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CN118497317A - 用于甲基化测序的单细胞全基因组文库 - Google Patents

用于甲基化测序的单细胞全基因组文库 Download PDF

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CN118497317A
CN118497317A CN202410696026.8A CN202410696026A CN118497317A CN 118497317 A CN118497317 A CN 118497317A CN 202410696026 A CN202410696026 A CN 202410696026A CN 118497317 A CN118497317 A CN 118497317A
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nucleic acid
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amplification
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CN202410696026.8A
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A·C·艾迪
R·穆奎恩
F·J·斯蒂默斯
D·K·波克洛克
S·诺伯格
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Oregon Health and Science University
Illumina Inc
Original Assignee
Oregon Health and Science University
Illumina Inc
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Abstract

本文提供了制备用于确定来自多个单细胞的核酸的甲基化状态的测序文库的方法。本发明方法将分开‑合并式组合指标化与亚硫酸氢盐处理技术组合，以快速、准确并且廉价地表征大量单细胞的甲基化概况。

Description

用于甲基化测序的单细胞全基因组文库
本申请是2018年06月05日提交的申请号为PCT/US2018/036078、发明名称为“用于甲基化测序的单细胞全基因组文库”的国际申请的分案申请，所述国际申请于2020年02月06日进入中国国家阶段，其申请号为201880051298.5。
序列表
本申请包含以ASCII格式电子提交的序列表，其以引用的方式全文纳入本文。所述ASCII副本，创建于2018年8月15日，名称为IP-1584-PCT_SL.txt且大小为35,954字节。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年6月7日提交的美国临时申请序列号62/516,324的权益，通过引用将其结合在此。
技术领域
本披露内容的实施例涉及对核酸进行测序。具体而言，本文提供的方法和组合物的实施例涉及产生单细胞亚硫酸氢盐测序文库并且从中获得序列数据。
背景技术
高细胞计数单细胞测序已经显示出其经由转录组、染色质-可及性和突变差异在复杂组织内的群体分离中的效率。此外，单细胞分辨率已经允许以基因组特异性模式(例如DNA的甲基化)来评估细胞分化的轨迹。DNA甲基化是胞嘧啶的共价加成；具有细胞类型特异性的标记，其是发育的组织中进行主动修饰的对象。可以使用亚硫酸氢钠处理的脱氨化学以碱基对的分辨率探测DNA甲基化。
最近的工作已经优化了亚硫酸氢盐测序，甚至在单细胞还原简约表示亚硫酸氢盐测序(scRRBS)或单细胞全基因组亚硫酸氢盐测序(scWGBS)中需要单细胞输入。然而，这些方法缺乏可扩缩性，依赖于经由并行和分离的文库产生的单细胞解卷积，其中单细胞反应是在分离中进行的。对于每个细胞测序均需要一套全新的试剂，导致每个额外细胞的成本的线性扩缩。由于DNA的亚硫酸氢盐转化的挑战，对于单细胞亚硫酸氢盐测序，没有采用基于液滴或芯片的微流体系统，也不存在使用替代平台的任何理论上可行的策略。
发明内容
本文提供了组合物和可扩缩的高细胞计数、单细胞甲基化组剖析测定。通过本文提供的单细胞组合指标化策略改善了单细胞全基因组测序(scWGBS)，因此可以批量处理细胞，并且可以在计算机上(in silico)对单细胞输出进行多路分解(demultiplexed)。在一些实施例中，本文提供的方法利用了基于转座酶的衔接子的掺入，与现有方法相比，该方法导致提高的效率以及更高的比对率。使用转座酶附加两个测序衔接子之一可以使文库构建更高效并且噪声读段更低，因此得到当与使用单细胞单孔方法的10％-30％相比时约60％的比对率(与大量细胞策略相似的比率)。这样可以得到更有用的序列读段，并且大大降低测定的测序部分的成本。使用单细胞组合指标化策略产生单细胞亚硫酸氢盐测序文库展示于具有最小冲突比率的人细胞与小鼠细胞的混合物中。还展示了三种人类细胞类型的混合物的成功解卷积，并且使用公开可用的数据实现了细胞类型分配。
定义
如本文所用，术语“生物体”、“受试者”可互换使用并且是指动物和植物。动物的实例是哺乳动物，如人类。
如本文所用，术语“细胞类型”旨在基于形态、表型、发育起源或其他已知或可识别的区别性细胞特征来鉴定细胞。可以从单个生物体(或从相同的生物体物种)获得多种不同的细胞类型。示例性细胞类型包括但不限于膀胱细胞、胰上皮细胞、胰α细胞、胰β细胞、胰内皮细胞、骨髓成淋巴细胞、骨髓B成淋巴细胞、骨髓巨噬细胞、骨髓成红细胞、骨髓树突细胞、骨髓脂肪细胞、骨髓骨细胞、骨髓软骨细胞、成早幼粒细胞(promyeloblast)、骨髓成巨核细胞、膀胱细胞、脑B淋巴细胞、脑神经胶质细胞、神经元细胞、脑星形胶质细胞、神经外胚层细胞、脑巨噬细胞、脑小神经胶质细胞、脑上皮细胞、皮质神经元细胞、脑成纤维细胞、乳腺上皮细胞、结肠上皮细胞、结肠B淋巴细胞、乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞、乳腺成纤维细胞、结肠肠上皮细胞、子宫颈上皮细胞、卵巢上皮细胞、卵巢成纤维细胞、乳腺导管上皮细胞、舌上皮细胞、扁桃体树突细胞、扁桃体B淋巴细胞、外周血成淋巴细胞、外周血T成淋巴细胞、外周血皮肤T淋巴细胞、外周血自然杀伤细胞、外周血B成淋巴细胞、外周血单核细胞、外周血成粒细胞、外周血成单核细胞、外周血成早幼粒细胞、外周血巨噬细胞、外周血嗜碱性粒细胞、肝内皮细胞、肝肥大细胞、肝上皮细胞、肝B淋巴细胞、脾内皮细胞、脾上皮细胞、脾B淋巴细胞、肝细胞、肝亚历山大细胞(liver Alexander)、肝成纤维细胞、肺上皮细胞、支气管上皮细胞、肺成纤维细胞、肺B淋巴细胞、肺施旺细胞(lung Schwann)、肺鳞状细胞、肺巨噬细胞、肺成骨细胞、神经内分泌细胞、肺泡细胞、胃上皮细胞和胃成纤维细胞。
如本文所用，术语“组织”旨在意指共同作用以在生物体中执行一种或多种特定功能的细胞的集合或聚集。这些细胞可以任选地形态相似。示例性组织包括但不限于眼、肌肉、皮肤、肌腱、静脉、动脉、血液、心、脾、淋巴结、骨骼、骨髓、肺、支气管、气管、肠、小肠、大肠、结肠、直肠、唾液腺、舌、胆囊、阑尾、肝、胰腺、脑、胃、皮肤、肾脏、输尿管、膀胱、尿道、性腺、睾丸、卵巢、子宫、输卵管、胸腺、垂体、甲状腺、肾上腺或甲状旁腺。组织可以衍生自人类或其他生物体的多种器官中的任一种。组织可以是健康组织或不健康组织。不健康组织的实例包括但不限于甲基化异常的多种恶性肿瘤，例如，肺、乳腺、结肠直肠、前列腺、鼻咽、胃、睾丸、皮肤、神经系统、骨骼、卵巢、肝脏、血液组织、胰腺、子宫、肾、淋巴组织等中的恶性肿瘤。这些恶性肿瘤可以是多种组织学亚型，例如癌、腺癌、肉瘤、纤维腺癌、神经内分泌癌或未分化的癌。
如本文所使用的，术语“区室”旨在意指将某物与其他事物分开或分离的区域或容积。示例性区室包括但不限于小瓶、管、孔、液滴、丸、珠、容器、表面特征或由诸如流体流、磁性、电流等的物理力分开的区域或容积。在一个实施例中，区室是多孔板(例如96孔板或384孔板)的孔。
如本文所用，“转座体复合物”是指整合酶和包括整合识别位点的核酸。“转座体复合物”是由转座酶和转座酶识别位点形成的功能性复合物，其能够催化转座反应(参见，例如，Gunderson等人,WO 2016/130704)。整合酶的实例包括但不限于诸如整合酶或转座酶。整合识别位点的实例包括但不限于转座酶识别位点。
如本文所用，术语“核酸”旨在与其在本领域中的用途一致，并且包括天然存在的环核酸或其功能类似物。特别有用的功能类似物能够以序列特异性方式与核酸杂交，或者能够用作特定核苷酸序列的复制的模板。天然存在的核酸通常具有含有磷酸二酯键的骨架。类似物结构可能具有替代的骨架连接，包括本领域已知的各种骨架连接中的任一种。天然存在的核酸通常具有脱氧核糖(例如在脱氧核糖核酸(DNA)中发现)或核糖(例如在核糖核酸(RNA)中发现)。核酸可能含有本领域已知的这些糖部分的多种类似物中的任一种。核酸可以包括天然或非天然碱基。就这一点而言，天然脱氧核糖核酸可以具有一种或多种选自由腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤组成的组的碱基，以及核糖核酸可以具有一种或多种选自由尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶或鸟嘌呤组成的组的碱基。可以包括在核酸中的有用的非天然碱基是本领域已知的。非天然碱基的实例包括锁核酸(LNA)和桥核酸(BNA)。可将LNA和BNA碱基掺入DNA寡核苷酸中，并且增加寡核苷酸杂交的强度和特异性。LNA和BNA碱基和此类碱基的使用是本领域技术人员已知的并且是常规的。
如本文所用，术语“靶标”当关于核酸使用时，旨在在本文列出的方法或化合物的情况下作为核酸的语义标识符，并且除非另有明确说明，否则不一定限制该核酸的结构或功能。靶核酸可以是具有已知或未知序列的基本上任何核酸。它可以是例如基因组DNA或cDNA的片段。测序可能会确定整个或部分靶分子的序列。靶标可以衍生自原代核酸样品，例如细胞核。在一个实施例中，可以通过在每个靶片段的末端放置通用序列，将靶标加工成适合扩增的模板。还可以通过逆转录成cDNA从原代RNA样品获得靶标。
如本文所用，术语“通用”当用于描述核苷酸序列时，是指两个或更多个核酸分子共有的序列区域，其中这些分子还具有彼此不同的序列区域。存在于分子集合的不同成员中的通用序列可以允许使用通用捕获核酸(例如捕获寡核苷酸)群体捕获多种不同的核酸，这些通用捕获核酸与通用序列(例如通用捕获序列)的一部分互补。通用捕获序列的非限制性实例包括与P5和P7引物相同或互补的序列。类似地，存在于分子集合的不同成员中的通用序列可以允许使用与通用序列(例如通用锚定序列)的一部分互补的通用引物群体复制或扩增多种不同的核酸。因此，捕获寡核苷酸或通用引物包括可以与通用序列特异性杂交的序列。
当涉及扩增引物，例如捕获寡核苷酸时，可以使用术语“P5”和“P7”。术语“P5'”(P5引物)和“P7'”(P7引物)分别是指P5和P7的补体。将理解的是，任何合适的扩增引物均可用于本文提出的方法，并且P5和P7的使用仅是示例性的实施例。扩增引物(例如P5和P7)在流动池上的使用是本领域已知的，如以WO 2007/010251、WO 2006/064199、WO 2005/065814、WO 2015/106941、WO 1998/044151和WO 2000/018957的披露内容所例示。例如，任何合适的正向扩增引物，无论是固定的还是在溶液中，均可在本文所呈现的方法中用于与互补序列杂交和扩增序列。类似地，任何合适的反向扩增引物，无论是固定的还是在溶液中，均可在本文所呈现的方法中用于与互补序列杂交和扩增序列。本领域技术人员将理解如何设计和使用适合于捕获和/或扩增如本文所示的核酸的引物序列。
如本文所用，术语“引物”及其衍生物通常是指可以与感兴趣的靶序列杂交的任何核酸。典型地，引物起衬底作用，可以在该引物上通过聚合酶聚合核苷酸；然而，在一些实施例中，该引物可以掺入合成的核酸链中，并且提供另一个引物可以与之杂交的位点，以引发与合成的核酸分子互补的新链的合成。该引物可以包括核苷酸或其类似物的任何组合。在一些实施例中，该引物是单链寡核苷酸或多核苷酸。术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”在本文可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式，并且可以包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、其类似物或其混合物。这些术语应理解为包括由核苷酸类似物制成的DNA或RNA的类似物作为等效物，并且可应用于单链(例如有义或反义)和双链多核苷酸。本文所用的术语还涵盖cDNA，其是例如通过逆转录酶的作用从RNA模板产生的互补的或复制的DNA。此术语仅指分子的一级结构。因此，该术语包括三链、双链和单链脱氧核糖核酸(“DNA”)，和三链、双链和单链核糖核酸(“RNA”)。
如本文所用，术语“衔接子”及其衍生物，例如通用衔接子，通常是指可以与本披露内容的核酸分子连接的任何线性寡核苷酸。在一些实施例中，衔接子与样品中存在的任何靶序列的3'末端或5'末端基本上不互补。在一些实施例中，合适的衔接子长度在约10-100个核苷酸、约12-60个核苷酸和约15-50个核苷酸的长度范围内。通常，衔接子可以包括核苷酸和/或核酸的任何组合。在一些方面，衔接子可以在一个或多个位置包括一种或多种可切割基团。在另一方面，衔接子可以包括与引物(例如通用引物)的至少一部分基本上相同或基本上互补的序列。在一些实施例中，衔接子可以包括条形码或标签，以帮助下游纠错、识别或测序。术语“衔接子”(“adaptor”)和“衔接子”(“adapter”)可互换使用。
如本文中所使用的，术语“每个”当关于项目集合使用时，旨在标识该集合中的单个项目，但是不一定是指该集合中的每个项目，除非上下文另外明确指出。
如本文所用，术语“转运”是指分子通过流体的运动。该术语可以包括被动转运，例如分子沿其浓度梯度的运动(例如被动扩散)。该术语还可以包括主动转运，分子可以借此沿其浓度梯度或逆着其浓度梯度运动。因此，转运可以包括施加能量以使一种或多种分子沿期望的方向运动或运动至期望的位置，例如扩增位点。
如本文所用，“扩增”(“amplify”)、“扩增”(“amplifying”)或“扩增反应”及其衍生物通常是指任何作用或过程，借此将核酸分子的至少一部分复制或拷贝到至少一个另外的核酸分子中。另外的核酸分子任选地包括与模板核酸分子的至少某一部分基本相同或基本互补的序列。该模板核酸分子可以是单链的或双链的，并且该另外的核酸分子可以独立地是单链的或双链的。扩增任选地包括核酸分子的线性或指数复制。在一些实施例中，这种扩增可以使用等温条件进行；在其他实施例中，这种扩增可以包括热循环。在一些实施例中，该扩增是多重扩增，其包括在单个扩增反应中同时扩增多个靶序列。在一些实施例中，“扩增”包括单独的或组合的基于DNA和RNA的核酸的至少某一部分的扩增。该扩增反应可以包括本领域普通技术人员已知的任何扩增方法。在一些实施例中，该扩增反应包括聚合酶链反应(PCR)。
如本文所用，“扩增条件”及其衍生物通常是指适合于扩增一种或多种核酸序列的条件。这种扩增可以是线性的或指数的。在一些实施例中，扩增条件可以包括等温条件，或可替代地可以包括热循环条件或等温和热循环条件的组合。在一些实施例中，适合于扩增一种或多种核酸序列的条件包括聚合酶链反应(PCR)条件。典型地，扩增条件是指足以扩增核酸(例如一种或多种靶序列)或足以扩增与一种或多种衔接子连接的扩增的靶序列(例如连接衔接子的扩增的靶序列)的反应混合物。通常，扩增条件包括用于扩增或用于核酸合成的催化剂，例如聚合酶；与待扩增的核酸具有某种程度的互补性的引物；以及核苷酸，例如脱氧核糖核苷酸三磷酸酯(dNTP)，以促进引物与核酸杂交后的延伸。扩增条件可能需要引物与核酸的杂交或退火、引物的延伸以及变性步骤，在该变性步骤中将延伸的引物与经历扩增的核酸序列分开。典型地，但并非必须如此，扩增条件可以包括热循环；在一些实施例中，扩增条件包括多个循环，其中重复进行退火、延伸和分离步骤。典型地，扩增条件包括阳离子(例如Mg2+或Mn2+)，并且还可以包括离子强度的各种修饰剂。
如本文所用，“再扩增”及其衍生物通常是指任何过程，扩增的核酸分子的至少一部分借此经由任何合适的扩增过程(在一些实施例中称为“次级”扩增)进一步扩增，从而产生再扩增的核酸分子。次级扩增不需要与借之产生扩增的核酸分子的原始扩增过程相同；再扩增的核酸分子也不需要与扩增的核酸分子完全相同或完全互补；所需要的只是再扩增的核酸分子包括扩增的核酸分子或其补体的至少一部分。例如，再扩增可以涉及使用不同的扩增条件和/或不同的引物，包括与初级扩增不同的靶特异性引物。
如本文所用，术语“聚合酶链反应”(“PCR”)是指Mullis美国专利号4,683,195和4,683,202的方法，其描述了用于在不进行克隆或纯化的情况下增加基因组DNA的混合物中感兴趣的多核苷酸区段的浓度的方法。这个用于扩增感兴趣的多核苷酸的过程由以下组成：将大量过量的两种寡核苷酸引物引入含有所需感兴趣的多核苷酸的DNA混合物中，然后在DNA聚合酶存在下进行一系列热循环。这两种引物与它们在感兴趣的双链多核苷酸中的相应链互补。首先将混合物在较高温度下变性，然后将引物退火至感兴趣的多核苷酸分子内的互补序列。退火后，将引物用聚合酶延伸以形成一对新的互补链。可以将变性，引物退火和聚合酶延伸的步骤重复多次(称为热循环)，以获得高浓度的所需感兴趣的多核苷酸的扩增区段。所需感兴趣的多核苷酸(扩增子)的扩增区段的长度由引物相对于彼此的相对位置决定，并且因此，此长度是可控制的参数。借助于重复该过程，该方法称为“聚合酶链反应”(以下称为“PCR”)。因为感兴趣的多核苷酸的所需扩增区段成为混合物中的主要核酸序列(就浓度而言)，所以将它们称为“PCR扩增的”。在上述方法的改进中，可以使用多个不同的引物对(在一些情况下，每个感兴趣的靶核酸分子使用一种或多种引物对)对靶核酸分子进行PCR扩增，从而形成多重PCR反应。
如本文所定义，“多重扩增”是指使用至少一种靶特异性引物对样品内的两个或更多个靶序列进行的选择性和非随机扩增。在一些实施例中，进行多重扩增，以便在单个反应容器中扩增一些或全部的靶序列。给定的多重扩增的“重性(plexy)”或“重(plex)”通常是指在该单个多重扩增期间扩增的不同靶特定序列的数量。在一些实施例中，该重性可以是约12重、24重、48重、96重、192重、384重、768重、1536重、3072重、6144重或更高。还可以通过几种不同的方法学来检测扩增的靶序列(例如，凝胶电泳后进行光密度测定，用生物分析仪或定量PCR进行定量，与标记探针杂交；掺入生物素化引物后进行抗生物素蛋白-酶缀合物检测；将32P标记的脱氧核苷酸三磷酸酯掺入扩增的靶序列中)。
如本文所用，“扩增的靶序列”及其衍生物通常是指通过使用本文提供的靶特异性引物和方法扩增靶序列而产生的核酸序列。相对于靶序列，扩增的靶序列可以是同义的(即，正链)或反义的(即，负链)。
如本文所用，术语“连接(ligating)”、“连接(ligation)”及其衍生物通常是指将两个或更多个分子共价连接在一起(例如将两个或更多个核酸分子彼此共价连接)的过程。在一些实施例中，连接包括连接核酸的相邻核苷酸之间的切口。在一些实施例中，连接包括在第一核酸分子的末端和第二核酸分子的末端之间形成共价键。在一些实施例中，该连接可以包括在一个核酸的5'磷酸基团和第二核酸的3'羟基基团之间形成共价键，从而形成连接的核酸分子。通常，出于本披露内容的目的，可以将扩增的靶序列与衔接子连接，以产生连接衔接子的扩增的靶序列。
如本文所用，“连接酶”及其衍生物通常是指能够催化两个底物分子连接的任何试剂。在一些实施例中，该连接酶包括能够催化核酸的相邻核苷酸之间的切口连接的酶。在一些实施例中，该连接酶包括能够催化一个核酸分子的5'磷酸基与另一个核酸分子的3'羟基之间的共价键形成，从而形成连接的核酸分子的酶。合适的连接酶可以包括但不限于T4DNA连接酶、T4RNA连接酶和大肠杆菌(E.coli)DNA连接酶。
如本文所用，“连接条件”及其衍生物通常是指适合于将两个分子彼此连接的条件。在一些实施例中，连接条件适合于密封核酸之间的切口或缺口。如本文所用，术语切口或缺口与该术语在本领域中的使用一致。典型地，可以在合适的温度和pH下，在酶(例如连接酶)的存在下连接切口或缺口。在一些实施例中，T4DNA连接酶可以在约70-72℃的温度下连接核酸之间的切口。
如本文所用，术语“流动池”是指包含固体表面的小室，一种或多种流体试剂可以流过该固体表面。在本披露内容的方法中可以容易地使用的流动池以及相关的流体系统和检测平台的实例描述于例如以下文献中：Bentley等人,Nature 456:53-59(2008),WO 04/018497；US 7,057,026；WO 91/06678；WO 07/123744；US 7,329,492；US 7,211,414；US 7,315,019；US 7,405,281和US2008/0108082，所述文献各自通过引用并入本文。
如本文所用，术语“扩增子”当关于核酸使用时，意指复制该核酸的产物，其中该产物具有与该核酸的核苷酸序列的至少一部分相同或互补的核苷酸序列。可以通过使用该核酸或其扩增子作为模板的多种扩增方法中的任一种产生扩增子，这些扩增方法包括例如聚合酶延伸、聚合酶链反应(PCR)、滚环扩增(RCA)、连接延伸或连接链反应。扩增子可以是具有特定核苷酸序列的单个拷贝(例如PCR产物)或核苷酸序列的多个拷贝(例如RCA的多联体产物)的核酸分子。靶核酸的第一个扩增子典型地是互补拷贝。后续扩增子是在产生第一扩增子之后从靶核酸或从第一扩增子产生的拷贝。后续的扩增子可以具有与靶核酸基本互补或与靶核酸基本相同的序列。
如本文所用，术语“扩增位点”是指阵列中或阵列上可能产生一种或多种扩增子的位点。扩增位点可以进一步配置为含有、保持或附接在该位点处产生的至少一个扩增子。
如本文所用，术语“阵列”是指可以根据相对位置彼此区分的位点的群体。将位于阵列不同位点的不同分子可以根据阵列中这些位点的位置彼此区分开。阵列的单个位点可以包括特定类型的一个或多个分子。例如，位点可以包括具有特定序列的单个靶核酸分子，或者位点可以包括具有相同序列(和/或其互补序列)的几个核酸分子。阵列的位点可以是位于同一衬底上的不同特征。示例性特征包括但不限于：衬底中的孔、衬底中或衬底上的珠(或其他颗粒)、衬底的突出物、衬底上的脊或衬底中的通道。阵列的位点可以是各自带有不同分子的分开的衬底。可以根据衬底在与衬底相连的表面上的位置，或根据衬底在液体或凝胶中的位置来确定附接在分开的衬底的不同的分子。其中分开的衬底位于表面上的示例性阵列包括但不限于在孔中具有珠的那些。
如本文所用，术语“容量”当关于位点和核酸材料使用时，意指可以占据该位点的核酸材料的最大量。例如，该术语可以指在特定条件下可以占据该位点的核酸分子的总数量。也可以使用其他量度，包括例如在特定条件下可以占据该位点的核酸材料的总质量或特定核苷酸序列的总拷贝数。典型地，位点对于靶核酸的容量将基本上等于该位点对于该靶核酸的扩增子的容量。
如本文所用，术语“捕获剂”是指能够附接、保留或结合到靶分子(例如，靶核酸)的材料、化学物质、分子或其部分。示例性捕获剂包括但不限于与靶核酸的至少一部分互补的捕获核酸(在本文中也称为捕获寡核苷酸)、能够与靶核酸(或与其附接的连接部分)结合的受体-配体结合对的成员(例如抗生物素蛋白、链霉亲和素、生物素、凝集素、碳水化合物、核酸结合蛋白、表位、抗体等)、或能够与靶核酸(或与其附接的连接部分)形成共价键的化学试剂。
如本文所用，术语“克隆群体”是指相对于特定核苷酸序列是同质的核酸群体。同源序列典型地长度是至少10个核苷酸，但是甚至可以更长，包括例如长度是至少50、100、250、500或1000个核苷酸。克隆群体可以衍生自单个靶核酸或模板核酸。典型地，克隆群体中的所有核酸都将具有相同的核苷酸序列。将理解的是，在不脱离克隆性的情况下，克隆群体中可能发生少量突变(例如由于扩增人工产物(artifact))。
如本文所用，在组合物、物品、核酸或细胞核的情况下，“提供”意指制造该组合物、物品、核酸或细胞核，购买该组合物、物品、核酸或细胞核，或者以其他方式获得该化合物、组合物、物品或细胞核。
术语“和/或”意指所列举的要素的一个或所有或所列举的要素的任何两个或更多个的组合。
词语“优选的”和“优选地”指可以在某些环境下提供某些益处的本发明实施例。然而，在相同或其他环境下，其他实施例也可以是优选的。此外，叙述一个或多个优选实施例不意味着其他实施例是没用的，并且不旨在将其他实施例排除在本发明的范围之外。
当术语“包含”及其变体出现在说明书和权利要求中的情况下，这些术语不具有限制性含义。
应当理解，本文中不论在什么地方用语言“包括(include)”、“包括(includes)”或“包括(including)”等来描述实施例时，还提供了以“由……组成”和/或“基本上由……组成”的方式描述的其他类似实施例。
除非另外说明，“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”、“该(the)”、和“至少一个/至少一种(at least one)”可互换地使用并且意指一个/一种或多于一个/多于一种。
并且在此，通过端点阐述的数值范围包括该范围内包含的所有数字(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。
对于在此所披露的包括不连续的步骤的任何方法来说，可以按任何可行的顺序来进行这些步骤。另外，在适当时，可以同时进行两个或更多个步骤的任何组合。
在整个本说明书中提及“一个实施例(one embodiment)”、“一个实施例(anembodiment)”、“某些实施例(certain embodiments)”或“一些实施例(someembodiments)”等时意指，结合该实施例描述的具体特征、配置、组成或特性包括在本披露内容的至少一个实施例中。因此，在整个本说明书中各个地方出现的此类短语不一定是指本披露内容的同一实施例。此外，这些具体特征、配置、组合物或特性可以在一个或多个实施例中以任何合适的方式组合。
附图说明
当结合以下附图阅读时，可以最好地理解本披露内容的说明性实施例的以下详细说明。
图1示出了根据本披露内容的用于单细胞组合指标化的一般说明性方法的通用框图。
图2示出了图1中总体阐述的用于单细胞组合指标化的方法的一个实施例的示意图。
图3示出了线性扩增之后的片段-衔接子分子的说明性实施例的示意图。
图4示出了在添加通用衔接子之后片段-衔接子分子的说明性实施例的示意图。
这些示意图不一定是按比例绘制的。附图中使用的相同标号是指相同部件、步骤等。然而，应该理解的是，在给定的附图中使用标号来指代部件并非意图限制在另一个附图中用同一标号标记的该部件。此外，使用不同标号来指代部件并非意图表示不同标号的部件不能与其他标号的部件相同或类似。
具体实施方式
本文提供的方法包括提供来自多个细胞的分离的细胞核(图1，框12)。这些细胞可以来自任何一种或多种生物体，以及来自一种或多种生物体的任何细胞类型或任何组织。该方法可以进一步包括解离细胞(图2，框i)，和/或分离细胞核(图2，框ii)。用于从细胞中分离细胞核的方法是本领域技术人员已知的并且是常规的。细胞核数可以至少是2。上限取决于在本文所述的方法的其他步骤中使用的设备(例如多孔板)的实际限制。例如，在一个实施例中，细胞核数可以不大于1,000,000,000、不大于100,000,000、不大于10,000,000、不大于1,000,000、不大于10,000或不大于1,000。本领域技术人员将意识到，在每个细胞核中的核酸分子表示生物体的整个遗传补体，并且是基因组DNA分子，所述基因组DNA分子包括内含子和外显子序列二者，以及非编码调控序列(例如启动子和增强子序列)。
在一个实施例中，细胞核包括与基因组DNA结合的核小体。此类细胞核可用于不确定细胞整个基因组的DNA序列的方法中，例如sciATAC-seq。在另一个实施例中，使分离的细胞核经历使核小体的细胞核耗尽的条件，从而产生耗尽核小体的细胞核(图1，框13和图2，框ii)。此类细胞核可用于旨在确定细胞整个基因组DNA序列的方法中。在一个实施例中，用于耗尽核小体的条件保持了分离的细胞核的完整性。用于产生耗尽核小体的细胞核的方法是本领域技术人员已知的(参见例如Vitak等人,2017,Nature Methods[自然方法],14(3):302-308)。在一个实施例中，这些条件是化学处理，包括用能够破坏核酸-蛋白质相互作用的离液剂进行的处理。有用的离液剂的实例包括但不限于二碘代水杨酸锂。在另一个实施例中，这些条件是化学处理，包括用能够破坏核酸-蛋白质相互作用的去污剂进行的处理。有用的去污剂的实例包括但不限于十二烷基硫酸钠(SDS)。在一些实施例中，当使用去污剂(例如SDS)时，在分离之前将从中分离出细胞核的细胞用交联剂处理。交联剂的有用的实例包括但不限于甲醛。
本文提供的方法包括将诸如耗尽核小体的细胞核的细胞核子集分配到第一多个区室中(图1，框14和图2，左示意图)。在子集中并且因此在每个区室中存在的细胞核数可以至少是1。在一个实施例中，子集中存在的细胞核数不大于2,000。用于将细胞核分配为子集的方法是本领域技术人员已知的并且是常规的。实例包括但不限于荧光激活的细胞核分选(FANS)。
每个区室均包括转座体复合物。在有时称为“标签化(tagmentation)”的过程中，转座体复合物(结合至转座酶识别位点的转座酶)可以将该转座酶识别位点插入细胞核内的靶核酸中。在一些此类插入事件中，可以将该转座酶识别位点的一条链转移到靶核酸中。这条链被称为“转移链”。在一个实施例中，转座体复合物包括具有两个亚基和两个不连续的转座子序列的二聚体转座酶。在另一个实施例中，转座酶包括具有两个亚基和连续的转座子序列的二聚体转座酶。
一些实施例可以包括使用过度活跃的Tn5转座酶和Tn5型转座酶识别位点(Goryshin和Reznikoff,J.Biol.Chem.[生物化学杂志],273:7367(1998))，或MuA转座酶和包含R1和R2末端序列的Mu转座酶识别位点(Mizuuchi,K.,Cell[细胞],35:785,1983；Savilahti,H等人,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志],14:4893,1995)。Tn5镶嵌末端(ME)序列也可以使用，如由熟练技术人员所优化。
可以与本文提供的组合物和方法的某些实施例一起使用的转座系统的更多实例包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Tn552(Colegio等人,J.Bacteriol.[细菌学杂志],183:2384-8,2001；Kirby C等人,Mol.Microbiol.[分子微生物学],43:173-86,2002)、Ty1(Devine和Boeke,Nucleic Acids Res.[核酸研究],22:3765-72,1994和国际公开WO 95/23875)、转座子Tn7(Craig,N L,Science.[科学]271:1512,1996；Craig,N L，综述于：Curr Top Microbiol Immunol.[微生物免疫学的当前主题],204:27-48,1996)、Tn/O和IS10(Kleckner N,等人,Curr Top Microbiol Immunol.[微生物免疫学的当前主题],204:49-82,1996)、海员转座酶(Mariner transposase)(Lampe D J,等人,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志],15:5470-9,1996)、Tc1(Plasterk R H,Curr.Topics Microbiol.Immunol.[微生物免疫学的当前主题],204:125-43,1996)、P元件(Gloor,G B,Methods Mol.Biol.[分子生物学方法],260:97-114,2004)、Tn3(Ichikawa和Ohtsubo,J Biol.Chem.[生物化学杂志]265:18829-32,1990)、细菌插入序列(Ohtsubo和Sekine,Curr.Top.Microbiol.Immunol.[微生物免疫学的当前主题]204:1-26,1996)、逆转录病毒(Brown等人,Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊],86:2525-9,1989)和酵母的逆转录转座子(Boeke和Corces,Annu Rev Microbiol.[微生物学年度评论]43:403-34,1989)。更多的实例包括IS5、Tn10、Tn903、IS911和转座酶家族酶的工程化形式(Zhang等人,(2009)PLoS Genet.[科学公共文库遗传学]5:e1000689.Epub 2009年10月16日；Wilson C.等人(2007)J.Microbiol.Methods[微生物学方法杂志]71:332-5)。
可以与本文提供的方法和组合物一起使用的整合酶的其他实例包括逆转录病毒整合酶和这些逆转录病毒整合酶(例如来自HIV-1、HIV-2、SIV、PFV-1、RSV的整合酶)的整合酶识别序列。
可与本文所述的方法和组合物一起使用的转座子序列提供于以下文献中：美国专利申请公开号2012/0208705、美国专利申请公开号2012/0208724和国际专利申请公开号WO2012/061832。在一些实施例中，转座子序列包括第一转座酶识别位点、第二转座酶识别位点和两个转座酶识别位点之间的指标。
可用于本文的一些转座体复合物包括具有两个转座子序列的转座酶。在一些此类实施例中，该两个转座子序列彼此不连接，换言之，这些转座子序列彼此不连续。此类转座体的实例是本领域已知的(参见例如，美国专利申请公开号2010/0120098)。
在一些实施例中，转座体复合物包括与两个转座酶亚基结合以形成“环状复合物”或“环状转座体”的转座子序列核酸。在一个实例中，转座体包括二聚体转座酶和转座子序列。环状复合物可以确保将转座子插入靶DNA，同时保持原始靶DNA的排序信息，并且不会使靶DNA片段化。应当理解，环状结构可以将所需的核酸序列(例如指标)插入到靶核酸，同时保持靶核酸的物理连接性。在一些实施例中，环状转座体复合物的转座子序列可以包括片段化位点，使得转座子序列可以被片段化以产生包含两个转座子序列的转座体复合物。此类转座体复合物可用于确保转座子插入其中的相邻靶DNA片段接收可以在测定的后期明确组装的密码组合。
转座体复合物还包括至少一个指标序列，也称为转座酶指标。该指标序列作为转座子序列的一部分存在。在一个实施例中，该指标序列可以存在于转移链上，转座酶识别位点的该链转移到靶核酸中。指标序列(也称为标签或条形码)可用作特定靶核酸存在于其中的区室的标记特征。对于每个区室，转座体复合物的指标序列是不同的。因此，在此实施例中，指标是核酸序列标签，该核酸序列标签附接于特定区室中存在的每个靶核酸上，该核酸序列标签的存在指示或用于鉴定其中在该方法的此阶段存在细胞核群体的区室。
指标序列的长度可以多达20个核苷酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18，19、20。四核苷酸标签提供了在同一阵列上复用256个样品的可能性，六碱基标签使得能在同一阵列上处理4096个样品。
在一个实施例中，转移链还可以包括通用序列、第一测序引物序列或其组合。本文描述了通用序列和测序引物序列。因此，在一些实施例中，在将转移链转移至靶核酸的情况下，该靶核酸包括转座酶指标，并且还包括通用序列、第一测序引物序列或其组合。
在一个实施例中，转移链的胞嘧啶核苷酸被甲基化。在另一个实施例中，转移链的核苷酸不含有胞嘧啶。这条转移链以及该转移链上存在的包括转座酶指标序列、通用序列和/或第一测序引物序列的任何序列可以被称为胞嘧啶耗尽的。在转座体复合物中使用胞嘧啶耗尽的核苷酸序列不会对转座酶效率产生重大影响。
该方法还包括产生指标化细胞核(图1，框15和图2，框iii)。在一个实施例中，产生指标化细胞核包括将存在于核小体耗尽的细胞核的子集中的核酸(例如，存在于每个区室中的核酸)片段化为多个核酸片段。在一个实施例中，将核酸片段化是通过使用存在于这些核酸中的片段化位点来完成。典型地，通过使用转座体复合物将片段化位点引入靶核酸。例如，环状转座体复合物可以包括片段化位点。片段化位点可用于切割在已插入靶核酸的指标序列之间的物理关联，而不是信息关联。切割可以通过生物化学、化学或其他方式进行。在一些实施例中，片段化位点可以包括可以通过各种方式片段化的核苷酸或核苷酸序列。片段化位点的实例包括但不限于限制性核酸内切酶位点、至少一个可被RNAse切割的核糖核苷酸、可在某些化学试剂存在下切割的核苷酸类似物、可通过用高碘酸盐处理切割的二醇连接、可用化学还原剂切割的二硫基，可以经历光化学切割的可切割部分，以及可被肽酶或其他合适方式切割的肽(参见例如，美国专利申请公开号2012/0208705、美国专利申请公开号2012/0208724和WO 2012/061832。片段化的结果是指标化细胞核的群体，每个细胞核均含有核酸片段，其中这些核酸片段在至少一条链上包括指示特定区室的指标序列。
可以组合来自多个区室的指标化细胞核(图1，框16和图2，左侧示意图)。例如，组合来自2到96个区室(使用96孔板时)或来自2到384个区室(使用384孔板时)的指标化细胞核。然后将这些组合的指标化细胞核的子集(在本文中称为合并的指标化细胞核)分配到第二多个区室中。存在于子集中并且因此存在于每个区室中的细胞核数部分地基于减少指标冲突的需求，所述指标冲突是指，存在具有相同转座酶指标的两个细胞核，它们在本方法的此步骤中最终位于同一区室中。在此实施例的子集中存在的细胞核数可以是2到30，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。在一个实施例中，子集中存在的细胞核数是20到24，例如22。用于将细胞核分配为子集的方法是本领域技术人员已知的并且是常规的。实例包括但不限于荧光激活的细胞核分选(FANS)。
处理分配的指标化细胞核以鉴定甲基化的核苷酸(图1，框17和图2，框iv)。位点(例如CpG二核苷酸序列)的甲基化可以使用本领域中用于分析此类位点的多种技术中的任何一种来测量。一种有用的方法是鉴定甲基化的CpG二核苷酸序列。甲基化的CpG二核苷酸序列的鉴定是使用基于胞嘧啶转化的技术来确定，这些技术依赖于在分离的基因组DNA或其片段内的CpG序列的甲基化状态依赖性化学修饰，然后进行DNA序列分析。能够区分甲基化和非甲基化的CpG二核苷酸序列的化学试剂包括切割核酸的肼和亚硫酸氢盐。亚硫酸氢盐处理和之后的碱水解将非甲基化胞嘧啶特异性转化为尿嘧啶，而5-甲基胞嘧啶未作修饰，如以下文献中所述：Olek A.,1996,Nucleic Acids Res.[核酸研究]24:5064-6；或Frommer等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89:1827-1831。经亚硫酸氢盐处理的DNA随后可以通过分子技术分析，这些分子技术例如PCR扩增、测序和包括寡核苷酸杂交的检测(例如使用核酸微阵列)。在一个实施例中，使每个区室中的指标化细胞核暴露于亚硫酸氢盐处理的条件下。核酸的亚硫酸氢盐处理是本领域技术人员已知的并且是常规的。在一个实施例中，亚硫酸氢盐处理将CpG二核苷酸的未甲基化的胞嘧啶残基转化为尿嘧啶残基，并且使5-甲基胞嘧啶残基保持不变。亚硫酸氢盐处理产生经亚硫酸氢盐处理的核酸片段。
在产生经亚硫酸氢盐处理的核酸片段后，对这些片段进行修饰，使其在一个或两个末端包括另外的核苷酸(图1，框18和图2，框v和vi)。在一个实施例中，该修饰包括使用多个引物使经亚硫酸氢盐处理的核酸片段经历线性扩增。每个引物至少包括两个区；5'末端的通用核苷酸序列和3'末端的随机核苷酸序列。该通用核苷酸序列在每个引物中都是相同的，并且在一个实施例中，该通用核苷酸序列包括第二测序引物序列(在图2中也称为读段2引物(框vii))。使用随机核苷酸序列的区域，以便应当存在与经亚硫酸氢盐处理的核酸片段中的每个序列互补的至少一个引物。可以用于将完全覆盖的概率增加到期望水平的随机核苷酸的数目可以使用常规方法确定，并且可以是6至12个随机核苷酸，例如9个随机核苷酸。在一个实施例中，循环数限制为不超过10个循环，例如9个循环、8个循环、7个循环、6个循环、5个循环、4个循环、3个循环、2个循环或1个循环。线性扩增的结果是扩增的片段-衔接子分子。片段-衔接子分子的实例在图3中示出。片段-衔接子分子30包括源自转座体复合物31和32的转移链的核苷酸，转座体复合物31和32包括可用于扩增和/或测序的转座酶指标和通用序列。片段-衔接子分子还包括源自细胞核33的基因组DNA的核苷酸、随机核苷酸序列34的区域和通用核苷酸序列35。
线性扩增之后是指数扩增反应(例如PCR)，以在固定和测序之前进一步修饰片段-衔接子分子的末端。此步骤导致通过PCR对片段-衔接子分子进行指标化(图1，框19)。存在于片段-衔接子分子末端的通用序列31、32和/或35可用于结合通用锚定序列，这些通用锚定序列可用作引物并且在扩增反应中延伸。典型地，使用两种不同的引物。一种引物与片段-衔接子分子的一条链的3'末端的通用序列杂交，并且第二引物与该片段-衔接子分子的另一条链的3'末端的通用序列杂交。因此，每种引物的锚定序列可以不同。合适的引物可以各自包括另外的通用序列(例如通用捕获序列)和另一个指标序列。因为每个引物可以包括指标，所以此步骤导致添加一个或两个指标序列，例如第二指标和任选的第三指标。具有第二指标和任选的第三指标的片段-衔接子分子被称为双指标片段-衔接子分子。第二指标和第三指标可以是彼此的反向补体，或第二指标和第三指标可以具有彼此不反向互补的序列。在用亚硫酸氢钠处理之前，此第二指标序列和任选的第三指标对于每个在其中放置所分配的指标化细胞核的区室都是独特的。此PCR扩增的结果是多个片段-衔接子分子的或片段-衔接子分子的文库，这些片段-衔接子分子具有与图2，框vii所示的片段-衔接子分子相似或相同的结构。
在另一个实施例中，该修饰包括使经亚硫酸氢盐处理的核酸片段经历导致另外的序列连接至这些片段的两个末端的条件。在一个实施例中，可以使用平末端连接。在另一个实施例中，这些片段是用单个悬突核苷酸通过例如某些类型的DNA聚合酶的活性来制备的，所述DNA聚合酶例如Taq聚合酶或Klenow exo-聚合酶，该Klenow exo-聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，其将单个脱氧核苷酸(例如脱氧腺苷(A))添加到经亚硫酸氢盐处理的核酸片段的3'末端。此类酶可用于将单个核苷酸‘A’添加至这些片段的每条链的平末端3'末端。因此，可以通过与Taq或Klenow exo-聚合酶反应，将‘A’添加到双链靶片段的每条链的3'末端，而要添加到该片段每个末端的另外的序列可以包括要添加的双链核酸中每个区域的3'末端上存在的相容‘T’悬突。此末端修饰还防止了核酸的自我连接，从而使得偏向于形成侧接在该实施例中添加的序列的经亚硫酸氢盐处理的核酸片段。
通过本文所述的方法对核酸分子的片段化产生具有平末端以及3'-和5'-悬突末端的异质混合物的片段。因此，期望使用本领域已知的方法或试剂盒(例如Lucigen DNA终止子末端修复试剂盒)来修复片段末端，以产生对于例如插入克隆载体的平位点而言最佳的末端。在具体的实施例中，核酸群的片段末端被平末端化。更具体地，这些片段末端被平末端化并且被磷酸化。可以经由酶处理例如使用多核苷酸激酶来引入磷酸部分。
在一个实施例中，通过首先将相同的通用衔接子(也称为‘错配衔接子’，其一般特征描述于Gormley等人的US 7,741,463和Bignell等人的US 8,053,192中)连接至经亚硫酸氢盐处理的核酸片段的5'和3'末端以形成片段-衔接子分子来处理经亚硫酸氢盐处理的核酸片段。在一个实施例中，该通用衔接子包括测序(包括将片段-衔接子分子固定在阵列上)所需的所有序列。因为要测序的核酸来自单个细胞，所以片段-衔接子分子的进一步扩增有助于获得足够数量的片段-衔接子分子用于测序。
在另一个实施例中，当通用衔接子不包括测序所需的所有序列时，则可以在固定和测序之前，使用PCR步骤进一步修饰每个片段-衔接子分子中存在的通用衔接子。例如，使用与片段-衔接子分子中存在的通用序列互补的通用锚定序列进行初始引物延伸反应，其中形成与每个单独的片段-衔接子分子的两条链互补的延伸产物。典型地，PCR添加另外的通用序列(例如通用捕获序列)和另一个指标序列。因为每个引物可以包括指标，所以此步骤导致添加一个或两个指标序列(例如第二指标和任选的第三指标)，并且通过衔接子连接对片段-衔接子分子进行指标化(图1，框19)。所得的片段-衔接子分子称为双指标片段-衔接子分子。
在通过连接通用衔接子(包括测序所需的所有序列)的单步方法，或通过连接通用衔接子且之后进行PCR扩增以进一步修饰通用衔接子的两步方法添加通用衔接子后，最终片段-衔接子分子将包括通用捕获序列、第二指标序列和任选的第三指标序列。这些指标与通过线性扩增产生双指标片段-衔接子中描述的第二和第三指标类似。第二指标和第三指标可以彼此反向互补，或第二指标和第三指标可以具有彼此不反向互补的序列。在用亚硫酸氢钠处理之前，这些第二指标和任选的第三指标序列对于每个在其中放置所分配的指标化细胞核的区室都是独特的。将通用衔接子添加到每个末端的结果是多个片段-衔接子分子的或片段-衔接子分子的文库，这些片段-衔接子分子具有与图4所示的片段-衔接子分子40相似或相同的结构。片段-衔接子分子40包括捕获序列41和48(分别也称为3'流动池衔接子(例如，P5)和5'流动池衔接子(例如，P7'))，以及指标42和47(例如i5和i7)。片段-衔接子分子40还包括源自转座体复合物43的转移链的核苷酸，该转座体复合物43包括可用于扩增和/或测序的转座酶指标44和通用序列45。片段-衔接子分子还包含源自细胞核46的基因组DNA的核苷酸。
所得的双指标片段-衔接子分子共同提供了可以固定然后测序的核酸文库。术语文库是指来自单个细胞的片段的集合，这些片段在其3'末端和5'末端处含有已知的通用序列。
在修饰经亚硫酸氢盐处理的核酸片段以包括另外的核苷酸后，可以使双指标片段-衔接子分子经历针对预定大小范围(例如长度为150至400个核苷酸，例如150至300个核苷酸)选择的条件。合并所得的双指标片段-衔接子分子，并且任选地可以使其经历净化过程，以通过除去至少一部分未掺入的通用衔接子或引物来提高DNA分子的纯度。可以使用任何合适的净化过程，例如电泳、尺寸排阻色谱法等。在一些实施例中，可采用固相可逆固定顺磁珠从未附接的通用衔接子或引物中分离出所需的DNA分子，并且基于大小选择核酸。固相可逆固定顺磁珠可购自拜克门寇尔特公司(Beckman Coulter)(Agencourt AMPure XP)、赛默飞世尔公司(Thermofisher)(MagJet)、奥米加百特公司(Omega Biotek)(Mag-Bind)、普洛麦格磁珠公司(普洛麦格)和卡帕生物系统公司(Kapa Biosystems)(Kapa PureBeads)。
可以制备多个片段-衔接子分子用于测序。合并片段-衔接子分子后，在测序之前，将它们固定并且扩增(图1，框20)。将来自一种或多种来源的片段-衔接子分子附接到衬底的方法是本领域已知的。同样，扩增固定的片段-衔接子分子的方法包括但不限于桥式扩增和动力学排排除。在测序之前进行固定和扩增的方法描述于例如以下文献中：Bignell等人(US 8,053,192)、Gunderson等人(WO 2016/130704)、Shen等人(US 8,895,249)和Pipenburg等人(US 9,309,502)。
可以将合并的样品固定以准备测序。测序可以作为单个分子的阵列进行，也可以在测序之前进行扩增。可以使用一种或多种固定的引物进行扩增。该一种或多种固定的引物可以是平坦表面上或珠合并物上的草坪状物(lawn)。可以将珠合并物分离至乳液中，在该乳液的每个“区室”中有单个珠。在每个“区室”仅一个模板的浓度下，在每个珠上仅扩增单个模板。
如本文所用，术语“固相扩增”是指在固体支持物上进行的或与固体支持物相关的任何核酸扩增反应，使得全部或部分扩增产物在形成时被固定在该固体支持物上。具体而言，该术语涵盖了固相聚合酶链反应(固相PCR)和固相等温扩增，它们是与标准溶液相扩增类似的反应，但是正向和反向扩增引物中的一者或二者被固定在固体支持物上。固相PCR覆盖了诸如乳液的系统，其中一个引物锚定在珠上，另一个引物位于自由溶液中，以及在固相凝胶基质中的集落形成，其中一个引物锚定在表面，以及一个在自由溶液中。
在一些实施例中，该固体支持物包含带图案的表面。“带图案的表面”是指在固体支持物的暴露层中或其上不同区域的排列。例如，一个或多个区域可以是其中存在一种或多种扩增引物的特征。这些特征可以由其中不存在扩增引物的间隙区域分开。在一些实施例中，该图案可以是成行和成列特征的x-y格式。在一些实施例中，该图案可以是特征和/或间隙区域的重复排列。在一些实施例中，该图案可以是特征和/或间隙区域的随机排列。可以在本文阐述的方法和组合物中使用的示例性带图案的表面描述于以下文献中：美国专利号8,778,848、8,778,849和9,079,148，以及美国公开号号2014/0243224中。
在一些实施例中，该固体支持物包括表面上的孔或凹坑的阵列。这可以如本领域中公知使用多种技术来制作，这些技术包括但不限于光刻法、压印技术、模制技术和微蚀刻技术。如本领域技术人员将理解的，所使用的技术将取决于阵列衬底的组成和形状。
带图案的表面中的特征可以是在玻璃、硅、塑料或具有带图案的、共价连接的凝胶的其他合适的固体支持物上的孔(例如，微孔或纳米孔)阵列中的孔，该凝胶例如聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(PAZAM，参见例如，美国公开号2013/184796、WO 2016/066586和WO 2015/002813)。该过程产生用于测序的凝胶垫，这些凝胶垫可以在具有大循环数的测序运行过程中稳定。聚合物与孔的共价连接有助于在多次使用期间在结构化衬底的整个生命周期中将凝胶保持在结构化特征中。但是，在许多实施例中，该凝胶不必与孔共价连接。例如，在一些条件下，可以将没有共价连接到结构化衬底的任何部分的无硅烷丙烯酰胺(SFA，参见例如，美国专利号8,563,477，其通过引用以其整体并入本文)用作凝胶材料。
在具体的实施例中，结构化衬底可以通过以下方式来制造：用孔(例如微孔或纳米孔)将固体支持物材料图案化，用凝胶材料(例如PAZAM、SFA或其化学修饰的变体，例如SFA的叠氮化形式(叠氮-SFA))涂覆带图案的支持物，并且例如经由化学或机械抛光对凝胶涂覆的支持物进行抛光，从而将凝胶保留在孔中，但是将结构化衬底在孔之间的表面上的间隙区域的所有凝胶除去或基本上灭活。可以将引物核酸附接在凝胶材料上。然后，可以将片段-衔接子分子的溶液与抛光的衬底接触，使得单个片段-衔接子分子将经由与附接在凝胶材料上的引物相互作用而接种于单独孔中；然而，由于凝胶材料不存在或失活，靶核酸将不会占据间隙区域。因为间隙区域中凝胶的不存在或失活阻止正在生长的核酸集落的向外迁移，所以片段-衔接子分子的扩增将被限制在孔中。该过程可以被方便地制造，是可扩缩的，并且利用常规的微米或纳米制造方法。
尽管本披露内容涵盖其中仅固定了一个扩增引物(另一个引物通常存在于自由溶液中)的“固相”扩增方法，但是对于固体支持物优选地提供固定的正向和反向引物二者。实际上，由于扩增过程需要过量的引物来维持扩增，因此将存在固定于固体支持物上的‘多个’相同的正向引物和/或‘多个’相同的反向引物。除非上下文另外指出，本文在提到正向和反向引物时应相应地解释为涵盖‘多个’此类引物。
如熟练的阅读者所理解的，任何给定的扩增反应都需要对要扩增的模板具有特异性的至少一种类型的正向引物和至少一种类型的反向引物。然而，在某些实施例中，这些正向和反向引物可能包括相同序列的模板特异性部分，并且可能具有完全相同的核苷酸序列和结构(包括任何非核苷酸修饰)。换言之，可以仅使用一种类型的引物进行固相扩增，并且这种单引物方法也涵盖在本发明的范围内。其他实施例可以使用正向和反向引物，这些引物含有相同的模板特异性序列，但是在一些其他结构特征上不同。例如，一种类型的引物可能含有在另一种引物中不存在的非核苷酸修饰。
在本披露内容的所有实施例中，用于固相扩增的引物优选地通过单点共价附接在该引物的5'末端处或附近固定至固体支持物，而该引物的模板特异性部分则可以自由地对其同源模板退火并且3'羟基可以自由进行引物延伸。出于此目的，可以使用本领域已知的任何合适的共价附接的方式。所选择的附接化学将取决于固体支持物的性质以及对其应用的任何衍生化或功能化。引物本身可以包括可以作为非核苷酸化学修饰的部分，以促进附接。在具体的实施例中，该引物可以在5'末端包括含硫的亲核基团，例如硫代磷酸酯(phosphorothioate)或硫代磷酸酯(thiophosphate)。在固体支持的聚丙烯酰胺水凝胶的情况下，此亲核基团将结合到存在于水凝胶中的溴乙酰胺基团。将引物和模板附接到固体支持物的更具体的方式是经由5'硫代磷酸酯附接到由聚合的丙烯酰胺和N-(5-溴乙酰胺基戊基)丙烯酰胺(BRAPA)构成的水凝胶，如WO 05/065814中全面描述。
本披露内容的某些实施例可以利用由惰性衬底或基质(例如载玻片、聚合物珠等)构成的固体支持物，这些固体支持物已经例如通过施加中间材料层或涂层而被“功能化”，该中间材料包含允许共价附接到生物分子(例如多核苷酸)的反应性基团。此类支持物的实例包括但不限于在惰性衬底(例如玻璃)上支持的聚丙烯酰胺水凝胶。在此类实施例中，生物分子(例如多核苷酸)可以直接共价附接到中间材料(例如水凝胶)上，但是中间材料本身可以非共价附接到衬底或基质(例如玻璃衬底)上。术语“共价附接到固体支持物”应相应地解释为涵盖此类布置。
合并的样品可以在珠上扩增，其中每个珠含有正向和反向扩增引物。在具体的实施例中，片段-衔接子分子的文库用于通过固相扩增，更具体地通过固相等温扩增，制备核酸集落的聚簇阵列，类似于以下文献中所述的那些：美国公开号2005/0100900、美国专利号7,115,400、WO 00/18957和WO 98/44151。术语‘簇’和‘集落’在本文可互换使用，是指在固体支持物上的离散位点，包括多个相同的固定的核酸链和多个相同的固定的互补核酸链。术语“聚簇阵列”是指由此类簇或集落形成的阵列。在这种情况下，术语“阵列”不应被理解为要求簇的有序排列。
术语“固相”或“表面”用于意指平面阵列，其中引物附接于诸如玻璃、二氧化硅或塑料显微镜载玻片的平坦表面，或类似的流动池装置；珠，其中一个或两个引物附接于珠，并且对珠进行扩增；或对珠进行扩增后在表面上的珠阵列。
聚簇阵列可以使用以下方法来制备：如WO 98/44151中所述的热循环方法，或其中将温度保持恒定，并且使用试剂变化进行延伸和变性的循环的方法。此类等温扩增方法描述于专利申请号WO 02/46456和美国公开号2008/0009420中。由于较低温度可用于等温过程中，因此这是特别优选的。
应当理解，本文描述的或本领域公知的任何扩增方法学均可以与通用或靶特异性引物一起用于扩增固定的DNA片段。用于扩增的合适的方法包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)，如美国专利号8,003,354中所述，其通过引用以其整体并入本文。上述扩增方法可以用于扩增一种或多种感兴趣的核酸。例如，可以利用PCR(包括多重PCR)、SDA、TMA、NASBA等来扩增固定的DNA片段。在一些实施例中，扩增反应中包括特异性针对感兴趣的多核苷酸的引物。
用于扩增多核苷酸的其他合适方法可以包括寡核苷酸延伸和连接、滚环扩增(RCA)(Lizardi等人,Nat.Genet.[自然遗传]19:225-232(1998))和寡核苷酸连接测定(OLA)(通常参见美国专利号7,582,420、5,185,243、5,679,524和5,573,907；EP 0 320308B1；EP 0 336 731B1；EP 0 439 182B1；WO 90/01069；WO 89/12696；和WO 89/09835)技术。应当理解，可以将这些扩增方法学设计为扩增固定的DNA片段。例如，在一些实施例中，扩增方法可能包括连接探针扩增或寡核苷酸连接测定(OLA)反应，其中含有特异性针对感兴趣的核酸的引物。在一些实施例中，扩增方法可以包括引物延伸连接反应，该反应含有特异性针对感兴趣的核酸的引物。作为可以专门设计用于扩增感兴趣的核酸的引物延伸和连接引物的非限制性实例，该扩增可以包括用于GoldenGate测定(伊鲁米纳公司(Illumina,Inc.)，加利福尼亚州圣地亚哥)的引物，如通过美国专利号7,582,420和7,611,869例示。
可以在本披露内容的方法中使用的示例性的等温扩增方法包括但不限于多重置换扩增(MDA)(如通过例如Dean等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]99:5261-66(2002)例示的)，或等温链置换核酸扩增(通过例如美国专利号6,214,587例示)。可以在本披露内容中使用的其他非基于PCR的方法包括，例如链置换扩增(SDA)(描述于例如以下文献中：Walker等人,Molecular Methods for Virus Detection[用于病毒检测的分子方法],Academic Press,Inc.[学术出版公司],1995；美国专利号5,455,166和5,130,238；以及Walker等人,Nucl.Acids Res.[核酸研究]20:1691-96(1992))或超支化链置换扩增(描述于例如以下文献中：Lage等人,Genome Res.[基因组研究]13:294-307(2003))。等温扩增方法可与链置换Phi 29聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段、5'->3'exo-一起用于基因组DNA的随机引物扩增。这些聚合酶的使用利用了它们的高持续合成能力和链置换活性。高持续合成能力允许这些聚合酶产生长度为10-20kb的片段。如上所述，可以使用具有低持续合成能力和链置换活性的聚合酶(例如Klenow聚合酶)在等温条件下产生较小的片段。扩增反应、条件和组分的其他描述在美国专利号7,670,810的披露内容中进行了详细说明。
可用于本披露内容中的另一种多核苷酸扩增方法是标记的PCR，其使用具有恒定的5'区和随后的随机3'区的二结构域引物的群体，如例如以下文献中所述：Grothues等人Nucleic Acids Res.[核酸研究]21(5):1321-2(1993)中。进行第一轮扩增，以允许基于来自随机合成的3'区的单个杂交在热变性的DNA上进行多次起始。由于3'区的性质，预期起始位点在整个基因组中是随机的。此后，可以除去未结合的引物，并且可以使用与恒定5'区互补的引物进行进一步的复制。
在一些实施例中，可以使用动力学排除扩增(KEA)(也称为排除扩增(ExAmp))进行等温扩增。可以使用包括以下步骤的方法来制备本披露内容的核酸文库：使扩增试剂反应以产生多个扩增位点，每个扩增位点包括来自已接种于该位点的单个靶核酸的扩增子的大量克隆群体。在一些实施例中，该扩增反应继续进行直到产生足够数量的扩增子填满相应扩增位点的容量为止。以这种方式填满已接种位点的容量抑制了靶核酸在该位点的着陆(landing)和扩增，从而在该位点产生扩增子的克隆群体。在一些实施例中，即使在第二靶核酸到达该位点之前未填满扩增位点的容量，也可以实现表观克隆性。在一些条件下，第一靶核酸的扩增可以继续进行到制造出足够数量的拷贝，以有效地在竞争中胜过或压倒来自转运到该位点的第二靶核酸的拷贝产生之时。例如，在直径小于500nm的圆形特征上使用桥式扩增方法的实施例中，已经确定在对第一靶核酸进行14次指数扩增循环后，来自相同位点的第二靶核酸的污染产生的污染扩增子的数量将不足以对Illumina测序平台上的合成测序分析产生不利影响。
在一些实施例中，阵列中的扩增位点可以是(但不一定是)完全克隆的。相反，对于一些应用，单个扩增位点可以主要由来自第一片段-衔接子分子的扩增子占据，并且还可能具有低水平的来自第二靶核酸的污染扩增子。阵列可以具有一个或多个具有低水平污染扩增子的扩增位点，只要污染水平不会对该阵列的后续使用产生不可接受的影响即可。例如，当阵列要用于检测应用时，可接受的污染水平将是不会以不可接受的方式影响检测技术的信噪比或分辨率的水平。因此，表观克隆性通常将与通过本文阐述的方法制成的阵列的特定用途或应用相关。对于具体应用，在单个扩增位点可接受的示例性污染水平包括但不限于最多0.1％、0.5％、1％、5％、10％或25％的污染扩增子。阵列可以包括一个或多个具有这些示例性污染扩增子水平的扩增位点。例如，在阵列中，多达5％、10％、25％、50％、75％或甚至100％的扩增位点可以具有一些污染扩增子。将理解的是，在位点的阵列或其他集合中，至少50％、75％、80％、85％、90％、95％或99％或更多的位点可以是克隆的或表观克隆的。
在一些实施例中，当过程以足够快的速率发生以有效地排除另一个事件或过发生时，可能会发生动力学排除。以核酸阵列的制造为例，其中该阵列的位点是用溶液中的片段-衔接子分子随机接种的，并且片段-衔接子分子的拷贝是在扩增过程中产生的，以填满每个接种位点的容量。根据本披露内容的动力学排除方法，播种和扩增过程可以在扩增速率超过接种速率的条件下同时继续进行。因此，在已被第一靶核酸接种的位点制造拷贝的相对较快的速率将有效排除第二核酸接种该扩增位点。动力学排除扩增方法可以如美国申请公开号2013/0338042的披露内容中的详细描述来进行。
动力学排除可以利用相对慢的起始扩增的速率(例如，缓慢的制造片段-衔接子分子的第一拷贝的速率)与相对快的制造片段-衔接子分子的后续拷贝(或片段-衔接子分子的第一拷贝)的速率。在上一段的实例中，由于相对慢的片段-衔接子分子接种的速率(例如，相对较慢的扩散或转运)与相对快的进行扩增以用片段-衔接子种子的拷贝填满该位点的速率而发生动力学排除。在另一个示例性的实施例中，可能由于已接种位点的片段-衔接子分子的第一拷贝的形成中的延迟(例如延迟或缓慢激活)与相对快的制造后续拷贝以填满该位点的速率而发生动力学排除。在此实例中，单个位点可能已经用几种不同的片段-衔接子分子接种(例如，在扩增之前，每个位点可以存在几种片段-衔接子分子)。但是，任何给定的片段-衔接子分子的第一拷贝形成都可以被随机激活，因此与后续拷贝产生的速率相比，第一拷贝形成的平均速率相对较慢。在这种情况下，尽管单个位点可能已用几种不同的片段-衔接子分子接种，但是动力学排除将仅允许那些片段-衔接子分子中的一种进行扩增。更具体地，一旦第一片段-衔接子分子被激活用于扩增，该位点将快速用其拷贝填满至容量，从而防止在该位点制造第二片段-衔接子分子的拷贝。
扩增试剂可以包括有助于扩增子形成并且在某些情况下提高扩增子形成速率的其他组分。实例是重组酶。重组酶可以通过允许重复侵入/延伸来促进扩增子的形成。更具体地，对于扩增子的形成，重组酶可以促进片段-衔接子通过聚合酶侵入，以及引物通过聚合酶使用片段-衔接子分子作为模板进行延伸。此过程可以作为链反应重复进行，其中每轮侵入/延伸产生的扩增子在随后的轮次中用作模板。由于不需要变性循环(例如经由加热或化学变性)，因此该过程可以比标准PCR更快地发生。因此，可以等温地进行重组酶促进的扩增。通常希望在重组酶促进的扩增试剂中包括ATP或其他核苷酸(或在一些情况下是其不可水解的类似物)以促进扩增。重组酶和单链结合(SSB)蛋白的混合物特别有用，因为SSB可以进一步促进扩增。用于重组酶促进的扩增的示例性制剂包括由TwistDx(英国剑桥)作为TwistAmp试剂盒商业出售的那些。在US 5,223,414和US 7,399,590中阐述了重组酶促进的扩增试剂的有用组分和反应条件。
可以包括在扩增试剂中以促进扩增子形成并且在一些情况下提高扩增子形成速率的组分的另一个实例是解旋酶。解旋酶可以通过允许扩增子形成的链反应来促进扩增子的形成。由于不需要变性循环(例如经由加热或化学变性)，因此该过程可以比标准PCR更快地发生。因此，可以等温地进行解旋酶促进的扩增。解旋酶和单链结合(SSB)蛋白的混合物特别有用，因为SSB可以进一步促进扩增。用于促进解旋酶的扩增的示例性制剂包括由百华百汇(Biohelix)(马萨诸塞州贝弗利)作为IsoAmp试剂盒商业出售的那些。此外，在US 7,399,590和US 7,829,284中描述了包括解旋酶蛋白的有用制剂的实例，所述文献各自通过引用并入本文。
可以包括在扩增试剂中以促进扩增子形成并且在一些情况下提高扩增子形成速率的组分的又另一个实例是起点结合蛋白。
将片段-衔接子分子附接到表面后，确定固定和扩增的片段-衔接子分子的序列。测序可以使用任何合适的测序技术进行，并且用于确定固定和扩增的片段-衔接子分子的序列的方法(包括链的再合成)在本领域中是已知的，并且描述于例如以下文献中：Bignell等人(US 8,053,192)、Gunderson等人(WO 2016/130704)、Shen等人(US 8,895,249)和Pipenburg等人(US 9,309,502)。
本文所述的方法可以与多种核酸测序技术结合使用。特别适用的技术是其中核酸附接在阵列中的固定位置以使它们的相对位置不变并且其中将阵列重复成像的那些技术。其中以不同的颜色通道获得图像的实施例特别适用，这些颜色通道例如与用于区分一种核苷酸碱基类型与另一种核酸碱基类型的不同标记一致。在一些实施例中，确定片段-衔接子分子的核苷酸序列的过程可以是自动化过程。优选的实施例包括合成测序(“SBS”)技术。
SBS技术通常涉及通过迭代添加针对模板链的核苷酸对新生核酸链进行酶促延伸。在SBS的传统方法中，在每次递送中可以在聚合酶的存在下将单个核苷酸单体提供给靶核苷酸。然而，在本文所述的方法中，在递送中可以在聚合酶的存在下将一种以上类型的核苷酸单体提供给靶核酸。
在一个实施例中，核苷酸单体包括锁核酸(LNA)或桥核酸(BNA)。当使用一种或多种胞嘧啶耗尽的核苷酸序列产生片段-衔接子分子时，例如当在来自转座体复合物的转移链中存在胞嘧啶耗尽的核苷酸序列时，则导致与胞嘧啶耗尽的区域杂交的核苷酸单体的解链温度发生变化。在核苷酸单体中使用LNA或BNA增加了核苷酸单体与固定片段-衔接子分子上存在的测序引物序列之间的杂交强度。
SBS可以利用具有终止子部分的核苷酸单体或缺乏任何终止子部分的那些。使用缺乏终止子的核苷酸单体的方法包括，例如焦磷酸测序和使用γ-磷酸标记的核苷酸的测序，如下文进一步详细阐述。在使用缺乏终止子的核苷酸单体的方法中，每个循环中添加的核苷酸的数量通常是可变的，并且取决于模板序列和核苷酸递送模式。对于利用具有终止子部分的核苷酸单体的SBS技术，该终止子在所用测序条件下可以有效地不可逆，对于利用双脱氧核苷酸的传统桑格测序(Sanger sequencing)也是如此，，或该终止子可以是可逆的，对于索莱克斯公司(Solexa，现为伊鲁米纳公司)开发的测序方法也是如此。
SBS技术可以利用具有标记部分的核苷酸单体或缺乏标记部分的那些。因此，掺入事件可以基于以下来检测：标记的特性，例如标记的荧光；核苷酸单体的特性，例如分子量或电荷；核苷酸掺入的副产物，例如焦磷酸盐的释放；等。在测序试剂中存在两种或更多种不同的核苷酸的实施例中，这些不同的核苷酸可以是彼此可区分的，或者替代地在使用的检测技术下，两种或更多种不同的标记可以是不可区分的。例如，存在于测序试剂中的不同的核苷酸可以具有不同的标记，并且它们可以使用适当的光学器件来区分，如索莱克斯公司(现为伊鲁米纳公司)开发的测序方法所例示。
优选的实施例包括焦磷酸测序技术。焦磷酸测序在将特定核苷酸掺入新生链中时检测无机焦磷酸盐(PPi)的释放(Ronaghi,M.,Karamohamed,S.,Pettersson,B.,Uhlen,M.和Nyren,P.(1996)“Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphaterelease.[使用焦磷酸盐释放的实时DNA测序检测]”Analytical Biochemistry[分析生物化学]242(1),84-9；Ronaghi,M.(2001)“Pyrosequencing sheds light on DNAsequencing[焦磷酸测序揭示了DNA测序].”Genome Res.[基因组研究]11(1),3-11；Ronaghi,M.,Uhlen,M.和Nyren,P.(1998)“Asequencing method based on real-timepyrophosphate[基于实时焦磷酸盐的测序方法].”Science[科学]281(5375),363；美国专利号6,210,891；6,258,568和6,274,320)。在焦磷酸测序中，释放的PPi可以通过被ATP硫化酶立即转化为三磷酸腺苷(ATP)来检测，并且经由萤光素酶产生的光子检测所产生ATP的水平。可以将要测序的核酸附接到阵列中的特征上，并且可以对该阵列进行成像以捕获由于在该阵列的特征上掺入核苷酸而产生的化学发光信号。用特定的核苷酸类型(例如A、T、C或G)处理阵列后，可以获得图像。添加每种核苷酸类型后获得的图像将关于检测到的阵列中的特征而有所不同。图像中的这些差异反映了阵列上特征的不同序列内容。然而，每个特征的相对位置在图像中将保持不变。可以使用本文阐述的方法来储存、处理和分析图像。例如，在用每种不同的核苷酸类型处理阵列后获得的图像可以用与本文针对从用于基于可逆终止子的测序方法的不同检测通道获得的图像所例示相同的方式来处置。
在另一种示例性的SBS类型中，循环测序是通过逐步添加可逆的终止子核苷酸来完成，这些可逆的终止子核苷酸含有例如可切割的或可光褪色的染料标记，如例如以下文献中所述：WO 04/018497和美国专利号7,057,026中，所述文献的披露内容是通过引用并入本文。此方法由索莱克斯公司(现在为伊鲁米纳公司)商业化，并且也描述于WO 91/06678和WO 07/123,744中。其中既可以逆转终止又可以切割荧光标记的荧光标记的终止子的可用性促进有效的循环可逆终止(CRT)测序。聚合酶也可以进行共工程化以有效掺入这些修饰的核苷酸并从这些核苷酸延伸。
优选地，在基于可逆终止子的测序实施例中，标记在SBS反应条件下基本上不抑制延伸。然而，检测标记可以是可除去的，例如通过切割或降解除去。可以在将标记掺入阵列化核酸特征中之后捕获图像。在具体的实施例中，每个周期涉及将四种不同的核苷酸类型同时递送到阵列，并且每种核苷酸类型具有光谱上不同的标记。然后可以获得四个图像，各自使用对四个不同标记之一具有选择性的检测通道。可替代地，可以顺序添加不同的核苷酸类型，并且可以在每个添加步骤之间获得阵列的图像。在此类实施例中，每个图像都将显示已经掺入特定类型核苷酸的核酸特征。由于每个特征的序列内容不同，在不同的图像中将存在或不存在不同的特征。然而，每个特征的相对位置在图像中将保持不变。如本文所阐述的，可以储存、处理和分析从此类可逆终止子-SBS方法获得的图像。在图像捕获步骤之后，可以除去标记，并可以除去可逆终止子部分，以进行核苷酸添加和检测的后续循环。在特定的循环中检测到标记之后以及在随后的循环之前，除去标记可以提供减少背景信号和减少循环之间串扰的优点。有用的标记和除去方法的实例阐述于下文中。
在具体的实施例中，一些或全部核苷酸单体可以包括可逆终止子。在此类实施例中，可逆终止子/可切割的荧光团可以包括经由3'酯连接与核糖部分连接的荧光团(Metzker,Genome Res.[基因组研究]15:1767-1776(2005))。其他方法已经将终止子化学与荧光标记的切割分开(Ruparel等人,Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊]102:5932-7(2005))。Ruparel等人描述了可逆终止子的开发，这些可逆终止子使用小型3'烯丙基基团来阻断延伸，但是可以通过用钯催化剂短暂处理容易地去阻断。经由可光切割的接头将荧光团附接到碱基，该可光切割的接头可以通过在长波长紫外线下暴露30秒而被容易地切割。因此，二硫化物还原或光切割可以用作可切割的接头。可逆终止的另一种方法是使用在dNTP上放置大块染料后进行的自然终止。dNTP上带电的大块染料的存在可以通过空间位阻和/或静电屏阻充当有效的终止子。除非除去染料，否则一个结合事件的存在会阻止进一步的掺入。染料的切割除去了荧光团并且有效逆转终止。修饰的核苷酸的实例也描述于美国专利号7,427,673和7,057,026中，其披露内容是通过引用以其整体并入本文。
可以与本文所述的方法和系统一起使用的另外的示例性SBS系统和方法描述于以下文献中：美国公开号2007/0166705、2006/0188901、2006/0240439、2006/0281109、2012/0270305和2013/0260372、美国专利号7,057,026、PCT公开号WO 05/065814、美国专利申请公开号2005/0100900以及PCT公开号WO 06/064199和WO 07/010,251。
一些实施例可以利用使用少于四种不同的标记对四种不同的核苷酸的检测。例如，SBS可以利用美国公开号2013/0079232中所述的方法和系统进行。作为第一个实例，一对核苷酸类型可以在相同的波长下检测，但是基于该对中一个成员与另一个成员相比的强度差异，或基于与针对该对中一个成员检测到的信号相比，该对中另一个成员的导致明显信号出现或消失的变化(例如，经由化学修饰、光化学修饰或物理修饰)来区分。作为第二个实例，四种不同的核苷酸类型中的三种可以在特定条件下检测，而第四种核苷酸类型缺乏可在那些条件下检测的标记，或者在那些条件下被检测到的极少(例如，由于背景荧光等导致的极少检测)。前三种核苷酸类型在核酸中的掺入可以基于它们的相应信号的存在来确定，并且第四种核苷酸类型在核酸中的掺入可以基于任何信号的不存在或极少检测来确定。作为第三个实例，一种核苷酸类型可以包括在两个不同通道中检测到的一种或多种标记，而其他核苷酸类型是在不超过一个通道中检测到。前述的三个示例性配置不被认为是相互排斥的，并且可以以各种组合使用。组合所有三个实例的示例性实施例是基于荧光的SBS方法，其使用在第一通道中检测到的第一种核苷酸类型(例如，具有在通过第一激发波长激发时在第一通道中检测到的标记的dATP)、在第二通道中检测到的第二种核苷酸类型(例如，具有在通过第二激发波长激发时在第二通道中检测到的标记的dCTP)、在第一和第二通道二者中都检测到的第三种核苷酸类型(例如，具有在通过第一和/或第二激发波长激发时在两个通道中均检测到的至少一个标记的dTTP)以及在任一通道中没有检测到或极少检测到的缺少标记的第四种核苷酸类型(例如，不具有标记的dGTP)。
此外，如在美国公开号2013/0079232的并入的材料中所描述的，可以使用单个通道获得测序数据。在此类所谓的单染料测序方法中，标记了第一种核苷酸类型，但是在产生第一个图像之后除去该标记，并且仅在产生第一个图像之后标记第二种核苷酸类型。第三种核苷酸类型在第一个和第二个图像二者中均保留其标记，并且第四种核苷酸类型在两个图像中均保持未标记。
一些实施例可以利用通过连接技术进行的测序。此类技术利用DNA连接酶掺入寡核苷酸并且鉴定此类寡核苷酸的掺入。这些寡核苷酸典型地具有不同标记，这些标记与寡核苷酸与之杂交的序列中的特定核苷酸的身份相关联。与其他SBS方法一样，可以在用标记的测序试剂处理核酸特征的阵列后获得图像。每个图像都将显示已经掺入特定类型标记的核酸特征。由于每个特征的序列内容不同，因此在不同的图像中将存在或不存在不同的特征，但是这些特征的相对位置在图像中将保持不变。如本文所阐述的，可以储存、处理和分析从基于连接的测序方法获得的图像。可以与本文所述的方法和系统一起使用的示例性SBS系统和方法描述于美国专利号6,969,488、6,172,218和6,306,597中。
一些实施例可以利用纳米孔测序(Deamer,D.W.和Akeson,M.“Nanopores andnucleic acids:prospects for ultrarapid sequencing[纳米孔和核酸：超高速测序的前景].”Trends Biotechnol.[生物科技趋势]18,147-151(2000)；Deamer,D.和D.Branton,“Characterization of nucleic acids by nanopore analysis”[通过纳米孔分析表征核酸],Acc.Chem.Res.[化学研究述评]35:817-825(2002)；Li,J.,M.Gershow,D.Stein,E.Brandin,和J.A.Golovchenko,“DNA molecules and configurations in asolid-statenanopore microscope[固态纳米孔显微镜中的DNA分子和构型]”Nat.Mater.[自然材料]2:611-615(2003))。在此类实施例中，片段-衔接子分子穿过纳米孔。纳米孔可以是合成的孔或生物膜蛋白，例如α-溶血素。在片段-衔接子分子穿过纳米孔时，可以通过测量该孔的电导率波动来鉴定每个碱基对。(美国专利号7,001,792；Soni,G.V.和Meller,“A.Progresstoward ultrafast DNA sequencing using solid-state nanopores[使用固态纳米孔向超快DNA测序的进展].”Clin.Chem.[临床化学]53,1996-2001(2007)；Healy,K.“Nanopore-based single-molecule DNA analysis[基于纳米孔的单分子DNA分析].”Nanomed.[纳米医学]2,459-481(2007)；Cockroft,S.L.,Chu,J.,Amorin,M.和Ghadiri,M.R.“A single-molecule nanopore device detects DNA polymerase activity with single-nucleotide resolution[单分子纳米孔装置以单核苷酸分辨率检测DNA聚合酶活性].”J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会会志]130,818-820(2008)，所述文献的披露内容是通过引用以其整体并入本文。如本文所阐述的，可以储存、处理和分析从纳米孔测序获得的数据。具体而言，可以根据本文阐述的光学图像和其他图像的示例性处理将数据处理成图像。
一些实施例可以利用涉及DNA聚合酶活性的实时监测的方法。可以通过带有荧光团的聚合酶与γ-磷酸标记的核苷酸之间的荧光共振能量转移(FRET)相互作用来检测核苷酸的掺入，如例如美国专利号7,329,492和7,211,414中所述，这两篇文献都是通过引用并入本文，或者可以用零模波导(zero-mode waveguide)(如例如美国专利号7,315,019中所述)以及使用荧光核苷酸类似物和工程化聚合酶(如例如美国专利号7,405,281和美国公开号2008/0108082中所述)来检测核苷酸的掺入。可以将照明限制在表面栓系的聚合酶周围的仄升(zeptoliter)级体积，使得可以在低背景下观察到荧光标记的核苷酸的掺入(Levene,M.J.等人“Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at highconcentrations[用于高浓度下的单分子分析的零模波导].”Science[科学]299,682-686(2003)；Lundquist,P.M.等人“Parallel confocal detection of single molecules inreal time[单分子的实时并行共聚焦检测].”Opt.Lett.[光学快报]33,1026-1028(2008)；Korlach,J.等人“Selective aluminum passivation for targeted immobilization ofsingle DNA polymerase molecules in zero-mode waveguide nano structures[用于单个DNA聚合酶分子在零模波导纳米结构中的靶向固定的选择性铝钝化].”Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]105,1176-1181(2008))。如本文所阐述的，可以储存、处理和分析从此类方法获得的图像。
一些SBS实施例包括检测在将核苷酸掺入延伸产物后释放的质子。例如，基于释放的质子的检测的测序可以使用电检测器和从可从离子激流公司(Ion Torrent)(康涅狄格州吉尔福德，生命科技公司(Life Technologies)子公司)商购获得的相关技术，或者以下文献中所述的测序方法和系统：美国公开号2009/0026082；2009/0127589；2010/0137143；和2010/0282617。本文阐述的使用动力学排除扩增靶核酸的方法可以容易地应用于用于检测质子的衬底。更具体地，本文阐述的方法可以用于产生用于检测质子的扩增子的克隆群体。
上述SBS方法可以有利地以多重形式进行，使得多个不同的片段-衔接子分子被同时操纵。在具体的实施例中，可以将不同的片段-衔接子分子在共同的反应容器中或在特定衬底的表面上进行处理。这样允许以多重方式方便地递送测序试剂、除去未反应的试剂并且检测掺入事件。在使用表面结合的靶核酸的实施例中，片段-衔接子分子可以呈阵列形式。以阵列形式，片段-衔接子分子可以典型地以空间上可区分的方式结合到表面。片段-衔接子分子可以通过直接共价附接、附接到珠或其他颗粒或结合到聚合酶或附接至表面的其他分子来结合。阵列可以在每个位点(也称为特征)包括片段-衔接子分子的单个拷贝，或者可以在每个位点或特征处存在具有相同序列的多个拷贝。可以通过扩增方法(例如桥式扩增或乳液PCR)产生多个拷贝，如下文进一步详细描述。
本文阐述的方法可以使用以多种密度中的任一种具有特征的阵列，所述密度包括例如至少约10个特征/cm2、100个特征/cm2、500个特征/cm2、1,000个特征/cm2、5,000个特征/cm2、10,000个特征/cm2、50,000个特征/cm2、100,000个特征/cm2、1,000,000个特征/cm2、5,000,000个特征/cm2或更高。
本文阐述的方法的优点在于，它们同时提供了多个cm2的快速并且有效的检测。因此，本披露内容提供了能够使用本领域已知的技术(例如以上例示的技术)制备和检测核酸的整合系统。因此，本披露内容的整合系统可以包括能够将扩增试剂和/或测序试剂递送至一种或多种固定的DNA片段的流体组件，该系统包括诸如泵、阀、储液器、流体管线等的组件。流动池可以在整合系统中配置和/或用于检测靶核酸。示例性的流动池描述于，例如美国公开号2010/0111768和美国序列号13/273,666中。如针对流动池所例示，整合系统的一个或多个流体组件可以用于扩增方法和检测方法。以核酸测序的实施例为例，整合系统的一个或多个流体组件可以用于本文阐述的扩增方法，以及用于在测序方法(例如以上例示的那些)中的测序试剂的递送。可替代地，整合系统可以包括单独的流体系统以进行扩增方法和进行检测方法。能够产生扩增的核酸并且还能确定核酸序列的整合测序系统的实例包括但不限于MiSeqTM平台(伊鲁米纳公司，加利福尼亚州圣地亚哥)和描述于美国序列号13/273,666的装置，所述文献是通过引用并入本文。
在实施本文描述的方法期间，可以得到各种组合物。例如，可以得到双指标片段-衔接子分子，包括具有图2，框vii或图4所示结构的双指标片段-衔接子分子以及包括双指标片段-衔接子分子的组合物。可以得到双指标片段-衔接子分子(包括具有图2，框vii或图4所示的结构的双指标片段-衔接子分子)的测序文库以及包括测序文库的组合物。这种测序库可以结合到阵列。
本发明通过下列实例阐明。应该理解，具体实例、原料、量和程序要根据如本文所阐述的本发明的范围和精神来宽泛地解释。
实例
实例中使用的试剂
·磷酸盐缓冲盐水(PBS，赛默飞世尔公司(Thermo Fisher)，目录号10010023)
·0.25％胰蛋白酶(赛默飞世尔公司，目录号15050057)
·Tris(飞世尔公司，目录号T1503)
·HCl(飞世尔公司，目录号A144)
·NaCl(飞世尔公司，目录号M-11624)
·MgCl2(西格玛公司(Sigma)，目录号M8226)
·IgepalCA-630(西格玛公司，I8896)
·蛋白酶抑制剂(罗氏公司(Roche)，目录号11873580001)
·PCR-Clean ddH2O
·3,5-二碘水杨酸锂(西格玛公司，目录号D3635)–仅LAND方法
·甲醛(西格玛公司，目录号F8775)–仅xSDS方法
·甘氨酸(西格玛公司，目录号G8898)–仅xSDS方法
·NEBuffer 2.1(NEB，目录号B7202)–仅xSDS方法
·SDS(西格玛公司，目录号L3771)–仅xSDS方法
·TritonTMX-100(西格玛公司，目录号9002-93-1)–仅xSDS方法
·DAPI(赛默飞世尔公司，目录号D1306)
·来自Nextera试剂盒的TD缓冲液(伊鲁米纳公司，目录号FC-121-1031)
·96个指标化的胞嘧啶耗尽的转座体(使用公开的方法组装，序列示于表1中)
·9-核苷酸随机引物(表2)
·10mM dNTP Mix(NEB，目录号N0447)
·Klenow(3'->5'Exo-)聚合酶(英载公司(Enzymatics)，目录号P7010-LC-L)
·200标准强度乙醇
·指标化的i5和i7PCR引物(表3)
·Kapa HiFiTMHotStart ReadyMix
·SYBRGreen(FMC生物制品公司(FMC BioProducts)，目录号50513)
·QIAquickPCR纯化试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，目录号28104)
·dsDNA高灵敏度Qubit(赛默飞世尔公司，目录号Q32851)
·高灵敏度生物分析仪试剂盒(安捷伦公司(Agilent)，目录号5067-4626)
·NextSeq测序试剂盒(高或中150个循环)
·未甲基化Lambda DNA(普洛麦格公司，目录号D1521)
·HiSeq2500测序试剂盒(伊鲁米纳公司)
·HiSeqX测序试剂盒(伊鲁米纳公司)
·EZ-96DNA甲基化MagPrep试剂盒(兹莫研究公司(Zymo Research)，目录号D5040)
·定制LNA测序引物(表4)
·聚乙二醇(PEG)
·SPRI珠
实例中使用的设备
·35μM细胞过滤器(BD生物科学公司(BD Biosciences)，目录号352235)
·96孔板兼容的磁性支架
·Sony SH800细胞分选仪(索尼生物科技公司(Sony Biotechnology)，目录号SH800)或能够进行基于DAPI的单核分选的其他FACS仪器
·CFX连接RT热循环仪(伯乐公司(Bio-Rad)，目录号1855200)或其他实时热循环仪
·恒温混匀仪
·Qubit2.0荧光计(赛默飞世尔公司，目录号Q32866)
·2100生物分析仪(安捷伦公司，目录号G2939A)
·NextSeq500(伊鲁米纳公司，目录号SY-415-1001-1)
·HiSeq2500(伊鲁米纳公司)
·HiSeqX(伊鲁米纳公司)
表4：sciMET测序引物(LNA，5'-3')
实例1
未甲基化的对照Lambda DNA的制备
将100纳克的未甲基化的Lambda DNA、5uL的2X TD缓冲液、5uL的NIB缓冲液(10mMTris-HCl pH7.4、10MM NaCl、3mM MgCl2、0.1％ Igepal、1x蛋白酶抑制剂)以及4μL500nM的独特地指标化的胞嘧啶耗尽的转座体合并。将混合物在55℃下孵育20分钟，并且然后使用QIAquickPCR纯化柱纯化，并且用30μL EB洗脱。
将DNA的浓度用2uL的该混合物，用dsDNA高灵敏度Qubit 2.0荧光计定量。将浓度稀释至17.95pg/uL，其模拟了约5个人类细胞的基因组质量。
实例2
18％ PEG SPRI珠混合物的制备
将Sera-Mag珠(1ml)等分到低结合的1.5mL管中，并且然后放在磁性架上，直到上清液变澄清。将珠用500uL 10mM Tris-HCl，pH 8.0的溶液洗涤，并且在上清液澄清后除去溶液，并且重复该洗涤步骤，共洗涤四次。将珠在以下混合物中重悬：18％ PEG 8000(以质量计)、1M NaCl、10mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mM EDTA、0.05％吐温-20；在室温和温和搅动下孵育至少一小时，并且然后将18％ PEG SPRI珠在4℃下储存。使用前，允许这些珠达到室温。
实例3
使用3,5-二碘水杨酸锂(LAND)或SDS(xSDS)制备细胞核
A.细胞核制备和核小体耗尽的LAND方法
如果细胞处于悬浮细胞培养物中，则将培养物轻轻研磨以破裂细胞团块，将细胞通过在4℃下以500xg旋转5分钟沉淀，并且用500μL冰冷的PBS洗涤。
如果细胞处于贴壁细胞培养物中，则将培养基吸出，并且在37℃下将细胞用10mL的PBS洗涤，并且然后在37℃下添加足够的0.25％胰蛋白酶以覆盖单层。在37℃下孵育5分钟或直到90％的细胞不再粘附于表面后，以1:1的比率添加37℃培养基以淬灭胰蛋白酶。将细胞通过在4℃下以500xg旋转5分钟沉淀，并且然后用500μL冰冷的PBS洗涤。
将来自悬浮细胞培养物或贴壁细胞培养物的细胞通过以500xg旋转5分钟沉淀，并且然后在NIB缓冲液中的200μL 12.5mM LIS(2.5μL1M LIS+197.5μL NIB缓冲液)中重悬。在冰上孵育5分钟后，添加800μL NIB缓冲液。将细胞缓慢通过35μM细胞过滤器，并且添加5μLDAPI(5mg/mL)。
B.细胞核制备和核小体耗尽的xSDS方法
如果细胞处于悬浮细胞培养物中，则将培养基轻轻研磨以破裂细胞团块。将406μL37％甲醛添加到10mL培养基中的细胞中，并且在室温下轻轻摇动孵育10分钟。将八百微升的2.5M甘氨酸添加到细胞中，并且在冰上孵育5分钟，并且然后在4℃下以550xg离心8分钟。用10mL冰冷的PBS洗涤后，将细胞重悬于5mL的冰冷的NIB(10mM TrisHCl pH7.4、10mMNaCl、3mM MgCl2、0.1％ Igepal、1x蛋白酶抑制剂)中，并且在冰上轻轻混合孵育20分钟。
如果细胞处于贴壁细胞培养物中，则将培养基吸出，并且在37℃下将细胞用10mL的PBS洗涤，并且然后在37℃下添加足够的0.25％胰蛋白酶以覆盖单层。在37℃下孵育5分钟或直到90％的细胞不再粘附于表面后，以1:1的比例添加37℃培养基以淬灭胰蛋白酶，并且用培养基将体积调至10ml。将细胞重悬于10mL培养基中，并且添加406μL的37％甲醛，并且在室温下轻轻摇动孵育10分钟。将八百微升的2.5M甘氨酸添加到细胞中，并且在冰上孵育5分钟。将细胞在4℃下以550xg离心8分钟，并且用10mL冰冷的PBS洗涤。将细胞重悬于5mL冰冷的NIB中后，将其在冰上轻轻混合孵育20分钟。
将来自悬浮细胞培养物或贴壁细胞培养物的细胞或细胞核通过以500xg旋转5分钟沉淀，并且用900μL的1x NEBuffer 2.1洗涤。在以500xg旋转5分钟后，将沉淀重悬于含有12μL的20％ SDS的800μL 1xNEBuffer 2.1中，并且在42℃剧烈振摇下孵育30分钟，并且然后添加200μL的10％ TritonTMX-100，并在42℃剧烈振摇下孵育30分钟。将细胞缓慢通过35μM细胞过滤器，并且添加5μL DAPI(5mg/mL)。
实例4
细胞核分选与标签化
用10μL 1x TD缓冲液(对于1个板：500μL NIB缓冲液+500μLTD缓冲液)制备标签化板，并且将2500个单细胞核分选到该标签化板的每个孔中。在此步骤中，每孔的细胞核数可以稍有变化，只要对于全板每孔的细胞核数一致即可。由于将保留转座酶指标，因此还可以将不同的样品复用到板的不同孔中。根据图2对这些细胞进行门控。在使板以500x g旋转沉降5分钟后，将4μL 500nM独特地指标化的胞嘧啶耗尽的转座体添加到每个孔中。密封后，将板在55℃下轻轻摇动孵育15分钟。然后将板置于冰上。合并所有的孔，然后通过35μM细胞过滤器。添加5微升的DAPI(5mg/mL)。
实例5
细胞核的第二分选
使用5uL Zymo消化试剂(2.5uL M-消化缓冲液，2.25uL H2O和0.25uL蛋白酶K)制备每个孔的主混合物。使用最严格的分选设置将10个或22个单细胞核分选到每个孔中。将10个单细胞核分选到孔中以用于未甲基化的对照加入(spike-in)，并且将22个细胞分选到其他孔中。然后将板在4℃下以600x g旋转沉降5min。
实例6
消化和亚硫酸氢盐转化
将约35pg(2uL)的用C耗尽的转座体预处理的未甲基化对照Lambda DNA用于在孔中掺加10个单细胞核。遵循制造商的方案，将板在50℃下孵育20分钟以消化细胞核，并且添加32.5uL刚制备的Zymo CT转化试剂。通过研磨将孔混合，并且将板在4℃下以600x g旋转沉降2min。在继续之前，将板置于热循环仪上进行以下步骤：98℃持续8分钟，64℃持续3.5小时，然后在4℃下保持少于20小时。将Zymo MagBinding珠(5uL)添加到每个孔中，并且将150uL M-结合缓冲液添加到每个孔中。通过研磨将孔混合后，将板在室温下孵育5分钟。将板置于96孔兼容的磁性架上，直到上清液澄清。
除去上清液，并且通过以下方式将孔用新鲜的80％乙醇(以体积计)洗涤：i)从磁性架上移开板，ii)向每个孔中添加100uL的80％乙醇，在珠沉淀上流动，并且iii)将板放回磁性架上，并且然后在上清液澄清后立即除去上清液。
通过以下方式完成脱磺化：向每个孔中添加50uL M-脱磺化缓冲液，通过研磨使珠完全重悬，在室温下孵育15分钟，并且将板置于磁性架上，并且然后在上清液澄清后立即除去上清液。
除去上清液，并且通过以下方式将孔用新鲜的80％乙醇(以体积计)洗涤：i)从磁性架上移开板，ii)向每个孔中添加100uL 80％乙醇，在珠沉淀上流动，并且iii)将板放回磁性架，然后在上清液澄清后立即除去上清液。
允许珠沉淀干燥约10分钟，直到沉淀开始明显破裂为止。
通过以下方式完成洗脱：向每个孔中添加25uL Zymo M-洗脱缓冲液，研磨以完全解离沉淀，并且将板在55℃下加热4分钟。
实例7
线性扩增
将全部洗脱液移至每孔配有以下反应混合物的板上：16uL PCR-洁净H2O、5uL 10XNEBuffer 2.1、2uL 10mM dNTP Mix和2uL 10uM9核苷酸随机引物。
线性扩增是如下进行的：i)通过在95℃下孵育45秒使DNA变成单链，然后在冰上快速冷却并保持在冰上，ii.一旦完全冷却后，向每个孔中添加10U Klenow(3'->5'exo-)聚合酶，以及iii)将板在4℃下孵育5分钟，然后以+1℃/15秒的速率升温至37℃，然后在37℃下保持90分钟。
将步骤i-iii再重复三次，总共进行四轮线性扩增。对于每次扩增，将以下混合物添加到每个孔的反应物中：1uL 10uM 9核苷酸随机引物、1uL 10mM dNTP Mix和1.25uL 4XNEBuffer 2.1。与较少轮次相比，四轮线性扩增典型地显著提高读段比对率和文库复杂性。
如下以1.1X(与孔反应物体积相比，浓度x体积)使用制备的18％ PEG SPRI珠混合物清理孔。将该板在室温下孵育5分钟，置于磁性架上，并且在上清液澄清后立即除去上清液。将珠沉淀用50uL 80％乙醇洗涤。除去任何残留液体，并且允许珠沉淀干燥，直到开始破裂。在21uL 10mM Tris-Cl(pH 8.5)中洗脱DNA。
实例8
指标化PCR反应
将全部洗脱液移至每孔配有以下反应混合物的板上：2uL的10uM i7指标PCR引物、2uL的10uM i5指标PCR引物、25uL的2X KAPA HiFiTMHotStart ReadyMix和0.5uL 100XSYBRGreen I。在实时热循环仪上以以下循环进行PCR扩增：95℃持续2分钟，(94℃持续80秒，65℃持续30秒，72℃持续30秒)，并且一旦大部分的孔显示测量的SYBR绿色荧光弯曲，立即停止反应。在文库制备的16-21个PCR循环之间观察到了弯曲稳定期。
实例9
文库清理和量化
如下以0.8X(与孔反应物体积相比，体积x浓度)使用18％ PEG SPRI珠混合物清理每孔的文库。将该板在室温下孵育5分钟，置于磁性架上，并且在上清液澄清后立即除去上清液。将珠沉淀用50uL 80％乙醇洗涤。除去任何残留液体，并且允许珠沉淀干燥，直到开始破裂。在25uL 10mM Tris-Cl(pH 8.5)中洗脱DNA。
遵循制造商的方案，使用每孔的5uL合并文库，并且用dsDNA高灵敏度Qubit2.0荧光计使用2uL定量DNA的浓度。遵循制造商的方案，将Qubit读数用于将文库稀释至约4ng/uL，并且将1uL在高灵敏度生物分析仪2100上运行。然后针对200bp-1kbp范围将文库定量，以将合并物稀释至1nM，用于Illumina测序。
实例10
测序
按照制造商的说明书，将NextSeq500设置用于1nM样品的运行，以下更改除外。以0.9pM的浓度和1.5mL的总体积加载文库合并物，并且将其存放于盒位置10中；通过将9μL的100μM储备测序引物1稀释到总共1.5mL的HT1缓冲液中，将定制引物设置到盒位置7中，并且通过将18μL100μM储备浓度的每种定制指标测序引物稀释到总共3mL HT1缓冲液中，将该定制指标测序引物设置到盒位置9中；以独立模式运行NextSeq500；选择SCIseq定制化学配方(Amini等人,2014,Nat.Genet.[自然遗传]46,1343–1349)；选择双指标；输入适当的读取循环数(建议150个)；10个循环用于指标1以及20个循环用于指标2；选择用于所有读段和指标的自定义复选框。
本文引用的所有专利、专利申请和出版物和以电子方式获得的材料(包括例如，在例如GenBank和RefSeq中的核苷酸序列提交、和在例如SwissProt、PIR、PRF、PDB中的氨基酸序列提交、和在GenBank和RefSeq中的注释编码区的翻译)的全部披露内容都是通过引用以其整体并入。出版物中提到的补充材料(如补充表、补充图、补充材料和方法和/或补充实验数据)同样是通过引用以其整体并入。在本申请的披露内容与通过引用结合在此的任何文献的一个或多个披露内容之间存在任何不一致性的情况下，将以本申请的披露内容为准。已经仅出于清晰理解的目的给出前述发明详述和实例。不用将其理解成不必要的限制。本发明不限于所示和所述的精确细节，因为将在权利要求书定义的本发明内包含对于本领域技术人员而言显而易见的变体。
除非另外指明，在所有情况下，表示在说明书和权利要求书中使用的组分的量、分子量等的所有数字都要理解为由术语“约”修饰。因此，除非另外指示相反含义，在说明书和权利要求书中阐述的数值参数是近似值，可以根据本发明所寻求获得的所需特性而变化。至少，并且不是试图限制权利要求的范围的等同物的原则，每个数值参数至少应根据所报告的有效位的数目并且通过应用一般舍入方法来解释。
虽然阐述本发明的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是在具体实例中阐述的数值是尽可能精确地报告。然而，所有数值固有地含有必然由其对应的测试测量中所发现的标准偏差所产生的范围。
所有标题都是为了方便读者，并且不应用来限制标题后正文的含义，除非这样说明。

Claims (97)

1.一种制备用于确定来自多个单细胞的核酸的甲基化状态的测序文库的方法，该方法包括：
(a)提供来自多个细胞的分离的细胞核；
(b)使这些分离的细胞核经历化学处理以产生耗尽核小体的细胞核，同时保持这些分离的细胞核的完整性；
(c)将这些耗尽核小体的细胞核的子集分配到包含转座体复合物的第一多个区室中，其中每个区室中的该转座体复合物包含与其他区室中的第一指标序列不同的第一指标序列；
(d)将耗尽核小体的细胞核的这些子集中的核酸片段化为多个核酸片段，并且将这些第一指标序列掺入这些核酸片段的至少一条链中，以产生指标化细胞核；
(e)将这些指标化细胞核组合以产生合并的指标化细胞核；
(f)将这些合并的指标化细胞核的子集分配到第二多个区室中，并且使这些指标化细胞核经历处理，以鉴定甲基化的核苷酸和产生经处理的核酸片段；
(g)通过使用多个引物的线性扩增来扩增每个区室中的这些经处理的核酸片段以产生扩增的片段-衔接子分子，这些引物在5'末端包含通用核苷酸序列，并且在3'末端包含随机核苷酸序列；
(h)将第二指标序列掺入这些扩增的片段-衔接子分子中以产生双指标片段-衔接子分子，其中在每个区室中的该第二指标序列不同于其他区室中的第二指标序列；以及
(i)将这些双指标片段-衔接子分子组合，从而产生用于确定来自该多个单细胞的核酸的甲基化状态的测序文库。
2.如权利要求1所述的方法，其中该化学处理包括用能够破坏核酸-蛋白质相互作用的离液剂进行的处理。
3.如权利要求2所述的方法，其中该离液剂包含二碘水杨酸锂。
4.如权利要求1所述的方法，其中该化学处理包括用能够破坏核酸-蛋白质相互作用的去污剂进行的处理。
5.如权利要求4所述的方法，其中该去污剂包含十二烷基硫酸钠(SDS)。
6.如权利要求5所述的方法，其中在步骤(a)之前，将这些细胞用交联剂处理。
7.如权利要求6所述的方法，其中该交联剂是甲醛。
8.如权利要求1所述的方法，其中步骤(c)和(f)中的该分配是通过荧光激活的细胞核分选进行的。
9.如权利要求1所述的方法，其中这些耗尽核小体的细胞核的子集包括大致相等的细胞核数。
10.如权利要求9所述的方法，其中这些耗尽核小体的细胞核的子集包括从1到约2000个细胞核。
11.如权利要求1所述的方法，其中该第一多个区室是多孔板。
12.如权利要求11所述的方法，其中该多孔板是96孔板或384孔板。
13.如权利要求1所述的方法，其中这些合并的指标化细胞核的子集包括大致相等的细胞核数。
14.如权利要求13所述的方法，其中这些合并的指标化细胞核的子集包括从1到约25个细胞核。
15.如权利要求1所述的方法，其中这些合并的指标化细胞核的子集包括比这些耗尽核小体的细胞核的子集少至少10倍的细胞核。
16.如权利要求1所述的方法，其中这些合并的指标化细胞核的子集包括比这些耗尽核小体的细胞核的子集少至少100倍的细胞核。
17.如权利要求1所述的方法，其中该第二多个区室是多孔板。
18.如权利要求17所述的方法，其中该多孔板是96孔板或384孔板。
19.如权利要求1所述的方法，其中这些转座体复合物各自包含转座酶和转座子，这些转座子各自包含转移链。
20.如权利要求19所述的方法，其中该转移链不包含胞嘧啶残基。
21.如权利要求20所述的方法，其中该转移链包含该第一指标序列。
22.如权利要求21所述的方法，其中该转移链还包含第一通用序列和第一测序引物序列。
23.如权利要求1所述的方法，其中该处理鉴定甲基化的CpG二核苷酸。
24.如权利要求1所述的方法，其中这些经处理的核酸片段的线性扩增包括1至10个循环。
25.如权利要求1所述的方法，其中步骤(g)中位于这些引物5'末端的该通用核苷酸序列包含第二测序引物序列。
26.如权利要求1所述的方法，其中步骤(g)中位于这些引物3'末端的该随机核苷酸序列由9个随机的核苷酸组成。
27.如权利要求1所述的方法，其中步骤(h)中该第二指标序列的掺入包括使每个区室中的这些扩增的片段-衔接子分子与各自包含指标序列的第一通用引物和第二通用引物接触，并且进行指数扩增反应。
28.如权利要求27所述的方法，其中该第一通用引物的指标序列是该第二通用引物的指标序列的反向补体。
29.如权利要求27所述的方法，其中该第一通用引物的指标序列与该第二通用引物的指标序列的反向补体不同。
30.如权利要求27所述的方法，其中该第一通用引物还包含第一捕获序列和与位于这些扩增的片段-衔接子分子3'末端的通用序列互补的第一锚定序列。
31.如权利要求30所述的方法，其中该第一捕获序列包含P5引物序列。
32.如权利要求27所述的方法，其中该第二通用引物还包含第二捕获序列和与位于这些扩增的片段-衔接子分子5'末端的通用序列互补的第二锚定序列。
33.如权利要求32所述的方法，其中该第二捕获序列包含P7引物序列的反向补体。
34.如权利要求27所述的方法，其中该指数扩增反应包括聚合酶链反应(PCR)。
35.如权利要求34所述的方法，其中该PCR包括15至30个循环。
36.如权利要求1所述的方法，该方法还包括使用对靶核酸具有特异性的多个捕获寡核苷酸富集这些靶核酸。
37.如权利要求36所述的方法，其中将这些捕获寡核苷酸固定在固体衬底的表面上。
38.如权利要求36所述的方法，其中这些捕获寡核苷酸包含通用结合对的第一成员，并且其中将该结合对的第二成员固定在固体衬底的表面上。
39.如权利要求1所述的方法，该方法还包括选择落入预定大小范围内的这些双指标片段-衔接子分子。
40.如权利要求1所述的方法，该方法还包括对这些双指标片段-衔接子分子进行测序，以确定来自该多个单细胞的核酸的甲基化状态。
41.一种制备用于确定来自多个单细胞的核酸的甲基化状态的测序文库的方法，该方法包括：
(a)提供来自多个细胞的分离的细胞核；
(b)使这些分离的细胞核经历化学处理以产生耗尽核小体的细胞核，同时保持这些分离的细胞核的完整性；
(c)将这些耗尽核小体的细胞核的子集分配到包含转座体复合物的第一多个区室中，其中每个区室中的该转座体复合物包含与其他区室中的第一指标序列不同的第一指标序列；
(d)将这些耗尽核小体的细胞核的子集中的核酸片段化为多个核酸片段，并且将这些第一指标序列掺入这些核酸片段的至少一条链中，以产生指标化细胞核；
(e)将这些指标化细胞核组合以产生合并的指标化细胞核；
(f)将这些合并的指标化细胞核的子集分配到第二多个区室中，并且使这些指标化细胞核经历处理，以鉴定甲基化的核苷酸和产生经处理的核酸片段；
(g)将每个区室中的这些经处理的核酸片段与通用衔接子连接，以产生连接的片段-衔接子分子；
(h)将第二指标序列掺入这些连接的片段-衔接子分子中以产生双指标片段-衔接子分子，其中每个区室中的该第二指标序列不同于其他区室中的第二指标序列；以及
(i)将这些双指标片段-衔接子分子组合，从而产生用于确定来自该多个单细胞的核酸的甲基化状态的测序文库。
42.如权利要求41所述的方法，其中该化学处理包括用能够破坏核酸-蛋白质相互作用的离液剂进行的处理。
43.如权利要求42所述的方法，其中该离液剂包含二碘水杨酸锂。
44.如权利要求41所述的方法，其中该化学处理包括用能够破坏核酸-蛋白质相互作用的去污剂进行的处理。
45.如权利要求44所述的方法，其中该去污剂包含十二烷基硫酸钠(SDS)。
46.如权利要求45所述的方法，其中在步骤(a)之前，将这些细胞用交联剂处理。
47.如权利要求46所述的方法，其中该交联剂是甲醛。
48.如权利要求41所述的方法，其中步骤(c)和(f)中的该分配是通过荧光激活的细胞核分选进行的。
49.如权利要求41所述的方法，其中这些耗尽核小体的细胞核的子集包括大致相等的细胞核数。
50.如权利要求49所述的方法，其中这些耗尽核小体的细胞核的子集包括从1到约2000个细胞核。
51.如权利要求41所述的方法，其中该第一多个区室是多孔板。
52.如权利要求51所述的方法，其中该多孔板是96孔板或384孔板。
53.如权利要求41所述的方法，其中这些合并的指标化细胞核的子集包括大致相等的细胞核数。
54.如权利要求53所述的方法，其中这些合并的指标化细胞核的子集包括从1到约25个细胞核。
55.如权利要求41所述的方法，其中这些合并的指标化细胞核的子集包括比这些耗尽核小体的细胞核的子集少至少10倍的细胞核。
56.如权利要求41所述的方法，其中这些合并的指标化细胞核的子集包括比这些耗尽核小体的细胞核的子集少至少100倍的细胞核。
57.如权利要求41所述的方法，其中该第二多个区室是多孔板。
58.如权利要求57所述的方法，其中该多孔板是96孔板或384孔板。
59.如权利要求41所述的方法，其中这些转座体复合物各自包含转座酶和转座子，这些转座子各自包含转移链。
60.如权利要求59所述的方法，其中该转移链不包含胞嘧啶残基。
61.如权利要求60所述的方法，其中该转移链包含该第一指标序列。
62.如权利要求61所述的方法，其中该转移链还包含第一通用序列和第一测序引物序列。
63.如权利要求41所述的方法，其中该处理鉴定甲基化的CpG二核苷酸。
64.如权利要求41所述的方法，该方法还包括在该通用衔接子的连接之前，将一个或多个核苷酸添加到这些经处理的核酸片段的3'末端，以产生3'悬突。
65.如权利要求64所述的方法，其中一个或多个核苷酸的该添加是使用末端转移酶进行的。
66.如权利要求64所述的方法，其中该通用衔接子包含与这些经处理的核酸片段中的3'悬突反向互补的悬突。
67.如权利要求41所述的方法，其中步骤(h)中该第二指标序列的掺入包括使每个区室中的这些双指标片段-衔接子分子与各自包含指标序列的第一通用引物和第二通用引物接触，并且进行指数扩增反应。
68.如权利要求67所述的方法，其中该第一通用引物的指标序列是该第二通用引物的指标序列的反向补体。
69.如权利要求67所述的方法，其中该第一通用引物的指标序列与该第二通用引物的指标序列的反向补体不同。
70.如权利要求67所述的方法，其中该第一通用引物还包含第一捕获序列和与位于这些双指标片段-衔接子分子3'末端的通用序列互补的第一锚定序列。
71.如权利要求70所述的方法，其中该第一捕获序列包含P5引物序列。
72.如权利要求67所述的方法，其中该第二通用引物还包含第二捕获序列和与位于这些双指标片段-衔接子分子5'末端的通用序列互补的第二锚定序列。
73.如权利要求72所述的方法，其中该第二捕获序列包含P7引物序列的反向补体。
74.如权利要求67所述的方法，其中该指数扩增反应包括聚合酶链反应(PCR)。
75.如权利要求74所述的方法，其中该PCR包括15至30个循环。
76.如权利要求41所述的方法，该方法还包括使用对靶核酸具有特异性的多个捕获寡核苷酸富集这些靶核酸。
77.如权利要求76所述的方法，其中将这些捕获寡核苷酸固定在固体衬底的表面上。
78.如权利要求76所述的方法，其中这些捕获寡核苷酸包含通用结合对的第一成员，并且其中将该结合对的第二成员固定在固体衬底的表面上。
79.如权利要求41所述的方法，该方法还包括选择落入预定大小范围内的这些双指标片段-衔接子分子。
80.如权利要求41所述的方法，该方法还包括对这些双指标片段-衔接子分子进行测序，以确定来自该多个单细胞的核酸的甲基化状态。
81.如权利要求40所述的方法，该方法还包括：
提供包含多个扩增位点的表面，
其中这些扩增位点包括具有自由3'末端的连接的单链核酸的至少两个群体，以及
使包含扩增位点的该表面与该测序文库在适合产生多个扩增位点的条件下接触，该多个扩增位点各自包含来自单个双指标片段-衔接子分子的扩增子的克隆群体。
82.如权利要求81所述的方法，其中这些双指标片段-衔接子分子的数量超过扩增位点的数量，其中这些双指标片段-衔接子分子具有到达这些扩增位点的流体通路，并且其中这些扩增位点各自包含用于该测序文库中的几个双指标片段-衔接子分子的容量。
83.如权利要求81所述的方法，其中该接触同时包括(i)以平均转运速率将这些双指标片段-衔接子分子转运到这些扩增位点，以及(ii)以平均扩增速率扩增位于这些扩增位点的双指标片段-衔接子分子，其中该平均扩增速率超过该平均转运速率。
84.如权利要求80所述的方法，该方法还包括：
提供包含多个扩增位点的表面，
其中这些扩增位点包括具有自由3'末端的连接的单链核酸的至少两个群体，以及
使包含扩增位点的该表面与该测序文库在适合产生多个扩增位点的条件下接触，该多个扩增位点各自包含来自单个双指标片段-衔接子分子的扩增子的克隆群体。
85.如权利要求84所述的方法，其中这些双指标片段-衔接子分子的数量超过扩增位点的数量，其中这些双指标片段-衔接子分子具有到达这些扩增位点的流体通路，并且其中这些扩增位点各自包含用于该测序文库中的几个双指标片段-衔接子分子的容量。
86.如权利要求84所述的方法，其中该接触同时包括(i)以平均转运速率将这些双指标片段-衔接子分子转运到这些扩增位点，以及(ii)以平均扩增速率扩增位于这些扩增位点的双指标片段-衔接子分子，其中该平均扩增速率超过该平均转运速率。
87.如权利要求1或41所述的方法，其中鉴定甲基化的核苷酸的处理包括亚硫酸氢盐或肼。
88.如权利要求1或41所述的方法，其中所述亚硫酸氢盐处理将CpG二核苷酸的未甲基化的胞嘧啶残基转化为尿嘧啶残基，并且使5-甲基胞嘧啶残基保持不变。
89.一种组合物，其包含耗尽核小体的细胞核，所述耗尽核小体的细胞核包含经处理以鉴定甲基化的核苷酸的核酸片段。
90.如权利要求89所述的组合物，其中所述核酸片段包括CpG序列的甲基化状态依赖性化学修饰。
91.如权利要求89所述的组合物，其中所述核酸片段还包括第一指标序列。
92.如权利要求89所述的组合物，其中所述核酸片段还包括通用序列。
93.如权利要求89所述的组合物，其中所述核酸片段还包括第一测序引物序列。
94.如权利要求88-93中任一项所述的组合物，其中所述第一指标、通用序列或第一测序引物序列为胞嘧啶耗尽的。
95.如权利要求89所述的组合物，其中所述耗尽核小体的细胞核还包括转座体复合物。
96.如权利要求91所述的组合物，其中所述组合物包括耗尽核小体的细胞核的子集，并且其中所述第一指标序列与耗尽核小体的细胞核的每个子集不同。
97.通过权利要求1或41所述的方法产生的测序文库。
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