CN118496354A

CN118496354A - 包含共同轻链的抗体库、其制备方法及其用途

Info

Publication number: CN118496354A
Application number: CN202310121673.1A
Authority: CN
Inventors: 郎国竣; 徐培芳; 闫鑫甜; 刘婵娟; 许彩云; 方小鹏; 薛超然; 韩洋洋; 卢艳青; 尚瑞沙
Original assignee: Sanyou Biopharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: Sanyou Biopharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 2023-02-15
Filing date: 2023-02-15
Publication date: 2024-08-16
Also published as: WO2024169928A1

Abstract

本发明涉及具有重链多样性的包含共同轻链的抗体库，以及制备所述抗体库的方法。本发明还涉及所述具有重链多样性的包含共同轻链的抗体库的用途，用于制备具有共同轻链的双特异性抗体；以及所制备的包含共同轻链的双特异性抗体。

Description

包含共同轻链的抗体库、其制备方法及其用途

技术领域

本发明总体上涉及抗体工程领域。更具体地，本发明涉及具有重链多样性的包含共同轻链的抗体库、其制备方法及其在获得具有共同轻链的双特异性抗体上的用途。

背景技术

双特异性抗体的概念早在60年前已经提出，随着单克隆抗体技术的发展以及单克隆抗体药物在临床应用的逐渐成熟，双特异性抗体技术及药物的开发速度也突飞猛进。由于双特异性抗体能够在机制上解决单克隆抗体不能及的问题，因此，为了开发具有更好治疗效果的抗体药物，诸多药物研发企业和研发机构展开了对双特异性抗体的布局和开发。目前仅有5款双特异性抗体药物上市在售，2018年的销售额为4.6亿美元，而到2024年预估能达到54.3亿美元(Siwei Nie,Jijie GuB et al.(2020).“Biology drives thediscovery of bispecific antibodies as innovative therapeutics.”AntibodyTherapeuticsv13(1):18-62)。由此可见，开发优于单克隆抗体疗效的双特异性抗体药物具有巨大的市场。

双特异性抗体是一种能够同时结合两个不同抗原表位的抗体，可以是结合两个靶点蛋白的双特异性抗体，或是结合同一个靶点不同表位的双表位型双特异性抗体。双特异性抗体因为其独特的作用机制，使得其拥有单克隆抗体达不到的效应，如能够将效应细胞带到靶细胞附近，杀伤靶细胞的双特异性抗体，例如抗CD3抗体和抗肿瘤相关抗原抗体组合的双特异性抗体；如能够同时结合细胞表面两个靶点的双特异性抗体，达到共激活或共抑制的效果；如通过抗体的一臂介导穿过血脑屏障、抗体另一臂发挥效应功能的双特异性抗体等；另外还有能结合同一抗原不同表位的双特异性抗体，其具有优于结合单一抗原表位的效应等，且这些双特异性抗体的作用机制均为单克隆抗体所不能及(Labrijn,A.F.,etal.

(2019)."Bispecific antibodies:a mechanistic review of the pipeline."Nat Rev Drug Discov 18(8):585-608.)。

由于双特异性抗体上的两个臂在作用机制上的协同，获得双特异性抗体是人们期望的。目前，在双特异性抗体的制备上面临的主要难题是链错配问题。而为了解决这个问题，各种各样的双特异性抗体构型平台应运而生，包括小型化的双特异性抗体、各种非对称构型的双特异性抗体和共同轻链的双特异性抗体等，双特异性抗体的构型类目繁多(Suurs,F.V.,et al.(2019)."A review of bispecific antibodies and antibodyconstructs in oncology and clinical challenges."Pharmacol Ther 201:103-119.)。目前仅有五款上市在售的双特异性抗体，一个为小型化的双ScFv串联抗体(CD3×CD19,blinatumomab)，一个为具有共同轻链的双特异性抗体(Factor IX×Factor X,emicizumab)，两个为Duobody构型双特异抗体(CD20

×CD3双抗mosunetuzumab和EGFR×cMET双抗amivantamab)，另一个是运用Crossmab和Knob in hole技术的ANG2×VEGF-A双抗faricimab，大部分其它构型的双特异性抗体均处于临床前研究或临床I期阶段。因此，对于各种双特异性抗体构型的临床研究，还需要很长时间来证实其安全性和有效性。

对于具有共同轻链构型的双特异性抗体，与常规IgG抗体相比较，其主要的区别在于两条重链的可变区序列不同，但组合的轻链序列完全相同，从而能够避免轻链错配的问题。进一步地，通过在两条重链的Fc区段具有数个位点的突变(例如，结入扣(knob-in-hole)突变)，可以规避相同重链组合成二聚体，进而规避了同源重链的错配问题。因此，共同轻链构型的双特异性抗体能很好地解决抗体链错配的问题，且在结构上和天然的IgG型抗体高度一致，而IgG抗体占人体抗体的总量的70％左右，因此，相比于各种双特异性抗体构型，可以预期共同轻链构型的双特异性抗体在人体内具有更好的成药性和安全性。

因此，本领域需要这样的抗体平台，其是一种具有重链多样性的包含共同轻链的抗体库，能够通过使用多种抗原淘选该抗体库来高通量获得具有共同轻链的多特异性抗体。

发明概述

本发明涉及对多特异性抗体(例如，双特异性抗体)中的共同轻链的设计及包含共同轻链的文库的构建。基于本发明中设计的成药性好的共同轻链序列，将其与具有高度多样性的人抗体重链序列组合，构建了具有共同轻链的抗体文库。

因此，在第一方面，本发明提供了具有重链多样性的包含共同轻链的抗体库，其中所述抗体库中的共同轻链是由IGKV3或IGKV1轻链种系基因编码的。

在一些实施方案中，本发明抗体库中的共同轻链是由IGKV3-20、IGKV3-11、IGKV1-39、IGKV1-5或IGKV1-33轻链种系基因编码的。

在优选的实施方案中，本发明抗体库中的共同轻链是由IGKV3-20或IGKV1-39轻链种系基因编码的。

在一些具体实施方案中，本发明抗体库中的共同轻链分别包含：

(a)SEQ ID NO:1所示的LCDR1或SEQ ID NO:1所示的LCDR1的不超过2个氨基酸变化的变体、SEQ ID NO:2所示的LCDR2或SEQ ID NO:2所示的LCDR2的不超过2个氨基酸变化的变体、和SEQ ID NO:3所示的LCDR3或SEQ ID NO:3所示的LCDR3的不超过2个氨基酸变化的变体；

(b)SEQ ID NO:4所示的LCDR1或SEQ ID NO:4所示的LCDR1的不超过2个氨基酸变化的变体、SEQ ID NO:5所示的LCDR2或SEQ ID NO:5所示的LCDR2的不超过2个氨基酸变化的变体、和SEQ ID NO:6所示的LCDR3或SEQ ID NO:6所示的LCDR3的不超过2个氨基酸变化的变体；

(c)SEQ ID NO:7所示的LCDR1或SEQ ID NO:7所示的LCDR1的不超过2个氨基酸变化的变体、SEQ ID NO:8所示的LCDR2或SEQ ID NO:8所示的LCDR2的不超过2个氨基酸变化的变体、和SEQ ID NO:9所示的LCDR3或SEQ ID NO:9所示的LCDR3的不超过2个氨基酸变化的变体；

(d)SEQ ID NO:10所示的LCDR1或SEQ ID NO:10所示的LCDR1的不超过2个氨基酸变化的变体、SEQ ID NO:11所示的LCDR2或SEQ ID NO:11所示的LCDR2的不超过2个氨基酸变化的变体、和SEQ ID NO:12所示的LCDR3或SEQ ID NO:12所示的LCDR3的不超过2个氨基酸变化的变体；

(e)SEQ ID NO:13所示的LCDR1或SEQ ID NO:13所示的LCDR1的不超过2个氨基酸变化的变体、SEQ ID NO:14所示的LCDR2或SEQ ID NO:14所示的LCDR2的不超过2个氨基酸变化的变体、和SEQ ID NO:15所示的LCDR3或SEQ ID NO:15所示的LCDR3的不超过2个氨基酸变化的变体；

(f)SEQ ID NO:16所示的LCDR1或SEQ ID NO:16所示的LCDR1的不超过2个氨基酸变化的变体、SEQ ID NO:17所示的LCDR2或SEQ ID NO:17所示的LCDR2的不超过2个氨基酸变化的变体、和SEQ ID NO:18所示的LCDR3或SEQ ID NO:18所示的LCDR3的不超过2个氨基酸变化的变体；

(g)SEQ ID NO:19所示的LCDR1或SEQ ID NO:19所示的LCDR1的不超过2个氨基酸变化的变体、SEQ ID NO:20所示的LCDR2或SEQ ID NO:20所示的LCDR2的不超过2个氨基酸变化的变体、和SEQ ID NO:21所示的LCDR3或SEQ ID NO:21所示的LCDR3的不超过2个氨基酸变化的变体；

(h)SEQ ID NO:22所示的LCDR1或SEQ ID NO:22所示的LCDR1的不超过2个氨基酸变化的变体、SEQ ID NO:23所示的LCDR2或SEQ ID NO:23所示的LCDR2的不超过2个氨基酸变化的变体、和SEQ ID NO:24所示的LCDR3或SEQ ID NO:24所示的LCDR3的不超过2个氨基酸变化的变体；

(i)SEQ ID NO:25所示的LCDR1或SEQ ID NO:25所示的LCDR1的不超过2个氨基酸变化的变体、SEQ ID NO:26所示的LCDR2或SEQ ID NO:26所示的LCDR2的不超过2个氨基酸变化的变体、和SEQ ID NO:27所示的LCDR3或SEQ ID NO:27所示的LCDR3的不超过2个氨基酸变化的变体；

(j)SEQ ID NO:28所示的LCDR1或SEQ ID NO:28所示的LCDR1的不超过2个氨基酸变化的变体、SEQ ID NO:29所示的LCDR2或SEQ ID NO:29所示的LCDR2的不超过2个氨基酸变化的变体、和SEQ ID NO:30所示的LCDR3或SEQ ID NO:30所示的LCDR3的不超过2个氨基酸变化的变体；

(k)SEQ ID NO:31所示的LCDR1或SEQ ID NO:31所示的LCDR1的不超过2个氨基酸变化的变体、SEQ ID NO:32所示的LCDR2或SEQ ID NO:32所示的LCDR2的不超过2个氨基酸变化的变体、和SEQ ID NO:33所示的LCDR3或SEQ ID NO:33所示的LCDR3的不超过2个氨基酸变化的变体；

(l)SEQ ID NO:34所示的LCDR1或SEQ ID NO:34所示的LCDR1的不超过2个氨基酸变化的变体、SEQ ID NO:35所示的LCDR2或SEQ ID NO:35所示的LCDR2的不超过2个氨基酸变化的变体、和SEQ ID NO:36所示的LCDR3或SEQ ID NO:36所示的LCDR3的不超过2个氨基酸变化的变体；

(m)SEQ ID NO:37所示的LCDR1或SEQ ID NO:37所示的LCDR1的不超过2个氨基酸变化的变体、SEQ ID NO:38所示的LCDR2或SEQ ID NO:38所示的LCDR2的不超过2个氨基酸变化的变体、和SEQ ID NO:39所示的LCDR3或SEQ ID NO:39所示的LCDR3的不超过2个氨基酸变化的变体；

(n)SEQ ID NO:40所示的LCDR1或SEQ ID NO:40所示的LCDR1的不超过2个氨基酸变化的变体、SEQ ID NO:41所示的LCDR2或SEQ ID NO:41所示的LCDR2的不超过2个氨基酸变化的变体、和SEQ ID NO:42所示的LCDR3或SEQ ID NO:42所示的LCDR3的不超过2个氨基酸变化的变体；

(o)SEQ ID NO:43所示的LCDR1或SEQ ID NO:43所示的LCDR1的不超过2个氨基酸变化的变体、SEQ ID NO:44所示的LCDR2或SEQ ID NO:44所示的LCDR2的不超过2个氨基酸变化的变体、和SEQ ID NO:45所示的LCDR3或SEQ ID NO:45所示的LCDR3的不超过2个氨基酸变化的变体；

(p)SEQ ID NO:46所示的LCDR1或SEQ ID NO:46所示的LCDR1的不超过2个氨基酸变化的变体、SEQ ID NO:47所示的LCDR2或SEQ ID NO:47所示的LCDR2的不超过2个氨基酸变化的变体、和SEQ ID NO:48所示的LCDR3或SEQ ID NO:48所示的LCDR3的不超过2个氨基酸变化的变体；

(q)SEQ ID NO:49所示的LCDR1或SEQ ID NO:49所示的LCDR1的不超过2个氨基酸变化的变体、SEQ ID NO:50所示的LCDR2或SEQ ID NO:50所示的LCDR2的不超过2个氨基酸变化的变体、和SEQ ID NO:51所示的LCDR3或SEQ ID NO:51所示的LCDR3的不超过2个氨基酸变化的变体；

(r)SEQ ID NO:49所示的LCDR1或SEQ ID NO:49所示的LCDR1的不超过2个氨基酸变化的变体、SEQ ID NO:52所示的LCDR2或SEQ ID NO:52所示的LCDR2的不超过2个氨基酸变化的变体、和SEQ ID NO:53所示的LCDR3或SEQ ID NO:53所示的LCDR3的不超过2个氨基酸变化的变体；或

(s)SEQ ID NO:54所示的LCDR1或SEQ ID NO:54所示的LCDR1的不超过2个氨基酸变化的变体、SEQ ID NO:35所示的LCDR2或SEQ ID NO:35所示的LCDR2的不超过2个氨基酸变化的变体、和SEQ ID NO:55所示的LCDR3或SEQ ID NO:55所示的LCDR3的不超过2个氨基酸变化的变体。

在一些实施方案中，本发明抗体库中的共同轻链包含任一SEQ ID NO:56-74所示的轻链可变区序列，或与所述轻链可变区序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的序列。

在一些实施方案中，本发明抗体库中的重链的可变区是由人免疫球蛋白基因座中的天然重链种系基因编码的。优选地，本发明抗体库中的重链的可变区是由人免疫球蛋白基因座中的天然重链种系基因IGHV1、IGHV3和/或IGHV4重链种系基因编码的。

在一些实施方案中，本发明抗体库中的重链的可变区是经工程化重组后的核苷酸序列编码的，例如，其中所述重链的可变区是经任一天然HCDR3与任一天然HCDR1和HCDR2重组后的核苷酸序列编码的，由此提高了抗体库的库容量和多样性。

在一些实施方案中，本发明的抗体库包含至少1×10¹⁰－1×10¹²种抗体，优选地，所述抗体库中包含的抗体至少90％是功能性的，优选地，所述抗体库中包含的抗体以100nM或更小的Kd与靶抗原结合。

在一些实施方案中，本发明的抗体库是Fab抗体库、scFv抗体库、scFab抗体库或全长抗体库。

在第二方面，本发明提供了制备本发明第一方面的抗体库的方法。

在一些实施方案中，制备本发明第一方面的抗体库的方法包括以下步骤：

(a)构建人天然抗体的基因文库；

(b)扩增步骤(a)所构建的人抗体的基因文库中的重链核苷酸序列，并回收；

(c)获得编码本发明第一方面中所述的共同轻链的核苷酸序列，

(d)将步骤(b)获得的重链核苷酸序列和步骤(c)获得的共同轻链的核苷酸序列连接入表达载体(例如，噬菌体载体酵母载体、哺乳动物细胞载体)中并表达；

例如，在原核细胞(如，大肠杆菌)或在真核细胞(如，酵母、哺乳动物细胞)中表达。

在一些实施方案中，制备本发明第一方面的抗体库的方法包括以下步骤，且所述方法使得本发明的抗体库库容扩大，包含至少1×10¹²种抗体：

(a)构建人天然抗体的基因文库；

(b)分别扩增步骤(a)所构建的人抗体的基因文库中的重链基因序列的“CDR1+CDR2”和“CDR3”；例如，使用SEQ ID NO:79-SEQ ID NO:81的引物扩增重链基因序列的“CDR1+CDR2”，使用SEQ ID NO:82-SEQ ID NO:84的引物扩增重链基因序列的“CDR3”；

(c)通过融合PCR方法将步骤(b)扩增的“CDR1+CDR2”和“CDR3”进行组合，获得PCR产物；

(d)扩增步骤(c)的人工重链核苷酸序列，并回收；

(e)获得编码本发明第一方面中所述的共同轻链的核苷酸序列，

(f)将步骤(d)获得的人工重链核苷酸序列和步骤(e)获得的共同轻链的核苷酸序列连接入表达载体(例如，噬菌体载体酵母载体、哺乳动物细胞载体)中并表达；

在第三方面，本发明提供了本发明的具有重链多样性的包含共同轻链的抗体库的用途，用于制备具有共同轻链的双特异性抗体。

在第四方面，本发明提供了通过淘选本发明的具有重链多样性的包含共同轻链的抗体库而获得的双特异性抗体。例如，基于噬菌体展示技术对本发明的Fab抗体文库在噬菌体表面进行抗体的展示，并使用任意2个靶抗原对该具有共同轻链的Fab抗体文库进行筛选，所获得的候选抗体轻链序列是共同轻链、但重链序列具有差异化。将所获得的候选分子经过体内外药效筛选、成药性评估之后，可直接用于构建具有共同轻链构型的双特异性抗体。因此，本发明中所设计的共同轻链和基于所述共同轻链构建的文库可作为共同轻链构型双特异性抗体筛选的平台，基于各种靶组合，源源不断地筛选双特异性抗体候选分子。

在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体包含第一抗原结合部分和第二抗原结合部分，其中所述第一抗原结合部分和第二抗原结合部分包含共同轻链，且所述共同轻链是由IGKV3或IGKV1轻链种系基因编码的；优选地，是由IGKV3-20、IGKV3-11、IGKV1-39、IGKV1-5或IGKV1-33轻链种系基因编码的；更优选地是由IGKV3-20或IGKV1-39轻链种系基因编码的；

例如，所述双特异性抗体中的共同轻链包含选自以下的CDR：

(r)SEQ ID NO:49所示的LCDR1或SEQ ID NO:49所示的LCDR1的不超过2个氨基酸变化的变体、SEQ ID NO:52所示的LCDR2或SEQ ID NO:52所示的LCDR2的不超过2个氨基酸变化的变体、和SEQ ID NO:53所示的LCDR3或SEQ ID NO:53所示的LCDR3的不超过2个氨基酸变化的变体；和

在一些实施方案中，本发明双特异性抗体中的共同轻链包含任一SEQ ID NO:56-74所示的轻链可变区序列，或与所述轻链可变区序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的序列。

在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体还包含由第一和第二亚基组成的Fc结构域，且所述第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合Fc结构域的第一亚基的N末端，所述第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合Fc结构域的第二亚基的N末端，例如，所述Fc结构域是免疫球蛋白分子的Fc结构域，特别是IgG类免疫球蛋白的Fc结构域，优选地是IgG₁或IgG₄ Fc结构域，更优选地是人IgG₁或IgG₄ Fc结构域。

在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替代，从而在第一亚基的CH3结构域内产生突起，其可定位在第二亚基的CH3结构域内的空腔中，并且Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替代，从而在第二亚基的CH3结构域内产生空腔，第一亚基的CH3结构域内的突起可定位于第二亚基的CH3结构域内的空腔中，由此所述双特异性抗体的重链彼此形成“结入扣(knob in hole)”的稳定缔合。

本发明还涉及编码本发明双特异性抗体的分离的多核苷酸、包含所述分离的多核苷酸的载体(特别地是表达载体)、包含所述分离的多核苷酸或所述载体的宿主细胞、以及生产所述双特异性抗体的方法。

附图简述

结合以下附图一起阅读时，将更好地理解以下详细描述的本发明的优选实施方案。出于说明本发明的目的，图中显示了目前优选的实施方案。然而，应当理解本发明不限于图中所示实施方案的精确安排和手段。

图1A显示了轻链种系(Germline)为IGKV3-20的轻链的氨基酸长度分布，其中纵坐标为个数，横坐标为氨基酸长度；图1B显示了轻链种系为IGKV3-11的轻链的氨基酸长度分布；图1C显示了轻链种系为IGKV1-39的轻链的氨基酸长度分布；图1D显示了轻链种系为IGKV1-5的轻链的氨基酸长度分布；图1E显示了轻链种系为IGKV1-33的轻链的氨基酸长度分布；图1F显示了轻链种系为IGKV3-16的轻链的氨基酸长度分布。

图2显示了实施例2.1中的19个具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库在原核细胞中的表达量。横坐标是共同轻链所来源的抗体名称；纵坐标是具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库在原核细胞中的表达量。

图3A显示了轻链种系为IGKV3-20的3个具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库在原核细胞中的表达量，其中横坐标是共同轻链所来源的抗体名称；纵坐标是具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库在原核细胞中的表达量；图3B显示了轻链种系为IGKV3-20的3个具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库在原核细胞中以不同表达量区间表达的克隆个数，其中，横坐标是表达量区间，纵坐标是克隆个数。

图4A显示了轻链种系为IGKV3-11的2个具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库在原核细胞中的表达量，其中横坐标是共同轻链所来源的抗体名称；纵坐标是具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库在原核细胞中的表达量；图4B显示了轻链种系为IGKV3-11的2个具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库在原核细胞中以不同表达量区间表达的克隆个数，其中，横坐标是表达量区间，纵坐标是克隆个数。

图5A显示了轻链种系为IGKV1-39的4个具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库在原核细胞中的表达量，其中横坐标是共同轻链所来源的抗体名称；纵坐标是具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库在原核细胞中的表达量；图5B显示了轻链种系为IGKV1-39的4个具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库在原核细胞中以不同表达量区间表达的克隆个数，其中，横坐标是表达量区间，纵坐标是克隆个数。

图6A显示了轻链种系为IGKV1-5的1个具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库在原核细胞中的表达量，其中横坐标是共同轻链所来源的抗体名称；纵坐标是具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库在原核细胞中的表达量；图6B显示了轻链种系为IGKV1-5的1个具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库在原核细胞中以不同表达量区间表达的克隆个数，其中，横坐标是表达量区间，纵坐标是克隆个数。

图7A显示了轻链种系为IGKV1-33的4个具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库在原核细胞中的表达量，其中横坐标是共同轻链所来源的抗体名称；纵坐标是具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库在原核细胞中的表达量；图7B显示了轻链种系为IGKV1-33的4个具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库在原核细胞中以不同表达量区间表达的克隆个数，其中，横坐标是表达量区间，纵坐标是克隆个数。

图8A显示了其他轻链种系的5个具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库在原核细胞中的表达量，其中横坐标是共同轻链所来源的抗体名称；纵坐标是具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库在原核细胞中的表达量；图8B显示了其他轻链种系的5个具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库在原核细胞中以不同表达量区间表达的克隆个数，其中，横坐标是表达量区间，纵坐标是克隆个数。

图9A显示了不同轻链种系的5个具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库在原核细胞中的表达量，其中横坐标是共同轻链所来源的抗体名称；纵坐标是具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库在原核细胞中的表达量；图9B显示了不同轻链种系的5个具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库在原核细胞中以不同表达量区间表达的克隆个数，其中，横坐标是表达量区间，纵坐标是克隆个数。

图10A-10B显示了具有表4中的克隆号的重链可变区的重链与共同轻链组合后的抗体在真核细胞中的表达量，其中图10A中横坐标是共同轻链所来源的抗体名称；纵坐标是具有共同轻链的各抗体在真核细胞中的表达量。

图11A显示了源自Eculizumab的轻链与具有表4中的克隆号的重链可变区亚型的重链组合后的抗体在真核细胞中的表达量，其中横坐标是表4中的克隆号的重链可变区种系；纵坐标是具有源自Eculizumab的共同轻链的各抗体在真核细胞中的表达量。

图11B显示了源自Sacituzumab的轻链与具有表4中的克隆号的重链可变区亚型的重链组合后的抗体在真核细胞中的表达量，其中横坐标是表4中的克隆号的重链可变区种系；纵坐标是具有源自Sacituzumab的共同轻链的各抗体在真核细胞中的表达量。

图11C显示了源自HNF-018的轻链与具有表4中的克隆号的重链可变区亚型的重链组合后的抗体在真核细胞中的表达量，其中横坐标是表4中的克隆号的重链可变区种系；纵坐标是具有源自HNF-018的共同轻链的各抗体在真核细胞中的表达量。

图11D显示了源自Robatumumab的轻链与具有表4中的克隆号的重链可变区亚型的重链组合后的抗体在真核细胞中的表达量，其中横坐标是表4中的克隆号的重链可变区种系；纵坐标是具有源自Robatumumab的共同轻链的各抗体在真核细胞中的表达量。

图11E显示了源自Olokizumab的轻链与具有表4中的克隆号的重链可变区亚型的重链组合后的抗体在真核细胞中的表达量，其中横坐标是表4中的克隆号的重链可变区种系；纵坐标是具有源自Olokizumab的共同轻链的各抗体在真核细胞中的表达量。

图11F显示了源自Fasinumab的轻链与具有表4中的克隆号的重链可变区亚型的重链组合后的抗体在真核细胞中的表达量，其中横坐标是表4中的克隆号的重链可变区种系；纵坐标是具有源自Fasinumab的共同轻链的各抗体在真核细胞中的表达量。

图11G显示了源自Matuzumab的轻链与具有表4中的克隆号的重链可变区亚型的重链组合后的抗体在真核细胞中的表达量，其中横坐标是表4中的克隆号的重链可变区种系；纵坐标是具有源自Matuzumab的共同轻链的各抗体在真核细胞中的表达量。

图11H显示了源自VK1-278的轻链与具有表4中的克隆号的重链可变区亚型的重链组合后的抗体在真核细胞中的表达量，其中横坐标是表4中的克隆号的重链可变区种系；纵坐标是具有源自VK1-278的共同轻链的各抗体在真核细胞中的表达量。

图11I显示了源自VK1-203的轻链与具有表4中的克隆号的重链可变区亚型的重链组合后的抗体在真核细胞中的表达量，其中横坐标是表4中的克隆号的重链可变区种系；纵坐标是具有源自VK1-203的共同轻链的各抗体在真核细胞中的表达量。

图11J显示了源自Zalutumumab的轻链与具有表4中的克隆号的重链可变区亚型的重链组合后的抗体在真核细胞中的表达量，其中横坐标是表4中的克隆号的重链可变区种系；纵坐标是具有源自Zalutumumab的共同轻链的各抗体在真核细胞中的表达量。

图11K显示了源自Fremanezuma的轻链与具有表4中的克隆号的重链可变区亚型的重链组合后的抗体在真核细胞中的表达量，其中横坐标是表4中的克隆号的重链可变区种系；纵坐标是具有源自Fremanezuma的共同轻链的各抗体在真核细胞中的表达量。

图12显示了根据图11A－图11K的结果挑选具有部分表4中的克隆号的重链可变区的重链与共同轻链组合后的抗体在真核细胞中的表达量，其中横坐标是共同轻链所来源的抗体名称；纵坐标是具有共同轻链的各抗体在真核细胞中的表达量。

图13A是饼状图，显示了源自HNF-018的共同轻链与实施例3.1中获得的重组HCDR3重链文库组合后获得的噬菌体Fab展示文库(CLC-09)中的重链种系分布。

图13B是柱状图，显示了源自HNF-018的共同轻链与实施例3.1中获得的重组HCDR3重链文库组合后获得的噬菌体Fab展示文库(CLC-09)中的重链种系分布。

图13C是饼状图，显示了源自Eculizumab的共同轻链与实施例3.1中获得的重组HCDR3重链文库组合后获得的噬菌体Fab展示文库(CLC-24)中的重链种系分布。

图13D是柱状图，显示了源自Eculizumab的共同轻链与实施例3.1中获得的重组HCDR3重链文库组合后获得的噬菌体Fab展示文库(CLC-24)中的重链种系分布。

图14A-图14C显示源自HNF-018的共同轻链与实施例3.1中获得的重组HCDR3重链文库组合后获得的噬菌体Fab展示文库(CLC-09)中的重链CDR区氨基酸长度分布，其中横坐标是氨基酸长度；纵坐标是所述氨基酸长度的CDR在总的CDR中的占比，其中14A-14C分别对应HCDR1、HCDR2和HCDR3。

图14D-图14F显示了源自Eculizumab的共同轻链与实施例3.1中获得的重组HCDR3重链文库组合后获得的噬菌体Fab展示文库(CLC-24)中的重链CDR区氨基酸长度分布，其中横坐标是氨基酸长度，纵坐标是所述氨基酸长度的CDR在总的CDR中的占比，14D-14F分别对应HCDR1、HCDR2和HCDR3

图15A显示了两个共同轻链抗体库中抗体的原核表达效率；图15B显示了两个共同轻链抗体库中抗体的噬菌体展示效率。

图16显示了来源于重组噬菌体展示文库(hRAL)和共同共轻链噬菌体展示文库(CLC)的抗TROP2抗体分子的等电点分布。

图17显示了基于ELISA检测的来源于hRAL库和CLC库的抗TROP2抗体分子与抗原蛋白结合的EC₅₀分布。

图18显示了70个共同轻链抗体和65个上市或者在研单抗的表达量。

图19显示了30个共同轻链抗体和24个上市或在研单克隆抗体Tm1。

发明详述

在详细描述本发明之前，应了解，本发明不受限于本说明书中的特定方法及实验条件，因为所述方法以及条件是可以改变的。另外，本文所用术语仅是供说明特定实施方案之用，而不意欲为限制性的。

I.定义

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。为了本发明的目的，下文定义了以下术语。

术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小10％的下限和比指定数字数值大10％的上限的范围内的数字数值。

术语“和/或”当用于连接两个或多个可选项时，应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或更多项。

如本文中所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。

术语“抗体文库”或“抗体库”在本文中可互换使用，指多种抗体的集合。

术语“抗体展示文库”是指在细胞表面或无细胞表面表达众多种抗体的平台。所述表达抗体的平台适用于针对靶抗原来筛选抗体。抗体展示文库包括但不限于噬菌体展示文库和酵母展示文库。

术语“合成的抗体文库”、“合成的抗体库”或“合成文库”在本文中可互换使用，指编码合成设计的VH和/或VL的抗体序列的集合。

术语“可变区结构域”、“可变区”、“可变结构域”、“VH/VL对”、“VH/VL”、“Fab部分”、“Fab臂”、“Fab”或“臂”在本文中可互换使用。

当谈及双特异性抗体时，两条臂包含“共同轻链”指的是抗体的两条臂中的轻链相同或虽然具有一些氨基酸序列差异但仍保留了抗体结合特异性的轻链。例如，本领域技术人员可以在本文所述的共同轻链的定义范围之内，例如，通过引入保守氨基酸改变来制备或发现序列不相同的但功能上仍然等同的轻链，所述保守氨基酸改变是指当与重链配对时，对抗原和抗体的结合特异性没有影响或仅有部分影响的区域内氨基酸的变化等。

术语“抗体”在本文中以最广意义使用并且包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。抗体可以是任何型和亚型(例如，IgM、IgD、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA1和IgA2)的完整抗体(例如，具有两个全长的轻链和两个全长的重链)。完整抗体的单体是由二硫键连接两个全长的轻链和两个全长的重链形成的一个四肽链分子，也称为Ig分子的单体。抗体单体是构成抗体的基本结构。

“表位”或“抗原决定子”指与抗体分子的可变区中称为互补位的特异性抗原结合部位相互作用的抗原决定簇。单个抗原可以具有一个以上表位。因此，不同抗体可以结合抗原上的不同区域，并可以具有不同的生物学效应。表位可以由连续氨基酸或经蛋白质的三级折叠并接的不连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位在暴露于变性溶剂时通常保留，而通过三级折叠形成的表位在用变性溶剂处理时通常消失。表位通常在独特空间构象中包括至少3个，并且更通常至少5个、约9个或约8-10个氨基酸。

术语“抗原结合片段”是比完整或完全抗体的氨基酸残基数要少的完整或完全抗体的一部分或一段，其能结合抗原或与完整抗体(即与抗原结合片段所来源的完整抗体)竞争结合抗原。可以通过重组DNA技术、或通过酶或化学切割完整的抗体制备抗原结合片段。抗原结合片段包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv、单链Fv(scFv)、单链Fab、双体抗体(diabody)、单结构域抗体(sdAb，纳米抗体)、骆驼Ig、Ig NAR、F(ab)'₃片段、双-scFv、(scFv)₂、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)。所述术语还包括经遗传工程改造的形式，例如嵌合抗体(例如人类化鼠抗体)、杂结合抗体(例如双特异性抗体)和其抗原结合片段。更详细的描述也请参见：皮尔斯目录与手册(Pierce Catalog and Handbook),1994-1995(皮尔斯化学公司(PierceChemical Co.),罗克福德(Rockford),伊利诺伊州(IL))；Kuby,免疫学杂志,第3版,W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman&Co.),纽约,1997。

“抗原结合位点”指抗体中提供与抗原相互作用的位点，即一个或多个氨基酸残基。例如，抗体的抗原结合位点包含来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基。一个天然免疫球蛋白分子一般具有两个抗原结合位点，一个Fab分子一般具有单个抗原结合位点。

术语“全抗体”、“全长抗体”、“完全抗体”和“完整抗体”在本文中可互换地用来指包含由二硫键相互连接的至少两条重链(HC)和两条轻链(LC)的糖蛋白。每条重链由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。哺乳动物重链分类为α、δ、ε、γ和μ。哺乳动物轻链分类为λ或κ。包含α、δ、ε、γ和μ重链的免疫球蛋白分类为免疫球蛋白(Ig)A、IgD、IgE、IgG和IgM。完全抗体形成“Y”形状。Y的茎由两条重链的第二和第三恒定区(并且对于IgE和IgM，第四恒定区)结合在一起组成，并且二硫键(链间)在铰链中形成。重链γ、α和δ具有由三个串联(成一行)Ig结构域构成的恒定区，和用于增加柔性的铰链区；重链μ和ε具有由四个免疫球蛋白结构域构成的恒定区。第二和第三恒定区分别称为“CH2结构域”和“CH3结构域”。Y的每个臂包括结合到单个轻链的可变和恒定区的单个重链的可变区和第一恒定区。轻链和重链的可变区负责抗原结合。

轻链可变区和重链可变区分别包含间插有三个高变区(也称为“互补决定区”或“CDR”)的“构架”区。“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”或“高变区”(在本文中与超变区“HVR”可以互换使用)，是抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。重链和轻链的CDR通常被称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始顺序编号。位于抗体重链可变结构域内的CDR被称作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位于抗体轻链可变结构域内的CDR被称作LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一个给定的轻链可变区或重链可变区氨基酸序列中，各CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知的抗体CDR指派系统的任一种或其组合确定，所述指派系统包括例如：基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature342:877-883，Al-Lazikani等人,“Standard conformations for the canonicalstructures of immunoglobulins”,Journal of Molecular Biology,273,927-948(1997))，基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第4版,U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987))，AbM(University of Bath)，Contact(University College London)，国际ImMunoGeneTics database(IMGT)(万维网imgt.cines.fr/)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinity propagationclustering)的North CDR定义。

然而，应该注意，基于不同的指派系统获得的同一抗体的可变区的CDR的边界可能有所差异。即不同指派系统下定义的同一抗体可变区的CDR序列有所不同。例如，对使用Kabat和Chothia编号的CDR区域在不同指派系统定义下的残基范围如下表A所示。

表A.不同指派系统定义下的CDR残基范围

环	Kabat	AbM	Chothia	Contact	IMGT
						L1	L24–L34	L24–L34	L24–L34	L30–L36	L27–L32
L2	L50–L56	L50–L56	L50–L56	L46–L55	L50–L52
						L3	L89–L97	L89–L97	L89–L97	L89–L96	L89–L96
H1	H31–H35b	H26–H35b	H26–H32…34	H30–H35b	H26–H35b
						H1	H31–H35	H26–H35	H26–H32	H30–H35	H26–H35
H2	H50–H65	H50–H58	H52–H56	H47–H58	H51–H57
						H3	H95–H102	H95–H102	H95–H102	H93–H101	H93–H102

因此，在涉及用本发明定义的具体CDR序列限定抗体时，所述抗体的范围还涵盖了这样的抗体，其可变区序列包含所述的具体CDR序列，但是由于应用了不同的方案(例如不同的指派系统规则或组合)而导致其所声称的CDR边界与本发明所定义的具体CDR边界不同。

本发明抗体的CDR可以根据本领域的任何方案或其组合人工地评估确定边界。除非另有说明，否则在本发明中，术语“CDR”或“CDR序列”涵盖以上述任一种方式确定的CDR序列。

不同轻链或重链的构架区的序列在物种(例如人类)内具有相对保存性。抗体的构架区(其是成分轻链和重链的组合构架区)用以在三维空间中定位和比对CDR。CDR主要负责结合到抗原的表位。具有不同特异性(即针对不同抗原有不同组合位点)的抗体具有不同CDR。尽管抗体与抗体之间的CDR不同，但CDR内仅有限数目的氨基酸位置直接参与抗原结合。CDR内的这些位置称为特异性决定残基(SDR)。

“单克隆抗体”是由B淋巴细胞的单个克隆或由其中已经转染单个抗体的轻链和重链基因的细胞产生的抗体。单克隆抗体通过本领域的技术人员已知的方法产生，例如通过由骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合体制备杂交抗体形成细胞。单克隆抗体包括人类化单克隆抗体。

“Fv”是含有完全抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施例中，双链Fv种类由一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域呈紧密非共价缔合的二聚体组成。在单链Fv(scFv)种类中，一个重链可变结构域与一个轻链可变结构域可以通过柔性肽连接子共价连接，使得轻链和重链可以按类似于双链Fv种类的“二聚”结构缔合。在这一配置中，每个可变结构域的三个高变区(HVR)相互作用以定义VH-VL二聚体的表面上的抗原结合位点。六个HVR共同地赋予对抗体的抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或包含仅三个对抗原具有特异性的HVR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，但亲和力低于完整结合位点。

Fab片段含有重链可变结构域和轻链可变结构域并且还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab′片段与Fab片段不同之处在于，重链CH1结构域的羧基末端增添了几个残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。Fab′-SH是本文关于Fab′的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基携有游离硫醇基。F(ab′)2抗体片段最初是作为其间具有铰链半胱氨酸的Fab′片段对产生。还已知抗体片段的其它化学偶合。

术语“Fc结构域”或“Fc区”在本文中用来定义免疫球蛋白重链的含有至少一部分恒定区的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。虽然IgG重链的Fc区的界限可能略微变动，但是通常将人IgG重链Fc区限定为从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非本文中另外说明，否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号根据如Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,1991中所述的EU编号体系，也称作EU index。如本文所用，Fc结构域的一个“亚基”指形成二聚体Fc结构域的两个多肽之一，即包含免疫球蛋白重链C末端恒定区的能够稳定自我缔合的多肽。例如，IgG Fc结构域的亚基包含IgG CH2和IgG CH3恒定结构域。

当谈及抗原和抗体时使用的术语“特异性结合”或“结合”意指抗体与生理条件下相对稳定的抗原形成复合物。用于确定抗体是否与抗原特异性结合的方法是本领域熟知的并且例如包括表面等离振子共振测定法、MSD测定法(Estep,P.等人,High throughputsolution-based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning,MAbs,2013.5(2):p.270-278)、ForteBio亲和力测定法(Estep,P等人，High throughputsolution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitopebinning.MAbs,2013.5(2):p.270-8)等。

“亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间1∶1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用结合解离平衡常数(K_D)来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括现有技术已知以及本文中所描述的那些。

如本文所用，术语“变体”是指已经修饰至少一个，例如1、2或3个氨基酸取代、缺失或添加的重链可变区或轻链可变区，其中包含重链或轻链变体的经修饰的抗原结合蛋白基本上保留修饰前抗原结合蛋白的生物学特征。在一个实施方案中，含有变体重链可变区或轻链可变区序列的抗原结合蛋白保留修饰前抗原结合蛋白的60％、70％、80％、90％、100％生物学特征。应当理解，可以单独或在与另一个重链可变区或轻链可变区组合修饰每个重链可变区或轻链可变区。本公开的抗原结合蛋白包含与本文描述的重链可变区氨基酸序列90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同源的重链可变区氨基酸序列。本公开的抗原结合蛋白包括与本文描述的轻链可变区氨基酸序列90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同源的轻链可变区氨基酸序列。同源性百分比可以在整个重链可变区和/或整个轻链可变区上，或者百分比同源性可以限于构架区，而对应于CDR的序列与重链可变区和/或轻链可变区内本文中公开的CDR具有100％同一性。如本文所用，术语“CDR变体”是指已经修饰至少一个，例如1、2或3个氨基酸取代、缺失或添加的CDR，其中包含CDR变体的经修饰的抗原结合蛋白基本上保留修饰前抗原结合蛋白的生物学特征。在一个实施方案中，含有变体CDR的抗原结合蛋白保留修饰前抗原结合蛋白的60％、70％、80％、90％、100％生物学特征。应当理解，可以修饰的每个CDR可以单独或与另一个CDR组合修饰。在一个实施方案中，修饰是取代，特别是保守取代。

如本领域已知，在本文中可交换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸链，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基、和/或它们的类似物、或者能够通过DNA或RNA聚合酶掺入链的任何底物。

如下进行序列之间序列同一性的计算。

为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分数，将所述序列出于最佳比较目的比对(例如，可以为了最佳比对而在第一和第二氨基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以为比较目的而抛弃非同源序列)。在一个优选实施方案中，为比较目的，所比对的参考序列的长度是至少30％、优选地至少40％、更优选地至少50％、60％和甚至更优选地至少70％、80％、90％、100％的参考序列长度。随后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由第二序列中对应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在这个位置处是相同的。

可以利用数学算法实现两个序列间的序列比较和同一性百分数的计算。在一个优选实施方案中，使用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444-453)算法(在http://www.gcg.com可获得)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。在又一个优选的实施方案中，使用GCG软件包中的GAP程序(在http://www.gcg.com可获得)，使用NWSgapdna.CMP矩阵和空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。特别优选的参数集合(和除非另外说明否则应当使用的一个参数集合)是采用空位罚分12、空位延伸罚分4和移码空位罚分5的Blossum 62评分矩阵。

还可以使用PAM120加权余数表、空位长度罚分12，空位罚分4，利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法，((1989)CABIOS,4:11-17)确定两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的同一性百分数。

额外地或备选地，可以进一步使用本文所述的核酸序列和蛋白质序列作为“查询序列”以针对公共数据库执行检索，以例如鉴定其他家族成员序列或相关序列。

如本文所用，当每种类型存在多于一个部分时，例如对于抗原结合部分等而言，使用术语“第一和第二”便利区分。除非上下文明确定义，否则使用这些术语不意在赋予双特异性抗体的特定顺序或取向。

如本文所用，“载体(vector)”表示构建体，其能够将一种或多种所关注的基因或序列递送入宿主细胞并且优选在宿主细胞中表达所述基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒、噬菌体载体(用于噬菌体展示系统)、酵母载体(用于酵母展示系统)、与阳离子凝聚剂相关的DNA或RNA表达载体、包囊化于脂质体中的DNA或RNA表达载体以及某些真核细胞，例如生产细胞。

术语“噬菌体载体(phagemid)”是一种DNA表达系统，其可以作为质粒复制，也可以作为单链DNA包装在噬菌体(phage)病毒颗粒中。噬菌体载体(phagemid)用于容纳抗体基因的全部库。噬菌体载体(phagemid)需要辅助噬菌体提供额外的蛋白质，从而在感染细菌后产生展示噬菌体载体(phagemid)编码的重组蛋白质的噬菌体病毒颗粒。

术语“噬菌体(phage)”是指感染细菌并扩增的病毒颗粒。

术语“辅助噬菌体”是指提供产生功能性噬菌体病毒颗粒所需的所有蛋白质/物质的特定噬菌体颗粒。

术语“淘选(panning)”是指选择针对特定靶/抗原选择结合物的亲和力选择技术。

在本发明中术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已经引入外源性核酸的细胞，包括这些细胞的子代。宿主细胞包括“转化子”和“转化的细胞”，其包括原代转化细胞以及由此来源的子代，而不考虑传代次数。子代在核酸含量上与亲代细胞可能不完全相同，但可能含有突变。本文包括与在初始转化的细胞中筛选或选择的细胞具有相同功能或生物学活性的突变子代。

II.多特异性抗体中共同轻链的设计

多特异性抗体(例如，双特异性抗体)的产生受到重链和轻链错配导致未配对和错配副产物形成的不可忽略的数目和量。

为了减少轻链错配，本发明设计了可以在多特异性抗体(例如，双特异性抗体)中使用的共同轻链，由此，对于多个由一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域形成的抗原结合位点，它们使用相同的抗体轻链可变结构域。

在本发明中，对本司已构建的人抗体基因文库(也称重组噬菌体展示文库)中的抗体及161个已经上市或已完成三期临床的抗体药物的轻链种系进行了大数据分析，挑选出成药性较好的κ轻链。

参考CN112250763B专利中的实施例2.1的方法构建人抗体基因文库，将构建号的文库菌液涂布板并培养，挑取若干单克隆进行测序。

将单克隆测序的轻链汇总，获得1590条轻链序列，去除重复的83条序列，按种系(Germline)分组后，挑选自然界占比较高的6个种系(IGKV1-33、IGKV1-5、IGKV1-39、IGKV3-11、IGKV3-20和IGKV3-15)分别分析氨基酸长度，获知氨基酸序列长度为107的轻链在种系为IGKV1-33、IGKV1-5、IGKV1-39、IGKV3-11的轻链中占比最高，氨基酸序列长度为108的轻链在种系为IGKV3-20、IGKV3-15的轻链中占比最高(Thomas Tiller等人，“A fullysynthetic human Fab antibody library based on fixed VH/VL framework pairingswith favorable biophysical properties”,mAbs,2013,5(3):1-26)。

将IGKV1-33、IGKV1-5、IGKV1-39、IGKV3-11轻链中氨基酸个数为107的轻链和IGKV3-20、IGKV3-15轻链中氨基酸个数为108的轻链分别单独进行比对分析，不考虑CDR3序列比对序列的保守性，每个种系选择保守的2-3条序列，总共选择12条轻链序列。

然后，将12条轻链序列与161条已上市或者在研抗体序列的轻链序列进行比对，去除重复序列后，比对LCDR3，按序列多样性挑选，最终选择25条不同种系的轻链序列。

对选择的25条不同种系的轻链序列进行检索，排除已用作共同轻链的序列以及与现有共同轻链具有较高同源性的序列，最终获得19条不同种系的序列。

所获得的19条不同种系的轻链序列的CDR区如表1所示。

表1不同种系的轻链序列的CDR区

III.具有重链多样性的包含共同轻链的抗体库的产生

本发明制备了两种合成的抗体库。本发明的抗体库具有至少1×10⁸－1×10¹²种抗体.

在一些实施方案中，本发明的抗体库包含多样化的重链可变区(VH)和共同轻链可变区(VL)，所述重链的可变区是由人免疫球蛋白基因座中的天然重链种系基因(例如，IGHV1、IGHV3和/或IGHV4重链种系基因)编码的，所述共同轻链可变区(VL)来源于选自表1中的抗体的轻链可变区(VL)。由此，所述抗体库能够反映人抗体重链的天然多样性，抗体库中的抗体包含天然的抗体重链可变区(VH)和共同轻链可变区(VL)。所述抗体库包含至少1×10⁸－1×10¹⁰种抗体，优选地，所述抗体库中包含的抗体至少90％是功能性的，优选地，以100nM或更小的Kd与靶抗原结合。

构建所述抗体库的示例性步骤可以包括：

(a)构建人天然抗体的基因文库；

(c)获得编码表1所述任一抗体的轻链的核苷酸序列，

(d)将步骤(b)获得的重链核苷酸序列和步骤(c)获得的轻链的核苷酸序列连接入表达载体(例如，噬菌体载体、酵母载体、哺乳动物细胞载体)中并表达；

在一些实施方案中，本发明的抗体库包含多样化的重链可变区(VH)和共同轻链可变区(VL)，所述重链的可变区是经工程化重组后的核苷酸序列编码的，所述共同轻链可变区(VL)来源于选自表1中的抗体的轻链可变区(VL)。例如，所述重链的可变区是经任一天然HCDR3与任一天然HCDR1和HCDR2重组后的核苷酸序列编码的，由此，所述任一天然HCDR3与任一天然HCDR1和HCDR2的组合远多于天然抗体中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的组合，从而提高了抗体库中的重链多样性和库容。所述抗体库包含至少1×10¹⁰－1×10¹²种抗体，优选地，所述抗体库中包含的抗体至少90％是功能性的，优选地，以100nM或更小的Kd与靶抗原结合。

构建所述抗体库的示例性步骤可以包括：

(a)构建人天然抗体的基因文库；

(d)扩增步骤(c)的人工重链核苷酸序列，并回收；

(e)获得编码表1所述任一抗体的共同轻链的核苷酸序列，

例如，在原核细胞(如，大肠杆菌)或在真核细胞(如，酵母)中表达。

IV.抗体库的筛选

本发明的任何抗体库可用于筛选对目的抗原具有结合特异性的抗体。由本发明抗体库中的核酸编码的抗体可使用合适的表达/展示系统来表达和展示，所述表达/展示系统例如，无细胞展示系统(例如，核糖体展示系统)、噬菌体展示系统、基于原核细胞的展示系统(例如，细菌展示系统)、或基于真核细胞的展示系统(例如，酵母展示系统或哺乳动物细胞展示系统)。

在一些实施方案中，抗体文库在酵母细胞上表达和展示。

在另一些实施方案中，抗体文库在噬菌体颗粒上表达和展示(噬菌体展示)。

在其它实施方案中，使用两个或更多个展示系统，例如，噬菌体展示和随后的酵母展示。

本发明的抗体文库可以以任何抗体形式在合适的展示系统中表达/展示，所述抗体形式例如，完整抗体(全长抗体)、其抗原结合片段(例如Fab)或单链抗体(scFv)。

噬菌体展示是使用噬菌体(例如，噬菌体f1、fd和M13)进行蛋白质展示。在该展示系统中，至少一条抗体链(例如，重链和/或轻链)通常与噬菌体外壳蛋白(例如，基因III蛋白、基因VIII蛋白或主要外壳蛋白)共价连接。噬菌体展示在例如美国专利号5223409中描述。

在其它实施方案中，使用真核表达/展示系统(例如，酵母细胞或哺乳动物细胞表达/展示系统)表达/展示本发明的抗体文库。酵母展示系统是将蛋白质组分(例如，抗体)直接或间接连接到酵母细胞壁蛋白(例如，Aga1p或Aga2p)。在一些情况下，抗体的一条链可以共价融合到酵母细胞壁蛋白上以直接展示。在其它情况下，抗体和酵母细胞壁组分之间由中间试剂介导连接。酵母展示描述于例如Boder等人,Arch Biochem Biophys526(2):99-106,2012。

为了筛选本发明的抗体文库以分离能够与靶抗原结合的抗体，抗体文库可以在允许抗体-抗原结合的合适条件下与靶抗原接触。

与靶抗原结合的展示有抗体的噬菌体颗粒或宿主细胞可以例如通过使用其上固定有靶抗原的支持体来分离。根据需要，可以扩增并确定编码展示的抗体的核酸。可重复该筛选过程多次，并且也可以组合使用展示系统。

可以通过任何合适的方法进行来自本文所述文库的抗体的筛选。例如，可以通过标准的免疫测定法和/或亲和层析法来评价结合活性。可以使用例如BIACORE^TM仪器在体外分析候选抗体结合治疗靶的能力，所述BIACORE^TM仪器基于表面等离子体共振法测量抗体与特定靶抗原的结合速率。可使用多种动物模型中的任何一种来进行抗体的体内分析，然后根据需要在人体内进行测试。

V.具有共同轻链的双特异性抗体

通过筛选本发明的抗体库，可以制备出具有共同轻链的双特异性抗体。

在一些实施方案中，所述双特异性抗体包含第一抗原结合部分和第二抗原结合部分，其中所述第一抗原结合部分和第二抗原结合部分包含共同轻链，且所述共同轻链是由IGKV3或IGKV1轻链种系基因编码的；优选地，是由IGKV3-20、IGKV3-11、IGKV1-39、IGKV1-5或IGKV1-33轻链种系基因编码的；更优选地是由IGKV3-20或IGKV1-39轻链种系基因编码的；例如，所述双特异性抗体中的共同轻链来源于选自表1中的抗体的轻链。

在一些实施方案中，所述双特异性抗体还包含由第一和第二亚基组成的Fc结构域，且所述第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合Fc结构域的第一亚基的N末端，所述第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合Fc结构域的第二亚基的N末端，例如，所述Fc结构域是免疫球蛋白分子的Fc结构域，特别是IgG类免疫球蛋白的Fc结构域，优选地是IgG₁或IgG₄Fc结构域，更优选地是人IgG₁或IgG₄ Fc结构域。

在一些优选的实施方案中，所述双特异性抗体在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替代，从而在第一亚基的CH3结构域内产生突起，其可定位在第二亚基的CH3结构域内的空腔中，并且Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替代，从而在第二亚基的CH3结构域内产生空腔，第一亚基的CH3结构域内的突起可定位于第二亚基的CH3结构域内的空腔中，由此所述双特异性抗体的重链彼此形成“结入扣(knob in hole)”的稳定缔合。

描述以下实施例以辅助对本发明的理解。不意在且不应当以任何方式将实施例解释成对本发明的保护范围的限制。

实施例

通过参考以下实施例将更容易地理解本文一般地描述的本发明，这些实施例是以举例说明的方式提供的，并且不旨在限制本发明的范围。这些实施例并不旨在表示下面的实验是全部或仅进行的实验。

实施例1：1590条轻链序列分析筛选

本实施例阐述了挑选用于构建万亿级共同轻链噬菌体展示文库的具体流程。

首先构建人抗体基因文库(也称重组噬菌体展示文库)，具体构建方法参考CN112250763B专利中的实施例2.1，将构建好的文库菌液涂布板并培养，挑取若干单克隆进行测序。

将上述库单克隆测序的轻链汇总，获得1590条轻链序列，去除重复的83条序列，按种系分组后，挑选自然界占比较高的6个种系(IGKV1-33、IGKV1-5、IGKV1-39、IGKV3-11、IGKV3-20和IGKV3-15)分别分析氨基酸长度，结果如图1A－图1F所示，氨基酸序列长度为107的轻链在种系为IGKV1-33、IGKV1-5、IGKV1-39、IGKV3-11的轻链中占比最高，氨基酸序列长度为108的轻链在种系为IGKV3-20、IGKV3-15的轻链中占比最高。因此，将IGKV1-33、IGKV1-5、IGKV1-39、IGKV3-11轻链中氨基酸个数为107的轻链和IGKV3-20、IGKV3-15轻链中氨基酸个数为108的轻链分别单独进行比对分析，不考虑CDR3序列比对序列的保守性，每个种系选择保守的2-3条序列，总共选择12条轻链序列。

然后将12条轻链序列与161条已上市或者在研抗体序列的轻链序列进行比对，去除重复序列后，比对LCDR3，按序列多样性挑选，最终选择25条不同种系的轻链序列。对选择的25条不同种系的轻链序列进行检索，排除已用作共同轻链的序列以及与现有共同轻链具有较高同源度的序列，最终获得19条不同种系的序列。

所获得的19条不同种系的轻链序列的CDR区如表1所示。

实施例2：共同轻链文库试建库验证

本实施例是基于实施例1中挑选到的19条轻链序列，与不同种系的重链序列组合构建库容在1×10⁸cfu左右的噬菌体展示Fab文库，并对所构建的噬菌体展示Fab文库进行原核表达检测、噬菌体展示情况分析、真核表达检测及初步成药性分析。

2.1共同轻链噬菌体展示文库的构建

将实施例1中挑选的19条轻链核苷酸序列，通过苏州金唯智生物科技有限公司进行基因合成，再用HindⅢ限制性酶(Thermo fisher，FD0505)和sgsI限制性酶(Thermofisher，FD1894)进行双酶切、连接到噬菌体展示载体中，将构建好的含有轻链目的基因的载体分别转化到感受态大肠杆菌SS320(Lucigen，MC1061 F)中，涂板后挑取单克隆测序，将测序正确的克隆接种到氨苄培养基中，37℃过夜培养，然后利用无内毒素质粒提取试剂盒(OMEGA，D6950-01)进行质粒提取。

同时，根据CN112250763B实施例2.1中所述的方法构建人抗体的基因文库，并且以此人抗体的基因文库中的质粒为模板，以Middle-F：TAAGGCGCGCCTAACCATCTATTTC(SEQ IDNO：77)为上游引物和HC-CDR3-R：

GAGGTGCTCTTGGAGGAGGGTGCCAGCGGGAAGACCGATGGGCCCTTGGTGCTAGC TGCTGAGACGGTGACCATTGTCCCTTGGCCCCAG(SEQ ID NO：78)为下游引物，扩增所构建的人抗体基因文库中的重链基因序列，并通过Eco91Ⅰ限制性酶(Thermo fisher、FD0394)和SfiⅠ限制性酶(Thermo fisher、FD1824)双酶切扩增到的重链基因序列，并回收。

通过Eco91Ⅰ限制性酶和SfiⅠ限制性酶双酶切上述提取的带有轻链序列的噬菌体展示质粒，并回收。

将回收的重链基因序列与回收的带有轻链序列的噬菌体展示质粒通过Eco91Ⅰ限制性酶和SfiⅠ限制性酶双酶切，产物连接，连接产物通过回收试剂盒(Omega，目录号：

D6492-02)回收。

最后，通过电转仪(Bio-Rad，MicroPulser)将具有人抗体重链基因且分别具有19条轻链基因之一的噬菌体展示质粒转化至感受态大肠杆菌SS320(Lucigen，MC1061 F)中，并将经转化的大肠杆菌SS320菌液涂布于具有氨苄青霉素抗性的2-YT固体平板(固体平板由1.5％的胰蛋白胨，1％的酵母提取物，0.5％的NaCl，1.5％的琼脂，按质量体积g/mL配制而成)，过夜培养后，在表面长满库菌的2-YT固体平板上加入2YT培养基并用涂布棒刮取具有氨苄青霉素抗性的2-YT固体平板上生长出的库菌，而后加入适量体积的80％灭菌甘油(终浓度10-20％)，构建了19个具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库。

通过梯度稀释铺板，测定获得的19个具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库的库容(库容计算方法参考CN112250763B中的实施例2.2)。同时每个文库挑取26至32个单克隆进行测序分析。

19个具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库的库容、独特(Unique)率及有效抗体率如表2所示，除了编号为CLC-2的噬菌体Fab展示文库之外，其他18个具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库的库容均在10⁸以上。

表2具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库的特征

2.2共同轻链噬菌体展示文库的Fab原核表达检测

在本实施例中，基于ELISA方法对实施例2.1中构建的19个具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库的原核表达及噬菌体展示进行检测。

将实施例2.1中的19个具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库的菌液稀释后涂布板，以获得单克隆细菌，每个噬菌体Fab展示文库挑取42个细菌克隆或32个细菌克隆，接种到氨苄青霉素抗性的2-YT培养基中，过夜培养(16h左右)；在96孔ELISA板上包被Anti-Fd(1μg/mL、30μL/孔，Bio-Rad，货号：STAR161)，4℃过夜。次日，将过夜培养的单克隆菌液以5000rpm进行离心，离心10min后取上清；同时，将96孔ELISA板用PBST洗3次后用5％脱脂牛奶封闭2h，用PBST洗板3次后，加入3倍梯度稀释的菌液上清或标准品IgG全长抗体蛋白(伊匹木单抗，其缩写为IPI，三优生物医药(上海)有限公司制备)(首孔2μg/mL)并孵育1h。之后用PBST清洗3次后加入第二抗体Anti-human Fab-HRP(Sigma，A0293)并孵育1h。孵育完成后，PBST洗板6次，加TMB(SurModics，TMBS-1000-01)显色。根据显色结果，加入2M HCl终止反应，通过酶标仪(Molecular Devices，SpecterMax190)在OD450处读板。

用Softmax pro 7.1软件拟合标准曲线并计算待测单克隆菌液浓度，统计后使用Graphpad prism7软件作图。

结果如图2所示，在19个具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库中，12个具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库(其中，轻链分别对应于Zalutumumab、Robatumumab、Eculizumab、VK1-203、Sacituzumab、Bococizumab、Fremanezumab、Olokizumab、Matuzumab、Fasinumab、VK1-278、HNF-018中的轻链)原核表达量相对较高，而其他7个具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库(其中，轻链分别对应于Glembatumumab、Ligelizumab、HNE-083、Sirukumab、Tanezumab、HNE-008、VK3-181中的轻链)原核表达量相对较低。

另外，对19个具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库，按各共同轻链所属的轻链种系分别进行原核表达量分析，结果分别如图3A－图3B、图4A－图4B、图5A－图5B、图6A－图6B、图7A－图7B、图8A－图8B所示。

结果表明，轻链种系为IGKV3-20的3个具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库(其中，轻链分别对应于VK3-181、HNF-018和Robatumumab中的轻链)除VK3-181的轻链对应的文库之外，HNF-018和Robatumumab的轻链所对应文库的原核表达量都相对较高；轻链种系为IGKV3-11的2个具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库(其中，轻链分别对应于Fremanezumab和Sirukumab中的轻链)中，Fremanezumab的轻链所对应文库的原核表达量相对较高，Sirukumab的轻链所对应文库的表达量相对较低；轻链种系为IGKV1-39的4个具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库(其中，轻链分别对应于Eculizumab、Sacituzumab、Bococizumab和HNE-083中的轻链)中，Eculizumab的轻链所对应文库的表达量最高，Sacituzumab和Bococizumab的轻链所对应文库的表达量相对较高，HNE-083的轻链所对应文库的表达量较低；轻链种系为IGKV1-5的具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库中，HNE-008的轻链所对应文库的原核表达量较低；轻链种系为IGKV1-33的4个具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库(其中，轻链分别对应于VK1-203、VK1-278、Matuzumab和Tanezumab中的轻链)中，Fab原核表达量较高的是VK1-203、VK1-278和Matuzumab的轻链所对应的文库，而Tanezumab的轻链所对应的文库表达量相对较低；其他轻链种系的5个具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库中，Zalutumumab的轻链所对应文库的表达量相对较高，Olokizumab和Fasinumab的轻链所对应文库的表达量次之，Glembatumumab、Ligelizumab的轻链所对应文库的表达量相对较低。

进一步地，挑选各个轻链种系表达量较高的Robatumumab(IGKV3-20)、Fremanezumab(IGKV3-11)、Eculizumab(IGKV1-39)、VK1-203(IGKV1-33)和Zalutumumab(IGKV1-13)的轻链所对应的文库，对每个文库各挑取48个克隆再次进行表达量检测，结果如图9A-图9B所示，Robatumumab(IGKV3-20)、Fremanezumab(IGKV3-11)、Eculizumab(IGKV1-39)、VK1-203(IGKV1-33)和Zalutumumab(IGKV1-13)的轻链所对应的文库整体表达量均较高，与图3-图8的结果基本一致。

2.3具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库的噬菌体展示情况分析

将实施例2.1中的19个具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库的菌液稀释后涂布板，以获得单克隆细菌，挑取若干个克隆接种到羧苄青霉素和四环素抗性的2-YT培养基中，37℃，220rpm培养1.5-2h至OD600达到0.5-0.6后，1:1000加入VSCM13辅助噬菌体(购自Stratagene)(滴度：5e+12)，37℃恒温培养箱静置培养半个小时，再转移到摇床37℃，220rpm培养1h后，5000rpm离心去除上清，加入新的羧苄青霉素和卡那霉素抗性的2-YT培养基，过夜培养(16h左右)；在96孔ELISA板上包被Anti-Fd(1μg/mL、30μL/孔，Bio-Rad，货号：STAR161)，4℃过夜。次日，将过夜培养的噬菌体菌液5000rpm离心10min后取上清；同时，将孔板用PBST洗3次后用5％脱脂牛奶封闭2h，用PBST洗板3次后，加入噬菌体菌液上清，并孵育1h。之后用PBST清洗3次后加入第二抗体Anti-M13-HRP(Sino biological，11973-MM05T-H)并孵育1h。孵育完成后，PBST洗板6次，加TMB(SurModics，TMBS-1000-01)显色。根据显色结果，加入2M HCl终止反应，通过酶标仪(Molecular Devices，SpecterMax 190)在OD450处读板。EXCEL统计后作图。

结果如表3所示，以阴性读值的2.1倍为阈值，除了VK3-181、Ligelizumab和Sacituzumab的轻链所对应的文库外，其他16个具有共同轻链的噬菌体文库的噬菌体Fab展示百分比均在80％以上。

表3具有共同轻链的噬菌体文库的噬菌体Fab展示百分比

2.4 11个具有共同轻链的抗体库的真核表达及成药性分析

2.4.1真核表达用轻链序列和重链序列的挑选

轻链序列的挑选：

根据实施例2.2和2.3的原核表达量及噬菌体展示结果，结合每个轻链种系情况，挑选表达量相对较高的11个轻链(分别为VK1-278、VK1-203、HNF-018、Olokizumab、Robatumumab、Sacituzumab、Zalutumumab、Matuzumab、Fremanezumab、Fasinumab、Eculizumab的轻链)进行真核表达检测。

2.4.2重链序列的挑选：

将实施例2.1中挑选的克隆的测序结果汇总，并对属于重链种系IGHV1、IGHV3和IGHV4的重链序列分别分析其重链CDR3氨基酸的长度。结果表明，IGHV1和IGHV3重链CDR3氨基酸的长度呈正态分布；IGHV4由于序列数量较少，只有42条，正态分布趋势不明显。

根据重链CDR3分析结果，每个亚型(重链种系IGHV1、IGHV3和IGHV4)分别挑选12条CDR3长度各异的重链序列。具体挑选的36个重链序列种系信息如表4所示。

表4重链序列种系信息

2.5共同轻链组合不同亚型重链的全长抗体构建、真核表达及纯化

本实施例将实施例2.4中挑选的36个重链与11个轻链组合进行全长抗体构建、表达及纯化，获得全长抗体蛋白。

首先，将表4所示重链的可变区氨基酸序列与人IgG1的恒定区(SEQ ID NO:75)的编码序列连接构建获得全人源抗体的重链编码序列，将实施例2.3.1中挑选的11个轻链的可变区核苷酸序列(SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ IDNO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ IDNO：74)与人轻链恒定区(CL)的κ型(SEQ ID NO:76)的编码序列连接构建获得全人源抗体的轻链编码序列。将抗体重链和轻链的编码序列分别插入真核表达载体质粒pcDNA3.4-TOPO(Invitrogen)上，转化到大肠杆菌DH5α中，37℃过夜培养。利用无内毒素质粒提取试剂盒(OMEGA，D6950-01)进行质粒提取，得到无内毒素的抗体质粒通过ExpiCHO瞬时转染表达系统(Thermo Fisher，A29133)表达。

ExpiCHO瞬时转染表达的具体方法如下：转染当天，确认细胞密度为7×10⁶至1×10⁷个活细胞/mL左右，细胞存活率>98％，此时用37℃预温的新鲜ExpiCHO表达培养基将细胞调整到终浓度为6×10⁶个细胞/mL。用4℃预冷的OptiPRO^TM SFM稀释目的质粒(向1mL所述培养基中加入1μg质粒)，同时用OptiPRO^TMSFM稀释ExpiFectamine^TMCHO，再将两者等体积混合并轻轻吹打混匀制备成ExpiFectamine^TMCHO/质粒DNA混合液，室温孵育1-5min，缓慢加入到准备好的细胞悬液中并同时轻轻摇晃，最后置于细胞培养摇床中，在37℃、8％CO₂条件下培养。

在转染后18-22h，向培养液中添加ExpiCHO^TMEnhancer和ExpiCHO^TMFeed，摇瓶放置于32℃摇床和5％CO₂条件下继续培养。在转染后的第5天，添加相同体积的ExpiCHO^TMFeed，缓慢加入ExpiCHO^TMFeed的同时轻轻混匀细胞混悬液。在转染7天后，将表达有目的蛋白的细胞培养上清于15000g高速离心10min，所得上清用GATOR(ProbeLife)仪器检测抗体蛋白表达量。

CHO细胞的全长抗体蛋白表达量结果如图10A-10B所示，除了Fasinumab和VK1-203外，其他轻链与不同重链组合后的抗体均有较高的表达量。

分别检测11个轻链(分别为VK1-278、VK1-203、HNF-018、Olokizumab、Robatumumab、Sacituzumab、Zalutumumab、Matuzumab、Fremanezumab、Fasinumab、Eculizumab的轻链)与不同亚型重链组合后的抗体表达量，结果如图11A-图11K所示。结果表明，重链种系IGHV3与11条轻链组合后的抗体表达量较高。

根据以上结果，进一步挑选部分重链和轻链组合后的抗体进行真核表达，再次确认抗体与共同轻链组合后的抗体表达量，结果如图12所示。

由图12可见，真核细胞中，抗体表达量较高的是轻链种系为IGKV1-39的Eculizumab和Sacituzumab以及轻链种系为IGKV3-20的HNF-018。

2.6共同轻链组合不同亚型重链的全长抗体理化性质检测

本实施例中，采用SDS-PAGE和SEC-HPLC检测了抗体的纯度。

2.6.1抗体分子构建、表达和纯化

结合实施例2.5中的CHO表达量结果，依据CDR3氨基酸长度多样性，重链每个亚型(IGHV1、IGHV3和IGHV4)分别随机挑选5条CDR3长度各异的重链序列。具体挑选的重链序列重系信息如表5所示。将挑选出来的15条重链序列组合11条轻链序列，参考实施例2.5的方法对组合出来的165个抗体分子进行表达，所得上清用MabSelect SuRe LX(GE，17547403)进行亲和纯化，然后用100mM乙酸钠(pH3.0)洗脱目的蛋白，接着用1M Tris-HCl中和，最后通过超滤浓缩管(Millipore，UFC901096)将所得蛋白换液至PBS缓冲液中。

纯化结果如下：HNF-018组合的IGHV3-43*02(16-16HC)未纯化出抗体，Sacituzumab组合的IGHV3-33*01,IGHV3-33*06(13-32HC)未纯化出抗体，Matuzumab组合的IGHV3-43*02(16-16HC)和IGHV4-61*02(24-13HC)未纯化出抗体，VK1-278组合的IGHV3-33*01,IGHV3-33*06(13-32HC)未纯化出抗体，Fasinumab组合的IGHV1-3*01(17-19HC)、IGHV1-46*01(10-40HC)、IGHV3-11*04(2-27HC)、IGHV3-23*01,IGHV3-23D*01(12-24HC)、IGHV3-33*01,IGHV3-33*06(13-32HC)、IGHV3-43*02(16-16HC)、IGHV4-34*01(2-18HC)和IGHV4-61*02(24-13HC)未纯化出抗体，VK1-203组合的IGHV1-3*01(17-19HC)、IGHV1-46*01(10-40HC)、IGHV1-69*01,IGHV1-69*12,IGHV1-69D*01(13-23HC)和IGHV3-23*01,IGHV3-23D*01(12-24HC)、IGHV3-33*01,IGHV3-33*06(13-32HC)和IGHV3-43*02(16-16HC)未纯化出抗体，共19个抗体未进行SDS-PAGE检测。可以进行SDS-PAGE检测的抗体共146个。

表5理化性能鉴定重链序列种系信息

2.6.2抗体分子的SDS-PAGE检测

SDS-PAGE非还原溶液制备：分别将1μg各个获得的抗体以及质控品IPI(伊匹木单抗，Ipilimumab)加入5×SDS上样缓冲液和40mM碘代乙酰胺中，75℃干浴加热10min。冷却混合物至室温后，12000rpm离心5min取上清。

还原溶液制备：分别将2μg各个获得的抗体以及质控品IPI加入5×SDS上样缓冲液和5mM DTT中，100℃干浴加热10min。冷却混合物至室温后，12000rpm离心5min取上清。将上清加入Bis-tris 4-15％梯度胶(金斯瑞)进行凝胶电泳并通过考马斯亮蓝染色使蛋白条带显色。

使用EPSON V550彩色扫描仪扫描带有显色蛋白条带的蛋白凝胶(用脱色液脱色凝胶至其背景透明)，通过ImageJ按照峰面积归一法计算还原和非还原条带纯度。

SDS-PAGE实验结果表明各个抗体非还原胶的条带在150kD左右，还原胶的条带在55kD左右和25kD左右，符合预期大小。通过还原胶检测表达的146个抗体，纯度均大于95％。

2.6.3抗体分子的SEC-HPLC检测

样品制备：流动相：150mmol/L磷酸缓冲液，pH 7.4；分别用流动相溶液稀释各个抗体以及质控品IPI到0.5mg/mL。

实验方法：使用Agilent HPLC 1100或岛津LC2030C PLUS液相色谱仪，色谱柱为XBridge BEH(SEC 3.5μm，7.8mm I.D.×30cm)，Waters流速设为0.8mL/min，进样体积20μL，VWD检测器波长为280nm和214nm。依次进样空白溶液、IPI质控品溶液和抗体样品溶液。按照面积归一法计算样品中高分子聚合物、抗体单体和低分子物质百分比。

结果如表6所示，HNF-018组合的15个重链获得的全长抗体可全部进行检测，单体纯度全部大于94％，11个为100％，占比73％；Eculizumab组合的15个重链获得的全长抗体可进行检测的有13个，除了一个峰形异常，其余12个单体纯度全部大于98％，7个为100％，占比54％；Olokizumab组合的15个重链获得的全长抗体可进行检测的有7个，单体纯度全部大于97％，1个为100％；Robatumumab组合的15个重链获得的全长抗体可进行检测的有8个，单体纯度全部大于94％，1个为100％；Sacituzumab组合的15个重链获得的全长抗体可进行检测的有6个，单体纯度全部大于96％，没有单体纯度为100％的抗体；Zalutumumab组合的15个重链获得的全长抗体可进行检测的有5个，单体纯度全部大于93％，没有单体纯度为100％的抗体；Matuzumab组合的15个重链获得的全长抗体可进行检测的有6个，除一个单体纯度为86.95％的抗体外，其余抗体的单体纯度全部大于90％，没有单体纯度为100％的抗体；VK1-278组合的15个重链获得的全长抗体可进行检测的有5个，单体纯度全部大于96％，1个抗体的单体纯度为100％；Fremanezumab组合的15个重链获得的全长抗体可进行检测的有5个，单体纯度单体全部大于90％，2个为100％；Fasinumab组合的15个重链获得的全长抗体可进行检测的有1个，单体纯度为85.4％；VK1-203组合的15个重链获得的全长抗体可进行检测的有2个，单体纯度为87.2％和95.76％。

SEC-HPLC结果表明HNF-018和Eculizumab与重链组合的全长抗体的单体纯度较高，表现出更好的成药性。

表6SEC-HPLC检测结果

实施例3：万亿级具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库构建

结合实施例2中的真核细胞CHO表达量结果以及理化性能检测结果，本实施例选择了HNF-018和Eculizumab两条轻链作为共同轻链进行万亿级共同轻链噬菌体文库构建。

3.1包含人HCDR3的重组重链的文库构建

取Ficoll-Paque密度梯度分离液(购自GE公司，目录号：17144003S)分离正常人血液的外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)，通过常规方法自分离的PBMC细胞提取总RNA，使用反转录试剂盒(购自TaKaRa公司,目录号：6210A)将提取的总RNA反转录成cDNA。基于重链种系基因和轻链种系基因的序列相似度，分别在重链和轻链的V区前端和第一个恒定区后端设计简并引物(李晓琳，大容量非免疫人源性Fab噬菌体抗体库的构建及初步筛选，《中国协和医科大学》硕士学位论文，2007年6月)，PCR后得到抗体的重链可变区基因片段和轻链可变区基因片段。通过融合PCR方法扩增得到含有抗体的轻链和重链可变区的片段，对该PCR产物和噬菌体展示用载体进行酶切、回收和连接，连接产物通过回收试剂盒(Omega，目录号：D6492-02)回收。最后，通过电转仪(Bio-Rad，MicroPulser)转化至感受态大肠杆菌SS320(Lucigen，MC1061 F)中，并将经转化的大肠杆菌SS320菌液涂布于具有氨苄青霉素抗性的2-YT固体平板。通过梯度稀释铺板，测定此文库库容量为3×10¹¹cfu，即3×10¹¹个抗体基因的重组噬菌体展示文库(hRAL)(库容计算方法参考CN112250763B中的实施例2.2)。

将上述获得的库菌用质粒提取试剂盒(OMEGA，D6950-01)进行质粒提取获得抗体基因文库质粒，再以此抗体基因文库质粒为模板，使用以下引物，扩增重链的“CDR1+CDR2”并纯化：

CDR1+CDR2正向引物HindⅢ-572-F：CATGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGG(SEQ ID NO:79)；

CDR1+CDR2反向引物LC-R1：CACAGTAATACACGGCCGTGTC(SEQ ID NO:80)；CDR1+CDR2反向引物LC-R2：CACAGTAATACACAGCCGTGTC(SEQ ID NO:81)；

以及，使用以下引物，扩增重链的“CDR3”并纯：

CDR3正向引物HC-F1：GACACGGCCGTGTATTACTGTG(SEQ ID NO:82)；

CDR3正向引物HC-F2：GACACGGCTGTGTATTACTGTG(SEQ ID NO:83)；

HC-CDR3-R：

GAGGTGCTCTTGGAGGAGGGTGCCAGCGGGAAGACCGATGGGCCCTTGGTGCTAGC TGCTGAGACGGTGACCRKKGTYCCYTGGCCCCAG(SEQ ID NO:84)

通过融合PCR方法将扩增出来的“CDR1+CDR2”和“CDR3”进行组合，对该融合产物和噬菌体展示载体进行酶切、回收和连接，连接产物通过回收试剂盒(Omega，目录号：

D6492-02)回收。最后，通过电转仪(Bio-Rad，MicroPulser)转化至感受态大肠杆菌SS320(Lucigen，MC1061 F)中。将经转化的大肠杆菌SS320菌液涂布于具有氨苄青霉素抗性的2-YT固体平板。通过梯度稀释铺板，测定此重链文库库容量为1×10¹²cfu，即1×10¹²个重链基因库。

3.2万亿级具有共同轻链的噬菌体展示文库构建

将实施例3.1中获得的重组HCDR3重链文库，用质粒提取试剂盒(OMEGA，D6950-01)进行质粒提取获得重组HCDR3基因文库质粒，以此文库质粒为模板，以Middle-F(TAAGGCGCGCCTAACCATCTATTTC)(SEQ ID NO：77)为上游引物和以HC-CDR3-R(GAGGTGCTCTTGGAGGAGGGTGCCAGCGGGAAGACCGATGGGCCCTTG GTGCTAGCTGCTGAGACGGTGACCATTGTCCCTTGGCCCCAG)(SEQ ID NO：78)为下游引物将重链可变区片段扩增出来，琼脂糖凝胶电泳、切胶回收后，对回收产物和实施例2.1中获得的两个含有共同轻链(Eculizumab和HNF018)的噬菌体展示载体分别进行Eco91Ⅰ(Thermo Fisher，FD0394)和SgsⅠ(Thermofisher，FD1894)双酶切、胶回收和连接，连接产物通过回收试剂盒(Omega，目录号：D6492-02)回收。最后，通过电转仪(Bio-Rad，MicroPulser)转化至感受态大肠杆菌SS320(Lucigen，MC1061 F)中，获得两个具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库CLC-09(共同轻链为HNF-018对应的轻链)和CLC-24(共同轻链为Eculizumab对应的轻链)。将经转化的大肠杆菌SS320菌液涂布于具有氨苄青霉素抗性的2-YT固体平板。通过梯度稀释铺板，测定此文库库容量为1×10¹²cfu，即1×10¹²个具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库。同时，将梯度稀释菌液涂布板，以获得单克隆，挑取3675个克隆进行测序。

测序后获得的重链种系占比结果如图13A-图13D所示。结果表明两个具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库中，重链种系占比都是IGHV3占比最高，分别是57％和53％，其中IGHV3亚型中占比最高的是IGHV3-30。

重链CDR区氨基酸长度分析结果如图14A-图14F所示，结果显示，重链CDR1氨基酸几乎都是5个氨基酸，CDR2氨基酸数量基本都是17或者16个，而与抗体多样性相关性较高的CDR3氨基酸数量6-25不等，且呈现正态分布，氨基酸数量为14的占比最高，说明获得的两个具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库的重链多样性很高。

3.3万亿级共同轻链噬菌体展示文库质控分析

本实施例中，对实施例3.2中的克隆测序结果进行分析，分析具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库中的重链种系占比、重链CDR3氨基酸长度及重链CDR3各位点氨基酸占比；同时挑取部分克隆，运用ELISA方法对共同轻链抗体文库的原核表达及噬菌体展示情况进行分析。

原核表达检测方法如下：具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库菌液稀释后涂布板，以获得单克隆，每个挑取1468个克隆接种到氨苄青霉素抗性的2-YT培养基中，过夜培养(16h左右)；在96孔ELISA板上包被Anti-Fd(1μg/mL，30μL/孔，Bio-Rad，货号：STAR161)，4℃过夜。次日，将过夜培养的单克隆菌液5000rpm离心10min后取上清；同时，将孔板用PBST洗3次后用5％脱脂牛奶封闭2h，用PBST洗板3次后，加入梯度稀释的菌液上清及标准品IgG全长抗体蛋白(标准品，首孔2μg/mL)并孵育1h。之后用PBST清洗3次后加入第二抗体Anti-humanKappa-HRP(Novus，NB7466)并孵育1h。孵育完成后，PBST洗板6次，加TMB(SurModics，TMBS-1000-01)显色。根据显色结果，加入2M HCl终止反应，通过酶标仪(Molecular Devices，SpecterMax 190)在OD450下读板。

噬菌体展示情况检测方法如下：具有共同轻链的噬菌体Fab展示文库菌液稀释后涂布板，以获得单克隆，挑取1305个克隆接种到氨苄青霉素抗性的2-YT培养基中，过夜培养后，转接到新的含有2％葡萄糖的氨苄青霉素抗性的2-YT培养基中，37℃220rpm培养至OD600为0.5后，加入辅助噬菌体(Helper phage)，静置30min后，37℃220rpm培养1h后，5000rpm离心去除上清，加入新的氨苄青霉素和卡纳抗性的2-YT培养基，30℃220rpm培养过夜(16h左右)后，5000rpm离心取上清，即为单克隆噬菌体上清；在96孔ELISA板上包被Anti-Fd(1μg/mL，30μL/孔，Bio-Rad，货号：STAR161)，4℃过夜。次日，将孔板用PBST洗3次后用5％脱脂牛奶封闭2h，用PBST洗板3次后，加入前述单克隆噬菌体上清及5倍梯度稀释的噬菌体阳性对照，首孔1e+10cfu，并孵育1h。之后用PBST清洗3次后加入第二抗体Anti-M13-HRP(Sino biological，11973-MM05T-H)并孵育1h。孵育完成后，PBST洗板6次，加TMB(SurModics，TMBS-1000-01)显色。根据显色结果，加入2M HCl终止反应，通过酶标仪(Molecular Devices，SpecterMax 190)在OD450下读板。EXCEL统计后作图。

共同轻链抗体库原核表达结果如图15A所示，以阴性对照(PBS)读值的1.65倍为阈值，检测两个共同轻链抗体库的原核(Fab)表达效率分别是74.68％和78.58％；共同轻链抗体库噬菌体展示结果如图15B所示，以阴性对照(以辅助噬菌体为阴性对照)读值的2倍为阈值，检测两个共同轻链抗体库噬菌体表达效率分别为69.77％、76.34％。结果表明两个共同轻链抗体噬菌体文库均有较高的原核表达及噬菌体展示效率。

实施例4：共同轻链噬菌体展示文库筛选验证

4.1噬菌体展示文库筛选原材料制备

4.1.1筛选用抗原蛋白制备

通过在编码基因水平的遗传操作，分别在人ROR1 ECD(Uniprot ID：Q01973，AA30-406)和人TROP2 ECD(Uniprot ID：P09758，AA31-274)的序列C端加上His或者human Fc标签。分别将获得的核酸序列构建至pcDNA3.4载体中，然后转化到大肠杆菌DH5α中，37℃过夜培养，之后利用无内毒素质粒提取试剂盒(OMEGA，D6950-01)提取质粒。将所得到的质粒用ExpiFectamine^TM293转染试剂盒(Gibco^TM，A14524)瞬转至HEK293细胞( CRL-1573^TM)中，表达7天后，收取细胞培养物上清液，对含有His标签的蛋白用Ni Smart Beads6FF(常州天地人和生物科技有限公司，SA036050)进行亲和纯化，然后用咪唑梯度洗脱目的蛋白。洗脱的各蛋白分别通过超滤浓缩管(Millipore，UFC901096)换液至PBS缓冲液中，最后获得抗原蛋白(huROR1-His和huTROP2-His)。对含有Fc标签蛋白通过ProteinA/G亲和层析柱亲和法进行纯化。纯化后用100mM甘氨酸盐(pH＝3.0)洗脱目的蛋白，浓缩、置换，最后获得抗原蛋白(huROR1-hFc和huTROP2-hFc)。

4.1.2过表达细胞构建及流式细胞术鉴定

过表达人ROR1和TROP2的HEK293细胞株(以下简称huROR1-HEK293、huTROP1-HEK293)的构建：将全长人ROR1(Uniprot ID：Q01973)、人TROP2(Uniprot ID：P09758)的核酸序列构建至pLVX-puro质粒(Clontech，Cat#632164)上。然后，将所得到的质粒通过电转仪(Invitrogen，NeonTM Transfection System)，MP922947电转化至HEK293细胞(CRL-1573^TM)中。电转化后，将所得到的细胞分别转移至含有体积百分比为10％FBS(Gibco，15140-141)且不含抗生素的DMEM培养基(Gibco，11995065)中，然后将细胞接种入10×10cm细胞培养皿中培养48小时，接着以平均0.5个细胞/孔的密度将细胞分装至96孔细胞培养板中，加入终浓度为2μg/mL的嘌呤霉素(Gibco，A111138-03)作为筛选压力，2周左右观察细胞株克隆生长情况，并挑取形成克隆的细胞株进行鉴定。

huROR1-HEK293细胞的流式细胞术鉴定：将对数生长期细胞消化并铺板到96孔板中，用FACS缓冲液(含体积百分比为2％的FBS的1×PBS缓冲液)清洗后，加入用PBS梯度稀释的一抗(99961.1)4℃孵育30min；清洗后，加入配制好的荧光二抗anti human IgG Fc(abcam，98596)，4℃孵育30min；最后通过流式细胞仪(Beckman，CytoFLEXAOO-1-1102)进行检测。检测结果显示hROR1-HEK293表面高表达人ROR1。

huTROP2-HEK293细胞的流式细胞术鉴定：将对数生长期的上述细胞株细胞消化并铺板到96孔板中，用FACS缓冲液(含体积百分比为2％的FBS的1×PBS缓冲液)清洗后，加入用PBS梯度稀释的一抗(Sacituzumab)4℃孵育30min；清洗后，加入配制好的荧光二抗antihuman IgG Fc(abcam，98596)，4℃孵育30min；最后通过流式细胞仪(Beckman，CytoFLEXAOO-1-1102)进行检测。检测结果显示获得了表面高表达人TROP2的hTROP2-HEK293细胞株。

4.2噬菌体展示文库筛选

本实施例中，采用磁珠法和免疫管法对实施例3中构建的共同轻链噬菌体展示文库(CLC)和实施例3.1中构建的包含人HCDR3的重组噬菌体文库(hRAL)进行筛选验证。比较了两种文库筛选出来的抗体分子在理化性能和亲和力方面的差异。

4.2.1磁珠法筛选抗体基因噬菌体展示文库

磁珠法筛选是基于将抗原蛋白(huROR1-His和huTROP2-His)进行生物素标记后，再与偶联有链霉亲和素的磁珠结合，通过将结合抗原的磁珠和抗体基因噬菌体展示文库进行孵育、洗涤和洗脱的淘选过程。通常经历3-4轮的淘选，由此针对抗原的特异性单克隆抗体可以大量富集。本实施例中，将生物素标记的抗原蛋白用于噬菌体展示文库筛选，经过3轮淘选后进行针对抗原蛋白的单克隆抗体初筛，具体方法参考CN112250763B中的实施例2.4.1。

4.2.2免疫管法筛选抗体基因噬菌体展示文库

免疫管法和磁珠法的目的均为富集针对抗原的特异性抗体，为两个相互补充和验证的实验方法。免疫管法筛选的原理是将抗原蛋白(huROR1-His、huTROP2-Hi、huROR1-hFc、和huTROP2-hFc)包被在具有高吸附力的免疫管表面，通过将噬菌体展示抗体文库加入免疫管中并和吸附于免疫管表面的抗原蛋白进行孵育、洗涤和洗脱的淘选过程，经历2-4轮淘选，最终将针对抗原的特异性单克隆抗体富集下来。本实施例中，经过3轮淘选后进行针对前述抗原蛋白的单克隆抗体初筛，具体方法参考CN112250763B中的实施例2.4.2。

4.3全长抗体蛋白构建表达及纯化

全长蛋白的构建、表达和纯化参见实施例2.5。

4.4抗TROP2抗体的理化性能和亲和力检测

本实施例中，对于实施例4.3中表达纯化的来源于CLC库和hRAL库的抗TROP2单抗进行理化分析和亲和活性检测。

4.4.1SDS-PAGE检测

SDS-PAGE检测方法参见实施例2.6.2，其中hRAL库共检测36个候选抗体，CLC库共检测38个候选抗体，实验结果如表7所示。

结果显示hRAL库的36个候选抗体中，34个候选抗体SDS-PAGE蛋白纯度大于95％，1个候选抗体(C34)SDS-PAGE蛋白纯度为57.5％，1个候选抗体(E35)SDS-PAGE蛋白纯度无法判别。CLC库库的38个候选抗体SDS-PAGE蛋白纯度均大于95％。

4.4.2等电点(PI)检测

本实施例中，基于毛细管等电聚焦电泳法检测hRAL库和CLC候选抗体等电点。毛细管等电聚焦电泳具体流程如下。

样品制备：配制目标浓度为1mg/mL,体积为50μL的供试品、参比品、iCIEF系统适用性对照品(中国食品药品检定研究院，330002)及空白溶液，分别取40μL的上述样品加入到吸取了160μL预混液的离心管中，漩涡震荡3次，每次5s，将离心管置于台式小型离心机上，室温，13000rpm离心3min,离心结束后取160μL样品上清按照加样顺序转移到96孔板中，贴上密封膜，室温，1000rpm离心10min,离心结束后立即进行分析。

上机检测：打开双功能毛细管电泳仪(ProteinSample，Maurice)，开机15min后进行系统自检，所有自检通过后进行后续实验。完成试剂盘试剂和卡盒准备后，进行测定方法参数设置，iCIEF系统适应性检测方法，参数设计如下：时间和电压:Focus Period 1:1500V,1.0min；Focus Period 2:3000V,7.5min；检测：Absorbance:0.005s；Fluorescence:3,5,10,20s；进样时长:55s；标准:pI 4.05:250pixels；pI 9.99:1800pixels.样品检测方法，参数设置如下：时间和电压:Focus Period 1:1500V,1.0min；Focus Period 2:3000V,8.0min；检测：Absorbance:0.005s；Fluorescence:3,5,10,20s；进样时长：55s；标准：pI4.05:250pixels；pI 9.99:1800pixels.上样，进样顺序依次为iCIEF系统适用性对照品2针、空白溶液1针、参比品溶液1针、供试品溶液各1针、iCIEF系统适用性对照品溶液1针。

下机及数据分析：保存数据后进行卡盒清洗，关机。采集的数据经过iCE软件分析可得各峰的等电点。

结果显示在表7和图16，hRAL库36个候选抗体等电点的范围为6.73-8.51，均值为7.73，CLC库38个候选抗体等电点的范围为7.27-8.60，均值为8.08。CLC库来源的抗体等电点更偏离中性值，表明CLC库抗体具有更好的成药性。

表7不同来源的抗TROP2抗体分子理化性能汇总

4.4.3抗TROP2抗体与huTROP2-His的结合活性检测

在96孔ELISA板上包被huTROP2-His(2μg/mL、30μL/孔)，4℃过夜。次日，将孔板用PBST洗3次后用5％脱脂牛奶封闭2h，用PBST洗板3次后，加入梯度稀释的候选抗体及阳性对照抗体Sacituzumab并孵育1h。之后用PBST清洗3次后加入二抗Anti-human IgG-Fc-HRP(abcam,ab98596)并孵育1h。孵育完成后，PBST洗板6次，加TMB(SurModics，TMBS-1000-01)显色。根据显色结果，加入2M HCl终止反应，通过酶标仪(Molecular Devices，SpecterMax190)在OD450下读板。

结果显示在图17：根据EC₅₀值的大小将结合活性分成了高中低三等，EC₅₀值在0.001-0.01之间的为高结合活性，EC₅₀值在0.01-0.1之间的为中等结合活性，EC₅₀值在0.1-1之间为低结合活性。hRAL库无高结合活性候选抗体，中等结合活性的候选抗体占比为94％(34/36)，低结合活性的候选抗体占比为6％(2/36)。CLC库的候选抗体高结合活性的候选抗体占比为79％(30/38)，中等结合活性的候选抗体占比为21％(8/38)，无低结合活性候选抗体。可见CLC库筛选获得的候选抗体ELISA结合活性优于hRAL库筛选获得的候选抗体。

4.5抗ROR1抗体的理化性能和亲和活性检测

本实施例中，对于实施例4.3中表达纯化的来源于CLC库和hRAL库的抗ROR1单抗进行理化分析和亲和活性检测。

4.5.1SDS-PAGE检测

SDS-PAGE检测方法参见实施例2.6.2，其中hRAL库共检测了11个候选抗体，CLC库了共检测12个候选抗体，实验结果见表8。

结果表明所有候选抗体非还原胶的条带在150kD左右，还原胶的条带在55kD左右和25kD左右，符合预期大小。且所有候选抗体纯度均大于95％。综上，共同轻链抗体库和人源抗体库获得的抗体都具有较好的SDS-PAGE纯度。

4.5.2SEC-HPLC检测

SEC-HPLC检测方法参见实施例2.6.3，实验结果见表8。

结果表明hRAL库获得的抗体的SEC单体纯度均大于90％，单体纯度在100％的仅有一个，占比0.09％；CLC库获得的抗体的SEC单体纯度均大于90％，单体纯度在100％的有7个，占比66.67％。因此CLC库筛选获得的抗体在纯度上表现得更好。

4.5.3DSF热稳定性鉴定

在本实施例中，利用差示扫描荧光法(DSF)检测了来源hRAL库和CLC库的全长抗体的变性温度(Tm)。

配制100×Sypro orange染料：取6μL 5000×Sypro Orange加入到294μL的1×PBS中制成100×Sypro Orange染料；配制Hercerptin参比品溶液：取一定量Hercerptin母液，用1×PBS稀释至0.2mg/mL；配制供试品溶液制备：取一定量的供试品母液，用1×PBS稀释至0.2mg/mL；母液浓度不足0.2mg/mL的直接用母液进行测试。加样：8联管中加入19μL的0.2mg/mL Hercerptin参比品溶液或0.2mg/mL供试品溶液，再加入1μL的100×Syproorange染料，混匀，每个供试品或者参比品作3个平行。参数设置：试验类型选择熔解曲线，采用连续模式，扫描温度范围为25℃～95℃，升温速率为1％(约1℃/min)，25℃平衡5min，在升温过程中采集数据，报告基团选择ROX，淬灭基团选择None，反应体积20μL；将8联管放置在预先设定好的位置，开始实验。Tm值确定：以一阶导数曲线第一个峰谷对应的温度记为该蛋白的Tm值。

hRAL库共检测了3个全长抗体，CLC库共检测了12个全长抗体。结果如表8所示，人源抗体库获得的抗体的Tm值最大的为74.01℃，平均值为70.76℃，共同轻链抗体库获得的抗体的Tm值最大的为74.27℃，平均值为70.86℃，Tm值在70℃以上的抗体占比58.3％。CLC库同hRAL库一样能够获得具有较好的热稳定性的抗体。

表8不同来源的抗ROR1抗体分子理化性能汇总

注：NA表示没有检测

4.5.4抗ROR1抗体的亲和动力学检测

在本实施例中，采用GATOR(ProbeLife)仪器，检测了来源人源抗体库和共同轻链抗体库的全长抗体对人重组蛋白huROR1-His的亲和活性。

具体方法如下：称取2g的BSA，量取2mL的10％Tween 20，加入到1000mL的1×PBS，混匀，将pH值到7.40，制成Q Buffer缓冲液，过滤后分装保存。称取0.38g甘氨酸、4.38g氯化钠加入500mL纯水中混匀，将pH调至2.0，制成传感器再生缓冲液，过滤后分装保存。候选或对照抗体以Q Buffer缓冲液稀释成30nM，作为抗原的人重组蛋白huROR1-His以Q Buffer缓冲液进行2倍梯度稀释，依次为600、300、150、75、37.5、18.8、9.38、0nM。避光条件下，采用QBuffer缓冲液预湿传感器(Protein A Probes,ProbeLife,CA)，至少10min后开始测试样品板(Greiner，655209)，测试无误后按预设程序进行。首先采用候选或对照抗体进行结合120s，结合完毕在Q Buffer缓冲液中继续平衡30s后，将结合有抗体的传感器转移至不同浓度抗原人重组蛋白huROR1-His稀释液中结合120s，再转移到Q Buffer缓冲液中，解离时间为180s，最后通过不同浓度抗原与抗体的结合解离数据拟合得到KD、Kon和Koff。人源抗体库共检测11个全长抗体，共同轻链抗体库共检测12个全长抗体。

结果如表9所示，CLC库获得的抗体中，亲和力最高的为3.82E-09M，hRAL库获得的抗体中，亲和力最高的为6.6E-09M，共同轻链抗体库中获得的抗体表现出更优的亲和活性。在Koff上来看，hRAL获得的抗体Koff小于5.0E-03/s的有3个，占比25％，CLC库获得的抗体Koff小于5.0E-03/s的有5个，占比45.5％。综上，在共同轻链噬菌体展示库中获得亲和力更好的抗体的可能性更高。

表9不同来源的抗ROR1抗体分子亲和动力学结果

实施例5：共同轻链抗体表征分析

为了进一步评价构建的共同轻链噬菌体展示抗体库(CLC)筛选得到的共同轻链抗体的成药性，本实施例采用磁珠法和免疫管法对CLC进行多靶点(ROR1、AXL、GPC1、CD228a、PTK7、FGFR2B、TROP2和5T4)筛选验证。

5.1筛选原材料制备及文库筛选

筛选原材料的制备及文库的筛选参见实施例4.1-4.2。

5.2ELISA法筛选特异结合抗原蛋白的阳性克隆

将实施例5.1中通过磁珠法和免疫管法筛选获得的输出集合，稀释后制备成单克隆，再使用抗原蛋白(huROR1-His、huAXL-His、huGPC1-His、huCD228a-His、huPTK7-His、huFGFR2B-His、huTROP2-His和hu5T4-His)包板用ELISA进行阳性克隆筛选。具体方法参考实施例3.3。

ELISA筛选到的阳性克隆经过测序分析获得结合抗原蛋白的独特(Unique)抗体序列，结果如表10所示，8个靶点筛选验证共获得5352个独特抗体序列，平均单靶点获得独特结合克隆达到706个(TROP2只筛选了CLC-24库，未计入统计)，其中针对ROR1、AXL和GPC1的抗体数量较多，均获得900多个独特结合克隆。

表10共同轻链库筛选验证靶点单克隆数量

靶点	单克隆数量
		FR2b	523
ROR1	959
		5T4	321
AXL	917
		PTK7	642
CD228a	679
		GPC1	901
TROP2	410

5.3共同轻链抗体和在研抗体性能检测

本实施例从前述针对各靶点筛选出的抗体分子中挑选出70个共同轻链抗体，将挑选的70个抗体和65个已上市或者在研单抗药物进行表达量、SDS PAGE、SEC和热稳定分析。

5.3.1全长蛋白的构建、表达和纯化

全长蛋白的构建、表达和纯化参见实施例2.5。

5.3.2共同轻链抗体和在研抗体表达量比对

本实施例中，对前述表达的70个共同轻链抗体和65个上市或在研抗体表达第七天的表达上清进行检测，具体方法如下：

Q Buffer配制：用1×PBS配制成含有0.02％Tween 20与0.2％BSA的动力学缓冲溶液。

R buffer配制：配制10mM Gly，150mM NaCl的Q Buffer，pH调至2.0。

标曲配制：三优生物医药(上海)有限公司自产标准品(VHH)浓度先稀释至234.50μg/mL，然后倍数稀释至0.46μg/mL，每个浓度200μL放入96孔板内。

质控点：取标曲中任意一点做质控点。

待测上清处理：表达上清用Q Buffer稀释10倍至200μL，放入96孔板里。

打开Gator仪器及相关软件，选择Quantitation实验模式，Loading程序运行120s，Regeneration程序运行50s，用四参数拟合标准曲线，将表达上清样品读值代入计算表达量。

结果如图18和表11-12所示，70个共同轻链抗体平均表达量为123.87μg/mL，65个上市或者在研单抗平均表达量为74.23μg/mL，P值小于0.0001，结果显示共同轻链抗体表达量显著优于上市或在研单抗，证明构建的共同轻链噬菌体展示文库筛选获得的共同轻链抗体具有更高的表达量。

5.3.3共同轻链抗体和上市或在研抗体的SDS PAGE检测

本实施例中，将前述70个共同轻链抗体和65个上市或在研单克隆抗体蛋白进行SDS-PAGE纯度鉴定，具体方法参见实施例2.6.2。

结果如表11-12所示，70个共同轻链抗体有10个表达量较低，未纯化到蛋白或者纯化蛋白浓度较低，未进行检测，59个抗体蛋白纯度大于95％。65个上市或者在研单克隆抗体有27个表达量较低，未纯化到蛋白或者纯化蛋白浓度较低，未进行检测，37个抗体蛋白纯度大于95％。

5.3.4共同轻链抗体和上市或在研抗体SEC-HPLC检测

本实施例中，将前述表达的70个共同轻链抗体和65个上市或在研单克隆抗体蛋白进行SEC-HPLC纯度检测，具体方法参见实施例2.6.3。

结果如表11-12所示，70个共同轻链抗体蛋白有30个浓度达到0.5mg/mL，经SEC-HPLC检测有28个单体纯度在95％以上，SEC-HPLC单体纯度在95％以上蛋白占比93.3％。65个在研单克隆抗体蛋白有15个浓度达到0.5mg/mL，经SEC-HPLC检测有11个单体纯度在95％以上，SEC-HPLC单体纯度在95％以上蛋白占比73.3％。结果表明构建的共同轻链噬菌体展示文库筛选获得的共同轻链抗体纯度显著优于在研单克隆抗体，共同轻链抗体具有更好的纯度。

5.3.5共同轻链抗体和在研抗体DSF热稳定分析

本实施例中，从前述表达的70个共同轻链抗体和65个上市或在研单克隆抗体蛋白中挑选30个表达量较高的共同轻链抗体和24个表达量较高的上市或在研单克隆抗体，进行DSF热稳定分析，具体方法参见实施例4.6.3。

结果如图19和表11-12所示，30个共同轻链抗体Tm1平均值为70.88℃，24个上市或在研单克隆抗体Tm1平均值为61.06℃，P值小于0.0001，结果表明共同轻链抗体热稳定性显著优于在研单克隆抗体，构建的共同轻链噬菌体展示文库筛选获得的共同轻链抗体具有更好的热稳定性。

表11 70个共同轻链抗体成药性数据汇总

表12 65个上市或在研单克隆抗体成药性数据汇总

示例性序列

Claims

1.具有重链多样性的包含共同轻链的抗体库，其中所述抗体库中的共同轻链是由IGKV3或IGKV1轻链种系基因编码的；优选地，是由IGKV3-20、IGKV3-11、IGKV1-39、IGKV1-5或IGKV1-33轻链种系基因编码的；更优选地是由IGKV3-20或IGKV1-39轻链种系基因编码的；

例如，所述抗体库中的共同轻链分别包含：

(s)SEQ ID NO:54所示的LCDR1或SEQ ID NO:54所示的LCDR1的不超过2个氨基酸变化的变体、SEQ ID NO:35所示的LCDR2或SEQ ID NO:35所示的LCDR2的不超过2个氨基酸变化的变体、和SEQ ID NO:55所示的LCDR3或SEQ ID NO:55所示的LCDR3的不超过2个氨基酸变化的变体；

例如，所述抗体库是Fab抗体库、scFv抗体库、scFab抗体库、全长抗体库。

2.根据权利要求1所述的具有重链多样性的包含共同轻链的抗体库，其中所述抗体库中的共同轻链包含任一SEQ ID NO:56-74所示的轻链可变区序列，或与所述轻链可变区序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的序列。

3.根据权利要求1所述的具有重链多样性的包含共同轻链的抗体库，其中所述抗体库中的重链的可变区是由人免疫球蛋白基因座中的天然重链种系基因(例如，IGHV1、IGHV3和/或IGHV4重链种系基因)编码的。

4.根据权利要求1所述的具有重链多样性的包含共同轻链的抗体库，其中所述重链的可变区是经工程化重组后的核苷酸序列编码的，例如，其中所述重链的可变区是经任一天然HCDR3与任一天然HCDR1和HCDR2重组后的核苷酸序列编码的，例如，所述抗体库包含至少1×10¹⁰－1×10¹²种抗体，优选地，所述抗体库中包含的抗体至少90％是功能性的，优选地，以100nM或更小的Kd与靶抗原结合。

5.制备权利要求1-3中任一项所述的抗体库的方法，包括：

(a)构建人天然抗体的基因文库；

(c)获得编码权利要求1或2中所述的共同轻链的核苷酸序列，

6.制备权利要求4所述的抗体库的方法，包括：

(a)构建人天然抗体的基因文库；

(d)扩增步骤(c)的人工重链核苷酸序列，并回收；

(e)获得编码权利要求1或2中所述的共同轻链的核苷酸序列，

7.权利要求1－4中任一项所述的具有重链多样性的包含共同轻链的抗体库的用途，用于制备具有共同轻链的双特异性抗体。

8.双特异性抗体，其包含第一抗原结合部分和第二抗原结合部分，其中所述第一抗原结合部分和第二抗原结合部分包含共同轻链，且所述共同轻链是由IGKV3或IGKV1轻链种系基因编码的；优选地，是由IGKV3-20、IGKV3-11、IGKV1-39、IGKV1-5或IGKV1-33轻链种系基因编码的；更优选地是由IGKV3-20或IGKV1-39轻链种系基因编码的；

例如，所述双特异性抗体中的共同轻链包含选自以下的CDR：

优选地，所述双特异性抗体中的共同轻链包含任一SEQ ID NO:56-74所示的轻链可变区序列，或与所述轻链可变区序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的序列。

9.根据权利要求8所述的双特异性抗体，其还包含由第一和第二亚基组成的Fc结构域，且所述第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合Fc结构域的第一亚基的N末端，所述第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合Fc结构域的第二亚基的N末端，例如，所述Fc结构域是免疫球蛋白分子的Fc结构域，特别是IgG类免疫球蛋白的Fc结构域，优选地是IgG₁或IgG₄ Fc结构域，更优选地是人IgG₁或IgG₄ Fc结构域。

10.根据权利要求9所述的双特异性抗体，其中在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替代，从而在第一亚基的CH3结构域内产生突起，其可定位在第二亚基的CH3结构域内的空腔中，并且Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替代，从而在第二亚基的CH3结构域内产生空腔，第一亚基的CH3结构域内的突起可定位于第二亚基的CH3结构域内的空腔中，由此所述双特异性抗体的重链彼此形成“结入扣”的稳定缔合。

11.分离的多核苷酸，其编码权利要求8－10中任一项所述的双特异性抗体。

12.一种载体，特别地是表达载体，其包含权利要求11的分离的多核苷酸。

13.一种宿主细胞，其包含权利要求11的分离的多核苷酸或权利要求12的载体。

14.一种生产权利要求8－10中任一项所述的双特异性抗体的方法，包括以下步骤:

a)在适于表达双特异性抗体的条件下培养权利要求13的宿主细胞，以及b)回收双特异性抗体。