于90-110％、R²≥0.98的要求。

特异性验证：

(1)参考实施例2的特异性验证步骤，以水为模板，使用染料法，使用Taq ProUniversal SYBR qPCR Master Mix试剂，分以下13组对内参质粒的上下游引物对和HIV-1的LTR区、gag区和pol区和Ψ区的四组上下游引物对进行两两比较，双孔复测，具体的反应体系及反应条件如上表5所示。

第一组复孔：内参的上游引物和下游引物；

第二组复孔：内参的上游引物和LTR区的上游引物；

第三组复孔：内参的上游引物和LTR区的下游引物；

第四组复孔：内参的上游引物和gag区的上游引物；

第五组复孔：内参的上游引物和gag区的下游引物；

第六组复孔：内参的上游引物和pol区的上游引物；

第七组复孔：内参的上游引物和pol区的下游引物；

第八组复孔：内参的下游引物和LTR区的上游引物；

第九组复孔：内参的下游引物和LTR区的下游引物；

第十组复孔：内参的下游引物和gag区的上游引物；

第十一组复孔：内参的下游引物和gag区的下游引物；

第十二组复孔：内参的下游引物和pol区的上游引物；

第十三组复孔：内参的下游引物和pol区的下游引物。

扩增结果如图7所示。由图7可知，内参的上下游引物对之间，以及内参的上游引物或下游引物与HIV-1的上游引物或下游引物之间均不存在非特异性扩增。

(2)参考实施例1的二轮筛选扩增步骤，以理论浓度为10⁵拷贝/μL的HIV-1体外转录RNA为模板，使用TaKaRa One Step PrimeScript^TM RT-PCR试剂盒及内参引物和探针进行双孔复测，具体反应体系及反应条件如上表3所示。扩增结果如图8所示。由图8可知，双孔复测均无法扩增成功。

(3)参考实施例2的扩增效率验证步骤，以理论浓度为10⁵拷贝/μL的线性化内参质粒为模板，使用TaKaRa One Step PrimeScript^TM RT-PCR试剂盒，分别使用LTR+gag和LTR+pol区的引物和探针进行双靶标检测，具体反应体系及反应条件如上表4所示。扩增结果如图9所示。由图9可知，双孔复测均无法扩增成功。

上述扩增结果均表明，内参引物和探针与HIV-1RNA的引物和探针一起使用时，不会发生非特异性扩增，具有良好的特异性。

实施例5：单重dPCR反应条件优化

使用Ψ区引物和探针建立单靶点的dPCR扩增反应以进行HIV-1RNA检测。通过以下步骤对单靶点的dPCR扩增反应条件进行优化。

退火温度优化：退火温度与引物的Tm值相关，通常最适的退火温度低于引物的最低Tm值3-5℃。本次合成的Ψ区上游引物Tm值为62℃，下游引物Tm值为63℃，理论上最适的退火温度为57-60℃。此外，本次使用的dPCR扩增试剂为QlAcuity One-step Viral RT-PCRKit，试剂说明书中推荐的最适退火温度为60℃。故以10⁵拷贝/μL的HXB2体外转录RNA为模板，分别以58℃、60℃和62℃为退火温度，观察在各退火温度下的“雨滴”形成情况，以“雨滴”形成较少且阴阳性分区较明显的温度作为退火温度。其中“雨滴”是指dPCR一维图的阳性分区和阴性分区之间存在的一些扩增效率较低的阳性液滴，如果在计算拷贝数时排除“雨滴”会造成结果被低估。反应体系及反应条件如下表8所示：

表8：退火温度优化的反应体系和反应条件：

扩增结果如图10所示，当退火温度为60℃时，“雨滴”形成较少，阴阳性分区较明显，故选择60℃作为退火温度。

延伸时间循环数优化：目前PCR常用的延伸时间和循环数通常为：“30秒，40/45个循环”和“1分钟，40/45个循环”，已可以满足绝大多数情况下的扩增需求。在60℃退火温度下，不改变反应体系和其他反应条件，比较在“退火延伸时间30秒，40个循环”和“退火延伸时间1分钟，45个循环”时的“雨滴”形成情况。扩增结果同样如图10所示，在两个条件下，“雨滴”形成情况及阴阳性分区情况类似，且dPCR定量值相近，为了减少扩增反应时间，选择“退火延伸时间30秒，40个循环”作为反应条件。

引物和探针浓度：在优化好的退火温度、延伸时间和循环数条件下，加入不同体积的引物和探针混合物(总浓度为10μM)：0.8μL、1.2μL、1.6μL、2μL和2.4μL，其中引物和探针混合物中的比例为上游引物：下游引物：探针＝2：2：1，使得扩增体系中每种引物的终浓度分别为0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM和0.6μM，探针的终浓度分别0.1μM、0.15μM、0.2μM、0.25μM和0.3μM。比较在各引物和探针浓度下的“雨滴”形成情况，当加入引物和探针混合物1.6μL(引物：0.4μM；探针：0.2μM)时，“雨滴”形成较少，阴阳性分区较明显。扩增结果如图10所示。由图10可知，在其他条件一致的情况下，退火温度60℃，退火延伸时间30秒，40个循环以及加入引物和探针混合物1.6μL(引物：0.4μM；探针：0.2μM)时，dPCR一维图中“雨滴”形成较少，阴阳性分区较明显，由此得到最终的反应条件为：退火温度：60℃；引物和探针的浓度：加入总浓度为10μM的引物和探针混合物1.6μL(引物：0.4μM；探针：0.2μM)；循环数和延伸时间：40个循环，30秒。

实施例6：双重dPCR的引物选择

在本实施例中，将LTR区、gag区和pol区的引物进行两两组合(即，LTR+gag、LTR+pol和gag+pol)，建立双靶点HIV-1RNA检测体系。这里未引入Ψ区引物和探针的原因在于在之前的实验中，发现Ψ区引物与其他三组引物之间会存在二聚体。

特异性验证：参考实施例2的特异性验证步骤，以水为模板，使用Taq ProUniversal SYBR qPCR Master Mix试剂，分以下12组对HIV-1LTR区、gag区和pol区的三组上下游引物对进行特异性验证，双孔复测，具体的反应体系及反应条件如上表5所示。

第一组复孔：LTR区的上游引物和gag区的上游引物；

第二组复孔：LTR上游引物和gag区的下游引物；

第三组复孔：LTR的上游引物和pol区的上游引物；

第四组复孔：LTR的上游引物和pol区的下游引物；

第五组复孔：LTR区的下游引物和gag区的上游引物；

第六组复孔：LTR区的下游引物和gag区的下游引物；

第七组复孔：LTR区的下游引物和pol区的上游引物；

第八组复孔：LTR区的下游引物和pol区的下游引物；

第九组复孔：gag区的上游引物和pol区的上游引物；

第十组复孔：gag区的上游引物和pol区的下游引物；

第十一组复孔：gag区的下游引物和pol区的上游引物；

第十二组复孔：gag区的下游引物和pol区的下游引物。

扩增结果如图11所示，其中gag区和pol区的引物对组合出现了一个高峰(第十一组)和一个矮峰(第十组)，表明gag区和pol区的引物之间存在非特异性扩增，而LTR+gag或LTR+pol的引物对组合并未出现类似的峰，表明这两个组合的引物之间不存在非特异性扩增，特异性良好，故在后续的实验中选择LTR+gag或LTR+pol的组合进行性能验证和条件优化。

双靶点引物探针组合选择：参考实施例1的二轮筛选步骤，以相同浓度的HIV-1RNA为模板，分别使用LTR+gag和LTR+pol组引物和探针进行扩增，双孔复测。具体步骤如下：以理论浓度为10⁵拷贝/μL的HIV-1体外转录RNA为模板，分别使用TaKaRa One StepPrimeScript^TM RT-PCR试剂盒、QlAcuity One-step Viral RT-PCR Kit及LTR+gag和LTR+pol组引物和探针进行扩增，双孔复测，具体的反应体系及反应条件如上表3及表8所示。扩增结果分别如图12和图13所示。由图12可知，LTR+pol组引物和探针的Ct值更小，并且由图13可知，LTR+pol组的dPCR定量结果更高，故选用LTR+pol组引物和探针进行后续优化。

实施例7：双重dPCR扩增反应条件优化

在本实施例中，对实施例6中选出的LTR+pol组引物和探针进行后续的扩增反应条件优化。

退火温度优化：为了找到最佳的退火温度，使用Bio-Rad CFX96 qPCR进行退火温度测试。使用dPCR的反应体系，在50-60℃之间设定8个温度梯度(即，50℃、50.7℃、52℃、53.9℃、56.3℃、58.3℃、59.4℃和60℃)，双孔复测，具体步骤如下：

以理论浓度为10⁵拷贝/μL的HIV-1体外转录RNA为模板，使用TaKaRa One StepPrimeScript^TM RT-PCR试剂盒及LTR+pol组引物和探针进行扩增，双孔复测，以避免因实验操作导致的单孔扩增失败造成的不准确结果。扩增时选用Bio-Rad CFX96仪器，在设置退火温度时，选择插入温度梯度，设置最低温度为50℃，最高温度为60℃，由仪器自动生成中间6个温度。反应体系及反应条件如下表9所示：

表9：退火温度优化的反应体系和反应条件：

扩增结果如图14所示，比较图14中各温度下的Ct值，Ct值越小表明扩增效率越高，初步确定退火温度的优化范围在50℃-56℃之间。

进一步，在dPCR仪上分别以50℃、52℃、54℃、56℃和60℃(说明书推荐的酶最适温度)为退火温度进行扩增，具体步骤同上。扩增结果如图15(一维图)和图16(二维图)所示。由此可知，当退火温度为52℃时，一维图中“雨滴”形成较少，阴阳性分区较明显；结合二维图进行分析，发现第一象限(HIV-1阳性，内参阴性)和第二象限(HIV-1阴性，内参阴性)之间的“雨滴”较少，分区较明显，由此，选择52℃为最终退火温度。

循环数优化：在52℃的退火温度下，保证扩增反应体系和其他反应条件不变，仅改变循环数，分别采用“40个循环，30秒”和“45个循环，30秒”这两个条件分别进行扩增，比较在这两个条件下的“雨滴”形成情况。

扩增结果如图17所示。由图17可知，当采用“45个循环，30秒”的条件时，一维图中“雨滴”形成较少，阴阳性分区较明显，二维图中第一象限和第二象限之间的“雨滴”较少，且最终定量结果高于“40个循环，30秒”的1拷贝/μL左右，最终选择“45个循环，30秒”作为最终循环数和延伸时间。

引物和探针浓度优化：在52℃退火温度、“45个循环，30秒”的循环数和延伸时间条件下，改变反应体系中引物探针的浓度，分别加入总浓度为10μM的引物和探针混合物1.0μL、1.2μL、1.4μL、1.6μL、1.8μL、2.0μL、2.2μL和2.4μL，使得每种引物的终浓度分别为0.25μM、0.3μM、0.35μM、0.4μM、0.45μM、0.5μM、0.55μM和0.6μM，探针的终浓度分别为0.125μM、0.15μM、0.175μM、0.2μM、0.225μM、0.25μM、0.275μM和0.3μM。比较在这八个浓度条件下的扩增情况，结果如图18所示。由图18可知，当加入1.8μL10μM的引物和探针混合物(即，引物：0.45μM；探针：0.225μM)时，“雨滴”形成较少，阴阳性分区较明显，定量结果较高且稳定，最终选择加入总浓度为10μM的引物和探针混合物1.8μL(即，引物：0.45μM；探针：0.225μM)作为最终的反应条件。

实施例8：亚型覆盖度验证

通过Sanger测序法对毒株进行近全长基因组测序，对阳性样本的pol区进行测序，分析获得的序列信息，获得毒株和样本的基因亚型，包括CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B和CRF55_01B亚型。采用本发明的Ψ区引物和探针进行单靶点(单重)dPCR检测，使用本发明的LTR+pol区引物和探针进行双靶点(双重)dPCR检测，dPCR试剂选用的为QlAcuity One-step Viral RT-PCR Kit，反应体系的总体积为40μL。将成功提取的核酸作为模板进行检测，反应体系及反应条件如下表10和表11所示：

表10：单重dPCR的反应体系和反应条件

表11：双重dPCR的反应体系和反应条件

使用建立的dPCR检测方法对其中的50份样本进行检测，双靶点dPCR方法和单靶点dPCR方法的阳性检出率均为100％，样本的亚型分布情况如表12所示：

表12：毒株和样本的亚型分布信息

实施例9：单重dPCR和双重dPCR检测的检出限

使用HIV-1国家标准品，在优化后的条件下与具有相同扩增靶区域的商品化试剂盒(采用qPCR方法，双靶点，LTR+pol，内参定量)的检测结果进行比较。使用本发明的dPCR检测方法分别对理论浓度为320IU/mL、160IU/mL、80IU/mL、40IU/mL、20IU/mL、10IU/mL、5IU/mL、2IU/mL和1IU/mL的标准品进行检测，每个浓度的标准品进行10次检测，反应体系和反应条件同实施例8。以检出数为响应频率对检测结果进行Probit概率分析，计算阳性检出率为95％时的预测值即为该试剂的检出限。

检测结果如表13所示。由表13可知，采用本发明的Ψ区、LTR+pol区引物和探针的dPCR扩增方法可以使用更少的模板量达到更高的灵敏度。通过计算dPCR方法的检出限并与双靶点的qPCR商品化试剂盒进行比较，发现双靶点dPCR、单靶点dPCR和商品化qPCR试剂盒的检出限分别为6.496IU/mL、17.687IU/mL和61.298IU/mL，即，本发明建立的双靶点dPCR方法检出限远低于现有技术的双靶点qPCR。

表13：本发明的引物探针组与商品化试剂盒的检出限比较

实施例10：特异性检测

使用本发明的dPCR检测方法对10支正常人血浆样本以及40支HIV-1RNA阴性，梅毒螺旋体、HCV和HBV单阳或双阳的样本进行检测，反应体系和反应条件同实施例8。HIV-1阴性样本的分布情况及检出率如下表14所示。由该表结果可知，双靶点dPCR方法和单靶点dPCR方法的阴性检出率均为100％，表明建立的dPCR检测方法特异性良好，不会与梅毒螺旋体、HCV和HBV感染者样本产生交叉反应。

表14：HIV-1阴性样本的分布情况

实施例11：双重dPCR检测的精密度

使用本发明的dPCR方法分别对理论浓度为13000IU/mL、1300IU/mL和130IU/mL的HIV-1国家标准品进行检测，反应体系和反应条件同实施例8，每个浓度的标准品进行5次检测，计算双靶点dPCR方法的精密度(CV％)。此外，将双靶点dPCR方法的CV％与商品化试剂盒A和B(采用qPCR方法，国家艾滋病参比实验室内部试剂评估精密度最优的国产(A)和进口(B)试剂盒)的结果进行比较。

检测结果如表15所示。由表15可知，采用本发明的LTR+pol区引物和探针的dPCR方法在检测高、中、低三个浓度的标准品时，检测结果的CV％均低于基于qPCR的商品化试剂盒，精密度更高，且远低于《中华人民共和国医药行业标准—核酸扩增检测用试剂(盒)》规定的定量试剂批内精密度应符合检测浓度对数值的变异系数(CV，％)≤5％的要求。

表15：本发明的双靶点引物探针组与商品化试剂盒的精密度比较

序列表：

SEQ ID NO.1(Ψ区上游)：TAGCAGTGGYGCCCGAACAG

SEQ ID NO.2(Ψ区下游)：GCTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCTA

SEQ ID NO.3(Ψ区探针)：CAGGACTCGGCTTGCTGA-MGB

SEQ ID NO.4(LTR区上游)：GCCTCAATAAAGCTTGCCTT

SEQ ID NO.5(LTR区下游)：GCRCCACTGCTAGAGATTTT

SEQ ID NO.6(LTR区探针)：ACTCTGGTAWCTAGAGATCCCTCAG-MGB

SEQ ID NO.7(pol区上游)：GGTTTATTACAGRGACARCAGA

SEQ ID NO.8(pol区下游)：CYGCYCCTTCACCTTTCCA

SEQ ID NO.9(pol区探针)：TGGAAAGGACCAGC-MGB

SEQ ID NO.10(gag区上游)：GCGGAGGCTAGAAGGAGA

SEQ ID NO.11(gag区下游)：CYCTGCTTGCCCATACTA

SEQ ID NO.12(gag区探针)：ATGGGTGCGAGAGCGTC-MGB

SEQ ID NO.13(内参上游)：GTTAGTACACGGGAATTTCATG

SEQ ID NO.14(内参下游)：CATTATTTTTGCTACAATTCAGTC

SEQ ID NO.15(内参探针)：ATTTCACCGGGAAGTTTCTT-MGB

SEQ ID NO.16(内参质粒序列)：CGAATTCTCAAAGGGGTTAGTACACGGGAATTTCA

TGAAAATTTCACCGGGAAGTTTCTTTTGATATTTTCACATAAATAGGTACTTATGGAT

ATATGAATTTGGTCATGACAATATTTGGGGCAGTCGAGACTGAATTGTAGCAAAAAT

AATGAAGTTCGAGTTTTT

Claims

1.用于扩增HIV-1核酸的引物对和探针组合，所述引物对组合为LTR区引物对和pol区引物对的组合，其中：

所述LTR区引物对包括序列如SEQ ID NO.4所示的LTR区上游引物和序列如SEQ IDNO.5所示的LTR区下游引物；

所述pol区引物对包括序列如SEQ ID NO.7所示的pol区上游引物和序列如SEQ IDNO.8所示的pol区下游引物；

所述探针组合为LTR区探针和pol区探针的组合，其中：

所述LTR区探针的序列如SEQ ID NO.6所示：

所述pol区探针的序列如SEQ ID NO.9所示。

2.用于检测HIV-1核酸的反应体系，所述反应体系包括根据权利要求1所述的引物对和探针组合。

3.根据权利要求2所述的反应体系，其中，所述反应体系还包括内参引物对和探针组合。

4.根据权利要求3所述的反应体系，其中，所述内参引物对和探针组合包括：序列如SEQID NO.13所示的内参上游引物，序列如SEQ ID NO.14所示的内参下游引物，以及序列如SEQID NO.15所示的内参探针。

5.权利要求1所述的引物对和探针组合在制备用于检测HIV-1的检测体系中的用途。

6.根据权利要求5所述的用途，其中，所述检测体系还包括内参引物对和探针组合，其包括：序列如SEQ ID NO.13所示的内参上游引物，序列如SEQ ID NO.14所示的内参下游引物，以及序列如SEQ ID NO.15所示的内参探针。

7.根据权利要求5或6所述的用途，其中，所述检测通过基于双重dPCR的引物扩增和探针杂交来进行。

8.一种用于检测HIV-1的方法，所述方法用于非诊断目的，包括：

1)提供HIV-1核酸样本；

2)以所述HIV-1核酸样本为模板，使用权利要求1所述的引物对和探针组合对HIV-1核酸扩增并检测。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述检测还包括使用内参引物对和探针组合。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述内参引物对和探针组合包括：序列如SEQ IDNO.13所示的内参上游引物，序列如SEQ ID NO.14所示的内参下游引物，以及序列如SEQ IDNO.15所示的内参探针。

11.根据权利要求8-10中任一项所述的方法，其中，所述扩增通过双重dPCR进行扩增。

12.根据权利要求8-10中任一项所述的方法，其中，每种引物的浓度为0.2μM-0.6μM，所述探针的浓度为0.1μM-0.3μM。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，每种引物的浓度为0.4μM-0.45μM。

14.根据权利要求12所述的方法，其中，所述探针的浓度为0.2μM-0.225μM。

15.根据权利要求8-10中任一项所述的方法，其中，所述扩增反应的退火温度为50℃-56℃，退火延伸时间为30秒，循环数为45次。

16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述扩增反应的退火温度为52℃。

17.一种用于检测HIV-1的试剂盒，包括：

a)权利要求1所述的引物对和探针组合；以及

b)用于指示如何使用该试剂盒的使用说明。

18.根据权利要求17所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括内参引物对和探针组合。

19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中，所述内参引物对和探针组合包括：序列如SEQID NO.13所示的内参上游引物，序列如SEQ ID NO.14所示的内参下游引物，以及序列如SEQID NO.15所示的内参探针。